CN101870640B - 从虎杖药材中提取制备白藜芦醇提取物的方法及产品 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从虎杖药材中提取制备白藜芦醇提取物的方法及产品,该方法是将虎杖药材粉碎,过筛,加入药粉重量0.5-3%的酵母,搅拌均匀,发酵4-10天;再加入6-12倍重量的有机溶剂水浴回流2-4次,每次1-3小时,提取液浓缩,干燥,得粗提物;粗提物用3-6倍重量的20-50%乙醇水浴回流0.5-3小时,抽滤,滤液浓缩后再滤过,滤渣干燥即得白藜芦醇提取物。与现有技术相比,本发明所采用的提取工艺简单,设备投资小,操作简便,生产成本低,白藜芦醇的转化率及提取率较高,资源利用率高,产业化生产前景好。
Description
技术领域
本发明涉及一种从虎杖药材中提取白藜芦醇的方法,属于药用活性成分的提纯技术领域。
背景技术:
现行的技术方案中,白藜芦醇主要是通过化学合成的方法来制备,但因其存在着设备投资大、工艺复杂、成本高及收率低等不尽如人意之处,近年来,人们试图从天然植物虎杖中提取虎杖苷(又名白藜芦醇苷)和白藜芦醇,而白藜芦醇是一种对人类健康非常有益、对多种疾病有着显著疗效作用的天然活性物质,已引起国际社会的普遍关注。经科学研究及临床应用证明,白藜芦醇具有抗癌、抗氧化以及防止血栓形成、保护肝脏和清除自由基等功效,对老年人的退化性疾病如帕金森症、痴呆症、早老性痴呆、风湿性疾病等都有较好的预防和治疗作用;在化妆品方面,它具有祛除黄褐斑和增白的功效;它对脂类代谢和血小板的凝固亦均有影响,可以防治冠心病和动脉粥样硬化等疾病。随着生物科学技术的不断发展,白藜芦醇的药用价值及其用量亦在日趋剧增。虽然天然植物虎杖内含有大量的虎杖苷和白藜芦醇,但因其组份复杂、提取难度大,加之现行提取工艺尚不完善,故其提取率和纯度都较低。
公开号为CN 1724495A,名称为“从中草药植物虎杖中制备白藜芦醇的方法”的发明专利申请公开了虎杖药材用有机溶剂提取、萃取、浓缩、硅胶柱层析获得白藜芦醇的工艺流程;公开号为CN 1385535A,名称为“提高中药虎杖中白藜芦醇含量的方法”的发明专利申请公开了采用水浸润后自然发酵、有机溶剂萃取、浓缩制得虎杖粗提取物的方法;公开号为CN 1896255A,名称为“微生物转化虎杖材料提取高纯度白藜芦醇的工艺”的发明专利申请公开了采用专用微生物对虎杖材料进行生物转化,制备虎杖提取物的工艺;公开号为CN 1384088A,名称为“一种从虎杖植物中提取白藜芦醇的制备方法”的发明专利申请公开了将虎杖药材用有机溶剂提取、浓缩、萃取、浓缩、水解、柱层析来获得白藜芦醇的方法。上述专利文献中的白藜芦醇提取工艺均是经过萃取、酶解反应或酸水解反应、柱层析等操作步骤,与本发明所采用的工艺步骤完全不同。而且,现行的技术方案均存在工艺复杂、操作繁琐、提取成本高、白藜芦醇转化率低等缺点,故其收率及产量的工业化程度仍不尽如人意。
发明内容:
本发明所要解决的技术问题是:克服上述现有技术的不足,提供一种从虎杖药材中提取制备白藜芦醇含量达50%以上提取物的方法及产品。本发明所采用的方法提取率高、产品纯度好,可达到公斤级批量工业化生产的目标。
本发明的技术方案:从虎杖药材中提取制备白藜芦醇提取物的方法为:将虎杖药材粉碎,过筛,加入药粉重量0.5-3%的酵母,搅拌均匀,发酵4-10天;再加入6-12倍重量的有机溶剂水浴回流2-4次,每次1-3小时,提取液浓缩,干燥,得粗提物;粗提物用3-6倍重量的20-50%乙醇水浴回流0.5-3小时,抽滤,滤液浓缩后再滤过,滤渣干燥即得白藜芦醇提取物。
具体的说,该方法包括以下步骤:
(1)将虎杖药材粉碎,过20-40目筛;
(2)发酵:取0.5-3重量份酵母,用2.5-4.5倍重量26-32℃温水溶解后,加入100重量份虎杖药材粉末中,搅拌均匀,发酵4-10天;
(3)提取:向发酵后的药材中加入6-12倍重量的有机溶剂,水浴回流2-4次,每次1-3小时,合并提取液,浓缩后减压干燥,得粗提物;
(4)纯化:将粗提物粉碎,加入3-6倍重量20-50%乙醇,水浴回流0.5-3小时,减压抽滤,取滤液浓缩至无醇味,滤过,滤渣减压干燥,即得白藜芦醇提取物。
以上所述酵母为葡萄酒酵母、面包酵母或白酒酵母。
所述的有机溶剂是乙酸乙酯、乙酸乙酯与石油醚任意比例的混合溶剂系统或乙酸乙酯与乙醚任意比例的混合溶剂系统。
更具体的从虎杖药材中提取制备白藜芦醇提取物的方法包括以下步骤:
(1)将虎杖药材粉碎,过20目筛;
(2)发酵:取1重量份葡萄酒酵母,用2.5倍重量28~30℃温水溶解后,加入100重量份虎杖药材粉末中,搅拌均匀,维持温度在28~30℃,发酵6天;
(3)提取:向发酵后的药材中加入8倍重量的乙酸乙酯,60-80℃水浴回流2次,第一次2小时,第二次1小时,合并提取液,浓缩后减压干燥,得粗提物;
(4)纯化:将粗提物粉碎,加入6倍重量40%乙醇,60-80℃水浴回流1小时,减压抽滤,取滤液浓缩至无醇味,滤过,滤渣40-70℃减压干燥,即得白藜芦醇提取物。
采用上述从虎杖药材中提取制备白藜芦醇提取物的方法制备得到的白藜芦醇提取物。所得提取物中白藜芦醇含量在50%以上。
以下是发明人在完成本发明的过程中所进行的相关试验研究:
一、粗提物制备方法
1、酵母种类的选择 精密称取虎杖药材粉末20g,分别加入下列酵母0.2g(溶于18mL水后加入),搅拌均匀,密封室温保持7天,发酵后加入90%乙醇120mL,60℃水浴回流2次,每次1小时,减压抽滤,合并提取液,浓缩回收溶剂,将粗提物减压干燥,精密称取10mg,加甲醇溶解并定容至25mL,经0.45μm微孔滤膜过滤,精密吸取续滤液20μL注入色谱仪,测定其白藜芦醇的含量,结果如下:
根据表1结果,选用安琪葡萄酒高活性干酵母(平均提取率为0.88%)。
2、发酵时间 精密称取虎杖药材粉末20g,分别加入葡萄酒酵母0.2g(溶于18mL水后加入),搅拌均匀,密封室温保持1~12天,发酵后加入90%乙醇120mL,60℃水浴回流2次,每次1小时,减压抽滤,合并提取液,浓缩回收溶剂,将粗提物减压干燥,精密称取10mg,加甲醇溶解并定容至25mL,经0.45μm微孔滤膜过滤,精密吸取续滤液20 μL注入色谱仪,测定其白藜芦醇的含量,结果如下:
由于发酵效果受温度和加水量的影响,综合考虑,选择发酵时间以6天为宜,温度为28~30℃,加水量2.5~3倍。
3、酶解加水量的考查 精密称取虎杖药材粉末20g,分别加入葡萄酒酵母0.20g(按下表加水量溶解后加入),搅拌均匀,密封室温保持7天,发酵后加入乙酸乙酯60mL,70℃水浴回流2次,每次1小时,减压抽滤,合并提取液,浓缩回收溶剂,将粗提物减压干燥,精密称取10mg,加甲醇溶解并定容至25mL,经0.45μm微孔滤膜过滤,精密吸取续滤液20μL注入色谱仪,测定其白藜芦醇的含量,结果如下:
4、酵母用量考查 精密称取虎杖药材粉末20g,按下表用量加入葡萄酒酵母(溶于50mL水后加入),搅拌均匀,密封室温保持6天,发酵后加入乙酸乙酯120mL,70℃水浴回流2次,每次1小时,减压抽滤,合并提取液,浓缩回收溶剂,将粗提物减压干燥,精密称取10mg,加甲醇溶解并定容至25mL,经0.45μm微孔滤膜过滤,精密吸取续滤液20 μL注入色谱仪,测定其白藜芦醇的含量,结果如下:
5、提取溶剂的选择 精密称取虎杖药材粉末20g,分别加入0.3g葡萄酒酵母(溶于50mL水后加入),搅拌均匀,密封室温保持6天,发酵后分别加入下列溶剂120mL,70℃水浴回流2次,每次1小时,减压抽滤,合并提取液,浓缩回收溶剂,将粗提物减压干燥,精密称取10mg,加甲醇溶解并定容至25mL,经0.45μm微孔滤膜过滤,精密吸取续滤液20μL注入色谱仪,测定其白藜芦醇的含量,结果如下:
6、提取温度选择 精密称取虎杖药材粉末20g,分别加入0.3g葡萄酒酵母(溶于50mL水后加入),搅拌均匀,密封室温保持6天,发酵后分别加入乙酸乙酯120mL,按下列温度水浴回流2次,每次1小时,减压抽滤,合并提取液,浓缩回收溶剂,将粗提物减压干燥,精密称取10mg,加甲醇溶解并定容至25mL,经0.45μm微孔滤膜过滤,精密吸取续滤液20μL注入色谱仪,测定其白藜芦醇的含量,结果如下:
7、溶剂用量考查 精密称取虎杖药材粉末20g,分别加入0.3g葡萄酒酵母(溶于50mL水后加入),搅拌均匀,密封室温保持6天,发酵后分别加入下列用量的乙酸乙酯,70 ℃水浴回流2次,每次1小时,减压抽滤,合并提取液,浓缩回收溶剂,将粗提物减压干燥,精密称取10mg,加甲醇溶解并定容至25mL,经0.45μm微孔滤膜过滤,精密吸取续滤液20μL注入色谱仪,测定其白藜芦醇的含量,结果如下:
8、提取时间考查:精密称取虎杖药材粉末20g,分别加入0.3g葡萄酒酵母(溶于50mL水后加入),搅拌均匀,密封室温保持6天,发酵后分别加入乙酸乙酯160mL,按下列温度水浴回流2次,时间按下表进行,回流后减压抽滤,合并提取液,浓缩回收溶剂,将粗提物减压干燥,精密称取10mg,加甲醇溶解并定容至25mL,经0.45μm微孔滤膜过滤,精密吸取续滤液20μL注入色谱仪,测定其白藜芦醇的含量,结果如下:
根据表8和图8、图9,选择回流提取时间为3小时(即:第一次2小时,第二次1小时)。
9、酵母发酵时是否加糖:精密称取虎杖药材粉末20g,分别按下表加入0.3g葡萄酒酵母(溶于75mL水或糖水后加入),搅拌均匀,密封室温保持6天,发酵后分别加入乙酸乙酯160mL,70℃水浴回流2次,第一次2小时,第二次1小时,回流后减压抽滤,合并提取液,浓缩回收溶剂,将粗提物减压干燥,精密称取10mg,加甲醇溶解并定容至25mL,经0.45μm微孔滤膜过滤,精密吸取续滤液20μL注入色谱仪,测定其白藜芦醇的含量,结果如下:
二、粗提物纯化
1、精密称取虎杖粗提物0.31g,加入40%的乙醇15mL超声溶解,过滤。将滤液挥干得样品1号,将剩余沉淀转移后加入15mL乙酸乙酯溶解,再加入石油醚15mL,产生沉淀,挥干得样品2号,分别测定白藜芦醇的含量。结果显示样品1号含量较高。
结论:40%乙醇中白藜芦醇含量较高, 粗提物纯化时选40%乙醇作为提取溶剂。
2、精密称取虎杖粗提物0.2g,加入40%的乙醇10mL,70℃水浴回流1小时,过滤。滤渣为样品1号,将滤液挥干的样品2号,称取一定量2号样品,分别加入3mL、5mL乙酸乙酯溶解,过滤,将滤液挥干得样品3号和4号,分别测定白藜芦醇的含量。结果如下:
3、精密称取虎杖粗提物(白藜芦醇含量20~23%)1.1206g,加入40%的乙醇56ml,70℃水浴回流1小时,过滤,将滤液挥干,称重为0.7270g,计算白藜芦醇转移率,分别取上层结晶和全部浸膏测定白藜芦醇的含量。结果如下:
纯化过程中白藜芦醇转移率:98.72%;全部浸膏中白藜芦醇的含量:35%;上层结晶物中白藜芦醇含量:72%。
4、精密称取虎杖粗提物(白藜芦醇含量20~23%)0.2030g,加入40%的乙醇10mL,70℃水浴回流1小时,放冷过滤,将滤液挥至无醇味(约2mL),过滤,将滤渣挥干。测定白藜芦醇的含量。结果如下:
滤液挥至剩1/5体积,白藜芦醇含量: 56.06%。
5、粗提物纯化验证 取虎杖粗提物(白藜芦醇含量约为23%)0.5g,精密称定,加入40%的乙醇25mL,70℃水浴回流1小时,放冷过滤,将滤液挥至无醇味(约5mL),过滤,将滤渣挥干。测定白藜芦醇的含量。结果如下:
6、精密称取虎杖粗提物4g,加入40%的乙醇200mL,70℃水浴回流1小时,放冷过滤,将滤液挥至无醇味(约50mL),过滤,将滤渣挥干。测定白藜芦醇的含量为64%。
7、提取-纯化 全过程验证
称虎杖药材粉末两份,各100g,分别加入纤维素酶与酵母(加水300mL溶解后加入),置于30℃水浴中,发酵6天,向发酵后的样品中加入乙酸乙酯800ml,70℃水浴回流2次,第一次2小时,第二次1小时。将提取液浓缩回收溶剂,减压干燥,研磨成粉末状,按1∶50加入40%乙醇70℃水浴回流1小时, 过滤,浓缩至无醇味(约160~200mL),放冷后过滤,将滤渣减压干燥。测定白藜芦醇的含量。
6、精密称取虎杖粗提物4g,加入40%的乙醇200mL,70℃水浴回流1小时,放冷过滤,将滤液挥至无醇味(约50mL),过滤,将滤渣挥干。测定白藜芦醇的含量为64%。
7、提取-纯化 全过程验证
称虎杖药材粉末两份,各100g,分别加入纤维素酶与酵母(加水300mL溶解后加入),置于30℃水浴中,发酵6天,向发酵后的样品中加入乙酸乙酯800mL,70℃水浴回流2次,第一次2小时,第二次1小时。将提取液浓缩回收溶剂,减压干燥,研磨成粉末状,按1∶50加入40%乙醇70℃水浴回流1小时, 过滤,浓缩至无醇味(约160~200mL),放冷后过滤,将滤渣减压干燥。测定白藜芦醇的含量。
8、加大量验证
称虎杖药材粉末1kg,加入纤维素酶与酵母(加水2.5L溶解后加入),置于30℃水浴中,发酵7天,向发酵后的样品中加入乙酸乙酯8L,70℃水浴回流2次,第一次2小时,第二次1小时。将提取液浓缩回收溶剂,减压干燥,研磨成粉末状,按1∶50加入40%乙醇70℃水浴回流1小时,过滤,浓缩至无醇味(约剩1/5体积),放冷后过滤,将滤渣减压干燥。测定白藜芦醇的含量为:
结果:得膏率3.11%,白藜芦醇粗提物平均含量为23.68%,纯化物平均含量为61.81%。
与现有技术相比,本发明所采用的提取工艺简单,设备投资小,操作简便,生产成本低,白藜芦醇的转化率及提取率较高,资源利用率高,产业化生产前景好。
附图说明:
图1是发酵时间考察结果图;
图2是加水量考察结果图;
图3是酵母用量考察结果图;
图4是溶剂种类考察结果图;
图5是水浴温度考察结果图;
图6是溶剂用量考察结果图;
图7是溶剂用量考察结果图;
图8是以白藜芦醇提取率为指标的回流时间考察结果图;
图9是以白藜芦醇含量为指标的回流时间考察结果图。
具体实施方式:
实施例1:
将虎杖药材粉碎,过20目筛,备用;取虎杖药粉和葡萄酒酵母(重量比100:1),酵母用2.5倍量温水(28~30℃)溶解后,加入虎杖药材粉末中,搅拌均匀,维持28~30℃,发酵6天;向发酵后的药材中加入8倍量的乙酸乙酯溶剂,60℃水浴回流2次,每次2小时,合并提取液,浓缩后减压干燥得虎杖粗提物。将虎杖粗提物粉碎,加入4倍量30%乙醇,60℃水浴回流0.5小时,减压抽滤,取滤液浓缩至无醇味,滤过,滤渣40℃减压干燥,即得白藜芦醇提取物。经检测,所得提取物中白藜芦醇的含量为61.32%。
实施例2:
将虎杖药材粉碎,过20目筛,备用;取虎杖药粉和白酒酵母(重量比200:1),酵母用3.0倍量温水(26~28℃)溶解后,加入虎杖药材粉末中,搅拌均匀,维持26~28℃,发酵8天;向发酵后的药材中加入10倍量的乙酸乙酯-乙醚(任意比例)混合溶剂,70℃水浴回流3次,每次1小时,合并提取液,浓缩后减压干燥得虎杖粗提物。将虎杖粗提物粉碎,加入3倍量40%乙醇,70℃水浴回流1小时,减压抽滤,取滤液浓缩至无醇味,滤过,滤渣50℃减压干燥,即得白藜芦醇提取物。经检测,所得提取物中白藜芦醇的含量为61.78%。
实施例3:
将虎杖药材粉碎,过30目筛,备用;取虎杖药粉和面包酵母(重量比100:2),酵母用3.0倍量温水(28~32℃)溶解后,加入虎杖药材粉末中,搅拌均匀,维持28~32℃,发酵6天;向发酵后的药材中加入12倍量的乙酸乙酯-石油醚(任意比例)混合溶剂,70℃水浴回流2次,第一次2小时,第二次1小时,合并提取液,浓缩后减压干燥得虎杖粗提物。将虎杖粗提物粉碎,加入3倍量50%乙醇,70℃水浴回流1.5小时,减压抽滤,取滤液浓缩至无醇味,滤过,滤渣60℃减压干燥,即得白藜芦醇提取物。经检测,所得提取物中白藜芦醇的含量为62.05%。
实施例4:
将虎杖药材粉碎,过40目筛,备用;取虎杖药粉和葡萄酒酵母(重量比100:3),酵母用4.5倍量温水(28~32℃)溶解后,加入虎杖药材粉末中,搅拌均匀,维持28~32℃,发酵7天;向发酵后的药材中加入6倍量的乙酸乙酯溶剂,75℃水浴回流2次,第一次1小时,第二次2小时,合并提取液,浓缩后减压干燥得虎杖粗提物。将虎杖粗提物粉碎,加入6倍量40%乙醇,65℃水浴回流2小时,减压抽滤,取滤液浓缩至无醇味,滤过,滤渣70℃减压干燥,即得白藜芦醇提取物。经检测,所得提取物中白藜芦醇的含量为61.67%。
Claims (1)
1.一种从虎杖药材中提取制备白藜芦醇提取物的方法,其特征在于:包括以下步骤:
(1)将虎杖药材粉碎,过20目筛;
(2)发酵:取1重量份葡萄酒酵母,用2.5倍重量28~30℃温水溶解后,加入100重量份虎杖药材粉末中,搅拌均匀,维持温度在28~30℃,发酵6天;
(3)提取:向发酵后的药材中加入8倍重量的乙酸乙酯,60-80℃水浴回流2次,第一次2小时,第二次1小时,合并提取液,浓缩后减压干燥,得粗提物;
(4)纯化:将粗提物粉碎,加入6倍重量40%乙醇,60-80℃水浴回流1小时,减压抽滤,取滤液浓缩至无醇味,滤过,滤渣40-70℃减压干燥,即得白藜芦醇提取物。
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