JPH04108396A - 高重合度キトオリゴ糖の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、キトオリゴ糖（ＣＯ５ということもある）、
特に高重合度キトオリゴ糖の製造法に関するものである
。

更に詳細には、本発明は、酵素を用いる生化学的な手法
によって、キトペンタオース、キトヘキサオース（各々
ＣＯ５５，ＣＯ３６ということもある）を中心とする重
合度が比較的高いキトオリゴ糖の非常に効率のよい製造
法に関する。また本発明は、限外濾過膜を使用するキト
オリゴ糖の連続的製造法にも関するものである。

（従来の技術） キトサンは、カニやエビ殻から得られるキチンを脱アセ
チル化して得られる、　２−アミノ−２−デオキシ−〇
−グリコースの１，４グルコシド結合で直鎖状に結合し
た塩基性の多糖類である。

この高分子塩基性多糖より得られたキトオリゴ糖または
このＮ−アセチル化物であるドアセチルキトオリゴ糖に
抗菌活性、抗腫瘍活性が見いだされ、特にその重合度の
比較的高い６糖、７糖に活性の高いことが明らかにされ
ている〔デイ−・エフ・ケンドラ−およびり−・ニー・
ハドウィガー：エクスペリメンタル・マイコロジー（Ｄ
、Ｆ、Ｋｅｎｄｒａａｎｄ　　Ｌｅｅ　Ａ、）Ｉａｄｗ
ｉｇｅｒ：　　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｙｃｏｌ
ｏｇｙ）第８巻、２７６〜２８１頁（１９８４））、　
　［別冊フードケミカル１、キチン／キトサンの科学、
４７〜５３頁（１９８７））。

また、ＣＯ５５のＮ−アセチル化物であるＮＡＣＯ３５
のバラニトロフェニル化物はりゾチームの基質となり、
白血病、大腸炎、肝疾患などの診断薬としての用途があ
り、試断薬の素材としてのＮＡＣＯ５５の需要が見込ま
れている。

キトオリゴ糖を得る方法としては、−船釣には、酸によ
る加水分解後、Ｄｏｗｅｘ−５０（Ｈ”型）を用いたイ
オン交換クロマトグラフィーによる方法（Ｈｏｒｏｖｉ
ｔｚ、　　Ｓ＋丁、、　　ｅｔ、　　ａｌ：　　Ｊ、　
　Ａ＋ｗ、　　Ｃｈｅｗ、　　Ｓｏｃ、。

Ｖｏｌ、　７９．５０４６〜５０４９（１９５７））が
知られているが、この方法は濃い酸、高温での非常に苛
酷な条件での加水分解が必要であることと、単糖を多量
に含む低重合度のキトオリゴ糖が多く生じるという欠点
がある。

また、酵素による分解後、分解液をバイオラッドＡＧ−
５０１１−Ｘ８（Ｈ”型）で分離した例も報告されてい
るが［Ｉｚｕ＋＊ｅ、　Ｍ　ｅｔ、　ａｌ：　Ａｇｒｉ
ｃ、　Ｂｉｏｌ＋Ｃｈｅｗ、。

Ｖｏｌ、　５１．１１８！ｊ−１１９１（１９８７））
、　コ（１）場合、単糖は生成されないものの、キトビ
オース、キトトリオース、キトテトラオースが大部分で
それより重合度の高いオリゴ糖はほとんど得られていな
いのが現状である。

（発明が解決しようとする問題点） 上記したように、キトペンタオース、キトヘキサオース
、キトヘプタオースまたはそのＮ−アセチル化物に高い
生理活性が明かにされているが、大量に入手する手段が
なくこれらの重合度の比較的高いキトオリゴ糖を効率よ
く安価に得る方法の開発が強く望まれていた。

（問題点を解決するための手段） 本発明は上記した問題点を一挙に解決するためになされ
たものであって、比較的重合度の高いキトオリゴ糖を効
率よく製造する目的でなされたものである。

キトサンを分解する方法としては酵素による分解方法が
あるが１本発明者らは、種々の市販の酵素剤、その他種
々微生物由来のキトサナーゼについてその基質特異性１
反応条件等について鋭意検討した結果、酵素反応時のｐ
Ｈを至適ｐＨより低いｐＨに設定することによりキトペ
ンタオース以下の低重合度のオリゴマーの生成を抑制し
、重合度の高いオリゴ糖が特異的に生成してくることを
見いだし、本発明を完成するに到ったものである。

すなわち本発明は、キトサン分解酵素をキトサンに作用
させてキトオリゴ糖を製造する際、反応液のｐＨを酵素
の至適ｐＨよりも低く設定維持し、もって高重合度のキ
トオリゴ糖を選択的に製造することを基本的技術思想と
するものである。

以下、本発明について詳述する。

本発明において使用するキトサン分解酵素は、市販のキ
トサン分解活性を有する酵素剤、または公知微生物を培
養することによって得られるキトサン分解活性を有する
酵素であればいずれの酵素でもよい。

例えば、バチルスｓｐ、　ＵＴＫ　（ＦＥＲＭ　Ｐ−１
１４４２）、ストレプトマイセス・グリセウスＨＬＩＴ
　６０３７等の生産する酵素が好適に使用出来る。

また１本発明において原料ないし酵素基質として使用す
るキトサンは、市販のキトサンが適宜自由に使用できる
が、脱アセチル化度の高いもののほうが好適に使用でき
る。

本発明を実施するには、例えば、脱アセチル化度７０％
以上好適には脱アセチル化度８０％以上のキトサンを、
トリス−マレイド−ＮａＯＨ緩衝液、マキルバイン氏緩
衝液、酢酸緩衝液またはコハク酸−ＮａＯＨ緩衝液等の
緩衝液を用いてキトサン分解酵素の至適ＰＨよりも低い
ｐＨ１好適にはｐＨ４，５〜５．５に、且つ０．１〜０
．５％になるように溶解し、この基質溶液１００＋＋Ｑ
当り１〜５０単位（１単位は１分間に１マイクロモルの
グルコサミンに相当する還元力を増加させる活性）加え
、２５℃〜４０℃で反応させる。

反応時間については、格別の限定はなく、生成してくる
還元力の増加を目安にして適宜設定すればよい。５時間
以上反応させ、反応住成物をＣＭセファデックスＣ−２
５イオン交換クロマトグラフイ−Ｄｏｖｅｘ５０ｗ　Ｘ
　８イオン交換クロマトグラフイー、ＣＭトヨパール６
５０Ｍイオン交換クロマトグラフィー等により分離生成
したところ、ＣＯ５４〜ＣＯ５６の生成量がほぼ一定量
となり、その量比もほぼ一定となった。従って１反応時
間は５時間以上あれば充分である。

また本発明によれば、上記反応液を限外濾過膜を介すこ
とにより低分子化した反応生成物を連続的に反応系外に
取り出しく一方、未分解のキトサン及びそれが一部分解
した高分子物質は、酵素とともに再度酵素反応系に返し
てやり、そして、基質及び緩衝液の減少分を新たに補充
してやり）、これをクロマト処理し、適当な濃度勾配の
溶剤で順次溶出して、各種の高級キトオリゴ糖画分を連
続的に得ることができる。

この連続法は、特に工業的製法としてすぐれている。な
お限外濾過膜としては、ポリアクリロニトリル系、ポリ
エーテルサルホン酸系等市販されているものであって、
使用する酵素分子より穴の大きさが小さい膜であれば何
でもよいが、分画分子量３０，０００．１０，０００の
膜が好適に使用できる。限外濾過膜のモジュールタイプ
としても、管状モジュール、中空系モジュール、プリー
ツモジュール、スパイラルモジュール等が適宜使用され
る。

以上の本発明方法により、非常に効率よく比較的高重合
度のキトオリゴ糖の製造が可能となる。

次に実施例を掲げ説明する。

実施例１　キトサン分解酵素の製造 ストレプトマイセス・グリセウスＨＵＴ６０３７を、５
００ｍＱの三角フラスコ中でグルコース１．５％、酵母
エキス１．０％、ペプトン０．４％の組成を有する培地
１００ｍＭに植菌し、３０℃、２４時間培養した。

得られた種培養液を３ＯＬのジャーファーメンタ−中で
キトサン０．２５％、酵母エキス１．０％、ペプトン０
．４％の酵素生産培地１８Ｌに植菌し、３０℃で通気量
１　ｖｖｍ、撹拌２００ｒｐｍで６０時間培養した。

得られた培養液を遠心分離（１０，０ＯＯｒρｍ）シて
菌体を除き、更に分画分子量ｓｏｏ、ｏｏｏの膜で除菌
した後、培養上澄を酵素液として使用した。

この時の培養上澄の酵素活性は６Ｕ／ＩＩＩＱであった
。

同様に処理して、バチルスｓｐ、　ＵＴＫ　（ＦＥＲＮ
　ｐ−１１４４２）からもキトサン分解酵素が得られた
。

実施例２　バッチ法による高重合度キトオリゴ糖の製造 キトサン（片倉チッカリン製　脱アセチル化率８３％）
　０．５ｇを０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５）　１００ｍ
Ｒに溶解し、更に酵素液６ｍＱ（酵素活性６０／ｍＱ）
を加え３０℃で反応させた。

反応の経時的変化を還元糖量 （Ｓｏｎ＋ｏｇｙｓ−Ｎｅｌｓｏｎ法）を測定した。そ
の結果を第１図に示した。

グルコサミン換算の還元力１２００μｇ／ｍＱのときの
反応液をＣＭ／Ｍファデックス−Ｃ２５カラムクロマト
グラフイーによって吸着させ、食塩の濃度勾配で溶出分
画することによってＣＯ５４、ＣＯ５５、ＣＯ５６各々
を得た。本発明方法による溶出パターンを第２図に、従
来法の溶出パターンを第３図に示した。また各々の量比
を第１表に示した。

第１表 ＣＯ５２２５ ＣＯ５３５５ ＣＯ５４７０ ＣＯ３５６０ ＣＯ５６３５ ＣＯ５７２５ 実施例３　連続反応法による高重合度キトオリゴ糖の製
造 キトサン（片倉チッカリン社製　脱アセチル化率８３％
）　２００ｇを０．１Ｍ酢酢酸液液ｐＨ５）　４０ｕニ
溶解した。

酵素液は実施例１で製造したものを５００＋ｉｆｌ加え
３０℃で反応させた。

限外濾過膜ホローファイバー型分画分子量１０．０００
（７ミｍｌ　ン社製ＨＩＰ１．０−２０型）の膜を介し
、低分子画分を外に押し出しながら１００＋＋１２／ｗ
ｉｎで循環させた。

外液をＣＭ−セファデックス−Ｃ−２５カラムクロマト
グラフイーにかけ、同様食塩濃度勾配で溶出し分離・分
画した。

また、反応液の基質及び酢酸緩衝液は低分子化されたキ
トサン画分と共に外液に流出する為０．１％キトサン含
有０．１Ｍ酢酸緩衝液１０ｍＱ／ｍｉｎの流速で補充し
た。

２４時間反応後の外液をＣトモファデックス−Ｃ２５カ
ラムクロマトグラフイーにかけ分離・分画した。

その時の各々の両分の収量を第２表に示した。

第２表 Ｏ３２ Ｏ３３ Ｏ３４ ＯＳ５ Ｏ３６ （発明の効果） 本発明によれば、酵素反応液のｐＨをコントロールする
という新規な工程を採用したことにより、各種の高級キ
トオリゴ糖を非常に高い収率で製造することができる。

更にまた、限外濾過膜処理を行えば、連続化が可能とな
るので、この方法は、工業的な製法として特に好適であ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例２における経時変化を図示したものであ
り、第２図及び第３図は、本発明方法及び従来法による
各種キトオリゴ糖の溶出パターンを、それぞれ図示した
ものである。 第１図 代理人　弁理士　戸　１）親　男 反応時間（ｈ「）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）キトサン分解酵素をキトサンに作用させキトオリ
   ゴ糖を製造する際、反応液のｐＨを酵素の至適ｐＨより
   も低くすることにより、特異的に高重合度のキトオリゴ
   糖を得ることを特徴とするキトオリゴ糖の製造法。
2. （２）反応液のｐＨを４．５〜５．５とすることを特徴
   とする請求項１に記載のキトオリゴ糖の製造法。
3. （３）限外濾過膜を介し、反応生成物を反応系外に取り
   出し、更に反応系にキトサンを補充することにより連続
   的に高重合度のキトオリゴ糖を得ることを特徴とする請
   求項１又は２に記載のキトオリゴ糖の製造法。