JPH04108395A - ガラクトサミノオリゴ糖の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ガラクトサミノオリゴ糖の製造方法に関する
ものである。

更に詳細には、本発明は、酵素を用いる生化学的な手法
によって、ガラクトサミンオリゴ５糖（ＧＯ５５）、ガ
ラクトサミンオリゴ６糖（ＧＯ５６）、またはそれ以上
の比較的高重合度のガラクトサミノオリゴ糖を非常に効
率的に製造する方法に関するものである。また１本発明
は限外濾過膜を用いた該オリゴ糖の連続的な製造方法に
も関するものである。

（従来の技術） ポリガラクトサミン（特公昭５６−１２６３９、特公平
１−４１１６０）は、不完全菌の一種であるＰａｅｃｉ
ｌｏｍｙｃｅｓｓｐ、　Ｉ−１株により生産されるガラ
クトサミンがα−１，４結合した３０万以上の分子量を
もつ多糖である。

近年、微生物、植物、あるいは動物の生産する多糖ある
いはそれらのオリゴ糖が種々の生理活性を有することが
知られているようになり、多糖またはそれらのオリゴ糖
に関心かたかまっている。

また、ポリガラクトサミンの類似多糖として知られるキ
チン、キトサン及びそのオリゴ糖が抗腫瘍活性を有する
事も確認されている。さらにポリガラクトサミン自身に
おいても同様な生理活性のある事が見いだされ（Ｋｏｕ
ｋｉ　ｌ５ＨＩＴＡＮＩ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ。

Ｐｈａｒｍａｃｏｂｉｏ−Ｄｙｎ、　１１．５８〜６５
（１９８８））、そのオリゴ糖の生理活性にも関心が高
まっている。生理活性以外の用途にもポリガラクトサミ
ン、ガラクトサミノオリゴ糖が有用になる可能性があり
、特に、オリゴマーは用途分野、作用面でポリマーにな
い特性を発揮するものと期待され、注目されている。

ガラクトサミノオリゴ糖は、ポリガラクトサミンを加水
分解することにより得られる。分解の方法には、酸又は
アルカリによるものと加水分解酵素による方法が知られ
ているが、重合度の高いガラクトサミノオリゴ糖の収率
は非常に悪い、特に塩酸によってポリガラクトサミンを
加水分解する場合、ランダムな分解の結果、得られるオ
リゴ糖の菫は七ノーガラクトサミン、ジ−ガラクトサミ
ン、トリーガラクトサミン、テトラ−ガラクトサミン、
ペンタ−ガラクトサミンの順であり、重合度が高い程そ
の収量は激減し、ペンタマー以上の高重合度のオリゴ糖
の収率は極端に悪かった。さらに、高濃度塩酸を高温で
使用するために作業に危険が伴うという欠点もあった。

一方、ポリガラクトサミン分解酵素による方法では、常
温で反応が行えるという、酸、アルカリによる加水分解
法にはない大きなメリットがある。

しかし、従来知゛られている酵素による分解法では得ら
れるガラクトサミノオリゴ糖は酸、アルカリによる加水
分解と同様に重合度の低いものが大部分であり、比較的
高重合度のガラクトサミノオリゴ糖の収量は低いもので
あった。

（発明が解決しようとする問題点） 比較的高重合度のガラクトサミノオリゴ糖に種々の生理
活性が期待されているが、従来の酸又はアルカリによる
ものや、加水分解酵素による方法では比較的高重合度の
ガラクトサミノオリゴ糖の収率が悪く、該オリゴ糖を効
率よく得る方法がなく、それに関する試験研究及び応用
範囲を狭くしていた。

（問題点を解決するための手段） 本発明は上記した問題点を一挙に解決するためになされ
たものであって、比較的高重合度なガラクトサミノオリ
ゴ糖を効率よく製造する目的でなされたものである。

従来より、ガラクトサミノオリゴ糖を得る方法としては
酵素による加水分解法があり、ポリガラクトサミン分解
酵素としては、例えば、シュードモナスｓｐ、Ｈ８８１
株（ＦＥＲＮ　Ｐ−８９５５）、バチルスｓｐ。

Ａ−４（ＦＥＲＮ　Ｐ−１０４７３）、バチルスｓｐ、
　Ｅ−１（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０５８１）などにより生産
される酵素が知られている。

本発明者らは各々の酵素についてその基質特異性、反応
条件等鋭意検討した結果、酵素反応時のｐＨを各々の酵
素の至適ｐＨより低いｐＨに設定することにより、低重
合度のオリゴ糖の生成が抑制され比較的高重合度のガラ
クトサミノオリゴ糖が効率良く得られることを見い出し
た。例えば、第１図は、反応ｐＨを６．０と４６０に設
定したときのＣトセファデックス力ラムクロマトパター
ンであるが、ガラクトサミノオリゴ糖の生成率を較べる
と、ＰＨ６，０では低重合度のガラクトサミノオリゴ糖
がほとんどであるのに対して、ＰＨ４，０では比較的高
重合度のガラクトサミノオリゴ糖が効率良く得られてい
る。

本発明は、この知見に基づき、酵素反応液のＰＩ（をポ
リガラクトサミン分解酵素の至適ＰＨをはずれた低いＰ
Ｈ３，０〜４．５に設定することにより比較的高重合度
のガラクトサミノオリゴ糖を効率良く得る方法を完成す
るにいたった。また、特に工業的見地から、反応液を限
外濾過膜を介して低分子の生成物を反応系外に取り出し
、未分解のポリガラクトサミンと酵素は反応系に戻し、
反応系にポリガラクトサミンを補充することにより連続
反応系を完成するに至った。

本発明方法において原料として用いるポリガラクトサミ
ンは、常法により調製したもので良くその調製例を示す
と次の通りである。

ガラクトサミン生産菌Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ　Ｉ−
１（ＦＥＲＭＢＰ−１１８０）をショ糖５％、ペプトン
１％、塩化カルシウム０．６％、ＰＨ７，０の組成の培
地で、２７℃好気的条件にて５日間培養し、培養液を遠
心分離し菌体を除いた上清を加温しながら限外濾過膜（
分画分子量１００，０００）で濃縮し、この濃縮物に塩
を加えＰＨを８．５に調整して沈澱させ、更にこの沈澱
物を集め酸に溶解し、再度ｐＨを８．５にするという操
作を繰り返すことにより、高純度のポリガラクトサミン
を得ることができる。

また、本発明で用いるポリガラクトサミン分解酵素は、
シュードモナス属、またはバチルス属に属する微生物に
より生産される。ポリガラクトサミン分解酵素生産菌の
培養培地としては、炭素源、窒素源、無機物、その他の
栄養素を程よく含有する培地ならば、合成培地あるいは
天然培地のいずれでも使用可能である。例えばシュード
モナスｓｐ。

Ｈ８８１菌（ＦＥＲＭ　Ｐ−８９５５）の酵素を使用す
る場合の培養培地の好適な例としては、ポリガラクトサ
ミン０．２５％、グルコース０．２５％、酵母エキス０
．０５％、ポリペプトン０．０５％、　ｐｌ（７，０の
例が挙げられる。

培養温度は２０〜４０℃、好ましくは３０〜３８℃の範
囲、培養開始ｐＨは６〜８、好ましくは７付近で３５〜
７２時間振どう又は深部攪拌培養すれば、培養液中にポ
リガラクトサミン分解酵素が得られる。

そして、ポリガラクトサミン分解酵素は必要に応じて単
離精製される。例えば、培養濾液をエタノール沈澱法に
よって粗酵素を分離し、これを水性溶媒に溶解し、セフ
ァデックスＧ−５０ゲル濾過、ＣＭ−セファデックスＣ
−２５イオン交換クロマトグラフイー、フェニル−セフ
ァロースＣＬ−４Ｂ疎水クロマトグラフィー等の処理に
より精製されたポリガラクトサミン分解酵素が得られる
。

このようにして得られたポリガラクトサミン分解酵素を
ポリガラクトサミン溶液に酵素至適ｐＨよりも低いｐＦ
Ｉ、特にＰＨ３，０〜４．５で作用させると、比較的高
重合度のオリゴガラクトサミンを効率的に得ることがで
きる１反応の例を示すと、まずポリガラクトサミンを低
濃度の酸↓こ溶解せしめる。酸としでは、例えば酢酸、
ギ酸等の有機酸のほが。

硫酸を除く無機酸が広く使用できる。こうして得られた
ポリガラクトサミン溶液のｐＨを６．０未満、例えば３
．０〜４．５に調整した後、上記により調製したポリガ
ラクトサミン分解酵素を加えて、３０℃前後の温度で酵
素分解を行う。

また本発明によれば、上記反応液を限外濾過膜を介すこ
とにより低分子生成物を反応系外に取り出しく一方、未
分解のポリガラクトサミン及びそれが一部分解した高分
子物質は、酵素とともに再度酵素反応系に返してやり、
そして反応系には原料であるポリガラクトサミンを新た
に補充してやり）、これをイオン交換樹脂に吸着させた
後、適当な濃度勾配の溶剤で順次溶出して、比較的高重
合度な各ガラクトサミノオリゴ糖両分を連続的に得るこ
とができる。

この連続法は、特に工業的製法としてすぐれている。な
お限外濾過膜としてはポリアクリルニトリル系、ポリエ
ーテルスルホン酸系等市販されているものが適宜自由に
使用され、モジュールタイプとしても、管状モジュール
、中空糸モジュール。

プリーツモジュール、スパイラルモジュール等が適宜選
択使用される。

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。

実施例１ ポリガラクトサミンの調製 ’ｊ）Ｌｉコ−２６００ｇ、ポリペプトン６０ｇ、ｃａ
ｃＱｚ・２Ｈ，０１２５ｇを水道水１７ｍに溶解し、濃
ＮａＯＨ溶液でｐＨ７，０に調整した後、３ｏΩ容ジャ
ーファーメンタ−に移した。

この培地溶液に蒸気を注入することにより加圧、加熱滅
菌（１２１℃、２０分間）を行った。冷却後の培地（最
終液量２０ｊｉ１）に、５００ｍｍ三角フラスコに１５
０１同組成の培地（グルコース３％、ポリペプトン０．
３％、ＣａＣら０．５％、ｐＨ７，０）で２６℃、４日
間振どう培養したベニシロマイセスｌ−１（ＦＥＲＮ　
ＢＰ−１１８０）を、容量比で約１０％無菌的に接種し
た。接種後２７℃。

通気量０．５ＶＶＭ、攪拌数２０ＯＲＰＭの条件で５日
間培養した。

培養終了後培養物を濾布濾過することにより培養濾液１
１Ｑを得た。この培養濾液を５０℃〜６０℃に加熱しな
がら分画分子量１５万の限外濾過膜（三菱レイヨン・エ
ンジニアリング社製ＵＦ膜チューブラ−モジュールＦタ
イプ）を通過させることにより、低分子画分を除き液量
が約３Ｑになる迄濃縮した。

更に、約１４０００　Ｘ　Ｇで遠心分離することにより
菌体残渣、熱変性蛋白を除去した。

遠心分離後に上澄液画分３Ｑに食塩約７５０ｇ（約２５
％濃度）を加えて攪拌し、溶解後、濃Ｎａ０）１でｐ）
ｌを７．０〜８．５に調整した。−夜装置し塩析物を十
分析出させた後、サラン製の布（塩化ビニリデンと塩化
ビニールの共重合体、商品名）上に塩析物を回収した。

更にこの塩析物の上から大量のアルカリ性の水（ＰＨ７
，０以上）を散布することにより余分の食塩及び培養物
に同時に混在している中性糖、その他の夾雑物を洗い流
した。

次に、水洗物の塩析物に０．１Ｍ塩酸溶液を容量比で約
３倍量加え溶解した。この溶解物に濃ＮａＯＨ溶液を加
えポリガラクトサミンの等電点であるｐＨ８，５に合せ
た。−夜装置し十分析出物を析出させた後、上記と同様
サラン製の布上に析出物を回収し、大意の水道水で洗っ
た。この水洗物をもう一度０．１Ｍ塩酸に溶解後、等電
点沈澱を行い水洗を繰り返すことにより精製した。

この精製した析出物を１２１℃、１５分間滅菌後、凍結
乾燥することにより、ポリガラクトサミンを主成分とす
るＰＦ−１０２の精製粉末（ポリガラクトサミンとして
の純度約９９％）を７ｇ得た。

また、用途により上記精製粉末の一部を０．Ｉｎ塩酸に
溶解し分画分子量３０万の限外濾過膜（アミコン社製分
子篩膜タイプＸＭ３００）で分画し、平均分子量１６〜
３０万のものと平均分子社３０万以上のものに分画する
こともできる。

実施例２ ポリガラクトサミン　解酵　の調製 シュードモナスｓｐ、　Ｈ８８１，ＦＥＲＭ　Ｐ−８９
５５を５００ｖｈＱ三角フラスコ中で、グルコース０．
５％、酵母エキス０．０５％、ポリペプトン０．０５％
の組成を有する種培地１００ｍＱに植菌し、　３０℃で
２０時間培養した。

得られた種培養物を３０Ｑのジャーファーメンタ−中で
、実施例１で得たポリガラクトサミン（ＰＦ−１０２）
０．２５％、グルコース０．２５％、酵母エキス０．０
５％、ポリペプトン０．０５％の酵素生産培地に植菌し
、３０℃テ通気量ＩＶＶＭ、攪拌数２０ＯＲＰＭテ４８
時間培養した。

得られた培養物を遠心分離（１４，ＯＯＯＲＰＭ）　し
て、菌体を除き、得られた培養濾液に冷却したエタノー
ルを６０％濃度まで加えて、タンパク質を沈澱させ、こ
の沈澱タンパクを遠心して、溶液から分離した。得られ
たタンパク質を０．１モル酢酸緩衝液（ＰＨ５，０）で
平衡化したＣトセファデックスＣ−２５カラム（２，５
Ｘ６０ｃ＋ｓ）に吸着させ、０〜０．５モル食塩の濃度
勾配を有する同緩衝液を用いて溶出させた。

溶出した酵素活性区分を集め、限外濾過装置（分画分子
量１万）を使って濃縮した１次に、２モル食塩を含む０
．１モル酢酸緩衝液（ｐＨ６，０）溶液とし、同緩衝液
で平衡化したセファデックスＧ−５０カラム（５ｘ　９
０ｃｍ）クロマトグラフィーにかけた６次いで、活性区
分の食塩濃度を４モルにまで高め、同様な溶液で平衡化
したフェニル−セファロースＣＬ−４Ｂカラム（２，５
Ｘ　２０ｃｍ）に吸着させ、食塩の逆濃度勾配を持つ０
．１モル酢酸緩衝液で溶出して精製ポリガラクトサミン
分解酵素５０ｍｇ　（収率２３．１％、比活性５２μｇ
　Ｇａ１Ｎ／ｗｉｎ／＋ｉｇ　ｐｒｏｔｉｅｎ）を得た
。

実施例３ ガラクトサミノオリゴ糖の調製 ポリガラクトサミン２０ｇを５Ｑの０．１モル酢酸に溶
解し、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ４，０に調整し、
ポリガラクトサミン分解酵素溶液を０．２ユニツト／１
Ｑ（１ユニツトは１分間にガラクトサミン１μモルを生
成する酵素力価）になるように加え、３０℃にて反応さ
せた。３０分後、加熱して酵素を失活させ１反応を停止
させた後、反応液は直ちにＣＭ−セファデックスカラム
（２１０＋ａｍＩＤ　Ｘ　３０ｃｗａ　Ｘ　３　）に吸
着させＮａＣｆｆ１の濃度勾配をかけることにより順次
各ガラクトサミノオリゴ糖を溶出させ分画した。それぞ
れの画文を脱塩、濃縮後凍結乾燥してジ−ガラクトサミ
ン、トリーガラクトサミン、テトラ−ガラクトサミン、
ペンタ−ガラクトサミン、ヘキサ−ガラクトサミン、ヘ
プタ−ガラクトサミン、オクタ−ガラクトサミン、ノナ
−ガラクトサミンを得た。

本発明方法におけるガラクトサミノオリゴ糖の収量は従
来法（ｐＨ６，０，第１表）との比較をもって。

第２表に示す。なお、分解に供したポリガラクトサミン
はともに２０ｇであった。

第１表 （ガラクトサミノオリゴ糖） ジ　　−ガラクトサミン トリ　−ガラクトサミン テトラ−ガラクトサミン ペンタ−ガラクトサミン ヘキサ−ガラクトサミン ヘプタ−ガラクトサミン オクタ−ガラクトサミン ノナ　−ガラクトサミン 第２表 ガラクトサミノオリゴ ジ　　−ガラクトサミン トリ　−ガラクトサミン テトラ−ガラクトサミン ペンタ−ガラクトサミン ヘキサ−ガラクトサミン ヘプタ−ガラクトサミン オクタ−ガラクトサミン ノナ　−ガラクトサミン 従来法 」（ｊ区■［ ０，２９ １，４４ ０，３２ ０，９６ ０，６７ ０，４８ ０，３８ ０，３１ 本発明法 ］（ｊＩｌト １．２０ ３．６０ ０．９４ １．３８ １．８０ １．１６ ０．６０ ０．４０ 」刊Ｉ式叉［ １，４５ ７，２０ １，６０ ４，８０ ３，３５ ２，４０ １，９０ １，５５ 第１．２表の結果から明らかなように１本発明方法によ
れば、比較的高重合度のガラクトサミノオリゴ糖の収電
が従来法に比して大幅に増加していることが判る。

実施例４ ガラクトサミノオリゴ　の ポリガラクトサミン２００ｇを５０Ｍの０．１モル酢酸
に溶解し、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ４，０に調整
し、ポリガラクトサミン分解酵素溶液を０．２ユニット
／ｍＱ（１ユニツトは１分間にガラクトサミン１μモル
を生成する酵素力価）になるように加え、３０℃にて反
応させた６反応液は分画分子量３０，０００の限外濾過
膜（アミコン・ファー・イースト・リミテッド社製、Ｄ
Ｃ−２型ホローファイバー〇ＩＰ−３０）を用いて、連
続的に分解生成したガラクトサミノオリゴ糖を反応系の
外に取り出した。反応系には０．１モル酢酸に溶解した
ポリガラクトサミン０．１％溶液ＰＨ４，０をｌＯｍｆ
ｉ／ｗｉｎ、で添加した。

反応系外に取り出したガラクトサミノオリゴ糖は直ちに
Ｃトセファデックスカラム（２１０ｍｍＩＤ　Ｘ　３０
Ｃ履Ｘ３）に吸着させＮａＣρの濃度勾配をかけること
により順次各ガラクトサミノオリゴ糖を溶出させ分画し
た。それぞれの両分を脱塩、濃縮後凍結乾燥したガラク
トサミノオリゴ糖を得た。

反応開始２時間後のそれぞれのガラクトサミノオリゴ糖
の生成量は、ジ−ガラクトサミン１２ｇ、トリーガラク
トサミン３６ｇ、テトラ−ガラクトサミン９．４ｇ、ペ
ンタ−ガラクトサミン１３．８ｇ、ヘキサ−ガラクトサ
ミン１８．０ｇ、ヘプタ−ガラクトサミン１１．６ｇ、
オクタ−ガラクトサミン６．０ｇ、ノナ−ガラクトサミ
ン４．０ｇであった。

（発明の効果） 本発明によれば、酵素反応液のＰＨをコントロールする
という非常にシンプルな工程を新規に採用したことによ
り、比較的高重合度の各種ガラクトサミノオリゴ糖を非
常に高い収率で製造することができる。

更にまた、限外濾過膜処理を行えば、連続化が可能とな
るので、この方法は、工業的な製法として特に好適であ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｐＨ６及び４におけるＣＭ−セファアツクス
力ラムクロマトパターンである。 図中、■〜■は、モノー〜ノナーガラクトサミンのピー
クをそれぞれ表わす。 代理人　弁理士　戸　１）親　男 ｆｒａｃｔｉｏｎ ｎｏ。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ポリガラクトサミン分解酵素をポリガラクトサミ
   ンに作用させることによりガラクトサミノオリゴ糖を製
   造する際、反応液のｐＨを酵素の至適ｐＨよりも低いｐ
   Ｈに設定することにより、特異的に高重合度のガラクト
   サミノオリゴ糖を得ることを特徴とするガラクトサミノ
   オリゴ糖の製造方法。
2. （２）反応液のｐＨを３〜４．５に設定することを特徴
   とする請求項１に記載のガラクトサミノオリゴ糖の製造
   方法。
3. （３）限外濾過膜を用い生成したガラクトサミノオリゴ
   糖を反応系外に取り出し、未分解のポリガラクトサミン
   と酵素を含む反応液を反応系にもどし、反応系にポリガ
   ラクトサミンを補充することにより、連続的に高重合度
   のガラクトサミノオリゴ糖を得ることを特徴とする請求
   項１又は２に記載のガラクトサミノオリゴ糖の製造方法
   。