JPH0646952B2 - 高重合度キトオリゴ糖の製造法 - Google Patents
高重合度キトオリゴ糖の製造法Info
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- JPH0646952B2 JPH0646952B2 JP2224223A JP22422390A JPH0646952B2 JP H0646952 B2 JPH0646952 B2 JP H0646952B2 JP 2224223 A JP2224223 A JP 2224223A JP 22422390 A JP22422390 A JP 22422390A JP H0646952 B2 JPH0646952 B2 JP H0646952B2
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- chitosan
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- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、キトオリゴ糖(COSということもある）。特に
高重合度キトオリゴ糖の製造法に関するものである。
高重合度キトオリゴ糖の製造法に関するものである。
更に詳細には、本発明は、酵素を用いる生化学的な手法
によって、キトペンタオース、キトヘキサオース（各々
COS5、COS6ということもある）を中心とする重合度が比
較的高いキトオリゴ糖の非常に効率のよい製造法に関す
る。また本発明は、限外濾過膜を使用するキトオリゴ糖
の連続的製造法にも関するものである。
によって、キトペンタオース、キトヘキサオース（各々
COS5、COS6ということもある）を中心とする重合度が比
較的高いキトオリゴ糖の非常に効率のよい製造法に関す
る。また本発明は、限外濾過膜を使用するキトオリゴ糖
の連続的製造法にも関するものである。
（従来の技術） キトサンは、カニやエビ殻から得られるキチンを脱アセ
チル化して得られる、 -2アミノ-2-デオキシ-D-グリコ
ースの１，４グルコシド結合で直鎖状に結合した塩基性
の多糖類である。
チル化して得られる、 -2アミノ-2-デオキシ-D-グリコ
ースの１，４グルコシド結合で直鎖状に結合した塩基性
の多糖類である。
この高分子塩基性多糖より得られたキトオリゴ糖または
このN-アセチル化物であるN-アセチルキトオリゴ糖に抗
菌活性、抗腫瘍活性が見いだされ、特にその重合度の比
較的高い６糖、７糖に活性の高いことが明らかにされて
いる〔ディー・エフ・ケンドラーおよびリー・エー・ハ
ドウィガー：エクスペリメンタル・マイコロジー(D.F.K
endra and Lee A. Hadwiger：Experimental Mycology)
第８巻、276〜281頁(1984)〕、〔別冊フードケミカル
１、キチン／キトサンの科学、47〜53頁(1987)〕。
このN-アセチル化物であるN-アセチルキトオリゴ糖に抗
菌活性、抗腫瘍活性が見いだされ、特にその重合度の比
較的高い６糖、７糖に活性の高いことが明らかにされて
いる〔ディー・エフ・ケンドラーおよびリー・エー・ハ
ドウィガー：エクスペリメンタル・マイコロジー(D.F.K
endra and Lee A. Hadwiger：Experimental Mycology)
第８巻、276〜281頁(1984)〕、〔別冊フードケミカル
１、キチン／キトサンの科学、47〜53頁(1987)〕。
また、COS5のN-アセチル化物であるNACOS5のパラニトロ
フェニル化物はリゾチームの基質となり、白血病、大腸
炎、肝疾患などの診断薬としての用途があり、試断薬の
素材としてのNACOS5の需要が見込まれている。
フェニル化物はリゾチームの基質となり、白血病、大腸
炎、肝疾患などの診断薬としての用途があり、試断薬の
素材としてのNACOS5の需要が見込まれている。
キトオリゴ糖を得る方法としては、一般的には、酸によ
る加水分解後、Dowex-50(H+型)を用いたイオン交換クロ
マトグラフィーによる方法〔Horowitz, S.T., et. al：
J・ Am. Chem. Soc., Vol. 79, 5046〜5049(1957)〕が知
られているが、この方法は濃い酸、高温での非常に苛酷
な条件での加水分解が必要であることと、単糖を多量に
含む低重合度のキトオリゴ糖が多く生じるという欠点が
ある。
る加水分解後、Dowex-50(H+型)を用いたイオン交換クロ
マトグラフィーによる方法〔Horowitz, S.T., et. al：
J・ Am. Chem. Soc., Vol. 79, 5046〜5049(1957)〕が知
られているが、この方法は濃い酸、高温での非常に苛酷
な条件での加水分解が必要であることと、単糖を多量に
含む低重合度のキトオリゴ糖が多く生じるという欠点が
ある。
また、酵素による分解後、分解液をバイオラッドAG-50W
-X8(H+型)で分離した例も報告されているが〔Izume, M
et. al：Agric. Biol. Chem., Vol. 51, 1189〜1191(19
87)〕、この場合、単糖は生成されないものの、キトビ
オース、キトトリオース、キトテトラオースが大部分で
それより重合度の高いオリゴ糖はほとんど得られていな
いのが現状である。
-X8(H+型)で分離した例も報告されているが〔Izume, M
et. al：Agric. Biol. Chem., Vol. 51, 1189〜1191(19
87)〕、この場合、単糖は生成されないものの、キトビ
オース、キトトリオース、キトテトラオースが大部分で
それより重合度の高いオリゴ糖はほとんど得られていな
いのが現状である。
（発明が解決しようとする問題点） 上記したように、キトペンタオース、キトヘキサオー
ス、キトヘプタオースまたはそのN-アセチル化物に高い
生理活性が明かにされているが、大量に入手する手段が
なくこれらの重合度の比較的高いキトオリゴ糖を効率よ
く安価に得る方法の開発が強く望まれていた。
ス、キトヘプタオースまたはそのN-アセチル化物に高い
生理活性が明かにされているが、大量に入手する手段が
なくこれらの重合度の比較的高いキトオリゴ糖を効率よ
く安価に得る方法の開発が強く望まれていた。
（問題点を解決するための手段） 本発明は上記した問題点を一挙に解決するためになされ
たものであって、比較的重合度の高いキトオリゴ糖を効
率よく製造する目的でなされたものである。
たものであって、比較的重合度の高いキトオリゴ糖を効
率よく製造する目的でなされたものである。
キトサンを分解する方法としては酵素による分解方法が
あるが、本発明者らは、種々の市販の酵素剤、その他種
々微生物由来のキトサナーゼについてその基質特異性、
反応条件等について鋭意検討した結果、酵素反応時のpH
を至適pHより低いpHに設定することによりキトペンタオ
ース以下の低重合度のオリゴマーの生成を抑制し、重合
度の高いオリゴ糖が特異的に生成してくることを見いだ
し、本発明を完成するに到ったものである。
あるが、本発明者らは、種々の市販の酵素剤、その他種
々微生物由来のキトサナーゼについてその基質特異性、
反応条件等について鋭意検討した結果、酵素反応時のpH
を至適pHより低いpHに設定することによりキトペンタオ
ース以下の低重合度のオリゴマーの生成を抑制し、重合
度の高いオリゴ糖が特異的に生成してくることを見いだ
し、本発明を完成するに到ったものである。
すなわち本発明は、キトサン分解酵素をキトサンに作用
させてキトオリゴ糖を製造する際、反応液のpHを酵素の
至適pHよりも低く設定維持し、もって高重合度のキトオ
リゴ糖を選択的に製造することを基本的技術思想とする
ものである。
させてキトオリゴ糖を製造する際、反応液のpHを酵素の
至適pHよりも低く設定維持し、もって高重合度のキトオ
リゴ糖を選択的に製造することを基本的技術思想とする
ものである。
以下、本発明について詳述する。
本発明において使用するキトサン分解酵素は、市販のキ
トサン分解活性を有する酵素剤、または公知微生物を培
養することによって得られるキトサン分解活性を有する
酵素であればいずれの酵素でもよい。
トサン分解活性を有する酵素剤、または公知微生物を培
養することによって得られるキトサン分解活性を有する
酵素であればいずれの酵素でもよい。
例えば、バチルスsp. UTK (FERM P-11442)、ストレプト
マイセス・グリセウスHUT 6037等の生産する酵素が好適
に使用出来る。
マイセス・グリセウスHUT 6037等の生産する酵素が好適
に使用出来る。
また、本発明において原料ないし酵素基質として使用す
るキトサンは、市販のキトサンが適宜自由に使用できる
が、脱アセチル化度の高いもののほうが好適に使用でき
る。
るキトサンは、市販のキトサンが適宜自由に使用できる
が、脱アセチル化度の高いもののほうが好適に使用でき
る。
本発明を実施するには、例えば、脱アセチル化度70％以
上好適には脱アセチル化度80％以上のキトサンを、トリ
ス-マレイト-NaOH緩衝液、マキルバイン氏緩衝液、酢酸
緩衝液またはコハク酸-NaOH 緩衝液等の緩衝液を用いて
キトサン分解酵素の至適pHよりも低いpH、好適にはpH4.
5〜5.5に、且つ0.1〜0.5％になるように溶解し、この基
質溶液 100ml当り１〜50単位（１単位は１分間に１マイ
クロモルのグルコサミンに相当する還元力を増加させる
活性）加え、25℃〜40℃で反応させる。
上好適には脱アセチル化度80％以上のキトサンを、トリ
ス-マレイト-NaOH緩衝液、マキルバイン氏緩衝液、酢酸
緩衝液またはコハク酸-NaOH 緩衝液等の緩衝液を用いて
キトサン分解酵素の至適pHよりも低いpH、好適にはpH4.
5〜5.5に、且つ0.1〜0.5％になるように溶解し、この基
質溶液 100ml当り１〜50単位（１単位は１分間に１マイ
クロモルのグルコサミンに相当する還元力を増加させる
活性）加え、25℃〜40℃で反応させる。
反応時間については、格別の限定はなく、生成してくる
還元力の増加を目安にして適宜設定すればよい。５時間
以上反応させ、反応生成物をCMセファデックスC-25イオ
ン交換クロマトグラフィー、Dowex50w×８イオン交換ク
ロマトグラフィー、CMトヨパール650Mイオン交換クロマ
トグラフィー等により分離生成したところ、COS4〜COS6
の生成量がほぼ一定量となり、その量比もほぼ一定とな
った。従って、反応時間は５時間以上あれば充分であ
る。
還元力の増加を目安にして適宜設定すればよい。５時間
以上反応させ、反応生成物をCMセファデックスC-25イオ
ン交換クロマトグラフィー、Dowex50w×８イオン交換ク
ロマトグラフィー、CMトヨパール650Mイオン交換クロマ
トグラフィー等により分離生成したところ、COS4〜COS6
の生成量がほぼ一定量となり、その量比もほぼ一定とな
った。従って、反応時間は５時間以上あれば充分であ
る。
また本発明によれば、上記反応液を限外濾過膜を介すこ
とにより低分子化した反応生成物を連続的に反応系外に
取り出し（一方、未分解のキトサン及びそれが一部分解
した高分子物質は、酵素とともに再度酵素反応系に返し
てやり、そして、基質及び緩衝液の減少分を新たに補充
してやり）、これをクロマト処理し、適当な濃度勾配の
溶剤で順次溶出して、各種の高級キトオリゴ糖画分を連
続的に得ることができる。
とにより低分子化した反応生成物を連続的に反応系外に
取り出し（一方、未分解のキトサン及びそれが一部分解
した高分子物質は、酵素とともに再度酵素反応系に返し
てやり、そして、基質及び緩衝液の減少分を新たに補充
してやり）、これをクロマト処理し、適当な濃度勾配の
溶剤で順次溶出して、各種の高級キトオリゴ糖画分を連
続的に得ることができる。
この連続法は、特に工業的製法としてすぐれている。な
お限外濾過膜としては、ポリアクリロニトリル系、ポリ
エーテルサルホン酸系等市販されているものであって、
使用する酵素分子より穴の大きさが小さい膜であれば何
でもよいが、分画分子量30,000、10,000の膜が好適に使
用できる。限外濾過膜のモジュールタイプとしても、管
状モジュール、中空系モジュール、プリーツモジュー
ル、スパイラルモジュール等が適宜使用される。
お限外濾過膜としては、ポリアクリロニトリル系、ポリ
エーテルサルホン酸系等市販されているものであって、
使用する酵素分子より穴の大きさが小さい膜であれば何
でもよいが、分画分子量30,000、10,000の膜が好適に使
用できる。限外濾過膜のモジュールタイプとしても、管
状モジュール、中空系モジュール、プリーツモジュー
ル、スパイラルモジュール等が適宜使用される。
以上の本発明方法により、非常に効率よく比較的高重合
度のキトオリゴ糖の製造が可能となる。
度のキトオリゴ糖の製造が可能となる。
次に実施例を掲げ説明する。
実施例１ キトサン分解酵素の製造 ストレプトマイセス・グリセウス HUT6037を、500mlの
三角フラスコ中でグルコーク1.5％、酵母エキス1.0％、
ペプトン0.4％の組成を有する培地100mlに植菌し、30
℃、24時間培養した。
三角フラスコ中でグルコーク1.5％、酵母エキス1.0％、
ペプトン0.4％の組成を有する培地100mlに植菌し、30
℃、24時間培養した。
得られた種培養液を、 30Lのジャーファーメンター中で
キトサン 0.25％、酵母エキス1.0％、ペプトン0.4％の
酵素生産培地18Lに植菌し、30℃で通気量１vvm、攪拌20
0rpmで60時間培養した。
キトサン 0.25％、酵母エキス1.0％、ペプトン0.4％の
酵素生産培地18Lに植菌し、30℃で通気量１vvm、攪拌20
0rpmで60時間培養した。
得られた培養液を遠心分離(10,000rpm)して菌体を除
き、更に分画分子量 500,000の膜で除菌した後、培養上
澄を酵素液として使用した。
き、更に分画分子量 500,000の膜で除菌した後、培養上
澄を酵素液として使用した。
この時の培養上澄の酵素活性は６U/mlであった。
同様に処理して、バチルスsp．UTK (FERM p-11442)から
もキトサン分解酵素が得られた。
もキトサン分解酵素が得られた。
実施例２ バッチ法による高重合度キトオリゴ糖の製造 キトサン（片倉チッカリン製 脱アセチル化率83％）0.
5gを0.1M酢酸緩衝液(pH５)100mlに溶解し、更に酵素液
６ml(酵素活性6U/ml)を加え30℃で反応させた。
5gを0.1M酢酸緩衝液(pH５)100mlに溶解し、更に酵素液
６ml(酵素活性6U/ml)を加え30℃で反応させた。
反応の経時的変化を還元糖量 (Somogys-Nelson法)を測定した。その結果を第１図に示
した。
した。
グルコサミン換算の還元力1200μｇ/mlのときの反応液
をCM/セファデックス-C25カラムクロマトグラフィーに
よって吸着させ、食塩の濃度勾配で溶出分画することに
よってCOS4、COS5、COS6各々を得た。本発明方法による
溶出パターンを第２図に、従来法の溶出パターンを第３
図に示した。また各々の量比を第１表に示した。
をCM/セファデックス-C25カラムクロマトグラフィーに
よって吸着させ、食塩の濃度勾配で溶出分画することに
よってCOS4、COS5、COS6各々を得た。本発明方法による
溶出パターンを第２図に、従来法の溶出パターンを第３
図に示した。また各々の量比を第１表に示した。
実施例３ 連続反応法による高重合度キトオリゴ糖の製
造 キトサン（片倉チッカリン社製 脱アセチル化率83％）
200gを0.1M酢酸衝液(pH５)40に溶解した。
造 キトサン（片倉チッカリン社製 脱アセチル化率83％）
200gを0.1M酢酸衝液(pH５)40に溶解した。
酵素液は実施例１で製造したものを 500ml加え30℃で反
応させた。
応させた。
限外濾過膜ホローファイバー型分画分子量10,000(アミ
コン社製HIP10-20型)の膜を介し、低分子画分を外に押
し出しながら 100ml/minで循環させた。
コン社製HIP10-20型)の膜を介し、低分子画分を外に押
し出しながら 100ml/minで循環させた。
外液をCM-セファデックス-C-25カラムクロマトグラフィ
ーにかけ、同様食塩濃度勾配で溶出し分離・分画した。
ーにかけ、同様食塩濃度勾配で溶出し分離・分画した。
また、反応液の基質及び酢酸緩衝液は低分子化されたキ
トサン画分と共に外液に流出する為 0.1％キトサン含有
0.1M酢酸緩衝液10ml/minの流速で補充した。
トサン画分と共に外液に流出する為 0.1％キトサン含有
0.1M酢酸緩衝液10ml/minの流速で補充した。
24時間反応後の外液をCM-セファデックス-C25カラムク
ロマトグラフィーにかけ分離・分画した。その時の各々
の画分の収量を第２表に示した。
ロマトグラフィーにかけ分離・分画した。その時の各々
の画分の収量を第２表に示した。
（発明の効果） 本発明によれば、酵素反応液のpHをコントロールすると
いう新規な工程を採用したことにより、各種の高級キト
オリゴ糖を非常に高い収率で製造することができる。
いう新規な工程を採用したことにより、各種の高級キト
オリゴ糖を非常に高い収率で製造することができる。
更にまた、限外濾過膜処理を行えば、連続化が可能とな
るので、この方法は、工業的な製法として特に好適であ
る。
るので、この方法は、工業的な製法として特に好適であ
る。
第１図は実施例２における経時変化を図示したものであ
り、第２図及び第３図は、本発明方法及び従来法による
各種キトオリゴ糖の溶出パターンを、それぞれ図示した
ものである。
り、第２図及び第３図は、本発明方法及び従来法による
各種キトオリゴ糖の溶出パターンを、それぞれ図示した
ものである。
Claims (3)
- 【請求項１】キトサン分解酵素をキトサンに作用させキ
トオリゴ糖を製造する際、反応液のpHを酵素の至適pHよ
りも低くすることにより、特異的に高重合度のキトオリ
ゴ糖を得ることを特徴とするキトオリゴ糖の製造法。 - 【請求項２】反応液のpHを４．５〜５．５とすることを
特徴とする請求項１に記載のキトオリゴ糖の製造法。 - 【請求項３】限外濾過膜を介し、反応生成物を反応系外
に取り出し、更に反応系にキトサンを補充することによ
り連続的に高重合度のキトオリゴ糖を得ることを特徴と
する請求項１又は２に記載のキトオリゴ糖の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2224223A JPH0646952B2 (ja) | 1990-08-28 | 1990-08-28 | 高重合度キトオリゴ糖の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2224223A JPH0646952B2 (ja) | 1990-08-28 | 1990-08-28 | 高重合度キトオリゴ糖の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04108396A JPH04108396A (ja) | 1992-04-09 |
| JPH0646952B2 true JPH0646952B2 (ja) | 1994-06-22 |
Family
ID=16810439
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2224223A Expired - Lifetime JPH0646952B2 (ja) | 1990-08-28 | 1990-08-28 | 高重合度キトオリゴ糖の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0646952B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003088394A (ja) * | 2001-09-19 | 2003-03-25 | Ehime Prefecture | 有機物分解物の製造方法及び製造装置 |
| JP6156829B2 (ja) * | 2011-10-05 | 2017-07-05 | 甲陽ケミカル株式会社 | 褐変を低減させたオリゴグルコサミン及び該オリゴグルコサミンの製造方法 |
| CN116640744B (zh) * | 2023-07-20 | 2023-09-22 | 中国海洋大学 | 壳聚糖酶OUC-CsnA4-S49I及其应用和制备壳寡糖的方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01291799A (ja) * | 1988-05-20 | 1989-11-24 | Nakano Vinegar Co Ltd | キトサンオリゴ糖の製造方法およびその利用 |
-
1990
- 1990-08-28 JP JP2224223A patent/JPH0646952B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04108396A (ja) | 1992-04-09 |
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