CN108398478A - 基于腺嘌呤/Au（Ⅲ）复合物的多功能电化学传感器的构建方法及应用 - Google Patents

基于腺嘌呤/Au（Ⅲ）复合物的多功能电化学传感器的构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于腺嘌呤/Au(III)复合物的多功能电化学传感器的构建方法及应用，特点是包括以下步骤：(1)将腺嘌呤水溶液与HAuCl4水溶液剧烈振荡混合，温育，离心并用水洗涤，制备腺嘌呤/Au(III)聚合物；(2)将预处理后的Au电极浸入捕获探针(DNA)的缓冲液中室温孵育。接着在MCH中除去电极表面非特异性DNA，记为电极1。然后，通过TdT扩增获得富T DNA长链，标记为电极2。最后，将腺嘌呤/Au(III)复合物溶液置于上述电极上，通过氢键作用和碱基互补配对原则发生特异性杂交吸附作用，获得电极3。修饰电极用超纯水冲洗，氮气流下干燥；(4)最后，将制备的传感器应用于DNA相关酶活性及其小分子抑制剂检测。

Description

基于腺嘌呤/Au(III)复合物的多功能电化学传感器的构建方 法及应用
技术领域
本发明涉及多功能电化学传感器，尤其是涉及基于腺嘌呤/Au(III)复合物的多功能电化学传感器的构建方法及其在DNA相关酶活性及其抑制剂检测方面的应用，属于功能材料和生物传感技术领域。
背景技术
DNA是最大的自然生物大分子之一，一种长链负电荷聚合物，组成单位为四种脱氧核苷酸，具有四种类型的核碱基，能够以各种分子间作用力与各类新型材料相互作用，譬如柠檬酸包裹的金纳米粒子、负电荷氧化石墨烯等。其中，腺嘌呤(DNA以及RNA 中的五个碱基之一，是含氮杂环分子，它的分子式为C5N5H5，分子量为135.127，常温下为白色结晶性粉末，味微酸，溶于沸水和氢氧化钠溶液，微溶于冷水、稀盐酸，不溶于乙醇和氯仿)环中含有4个氮原子(分别为1、3、7、9号位)，因此存在4个可能的金属离子作用位点，并由此可形成各种结构的复合物；另一方面，金属离子能够与 DNA配位，即金属离子与DNA的某些亲核基团(如磷酸氧位点或碱基氮、氧位点)能够直接螯合。据有关文献报道，一个三价金离子能够结合多个腺嘌呤分子，因此，通过改变金离子和腺嘌呤分子的摩尔合成比，可以合成各种结构形貌的腺嘌呤/Au(III)复合物，该复合物能够通过氢键作用和碱基互补配对作用与DNA发生相互作用，是一种能够与DNA发生杂交吸附作用的理想复合物材料。
基于腺嘌呤/Au(III)复合物与DNA之间的杂交吸附性质，利用该复合物发展DNA相关酶活性检测的生物传感器，我们以脱氧核苷酸末端转移酶(terminaldeoxynucleotidyl transferase，TdT)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)作为检测模板，探讨腺嘌呤/Au(III)复合物在DNA相关酶活性检测方面的应用。一方面，TdT是一种不需模板就可以催化脱氧核苷酸(dNTP)结合到DNA分子3’-OH末端使DNA链延伸的DNA聚合酶。已经有研究证明，TdT含量的多少与癌症的发生发展极为相关，基于TdT在生物体系中的活性随着组织细胞变化而不同，可以通过检测TdT在特定组织细胞中的含量以达到临床诊断的目的。传统的TdT检测分析主要依靠凝胶电泳分析，但凝胶电泳分析操作过程复杂、耗时长、费用昂贵、重现性较差，且只能给出半定量的结果。因此，开发一种简便、灵敏、低成本、选择性好的TdT检测手段势在必行；另一方面，ALP在人体内的分布十分广泛，如乳腺、骨、肝、肾、肠粘膜以及胎盘等组织及体液中。不同器官、体液分布的ALP的生物学功能也不尽相同。ALP大多数由成骨细胞产生，当机体发生骨折或患有骨软化症、佝偻病、骨细胞癌、骨质疏松等骨骼疾病时，成骨细胞将会增殖，致使血清中的ALP含量升高。临床上常借助ALP的动态变化观察判断一些疾病如肝胆疾病、骨骼疾病及自身免疫性疾病等的病情发展和临床疗效。因此，ALP活性的定量检测对于各种相关疾病诊断具有十分重要的意义。
本发明合成了一种具有特殊电催化活性的腺嘌呤/Au(III)复合物，并基于TdT的延伸聚合作用形成了一条富T DNA长链，利用腺嘌呤/Au(III)复合物与延伸的富T DNA长链的杂交吸附作用，通过该复合物对过氧化氢(H2O2)的催化还原作用作为信号输出，构建一种无标记的、简单的TdT活性检测。另外，通过在3’-PO3的DNA添加ALP反应液，利用ALP的消化作用暴露新的3’-OH末端，在TdT的延伸聚合作用及底物三磷酸脱氧胸腺嘧啶核苷酸(dTTP)条件下，新暴露的3’-OH末端可以延长并形成富T DNA 长链，通过氢键作用和碱基互补配对作用捕获腺嘌呤/Au(III)复合物，所输出的电化学信号与ALP浓度成正比。该多功能电化学传感器可以用来检测DNA相关酶活性并筛选其对应的小分子抑制剂，特异性好、灵敏度高、结果准确可靠、成本低、快速，且制备过程极其简单。目前，国内外还没有公开任何关于利用腺嘌呤/Au(III)复合物的电催化特性进行DNA相关酶活性检测的多功能电化学传感器的构建方法及应用的相关报道，特别是通过同一检测策略实现TdT和ALP活性检测及他们小分子抑制剂的筛选，为癌症相关理论的发生发展、临床诊断和药物开发提供了新方向和新视角。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性好、灵敏度高、检测速度快，结果准确可靠、成本低的基于腺嘌呤/Au(III)复合物的电催化活性及其与富T DNA长链的杂交吸附作用的DNA相关酶活性检测的多功能电化学传感器的构建方法及应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：基于腺嘌呤/Au(III)复合物的多功能电化学传感器的构建方法及应用，具体步骤如下：
(1)腺嘌呤/Au(III)聚合物的制备
依次取1～100μL浓度为10～50mM的腺嘌呤水溶液，1～100μL浓度为10～50mMHAuCl4水溶液，加蒸馏水配成0.01～1mL的溶液，将溶液剧烈振荡，在磁力搅拌下将混合物在敞口烧杯中孵育3～9小时，通过离心并用水洗涤以除去剩余的化学物质，标记为腺嘌呤/Au(III)。
(2)传感器的制备
a.金电极预处理
金电极表面按照以下顺序逐步预处理：在piranha溶液(30％H2O2：浓H2SO4，3： 7)中加热3～10分钟去除任何先前的有机层，用氧化铝浆(0.3和0.05μm)，得到镜面状的金电极表面，用超纯水超声波洗涤，氮气干燥，在0.1M H2SO4水溶液中循环伏安扫描，保持电压为-0.3～+1.5V，时间5～15分钟。最后，将处理好的Au电极用水洗涤并在氮气流下干燥。
b.传感器的制备
将处理后的Au电极浸入含有0.5～1.5μM捕获探针(3’-OH末端的DNA)的缓冲液中室温孵育12～20小时。接着，将修饰电极浸在0.5～1.5mM MCH中20～40分钟，除去吸附在Au电极表面上的非特异性DNA，记为电极1。然后，将2.5～10μL含有0.05～0.5 mM dTTP，6～60U/mL TdT和0.2～2μL TdT缓冲液滴加到修饰电极表面，37℃孵育1～2 小时，实现扩增获得富T DNA长链，标记为电极2。最后，将5～15μL腺嘌呤/Au(III) 复合物溶液置于上述电极上10～60分钟实现腺嘌呤/Au(III)复合物与富T DNA长链之间的杂交吸附，获得电极3。在上述每一步之后，这些修饰电极用超纯水彻底冲洗，并在电化学表征之前置于氮气流下干燥。
(3)检测TdT活性
a.TdT活性检测
将含有0.05～0.5mM dTTP，不同终浓度的TdT(0～200U/mL)和0.2～2μL TdT缓冲液的2.5～10μL反应混合物添加到电极1的表面，电极2和电极3的制备步骤同(2)。最后，在含有5mM H2O2的PBS(0.1M，pH 7.4)中进行循环伏安测量。
b.TdT抑制剂检测
对于抑制剂检测，将TdT(最终浓度为60U/mL)与一系列不同的终浓度(0～12mM)的焦磷酸钠(PP)，37℃孵育3～10分钟。其他反应条件和后续步骤与TdT活性检测步骤相同。
(4)检测ALP活性
a.ALP活性检测
按照以下步骤进行基于腺嘌呤/Au(III)复合物的ALP的电化学检测。通过将预处理的Au电极浸入含有0.1～1μM捕获探针(3’-PO3末端的DNA)的固定缓冲液中6～16小时，然后将含有不同终浓度(0～240U/L)的ALP、0.1M MgSO4的总体积为2.5～10μL 的Tris-HCl缓冲溶液(10mM，pH 9.0)滴至电极表面，37℃孵育20～60分钟，用于制备电极1，其它的操作步骤如TdT活性检测步骤。
b.ALP抑制剂检测
为了研究我们建立的用于ALP抑制剂评估的电化学方法的应用，将不同终浓度 (0～2400μM)的Na3VO4水溶液溶液在37℃下加入到ALP反应溶液(含有10U/LALP 和0.1μMMgSO4)中，然后将该反应液滴至电极表面孵育20～60分钟，其它的操作步骤如ALP活性检测步骤。
利用上述基于腺嘌呤/Au(III)复合物的多功能电化学传感器的构建方法及应用，利用循环伏安法，设置电位范围为-1.0～0V，扫速为50mV/s，检测制得传感器对不同浓度TdT或ALP的电化学响应，获得一系列不同浓度的TdT或ALP对应的还原峰电流大小，建立电流响应与TdT或ALP浓度之间的定量关系，根据两者之间的定量关系，确定待测样品中TdT或ALP的含量。
发明原理：本发明是一种多功能电化学生物传感器，制备了腺嘌呤/Au(HI)复合物，同时，在底物dTTP存在的条件下，TdT催化单链DNA上的3’-OH末端进行延伸聚合作用，得到富T DNA长链，该长链可通过氢键作用和碱基互补配对作用与腺嘌呤/Au(III) 复合物发生特异性杂交吸附作用，构建了一种简单快速、高灵敏、高选择性、免标记的 TdT或ALP活性分析方法。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明构建了一种基于腺嘌呤/Au(III)复合物的多功能电化学传感器的构建方法及应用。首先，利用单链DNA上的-SH与金电极通过Au-S键结合，TdT催化DNA的3’-OH末端进行聚合延长，制备富T DNA长链，然后，将腺嘌呤/Au(III)复合物与富T DNA长链杂交吸附，成功制备传感器。随后利用循环伏安法检测传感器对不同浓度TdT或ALP的电化学响应。显然，在浓度一定范围内，目标物浓度越大，电流响应越明显。实验结果表明，电流的大小与目标物的浓度在一定范围内呈线性关系，实现对目标物的检测。其优点在于：
(1)高灵敏度。本发明实验得出传感器的电流响应对TdT浓度的线性相关方程为 y＝-30.47x-42.73，R2＝0.9923，检测限为0.01U/mL，由此说明传感器对TdT可实现高灵敏度检测；传感器的电流响应对ALP浓度线性相关方程为y＝-15.40x-52.80，R2＝0.9918，检测限为0.003U/L，说明传感器对ALP活性实现高灵敏度检测。
(2)高特异性。其他常见的蛋白质或酶如溶菌酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶对TdT活性检测体系均无干扰；其他常见的蛋白质或酶如乙酰胆碱酯酶、凝血酶、牛血清白蛋白、辣根过氧化物酶或溶菌酶对ALP活性检测体系均无干扰。
(3)结果准确。回收率均在90％～110％之间。
(4)制备与检测方法试剂用量少、检测速度快、成本低。本发明只需消耗少量材料和试剂就可实现对TdT或ALP的高灵敏检测。
综上所述，本发明是基于具有电催化活性的腺嘌呤/Au(III)复合物及其与富TDNA 长链的特异性杂交吸附作用，用于对TdT或ALP活性检测，具有灵敏度高、选择性好、操作简单、分析快速、易于操作等优点，可以实现低浓度TdT或ALP的检测及其抑制剂的筛选，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明传感器的可行性实验图；
图2为本发明传感器的腺嘌呤/Au(III)复合物电催化性能验证实验图；
图3为本发明传感器对不同浓度TdT的电流响应对浓度的校准曲线图；
图4为不同浓度的PP对TdT的抑制作用；
图5为本发明传感器对不同浓度ALP的电流响应对浓度的校准曲线图；
图6为不同浓度的Na3VO4对ALP的抑制作用。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
一、具体实施例
具体实施例1
基于腺嘌呤/Au(III)复合物的多功能电化学传感器的构建方法及应用，具体步骤如下：
(1)腺嘌呤/Au(III)聚合物的制备
依次取100μL浓度为50mM的腺嘌呤水溶液，100μL浓度为50mM HAuCl4水溶液，加蒸馏水配成0.8mL的溶液，将溶液剧烈振荡，在磁力搅拌下将混合物在敞口烧杯中孵育6小时，通过离心并用水洗涤以除去剩余的化学物质，标记为腺嘌呤/Au(III)。
(2)传感器的制备
a.金电极预处理
金电极的表面按照以下顺序逐步预处理：在piranha溶液(30％H2O2：浓H2SO4，3：7)中加热5分钟去除任何先前的有机层，用氧化铝浆(0.3和0.05μm)，得到镜面状的金电极表面，用超纯水超声波洗涤，氮气干燥，在0.1M H2SO4水溶液中循环伏安扫描，保持电压为-0.3～+1.5V，时间10分钟。最后，将处理好的Au电极用水洗涤并在氮气流下干燥。
b.传感器的制备
将处理后的Au电极浸入含有1μM捕获探针(3’-OH末端的DNA)的缓冲液中室温孵育16小时。接着，将修饰电极浸在1.0mM MCH中30分钟，除去吸附在Au电极表面上的非特异性DNA，记为电极1。然后，将10μL含有0.5mM dTTP，60U/mL TdT 和将2μL TdT缓冲液滴加到修饰电极表面，37℃孵育2小时，实现扩增获得富T DNA 长链，标记为电极2。最后，将10μL腺嘌呤/Au(III)复合物溶液置于上述电极上30分钟实现腺嘌呤/Au(III)复合物与富T DNA长链之间的杂交吸附，获得电极3。在上述每一步之后，这些修饰电极用超纯水彻底冲洗，并在电化学表征之前置于氮气流下干燥。
(3)检测TdT活性
a.TdT活性检测
将含有0.5mM dTTP，不同终浓度的TdT(0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.8，1，1.5， 3，5，10，20，40，60，80，100，120，140和160U/mL)和2μL的TdT缓冲液的10 μL反应混合物添加到电极1的表面，电极2和电极3的制备步骤同(2)。最后，在含有5mM H2O2的PBS(0.1M，pH 7.4)中进行循环伏安测量。
b.TdT抑制剂检测
对于抑制剂检测，将TdT(最终浓度为60U/mL)与一系列不同的终浓度(0，0.005，0.01，0.02，0.04，0.08，0.12，0.25，0.5，1，1.5，2，2.5，3，4，6，8，10mM)的焦磷酸钠(PP)，37℃孵育5分钟。其他反应条件和后续步骤与TdT活性检测步骤相同。
(4)检测ALP活性
a.ALP活性检测
按照以下步骤进行基于腺嘌呤/Au(III)复合物的ALP的电化学检测。通过将预处理的Au电极浸入含有1μM捕获探针(3’-PO3末端的DNA)的固定缓冲液中16小时，然后将含有不同终浓度(0，0.01，0.02，0.05，0.08，0.1，0.5，1，5，10，20，30，50， 100，150，200U/L)的ALP、0.1M MgSO4的总体积为10μL的Tris-HCl缓冲溶液(10 mM，pH 9.0)滴至电极表面，37℃孵育50分钟，用于制备电极1，其它的操作步骤如 TdT活性检测步骤。
b.ALP抑制剂检测
为了研究我们建立的用于ALP抑制剂评估的电化学方法的应用，将不同终浓度(0，20，40，80，100，150，200，400，600，800，1000，1300，1500，2000μM)的Na3VO4水溶液溶液在37℃下加入到ALP反应溶液(含有10U/LALP和0.1μM MgSO4)中，然后将该反应液滴至电极表面孵育20～60分钟，其它的操作步骤如ALP活性检测步骤。
具体实施例2
基于腺嘌呤/Au(III)复合物的多功能电化学传感器的构建方法及应用，具体步骤如下：
(1)腺嘌呤/Au(III)聚合物的制备
依次取50μL浓度为25mM的腺嘌呤水溶液，50μL浓度为25mM HAuCl4水溶液，加蒸馏水配成0.9mL的溶液，将溶液剧烈振荡，在磁力搅拌下将混合物在敞口烧杯中孵育9小时，通过离心并用水洗涤以除去剩余的化学物质，标记为腺嘌呤/Au(III)。
(2)传感器的制备
a.金电极预处理
金电极表面按照以下顺序逐步预处理：在piranha溶液(30％H2O2：浓H2SO4，3： 7)中加热5分钟去除任何先前的有机层，用氧化铝浆(0.3和0.05μm)，得到镜面状的金电极表面，用超纯水超声波洗涤，氮气干燥，在0.1M H2SO4水溶液中循环伏安扫描，保持电压为-0.3～+1.5V，时间15分钟。最后，将处理好的Au电极用水洗涤并在氮气流下干燥。
b.传感器的制备
将处理后的Au电极浸入含有1.5μM捕获探针(3’-OH末端的DNA)的缓冲液中室温孵育20小时。接着，将修饰电极浸渍在1.5mM MCH中40分钟，除去吸附在Au 电极表面上的非特异性DNA，记为电极1。然后，将5μL含有0.25mM dTTP，60U/mL TdT和1μL TdT缓冲液滴加到修饰电极表面，37℃孵育1.5小时，实现扩增获得富T DNA长链，标记为电极2。最后，将15μL腺嘌呤/Au(III)复合物溶液置于上述电极上 60分钟实现腺嘌呤/Au(III)复合物与富T DNA长链之间的杂交吸附，获得电极3。在上述每一步之后，这些修饰电极用超纯水彻底冲洗，并在电化学表征之前置于氮气流下干燥。
(3)检测TdT活性
a.TdT活性检测
将含有0.5mM dTTP，不同终浓度的TdT(0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.8，1，1.5， 3，5，10，20，40，60，80，100，120，140，160，180和200U/mL)和1μL的TdT 缓冲液的10μL反应混合物添加到电极1的表面，电极2和电极3的制备步骤同(2)。最后，在含有5mM H2O2的PBS(0.1M，pH7.4)中进行循环伏安测量。
b.TdT抑制剂检测
对于抑制剂检测，将TdT(最终浓度为60U/mL)与一系列不同的终浓度(0，0.005，0.01，0.02，0.04，0.08，0.12，0.25，0.5，1，1.5，2，2.5，3，4，6，8，10，12mM) 的焦磷酸钠(PP)，37℃孵育10分钟。其他反应条件和后续步骤与TdT活性检测步骤相同。
(4)检测ALP活性
a.ALP活性检测
按照以下步骤进行基于腺嘌呤/Au(III)复合物的ALP的电化学检测。通过将预处理的Au电极浸入含有0.5μM捕获探针(3’-PO3末端的DNA)的固定缓冲液中12小时，然后将含有不同终浓度(0，0.01，0.02，0.05，0.08，0.1，0.5，1，5，10，20，30，50， 100，150，200，240U/L)的ALP、0.1M MgSO4的总体积为2.5～10μL的Tris-HCl缓冲溶液(10mM，pH 9.0)滴至电极表面，37℃孵育60分钟，用于制备电极1，其它的操作步骤如TdT活性检测步骤。
b.ALP抑制剂检测
为了研究我们建立的用于ALP抑制剂评估的电化学方法的应用，将不同终浓度(0，20，40，80，100，150，200，400，600，800，1000，1300，1500，2000，2400μM) 的Na3VO4水溶液溶液在37℃下加入到ALP反应溶液(含有10U/L ALP和0.1μM MgSO4)中，然后将该反应液滴至电极表面孵育60分钟，其它的操作步骤如ALP活性检测步骤。
具体实施例3
基于腺嘌呤/Au(III)复合物的多功能电化学传感器的构建方法及应用，具体步骤如下：
(1)腺嘌呤/Au(III)聚合物的制备
依次取10μL浓度为15mM的腺嘌呤水溶液，10μL浓度为15mM HAuCl4水溶液，加蒸馏水配成0.98mL的溶液，将溶液剧烈振荡，在磁力搅拌下将混合物在敞口烧杯中孵育3小时，通过离心并用水洗涤以除去剩余的化学物质，标记为腺嘌呤/Au(III)。
(2)传感器的制备
a.金电极预处理
金电极表面按照以下顺序逐步预处理：在piranha溶液(30％H2O2：浓H2SO4，3： 7)中加热3～10分钟去除任何先前的有机层，用氧化铝浆(0.3和0.05μm)，得到镜面状的金电极表面，用超纯水超声波洗涤，氮气干燥，在0.1M H2SO4水溶液中循环伏安扫描，保持电压为-0.3～+1.5V，时间5分钟。最后，将处理好的Au电极用水洗涤并在氮气流下干燥。
b.传感器的制备
将处理后的Au电极浸入含有0.5μM捕获探针(3’-OH末端的DNA)的缓冲液中室温孵育12小时。接着，将修饰电极浸渍在0.5mM MCH中20分钟，除去吸附在金表面上的非特异性DNA，记为电极1。然后，将2.5μL含有0.05mM dTTP，60U/mL TdT 和1μL TdT缓冲液滴加到修饰电极表面，37℃孵育1小时，实现扩增获得富T DNA 长链，标记为电极2。最后，将5μL腺嘌呤/Au(III)复合物溶液置于上述电极上10分钟实现腺嘌呤/Au(III)复合物与富T DNA长链之间的杂交吸附，获得电极3。在上述每一步之后，这些修饰电极用超纯水彻底冲洗，并在电化学表征之前置于氮气流下干燥。
(3)检测TdT活性
a.TdT活性检测
将含有0.25mM dTTP，不同终浓度的TdT(0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.8，1，1.5， 3，5，10，20，40，60，80，100，120，140，160，180和200U/mL)和1μL的TdT 缓冲液的10μL反应混合物添加到电极1的表面，电极2和电极3的制备步骤同(2)。最后，在含有5mM H2O2的PBS(0.1M，pH7.4)中进行循环伏安测量。
b.TdT抑制剂检测
对于抑制剂检测，将TdT(最终浓度为60U/mL)与一系列不同的终浓度(0，0.005，0.01，0.02，0.04，0.08，0.12，0.25，0.5，1，1.5，2，2.5，3，4，6，8mM)的焦磷酸钠(PP)，37℃孵育3分钟。其他反应条件和后续步骤与TdT活性检测步骤相同
(4)检测ALP活性
a.ALP活性检测
按照以下步骤进行基于腺嘌呤/Au(III)复合物的ALP的电化学检测。通过将预处理的Au电极浸入含有0.1μM捕获探针(3’-PO3末端的DNA)的固定缓冲液中6小时，然后将含有不同终浓度(0，0.01，0.02，0.05，0.08，0.1，0.5，1，5，10，20，30，50， 100U/L)的ALP、0.1MMgSO4的总体积为2.5～10μL的Tris-HCl缓冲溶液(10mM， pH 9.0)滴至电极表面，37℃孵育20分钟，用于制备电极1，其它的操作步骤如TdT 活性检测步骤。
b.ALP抑制剂检测
为了研究我们建立的用于ALP抑制剂评估的电化学方法的应用，将不同终浓度(0，20，40，80，100，150，200，400，600，800，1000μM)的Na3VO4水溶液溶液在37℃下加入到ALP反应溶液(含有10U/LALP和0.1μM MgSO4)中，然后将该反应液滴至电极表面孵育20分钟，其它的操作步骤如ALP活性检测步骤。
二、应用实施例
基于腺嘌呤/Au(III)复合物的多功能电化学传感器的构建方法及应用
应用实施例1
可行性实验
基于腺嘌呤/Au(III)复合物的多功能电化学传感器的构建方法及应用，制备4种修饰电极，处理后的金电极记为裸电极，电极1、电极2、电极3的制备步骤同具体实施例1，记录该4种电极在含有5mM H2O2的PBS(0.1M，pH 7.4)溶液中测量所得的循环伏安图。结果如图1所示，裸电极、电极1和电极2对含有5mM H2O2的PBS(0.1M， pH 7.4)溶液基本无电化学响应，而电极3对含有5mM H2O2的PBS(0.1M，pH 7.4) 溶液的电化学响应较明显，证明该传感器制备成功及其检测策略是可行的。
应用实施例2
基于腺嘌呤/Au(III)复合物的多功能电化学传感器的构建方法及应用，电极2的制备步骤同具体实施例1，在3支电极2上分别修饰腺嘌呤、HAuCl4和腺嘌呤/Au(III)复合物，修饰电极分别记为腺嘌呤、Au(III)和腺嘌呤/Au(III)。结果如图2所示，腺嘌呤和 Au(III)修饰电极对含有5mM H2O2的PBS(0.1M，pH 7.4)溶液基本无电化学响应，腺嘌呤/Au(III)复合物修饰电极对含有5mM H2O2的PBS(0.1M，pH 7.4)溶液的电化学响应较明显，证明该信号输出是因为腺嘌呤/Au(III)复合物对H2O2具有良好的电催化性能，而不是单一的腺嘌呤或Au(III)的作用。
应用实施例3
1、TdT活性检测
基于腺嘌呤/Au(III)复合物的多功能电化学传感器的构建方法及应用，对TdT活性的检测步骤同具体实施例1。根据实验结果，获得一系列不同浓度的TdT对应的H2O2还原峰电流大小，建立电流响应与TdT浓度之间的定量关系，根据两者之间的定量关系，确定待测样品中TdT的浓度。TdT检测终浓度范围为0～160U/mL。实验结果如图3所示，说明随着TdT浓度增大，传感器的电化学响应越明显，线性相关方程为 y＝-30.47x-42.73，R2＝0.9923，线性范围为0.05～160U/L，检测限为0.01U/mL，说明传感器对TdT活性可实现高灵敏度检测。
2、TdT抑制剂焦磷酸钠(PP)的检测
基于腺嘌呤/Au(III)复合物的多功能电化学传感器的构建方法及应用，对TdT抑制剂的检测步骤同具体实施例1。根据实验结果得知(如图4)，随着抑制剂PP浓度的增大，相对应的电流响应越弱，说明PP对TdT活性的抑制作用越强。另外，根据实验现象得知，即使PP浓度较小时，相对应的电流值变化也很明显；但是随着PP浓度增大，相对应的电流值变化不太明显，说明小浓度的PP就可以抑制TdT的活性，抑制作用效果好，PP抑制剂的半抑制浓度为1.1±0.15mM。
应用实施例4
1、ALP活性检测
基于腺嘌呤/Au(III)复合物的多功能电化学传感器的构建方法及应用，对ALP酶活性的检测步骤同具体实施例1。根据实验结果，获得一系列不同浓度的ALP对应的H2O2还原峰电流大小，建立电流响应与ALP浓度之间的定量关系，根据两者之间的定量关系，确定待测样品中ALP的浓度。ALP检测终浓度范围为0～200U/mL。实验结果如图5所示，说明随着ALP浓度增大，传感器的电化学响应越明显，线性相关方程为y＝-15.40x-52.80， R2＝0.9918，R2＝0.9923，线性范围为0.01～200U/L，检测限为0.003U/L，说明传感器对 ALP活性可实现高灵敏度检测。
2、ALP抑制剂Na3VO4的检测
基于腺嘌呤/Au(III)复合物的多功能电化学传感器的构建方法及应用，对ALP酶抑制剂的检测步骤同具体实施例1。根据实验结果得知(如图6)，随着抑制剂Na3VO4浓度的增大，相对应的电流响应越弱，说明Na3VO4对ALP活性的抑制作用越强。另外，根据实验现象得知，即使Na3VO4浓度较小时，相对应的电流值变化也很明显；但是随着Na3VO4浓度增大，相对应的电流值变化不太明显，说明小浓度的Na3VO4就可以抑制ALP的活性，抑制作用效果好，PP抑制剂的半抑制浓度为200±12μM。
当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明保护范围。

Claims (7)

1.基于腺嘌呤/Au(III)复合物的多功能电化学传感器的构建方法及应用，其特征在于该电化学生物传感器通过以下方法构建的：
首先，利用腺嘌呤和HAuCl4水溶液合成腺嘌呤/Au(III)复合物；其次，预处理金电极，在piranha溶液(30％H2O2∶浓H2SO4，3∶7)中加热3～10分钟以去除任何先前的有机层，用氧化铝浆(0.3和0.05μm)，得到镜面状的样品，用超纯水超声波洗涤，氮气干燥，在0.1M H2SO4水溶液中循环伏安扫描，保持电压为-0.3～+1.5V，时间5～15分钟，最后，将电极用水洗涤并在氮气流下干燥；再次，在金电极上修饰捕获探针(捕获DNA)，记为电极1；然后，将dTTP，TdT和TdT缓冲液滴加到修饰电极表面，实现扩增得到富T DNA长链，标记为电极2；最后，将合成的腺嘌呤/Au(III)复合物溶液滴至电极2上，通过氢键作用和碱基互补配对作用与TdT延长的富T DNA长链进行杂交吸附，获得电极3，即为所需电化学生物传感器。
2.如权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征是，电化学信号输出的具体检验方法：将裸电极、电极1、电极2、电极3分别置于5mM H2O2的PBS(0.1M，pH 7.4)中测量，通过循环伏安检测方法测试这些修饰电极对于过氧化氢的电催化还原；同时制备腺嘌呤、金离子、腺嘌呤/Au(III)复合物修饰电极，分别置于5mM H2O2的PBS(0.1M，pH 7.4)中测量，通过循环伏安检测方法测试这些修饰电极对于过氧化氢的电催化还原。
3.如权利要求1～2所述的电化学生物传感器，其特征是，TdT活性检测的具体方法是：将含有0.05～0.5mM dTTP，不同终浓度的TdT(0～200U/mL)和0.2～2μL的TdT缓冲液的2.5～10μL反应混合物添加到电极1的表面，电极2和电极3的制备步骤同权利要求1。最后，在含有5mM H2O2的PBS(0.1M，pH 7.4)中测量所得溶液的循环伏安图。通过改变TdT浓度，得到不同的电化学信号，实现TdT活性的定量检测。
4.如权利要求1～3所述的电化学生物传感器，其特征是，TdT抑制剂检测的具体方法是：对于抑制剂检测，将TdT(固定最终浓度为60U/mL)与一系列不同的终浓度(0～12mM)的焦磷酸钠(PP)，37℃孵育3～10分钟。其他反应条件和后续步骤与TdT活性检测的相同。通过改变PP浓度，得到不同的电化学信号，实现小分子抑制剂的筛选。
5.如权利要求1～2所述的电化学生物传感器，ALP电化学传感器的制备方法及其活性检测的具体方法是：通过将电极浸入含有0.1～1μM捕获探针(3’-PO3末端的DNA)的固定缓冲液中6～16小时，然后将含有不同终浓度(0～240U/L)的ALP、0.1M MgSO4的总体积为2.5～10μL的Tris-HCl缓冲溶液(10mM，pH 9.0)滴至电极表面，37℃孵育20～60分钟，用于制备电极1，电极2和电极3的制备步骤如权利要求1，电化学方法的实施如权利要求2。通过改变ALP的浓度，电化学信号响应发生改变，实现ALP活性的定量检测。
6.如权利要求5所述的电化学生物传感器，其特征是，ALP抑制剂评估的电化学方法是：将不同终浓度(0～2400μM)的Na3VO4水溶液溶液在37℃下加入到ALP反应溶液(含有10U/LALP和0.1μM MgSO4)中，然后将该反应液滴至电极表面孵育20～60分钟，其它的操作步骤如权利要求5。
7.根据权利要求1～6所述的基于腺嘌呤/Au(III)复合物的多功能电化学传感器的构建方法及应用，其特征在于：利用腺嘌呤/Au(III)复合物的电催化活性以及腺嘌呤/Au(III)复合物与富T DNA长链的特异性杂交吸附作用，采用循环伏安法，设置电位范围为-1.0～0V，检测传感器在含有5mM H2O2的PBS(0.1M，pH 7.4)中测量所得溶液的电化学响应，根据电流响应的大小确定与DNA相关酶活性及其抑制剂的关系。
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Assignee: Shunkang Energy (Zhejiang) Co.,Ltd.

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Denomination of invention: Construction and application of multifunctional electrochemical sensor based on adenine/Au (III) complex

Granted publication date: 20200811

License type: Common License

Record date: 20221209

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