CN101480407A - 透明质酸酶抑制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用单宁酸制备1，2，3，4，6－五－O－没食子酰基－β－D－葡萄糖(PGG)的新方法及其新用途。单宁酸经酸水解制得PGG粗品；再经大孔吸附树脂和葡聚糖凝胶柱层析分离纯化得PGG，纯度＞90％。该方法所得PGG色泽好，纯度高，制备过程简单安全易行，成本较低，生产周期短，易于批量制备和工业化生产。活性评价表明PGG对透明质酸酶活性的抑制作用(IC50 0.01mM)显著强于阳性对照色甘酸钠(IC50 6.99mM)，可以直接用作药剂，保健食品及化妆品的原料或其添加剂。
Description
技术领域：
本发明涉及化学领域，具体地，涉及以1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖为活性成分的透明质酸酶抑制剂或化妆品或保健品或药品，及其制备方法和其在制备透明质酸酶抑制剂或化妆品或保健品或药品中的应用。
背景技术：
1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖(1，2，3，4，6-penta-O-galloyl-β-D-glucose，PGG)为水解单宁，由葡萄糖与5个没食子酸通过酯键相连形成的没食子酸单宁。药理研究表明，该化合物具有多方面的生理活性，如抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、拮抗内毒素/脂多糖、降糖祛脂等。但是，迄今为止没有关于对透明质酸酶抑制作用的报道。
透明质酸酶是透明质酸的特异性裂解酶，而透明质酸广泛地存在于动物的各种组织中，在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节、调节蛋白质的运转、促进创伤愈合等。更为重要的是，它具有良好的保湿作用，在保湿的同时，又是良好的透皮吸收促进剂。含透明质酸的化妆品目前在国际上被公认为“仿生化妆品”、“第四代化妆品”。透明质酸酶是I型过敏反应和肿瘤细胞增殖的参与者，它与炎症、过敏有强相关性。因此，抑制透明质酸酶的活性，既能使透明质酸不被分解以维持其正常的生理功能，又能达到抗炎、抗过敏、抗肿瘤的功效。另外，在含有透明质酸的制剂(特别地，如美容增强剂和组织填充剂)中加入透明质酸酶抑制剂，能够增强制剂作用的持久性，避免规律性地重复给药。所以，透明质酸酶抑制剂的开发在制药、保键品、化妆品行业具有重要意义。可以作为防止和改善炎症的药品或保键品。亦可作为抗过敏和抗炎的化妆品。此外，可作为含有透明质酸制剂的添加剂，增强制剂的稳定性、持久性和活性。
目前，已报道的透明质酸酶抑制剂根据其化学结构可分为蛋白质类、葡糖氨基聚糖类、多糖类、生物碱、萜类等。它们主要提取自蛇毒、动植物器官、微生物或经人工合成制得。但是，大批量制备所需成本较高。迄今，没有1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖(PGG)对透明质酸酶活性的抑制作用的报道；目前，PGG主要从植物提取物中分离纯化，但此方法因为PGG为水溶性好的水解单宁，存在极性大，分离纯化过程繁琐，得率低等问题，迄今没有以单宁酸为原料，工业化批量生产PGG的制备工艺。
发明内容：
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的在于提供一种以1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖(PGG)为活性成分的透明质酸酶抑制剂，提供一种成本低、得率高、纯度高、制备过程简单安全易行、生产周期短，易于批量制备和工业化生产1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖(PGG)的制备方法及其作为透明质酸酶抑制剂的用途。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
透明质酸酶抑制剂，含有1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖。
所述的1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖即PGG的制备方法，是以将单宁酸溶于含有pH＝6的HAc-NaAc缓冲溶液的90％的甲醇或乙醇溶液中，50℃水浴中密闭水解12小时，在48℃下减压蒸干，溶于甲醇或乙醇后经葡聚糖凝胶柱洗脱得PGG粗品；再经大孔吸附树脂分离纯化，用水、10％、20％、30％、40％甲醇或乙醇水溶液梯度洗脱，收集洗脱液，浓缩、干燥即可。
所述的原料为单宁酸，包括但不限于工业单宁酸，单宁酸，含单宁酸的提取物。
单宁酸质量(g)，HAc-NaAc缓冲溶液(mL)和甲醇或乙醇(mL)的比例为1∶1.5∶13.5。
用于检测和指导柱层析分离的薄层层析法是以7∶3∶0.5的氯仿-甲醇-水为展开剂，FeCl3乙醇液为显色剂。
柱层析分离用的葡聚糖凝胶柱填充剂为葡聚糖凝胶，包括但不限于Sephadex G，Sephadex C-50，Sephadex LH-20；大孔吸附树脂填充剂为聚苯乙烯型的大孔吸附树脂，包括但不限于SEPABEADS SP825(SP850，SP70，SP207，SP700)、MCI gel CHP20P(75-150m)、Diaion HP20(HP20SS)、XAD-2、XAD-4、D-101、KB-8。
1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖在制备透明质酸酶抑制剂中的应用。
1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖在制备药物中的应用。
1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖在制备化妆品中的应用。
1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖在制备保健品中的应用。
通过本发明的活性评价试验结果表明，1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖(PGG)对透明质酸酶活性的抑制作用(IC50 0.01mM)显著强于阳性对照色甘酸钠(IC50 6.99mM)，可作为一个很好的透明质酸酶抑制剂，添加入含有透明质酸的制剂中，增强药品、化妆品或保健品的稳定性、持久性和活性。此外，可用于制备抗过敏和抗炎的化妆品，或防止和改善炎症的药品或保键品。
与现有技术相比，本发明的方法具有下述的优点：
1.本发明是工业单宁酸，单宁酸或含单宁酸提取物中的任何一种为原料制备1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖。
2.本发明用含水低级醇(可以是甲醇或乙醇)为溶剂，用HAc-NaAc缓冲溶液水解制备1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖，得率高，成本低。
3.本发明水解溶液为弱酸，温度为50℃，无有机溶剂的残留，安全，简单易行、成本低。
4.本发明使用的柱层析填充剂为聚苯乙烯型大孔吸附树脂和葡聚糖凝胶，填充剂材料可以重复使用。
5.本发明采用术层析的方法纯化1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖，不仅产品形状好、纯度高、无溶剂残留，而且简单易行、成本低。
6.本发明提供了1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖作为透明质酸酶抑制剂的新用途。
具体实施方式：
下面以本发明的试验例和实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。
试验例1：
取任何一种单宁酸或含单宁酸的提取物，溶于含有HAc-NaAc缓冲溶液(PH＝6)的低级醇-水溶液中，50℃水浴中密闭水解12小时。水解液应在48℃下减压蒸干后再溶于低级醇，经葡聚糖凝胶柱层析分离，用含水低级醇(乙醇或甲醇)洗脱，收集富含1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖(PGG)的洗脱液，浓缩干燥，得1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖(PGG)粗品。将1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖(PGG)粗品溶于低级醇，经大孔树脂柱层析分离，用水、10％、20％、30％、40％低级醇水溶液梯度洗脱，得1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖(PGG)纯品，收率高，纯度大于90％，无有机溶剂的残留，可直接用作为制药，保健品及化妆品的原料或其添加剂。
原料为：工业单宁酸，单宁酸或含单宁酸的提取物，如：五倍子提取物，洋甘菊提取物，绿茶提取物，赤芍总苷，塔拉果荚提取物，葡萄汁提取物、石榴提取物、漆树叶提取物、黄栌提取物、金缕梅树提取物等。
用正交实验从水解时间、低级醇浓度、温度、以及投料比四个因素，设定L9(34)正交实验表(表1)，考察水解1，2，3，4，6-五-O--没食子酰基-β-D-葡萄糖的最佳条件，应为将原料溶于含有HAc-NaAc缓冲溶液(PH＝6)的90％低级醇-水溶液中，50℃水浴中密闭水解12小时。单宁酸质量(g)，HAc-NaAc缓冲溶液(mL)和低级醇(主要指甲醇或乙醇)(mL)的比例为1:1.5:13.5。
表1 单宁酸水解因素水平表
| 水平 | 因素因素 | 因素 | 因素 | 因素 |
| A水解时间(h) | B甲醇浓度 | C温度(℃) | D料液比(m/v) | |
| 1 | 12 | 30 | 室温 | 1:5 |
| 2 | 24 | 60 | 37 | 1:10 |
| 3 | 36 | 90 | 50 | 1:15 |
应用高压液相色谱法进行(HPLC)测定水解液中PGG的含量(表2)。
表2 高压液相色谱法(HPLC)测定水解液中PGG的含量结果
用于柱层析分离用的葡聚糖凝胶柱填充剂为葡聚糖凝胶的树脂。使用Sephadex G，Sephadex C-50，Sephadex LH-20等。41×6.4cm的柱材料载样约100g单宁酸。
用于葡聚糖凝胶柱柱层析分离的洗脱溶液可以是含水低级醇(乙醇或甲醇)。
用于柱层析分离的大孔吸附树脂为聚苯乙烯型大孔吸附树脂：SEPABEADS SP825(SP850，SP70，SP207，SP700)，MCI gel CHP20P(75-150m)，Diaion HP20(HP20SS)，XAD-2，XAD-4，D-101，KB-8等。35×3.6cm的MCI-gel CHP 20P柱载样约20g PGG粗品。
用于大孔吸附树脂柱层析分离的洗脱溶液是含水低级醇(乙醇或甲醇)。
PGG的干燥方法可用加热干燥、冷冻干燥、喷雾干燥或微波干燥。
上述制备工艺操作简单可行，产品收率高，纯度大于90％，无有机溶剂的残留。
活性测定表明，1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖对透明质酸酶活性的抑制作用(IC50 0.01mM)显著强于阳性对照色甘酸钠(IC50 6.99mM)，可直接用作为制药，保健食品及化妆品的原料或其添加剂。
实施例1：
本发明制备1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖及其活性测定的具体步骤如下：
(1)将单宁酸溶于含有HAc-NaAc缓冲溶液(PH＝6)的甲醇-水溶液中，50℃水浴中密闭水解12小时。
(2)上述水解液48℃下减压蒸干溶于甲醇后缓缓倾入葡聚糖凝胶柱(如：Sephadex LH-20等)层析柱的上端。41×6.4cm的柱材料载样约100g单宁酸。利用甲醇洗脱，洗脱流速控制在2mL/min左右。收集富含得1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖的洗脱液，浓缩，干燥，得PGG粗品，HPLC检测其纯度大于85％。
(3)将上述1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖粗品溶于小体积水溶液后缓缓倾入大孔吸附树脂(如：DiaionHP20，D-101，KB-8等)层析柱的上端。先用水、10％、20％、30％、40％甲醇水溶液梯度洗脱，每个梯度的洗脱液用量约1-1.2倍柱体积，收集富含1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖的洗脱液，浓缩，干燥，得1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖纯品。35×3.6cm的MCI-gel CHP 20P柱载样约20g PGG粗品。
(4)1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖纯品的干燥，可用加热干燥、冷冻干燥、喷雾干燥或微波干燥等。
(5)1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖的高压液相色谱(HPLC)定量分析按以下的方法进行：
仪器与试剂：岛津10AD高效液相色谱仪，高压二元泵，SPD-10Avp二极管阵列检测器，CLASS-LC10工作站，色谱纯乙腈，超纯水。
色谱条件及检测波长的选择：固定相为安杰伦Zorbax SB-C18(4.6×250mm，5μm)色谱柱，流动相为乙腈-0.34％磷酸水梯度洗脱(0-45min，4％-40％乙腈)，流速1mL/min，柱温30℃，检测波长280nm。
含量测定：由上述工艺制备的1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖的含量>90％。
(6)1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖对透明质酸酶抑制活性测定按以下方法进行：
仪器与试剂：Emax酶标仪测定，软件为SOFT max PRO。透明质酸，分析纯透明质酸酶，分析纯磷酸盐，分析纯西吡氯铵。
条件及检测波长：待测样品、透明质酸以及透明质酸酶分别溶于0.1M PH＝5.3的磷酸盐缓冲液中，使酶的终浓度分为60U/mL。将50μL待测样品液与50μL透明质酸酶加入Eppendorf管中，37℃条件下培养20min，然后加入100μL透明质酸，震摇30min后在100℃水浴中加热5min。冷却之后，移取160μL反应液至96孔板中，再向96孔板中加入100μL 1％(w/v)的西吡氯铵水溶液，室温震摇30min，在595nm波长下测吸光度。并计算IC50值。
透明质酸酶的抑制率＝(A-B)/A×100％
A：空白对照溶液吸光值
B：待测样品溶液吸光值
活性测定：1，2，3，4，6-五-O--没食子酰基-β-D-葡萄糖(PGG)：IC50＝0.01mM
阳性对照色甘酸钠(DSCG)：IC50＝6.99mM
经过上述工艺制备得到的1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖，收率高，产品的纯度大于90％，无有机溶剂的残留，对透明质酸酶活性的抑制作用(IC50 0.01mM)显著强于阳性对照色甘酸钠(IC506.99mM)，可直接作为制药，保健食品或化妆品的原料或其添加剂。
按照上述步骤和方法，具体地例子如下：
(1)称取2.7g单宁酸置100mL锥形瓶中，加入3mL PH＝6.0的HAc-NaAc缓冲溶液、27mL甲醇，配制成溶液。37℃水浴中密闭反应24h(隔数小时震摇一次)。
(2)上述水解液48℃下减压蒸干溶于小体积甲醇后缓缓倾入葡聚糖凝胶柱(Sephadex LH-20)层析柱的上端。利用甲醇洗脱，洗脱流速控制在2mL/min左右。收集富含1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖的洗脱液，浓缩，干燥，得PGG粗品，HPLC检测其纯度大于85％。
(3)将上述1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖粗品溶于小体积水溶液后缓缓倾入大孔吸附树脂(如：DiaionHP20，D-101，KB-8等)层析柱的上端。先用水、10％、20％、30％、40％甲醇水溶液梯度洗脱，收集富含1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖的洗脱液，浓缩，干燥，得1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖纯品260mg，得率9.6％。
(4)冷冻干燥1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖的纯品。
(5)按1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖的高压液相色谱(HPLC)定量分析方法进行含量测定：纯度90.6％。
(6)按1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖对透明质酸酶抑制活性测定方法进行活性测定：IC50＝0.01mM，阳性对照品色甘酸钠IC50＝6.99mM。
实施例2：
(1)称取工业单宁酸90g，与135mL pH＝6.0的HAc-NaAc缓冲溶液、1.2L甲醇配制成溶液，在50℃水浴中密闭水解12h。
(2)述水解液48℃下减压蒸干溶于小体积甲醇后缓缓倾入葡聚糖凝胶柱(Sephadex LH-20)层析柱的上端。利用甲醇洗脱，洗脱流速控制在2mL/min左右。收集富含得1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖的洗脱液，浓缩，干燥，得PGG粗品，HPLC检测其纯度大于85％。
(3)将上述1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖粗品溶于小体积水溶液后缓缓倾入大孔吸附树脂(如：Diaion HP20，D-101，KB-8等)层析柱的上端。先用水、10％、20％、30％、40％甲醇水溶液梯度洗脱，收集富含1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖的洗脱液，浓缩，干燥，得1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖纯品11.6g，得率12.8％。
(4)冷冻干燥1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖的纯品。
(5)按1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖的高压液相色谱(HPLC)定量分析方法进行含量测定：纯度93.0％。
(6)按1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖对透明质酸酶抑制活性测定方法进行活性测定：IC50＝0.01mM，阳性对照品色甘酸钠IC50＝6.99mM。
实施例3：
片剂：实施例2所得化合物1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖10mg，乳糖180mg，淀粉55mg，硬脂酸镁5mg；
制备方法：将化合物、乳糖和淀粉混合，用水均匀湿润，把湿润后的混合物过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片，每片重250mg，化合物含量为10mg。
实施例4：
安瓿剂：实施例2所得化合物1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖2mg，氯化钠10mg；
制备方法：将化合物和氯化钠溶解于适量的注射用水中，过滤所得溶液，在无菌条件下装入安瓿瓶中。
实施例5：
胶囊剂：实施例2所得化合物1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖10mg，乳糖187mg，硬脂酸镁3mg；
制备方法：将化合物与助剂混合，过筛，均匀混合，把得到的混合物装入硬明胶胶囊，每个胶囊重200mg，活性成分含量为10mg。
实施例6：
含有化合物1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖的美白霜配方(W％)：
1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖 0.05
硬脂酸 8.0
C16醇 2.0
自乳化单甘酯 2.0
氢化羊毛脂 2.0
液体石蜡 12.0
甘油 7.0
乳化剂 1.5
防腐剂 0.2
香精 0.2
去离子水 加至100
按常规制作化妆品的方法制得本发明上述配方的化妆品。
实施例7：含有化合物1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖的乳剂配方(W％)：
1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖 0.05
硬脂酸 1.4
鲸蜡醇 0.1
2-乙基醇鲸蜡基硬脂酸酯 1.8
肉豆蔻酸异丙酯 0.2
2-己基-1-癸醇 1.0
液体石蜡 7.5
甘油 3.0
丙二醇 8.0
三乙醇胺 1.0
羧乙烯基聚合物 0.35
Arlacel 165 2.0
防腐剂 0.2
香精 0.2
去离子水 加至100
按常规制作化妆品的方法制得本发明上述配方的化妆品。
实施例8：
含有的1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖的乳酸菌饮料配方(W％)：
1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖 0.05
发酵乳 15
果糖葡萄糖液精 13
柠檬酸 0.08
果胶 0.5
香精 0.2
去离子水 加至100
按常规制作食品的方法制得本发明的上述饮料。
Claims (10)
1、透明质酸酶抑制剂，含有1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖。
2、权利要求1的1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖即PGG的制备方法，以将单宁酸溶于含有pH＝6的HAc-NaAc缓冲溶液的90％的甲醇或乙醇溶液中，50℃水浴中密闭水解12小时，在48℃下减压蒸干，溶于甲醇或乙醇后经葡聚糖凝胶柱洗脱得PGG粗品；再经大孔吸附树脂分离纯化，用水、10％、20％、30％、40％甲醇或乙醇水溶液梯度洗脱，收集洗脱液，浓缩、干燥即可。
3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的原料为单宁酸，包括但不限于工业单宁酸，单宁酸，含单宁酸的提取物。
4、根据权利要求2所述的方法，其特征在于，单宁酸质量(g)，HAc-NaAc缓冲溶液(mL)和甲醇或乙醇(mL)的比例为1∶1.5∶13.5。
5、根据权利要求2所述的方法，用于检测和指导柱层析分离的薄层层析法是以7:3:0.5的氯仿-甲醇-水为展开剂，FeCl3乙醇液为显色剂。
6、根据权利要求2所述的方法，其特征在于柱层析分离用的葡聚糖凝胶柱填充剂为葡聚糖凝胶，包括但不限于Sephadex G，Sephadex C-50，Sephadex LH-20；大孔吸附树脂填充剂为聚苯乙烯型的大孔吸附树脂，包括但不限于SEPABEADS SP825(SP850，SP70，SP207，SP700)、MCI gel CHP20P(75-150m)、Diaion HP20(HP20SS)、XAD-2、XAD-4、D-101、KB-8。
7、1，2，3，4，6-五-0-没食子酰基-β-D-葡萄糖在制备透明质酸酶抑制剂中的应用。
8、1，2，3，4，6-五-0-没食子酰基-β-D-葡萄糖在制备药物中的应用。
9、1，2，3，4，6-五-0-没食子酰基-β-D-葡萄糖在制备化妆品中的应用。
10、1，2，3，4，6-五-0-没食子酰基-β-D-葡萄糖在制备保健品中的应用。
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| CNA2009100940586A Pending CN101480407A (zh) | 2009-01-23 | 2009-01-23 | 透明质酸酶抑制剂及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101480407A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105524977A (zh) * | 2015-12-30 | 2016-04-27 | 广州医科大学 | 一种快速测定透明质酸酶活性的方法 |
| CN106053450A (zh) * | 2016-05-19 | 2016-10-26 | 中国农业大学 | 一种优化的体外抗过敏作用检测方法 |
| US11331102B2 (en) | 2018-08-03 | 2022-05-17 | Nectero Medical, Inc. | Purified pentagalloyl glucose and devices for delivery |
| CN117653562A (zh) * | 2023-11-27 | 2024-03-08 | 广州亚丽化妆品有限公司 | 一种具有抗衰老及提高免疫力功效的胶原蛋白肽组合物及其制备方法 |
-
2009
- 2009-01-23 CN CNA2009100940586A patent/CN101480407A/zh active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105524977A (zh) * | 2015-12-30 | 2016-04-27 | 广州医科大学 | 一种快速测定透明质酸酶活性的方法 |
| CN106053450A (zh) * | 2016-05-19 | 2016-10-26 | 中国农业大学 | 一种优化的体外抗过敏作用检测方法 |
| US11331102B2 (en) | 2018-08-03 | 2022-05-17 | Nectero Medical, Inc. | Purified pentagalloyl glucose and devices for delivery |
| CN117653562A (zh) * | 2023-11-27 | 2024-03-08 | 广州亚丽化妆品有限公司 | 一种具有抗衰老及提高免疫力功效的胶原蛋白肽组合物及其制备方法 |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20090715 |