WO2010051612A1 - Processo industrial continuo para produção de polissacarídeo sob a forma de caldo concentrado base água - Google Patents

Processo industrial continuo para produção de polissacarídeo sob a forma de caldo concentrado base água Download PDF

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WO2010051612A1
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xanthomonas
broth
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enzyme
better
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PCT/BR2009/000371
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Inventor
Alessander Acacio Ferro
Marino Tadeu Fabi
José Fernando BARRETO DA SILVA
Lucio José Sobral ROCHA
Luca Pessoa Buzzanelli
Edson Quirino Buzzanelli
Original Assignee
Serviço Nacional De Aprendizagem Industrial - Senai/Dr-Ba
Quantas Biotechnologia S/A
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    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
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    • C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0024—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Glucans; (beta-1,3)-D-Glucans, e.g. paramylon, coriolan, sclerotan, pachyman, callose, scleroglucan, schizophyllan, laminaran, lentinan or curdlan; (beta-1,6)-D-Glucans, e.g. pustulan; (beta-1,4)-D-Glucans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Glucans, e.g. lichenan; Derivatives thereof
    • C08B37/0033—Xanthan, i.e. D-glucose, D-mannose and D-glucuronic acid units, saubstituted with acetate and pyruvate, with a main chain of (beta-1,4)-D-glucose units; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds

Definitions

  • the present invention relates to polissacar Videos water based, especially Xanthan Gum f which is produced in the form of concentrated broth in a continuous process that links the stages of growth of Xanthomonas cells campestris as well as other species of Xanthomonas, or other microorganisms with production of the corresponding polysaccharide. (I.e.
  • Water-based polysaccharides are produced by fermentation of carbon sources, especially glucose, but also other carbohydrates in culture media rich in nitrogen and inorganic, cationic and anionic species by microorganisms of the genus Xanthomonas of various species, Xanthomonas campestris.
  • the glucose fermentation product in a medium consisting of potassium monohydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate and magnesium sulfate by treatment of the fermented broth with substances of phenolic nature has its practically triplicate viscosity as well as the fertility of such fermented broth.
  • a culture broth suitable for the direct use in recovering oil wells is obtained by the fermentation of a carbohydrate, a source of nitrogen, an acid assimilable from the Krebs cycle, such as citric acid, calcium in the complexed form and elements in trace-level concentration, which final broth is substantially free of insoluble materials having particles greater than 3 microns.
  • Cadmus et al. A xanthan gum substantially free of insoluble materials of suitable staining, having a high content of bound pyruvate, is produced by the fermentation of Xanthomonas campestris in a carbohydrate-rich medium and containing as the source of nitrogen the substance monohydrogen phosphate of diammonium at a level of 0.15%, and so that the phosphate content of the medium is at least on the order of 0.25%.
  • a high performance fluid for recovery of oil wells is achieved by heating the fermentation broth to temperatures in the range of 100 ° C in a condition wherein the corresponding xanthan is in the salt form with anions which may be chloride, carbonate, sulfate, bicarbonate or the like.
  • the polysaccharide is subjected to the growth stages of the microorganism and fermentation, thus obtaining the fermentation broth.
  • This fermentation broth contains about 2% biopolymer and 1.5% to 2% cells and residues from the xanthomonas growth process and biopolymer production.
  • the polysaccharide is precipitated with solvent of the alcohol type or subjected to ultrafiltration or ultra-centrifugation for the removal of cells and residues after the pasteurizing step which has inactivated those cells. Thereafter, after precipitation and washing, a drying step is carried out to produce the powdered polymer.
  • the continuous industrial process for the production of polysaccharide in the form of concentrated, water-based broth results in a product that is used directly in the injection for recovery of oil in wells considered depleted.
  • the fermentation broth resulting from the development of xanthomonas in carbon source after pasteurization and containing remains of cells constituted of particulate material with nefarious effect, in order to reduce the injectivity of this polymer in aqueous solution, is treated enzymatically so that the particles are cleaved so as to leave no particles larger than 5 (five) microns in diameter.
  • the proper use of the enzymes after the pasteurisation step is the key to ensuring the quality of the fermented broth as regards its injectivity characteristic is guaranteed, allowing it to be used directly after dilution in the recovery of mature oil wells, if the solid product and subsequently dissolve it, which means a saving of energy and operations to reach an aqueous product, which already meets stringent specifications for the important operation of recovery of advanced oil wells offshore.
  • Figure 1 shows a flowchart of the process for producing polysaccharide in the form of concentrated water-based broth.
  • the ingredients (1) are added for the preparation of the production culture medium.
  • This production culture medium (2) is transferred to the fermenter F-01 which still receives the cell concentrate (3). Appropriate process controllers are available in this fermenter.
  • the fermented broth (4) is sent to pasteurizer PAS-01, which operates in closed loop with the fermenter F-01.
  • the pasteurized broth (5) resulting from the pasteurization is sent to the reactor TE-01 or may be returned to the fermenter F-01.
  • the pasteurized broth is enzymaticised, under controlled conditions.
  • the enzyme still product receives the bactericidal agent in the same reactor TE-01.
  • the final product of this process called the water-based concentrated broth (6) will be available for the final treatment of xanthan gum.
  • Base-water polysaccharides a class of products of which xanthan gum and other water-soluble gums are representatives, are widely applied in cosmetics, pharmaceuticals, food, textiles and, in the case of xanthan gum, have a specific use that is related to petroleum, in several stages of its extraction, either in the drilling and completion of an oil well or in the viscosification of water for recovery of advanced oil wells.
  • the present invention relates to experimental data of xanthan gum, although the procedures and ideas presented herein are of equal value also for the other water-based polysaccharides as representatives of a larger class of biopolymers, which are in themselves recommended because they are non-toxic materials. synthetic and therefore preferable with respect to polymers of synthetic nature.
  • water-based biopolymers for which the content of this patent refers are carrageenan gums, pullulans, pectins, soluble chitosan and some water-soluble gelatins, in aspects especially related to enzymatic procedures that can be used in their industrial operation and to the general aspects of microbiological action described herein, specifically for xanthan gum.
  • Xanthan gum is a hydrophilic polysaccharide obtained by the fermentation of appropriate carbohydrate based nutrients by the action of specific microorganisms specially belonging to the genus Xanthomonas.
  • the hydrophilic colloid of Xanthomonas campestris is a microbial heteropolysaccharide containing glucose, mannose, glucuronic acid, O-acetyl radical attached to central mannose and pyruvate attached by acetal bond to the side mannose, in a ratio of 2: 2: 1: 1: 0.5.
  • Xanthomonas campestris is the preferred bacterium for the purpose of synthesizing the xanthan gum biopolymer
  • other Xanthomonas species may also be used such as Xanthomonas begoniae, Xanthomonas tranlucens, Xanthomonas vasculorum, Xanthomonas malvacearum,
  • Xanthan gum is obtained by growth of Xanthomonas campestris or other species in YM culture medium followed by the development of polysaccharide-based medium for 2 HP0 4 and MgS0 4.
  • the substrate for the growth and production stages is sucrose or other carbohydrates isolated or together that can be used (this process occurs in (3)).
  • the fermented broth After development and production of polysaccharide xanthan gum, the fermented broth is subjected to pasteurization. This fermentation broth has a viscosity of 300-0 to 6,000 Cp (this process also occurs in the fermenter F-01).
  • the pasteurized broth is subjected to treatment with an enzyme of the polygalacturanase family at a content of 80 to 240 ppm, better 90 to 150 ppm, still better 95 to 120 ppm, at a temperature of 26 ° C to 64 ° C, better than 35 ° C at 45 ° C and even better at 42 ° C to 48 ° C for a set time of 1 to 8 hours, better 3 to 7 hours, better still 4 to 6 hours.
  • a second protease family enzyme is added at about 10 to 1000 ppm in the same manner and the stirring is continued at 42 ° C at 48 ° C, and in the same H, for another 3 to 5 hours (this process occurs in the reactor TE-01).
  • This solution after enzymatic treatment, receives a bactericide like formaldehyde or another substance to allow its conservation (addition of bactericide occurring in the reactor TE-01).
  • the enzymes used in the process are commercial products.
  • the enzymes were used in solution and in the way they were received from the specialist manufacturer.
  • the choice of enzyme concentration to be used, ie the volume of enzyme solution to be applied in each assay was performed according to the manufacturer's data on its activity and previous tests of the individual performance of each enzymatic agent used alone or together.
  • the enzymes involved are of the protease and galacturanase type.
  • the protease used was COROLASE ® 9 from AB Enzimas Ltda. Such an enzyme preparation has a declared minimum activity of 840 uhb g -1 .
  • Two polygalacturanases were used which were ROHAPECT ® DA12L and ROHAPECT ® MA Plus.
  • ROHAPECT® DA12L shows: a declared activity of 50 PA.
  • ROHAPECT® MA Plus has a reported activity of 55 PA.
  • the PA unit is the reciprocal value of the amount in kilograms required to depectinize 100 liters of a standard apple juice under standard conditions (50 ⁇ C, pH 3.2, 1 hour).
  • a typical fermentation broth is a pseudoplastic solution containing from 0.5 to 4% by weight of the biosynthetic polysaccharide, together with small amounts of salts, unreacted carbohydrate, Xanthomonas cells and other insoluble "debris" normally present in the concentration range of mass ratio of 0.6 to 2.5%.
  • the insoluble solids are difficult to remove from the stock containing the biopolymer, and the presence of such insoluble materials causes that suspension to have an opaque rather than transparent feature.
  • a Xanthomonas fermentation culture medium In a typical process for clarifying a Xanthomonas fermentation culture medium, it is treated with water to reduce the viscosity, optionally the solution being sufficiently diluted, filtered - for removal of suspended solids.
  • a salt such as potassium chloride and a non-solvent such as methanol, ethanol or isopropanol are added to the culture medium to floculate the gum in potassium form and the gum is then recovered by centrifugation or other solid / liquid separation technique. Subsequent steps of dissolution, reprecipitation and washing are commonly used. In such processes the alcoholic solvent is recovered and recycled.
  • Carbohydrates sources of carbon in the fermentation with bacteria of the genus Xanthomonas, may be glucose, sucrose, fructose, galactose, soluble starch, corn starch, and others. Such carbohydrates are not necessarily used in refined form, and molasses or other sources with a high carbohydrate content may be used.
  • the biopolymer formed by fermentation in solution is separated from the aqueous medium by precipitation or drying being recovered in the solid state.
  • the product is the water-based concentrated broth without the precipitation of the biopolymer contained therein.
  • This concentrated aqueous broth has direct application in the tertiary recovery of petroleum.
  • the absorbance response curve at 630 nm as a function of cell concentration is also shown in Table 1 below.
  • the data show the improvements in transparency obtained as a function of the enzymatic treatment.
  • the linearity range of this curve is set from 0.50 to 3.00 g / kg of solution.
  • the absorbance curve x concentration in grams / kg gives the linear coefficient and the coefficient that were introduced in the in-line apparatus, the curve has the correlation coefficient of 0.9999.
  • Xanthomonas campestris cells from the ATCC collection derived from B-1459, selected by several replications and conserved in YM growth medium, as mentioned in the prior art, compound of yeast, malt, agar and peptone in Ependorf type flask were integrally transferred to two 400 ml Erlemeyers each containing 100 ml of YM medium and allowed to grow for 48 to 96 hours at 26 ° C to 30 ° C shaker. This material was stored in a refrigerator (2).
  • the stirring and aeration conditions were maintained for 91 hours at 28-30 ° C. Throughout the process it is found that the measured oxygen content is in the range of 1 to 2 mg / l.
  • the carbon dioxide content in the range of 20 to 60 mg / l.
  • No external pH control is applied, having varied in the range of 7 to 4.58 until the end of the fermentation process.
  • the CO 2 content is maintained from 1 to 25 mg / l and the oxygen content in the range of 2 to 8 mg / l.
  • the fermented broth had a viscosity of 4720 Cp (6 RPM) at the end of the production phase. This broth contains low sucrose content in excess not yet consumed.
  • the precipitated product with isopropanol expressly for analysis as dry xanthan gum, has a pyruvic acid content of about 2.56%.
  • protease choralease enzyme solution (Type 2) was added and the medium was maintained between 45 ⁇ C and 55 ⁇ C for five hours. Thereafter, 40 ml of polygalacturanase enzyme solution was added (AB Enzimes) and the medium was maintained between 45 ⁇ ° C and 55 ⁇ ° C for five hours.
  • protease choralease enzyme solution (Type 1) was added and the medium was maintained between 45 ⁇ C and 55 ⁇ C for five hours. Thereafter, 40 ml of polygalacturanase enzyme solution was added (AB Enzimes) and the medium was maintained between 45 ⁇ ° C and 55 ⁇ ° C for five hours.
  • Mean value of final cell concentration 0.2 g / kg of fermented broth.
  • Mean value of final cell concentration 0.3g / kg fermented broth.
  • the cell content is measured by absorbance of the standard 630 nm solution against established response curve with Xanthomonas cells subjected to the growth stage, pasteurization and then oven dried at 105-110 ° C until constant weight.
  • This material in the form of dry mass, was kept in a desiccator and used for the quantification of cells in the growth and production media, by its absorbance measurement at 630 nm.
  • the HAZEN measurement was also used, in each case, the absorbance values being correlated at 630 nm with the Hazen value of each suspension.
  • a control of the non-enzymatically treated example 1 process showed the HAZEN value equal to 220 measured directly.
  • the broth corresponding to example 1 showed the value 112, which corresponded to an increase of transparency in relation to the control of 50.5%.
  • the broth corresponding to example 2 showed the value 87, which corresponded to an increase of transparency in relation to the control of 61%.
  • the broth corresponding to example 3 showed the value 10, which corresponded to an increase of transparency with respect to the control of 96%.

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Abstract

Para um processo industrial contínuo de produção de polissacarídeo sob a forma de caldo concentrado base água, é empregada a fermentação de fonte de carbono adequada, que pode ser glicose, sacarose ou outra, por microorganismos do tipo Xanthomonas campestris ou outras espécies de Xanthomonas, em meio de crescimento e de produção em um único reator controlado por analisadores de oxigênio, dióxido de carbono, pH e temperatura, sendo o produto fermentado e pasteurizado, tratado posteriormente com enzimas poligalacturanase e proteases obtende-se um caldo fermentado suficientemente transparente e sem resíduos celulares que pode ser adequadamente armazenado ou utilizado diretamente na recuperação de poços avançados de petróleo.

Description

PROCESSO INDUSTRIAL CONTÍNUO PARA PRODUÇÃO DE
POLISSACARÍDEO SOB A FORMA DE CALDO CONCENTRADO BASE ÁGUA
A presente invenção trata de polissacar deos base água, especialmente Goma Xantanaf que é produzido em forma de caldo concentrado, em processo continuo que encadeia as etapas de crescimento das células de Xanthomonas campestris e também de outras espécies de Xanthomonas, ou demais microorganismos com as etápas de produção do polissacarideo correspondente. ¾
É um processo enzimático que garante a transparência, a filtrabilidade e a injetividade do biopolimero obtido. Esse caldo concentrado base água tem aplicação direta na recuperação de petróleo em poços "off shore" e ou "on shore", considerados maduros e em queda de produção.
Estado da Técnica
Polissacarideos base água, especialmente goma xantana, são produzidos por fermentação de fontes de carbono, especialmente glicose, mas também outros carboidratos em meios de cultura ricos em nitrogénio e em espécies inorgânicas, catiônicas e aniônicas por microorganismos do género Xanthomonas de diversas espécies, destacando-se Xanthomonas campestris .
A fermentação de carboidratos para produzir biopolimeros aquo-solúveis pela ação de bactérias do género Xanthomonas é bem conhecida.
0 primeiro trabalho nesse campo foi desenvolvido pelo United States Department of Agriculture e descrito na Patente US 3.000.790 em nome de Jeanes et al. , onde a ação de Xanthomonas campestris NRRL B-1459 é bem conhecida sobre um substrato de glicose. Conforme revelado na Patente US 3.208.518, em nome de Patton, o polissacarideo iônico que caracteriza a goma xantana é produzido por inoculação de um meio estéril contendo aproximadamente 2% de açúcar de diversas origens, 0,1% de fosfato dipotássico com Xanthomonas campestris em condição aeróbica à temperatura de 24°C. O fermentado após 72 horas é filtrado para remover as células e então diluído para produzir uma solução a 0,075% de polissacarideo que pode ser injetado diretamente na recuperação de poços avançados de petróleo.
Conforme revelado na Patente US 3.355.447, em nome de 0'Connell, as etapas de crescimento e fermentação utilizando glicose como fonte de carbono, iniciando-se com inoculação a partir das células de Xanthomonas campestris , devem ser seguidas distintamente, recomendando-se um meio de produção onde a fonte de nitrogénio é um "distiler dry solubles" e que contem sulfato de magnésio e fosfato dipotássico e é fonte de nitrogénio. Os autores, após a fermentação, submetem o caldo obtido ao aquecimento à 75 °C, em pH 8-9 , sendo esse caldo apropriado para o uso em recuperação de poços avançados de petróleo.
Da mesma forma, conforme revelado na Patente US 3.591.578, em nome de Colin et al., o aquecimento do caldo de cultura a 80 °C ou temperatura ainda superior leva a um caldo de fermentação diretamente aplicável em operação de recuperação de poços de petróleo de forma vantajosa em relação ao caldo não submetido a aquecimento.
Conforme revelado na Patente US 3.801.502, em nome de Hitzman, o produto de fermentação de glicose em um meio constituído de monohidrogeno fosfato de potássio, dihidrogeno fosfato de potássio e sulfato de magnésio, por tratamento do caldo fermentado com substâncias de natureza fenólica, tem sua viscosidade praticamente triplicada bem como a fxltrabilidade desse caldo fermentado.
Conforme revelado na Patente US 3.966.618, em nome de
Colegrove, o uso de enzimas do tipo protease alcalina pode melhorar sensivelmente as características, tanto de filtração quanto de clarificação de um caldo de cultura resultante da fermentação de glicose com Xanthomonas campestris e outras espécies de Xanthomonas. ¾
Conforme revelado na Patente US 4.119.546, em nome de Wernau, um caldo de cultura apropriado para a utilização direta em recuperação de poços de petróleo é obtido pela fermentação de um carboidrato, uma fonte de nitrogénio, um ácido assimilável do ciclo de Krebs, como ácido cítrico, cálcio na forma complexada e elementos em concentração a nível de traços sendo que esse caldo final é sensivelmente livre de materiais insolúveis que tenham partículas superiores a 3 micra.
Conforme revelado na Patente US 4.394.447, em nome de
Cadmus et al., uma goma xantana substancialmente livre de materiais insolúveis e de coloração adequada, apresentando alto teor de piruvato ligado, é produzida pela fermentação de Xanthomonas campestris em um meio rico em carboidrato e contendo, como fonte de nitrogénio, a substância monohxdrogeno fosfato de diamônio a um nível de 0,15%, e de forma que o teor de fosfato do meio seja pelo menos da ordem de 0,25%.
Conforme revelado na Patente US 4.182.860, em nome de Lars et al., um fluido de alta performance para a recuperação avançada de poços de petróleo é obtido pelo aquecimento do caldo de fermentação à temperaturas da ordem de 100°C em condição em que a xantana correspondente esteja na forma salina com ânions que podem ser cloreto, carbonato, sulfato, bicarbonato ou outros.
Respeitadas, quanto aos aspectos cinéticos, o polissacarideo é submetido às etapas de crescimento do microorganismo e de fermentação, obtendo-se, assim, o caldo de fermentação. Esse caldo de fermentação contém por volta de 2% de biopolimero e de 1,5% a 2% de células e resíduos do processo de crescimento da xanthomonas e de produção do biopolimero. Via de regra, o polissacarideo é precipitado com solvente do tipo alcoólico ou submetido à ultra- filtração ou à ultra-centrifugação para a remoção das células e resíduos após a etapa de pasteurização que tenha inativado essas células. Segue-se, após a precipitação e lavagem, uma etapa de secagem produzindo-se o polímero em pó .
Conforme revelado nas Patentes US 4.010.071 me nome de Colegrove, e US 4.119.491, em nome de Wellington, o tratamento enzimático é recomendado para reduzir a tendência de entupimento de polissacarídeos em sua injeção como solução viscosificante na recuperação de poços de petróleo. Ambas patentes descrevem o tratamento do caldo de fermentação com a enzima protease que, segundo os autores, ataca especificamente os fragmentos de paredes celulares em suspensão no meio, reduzindo assim significativamente a tendência desse caldo de cultura de entupir os poros das reentrâncias nos depósito de petróleo conforme já mencionado. Para as diversas utilizações do polímero, a forma sólida de apresentação é a desejada. Para a utilização em recuperação de poços avançados de petróleo a forma em solução, na concentração geralmente de 0,2% de polímero em água é a utilizada. Essa solução deve cumprir rigorosas especificações quanto à massa molecular do polímero, estabilidade química e biológica do polímero e de tamanho de .partículas. Via de regra, . tratamentos enzimáticos células e resíduos
Figure imgf000006_0001
xantana. Diversas condições descritas na literatura quanto ao pH, temperatura, tempo de contato e tipos de enzimas são mencionadas.
O processo industrial contínuo para produção de polissacarídeo sob a forma de caldo concentrado, base água, resulta num produto que é utilizado diretamente na injeção para recuperação de petróleo em poços considerados esgotados. 0 caldo de fermentação, resultado do desenvolvimento de xanthomonas em fonte de carbono após pasteurização, e contidas de restos de células constituídas de material particulado com efeito nefasto, com a finalidade de reduzir a injetividade desse polímero em solução aquosa, é tratado enzimaticamente de forma que as partículas são clivadas de maneira a não restarem partículas de diâmetro maior do que 5 (cinco) micra. 0 uso adequado das enzimas após a etapa de pasteurização é a chave para que a qualidade do caldo fermentado quanto à sua característica de injetividade, seja garantida, permitindo- lhe ser utilizado diretamente após diluição na .recuperação de poços maduros de petróleo, evitando precipitar-se o produto sólido e posteriormente dissolvê-lo, o que significa uma economia de energia e de operações para chegar a um produto aquoso, que já cumpre especificações rigorosas para a importante operação de recuperação de poços avançados de petróleo a alto mar.
Breve descrição do desenho
A Figura 1 representa um fluxograma do processo para produção de polissacarideo sob a forma de caldo concentrado base água. ff!
Descrição do Processo
No misturador ME-01 são adicionados os ingredientes (1) para a preparação do meio de cultura de produção. Esse meio de cultura de produção (2) é transferido para o fermentador F-01 que ainda recebe o concentrado de células (3). Nesse fermentador F-01 estão disponíveis controladores de processo adequados.
0 caldo fermentado (4) é enviado ao pasteurizador PAS- 01, que opera em circuito fechado com o fermentador F-01. 0 caldo pasteurizado (5), resultante da pasteurização é enviado ao reator TE-01 ou poderá retornar para o fermentador F-01. No reator TE-01 é feita a enzimatização do caldo pasteurizado, sob condições controladas . 0 produto caldo enzimatizado ainda recebe o agente bactericida no mesmo reator TE-01.
0 produto final desse processo, denominado de caldo concentrado base água (6) estará disponível para o tratamento final da goma xantana.
Detalhamento do Processo
Polissacarídeos base-água, uma classe de produtos da qual goma xantana e outras gomas aquo-solúveis são representantes, têm ampla aplicação em cosméticos, farmacêutica, alimentícia, têxtil e, no caso da goma xantana apresentam um uso específico que é aquele referente à petróleo, em diversas etapas de sua extração, seja na perfuração e completação de um poço de petróleo ou na viscosificação de águas para recuperação de poços de petróleo avançados.
A presente invenção refere-se a dados experimentais da goma xantana, embora os procedimentos e ideias aqui apresentados sejam de igual valia também para os demais polissacarídeos base água como representantes de uma classe maior de biopolímeros, por si só recomendáveis por se tratarem de materiais não sintéticos e, portanto preferíveis em relação aos polímeros de natureza sintética.
Entre os demais biopolímeros base água para os quais o conteúdo dessa patente se refere, constam-se as gomas carragenana, pululana, pectinas, quitosana solúvel e algumas gelatinas aquo-solúveis , nos aspectos especialmente relacionados a procedimentos enzimáticos utilizáveis em sua operação industrial e aos aspectos gerais de ação microbiológica aqui descritos, especificamente para goma xantana .
A goma xantana é um polissacarídeo hidrofílico obtido pela fermentação de nutrientes adequados à base de carboidratos pela ação de microorganismos específicos especialmente pertencentes ao género Xanthomonas .
O colóide hidrofílico de Xanthomonas campestris é um heteropolissacarídeo microbial que contém glicose, manose, ácido glicurônico, radical O-acetil ligado à manose central e piruvato ligado por ligação acetal à manose lateral, numa proporção de 2:2:1:1:0,5.
Enquanto Xanthomonas campestris é a bactéria preferida para o propósito de síntese do biopolímero goma xantana, outras espécies de Xanthomonas podem também ser utilizadas tais como Xanthomonas begoniae , Xanthomonas tranlucens , Xanthomonas vasculorum, Xanthomonas malvacearum,
Xanthomonas carotae, Xanthomonas incanae, > Xanthomonas phaseoli, Xanthomonas vesicatória, '.^ Xanthomonas papavericolá , Xanthomonas hedrae. ' f
A goma xantana é obtida por crescimento de Xanthomonas campestris , ou outras espécies, em meio de cultura YM seguido do desenvolvimento do polissacarídeo em meio à base de 2HP04 e MgS04. O substrato para as etapas de crescimento e de produção é a sacarose ou outros carboidratos isolados ou em conjunto que podem ser utilizados (esse processo ocorre em ( 3 ) ) .
Após desenvolvimento e produção do polissacarídeo goma xantana, o caldo fermentado é submetido à pasteurização. Esse caldo de fermentação tem viscosidade de 300-0 a 6000 Cp (esse processo ocorre também no fermentador F-01).
O caldo pasteurizado é submetido a tratamento com uma enzima da família das poligalacturanases ao teor de 80 a 240 ppm , melhor 90 a 150 ppm , ainda melhor 95 a 120 ppm, à temperatura de 26°C a 64°C, melhor de 35°C a 45°C e ainda melhor de 42 °C a 48 °C por tempo definido de 1 até 8 horas, melhor de 3 a 7 horas, melhor ainda de 4 a 6 horas. Após esse período, adiciona-se uma segunda enzima da família das proteases ao teor aproximado de 10 a 1000 ppm da mesma forma e prosseguindo a agitação do caldo a temperatura 42 °C a 48 °C, e no mesmo H, por mais 3 a 5 horas (esse processo ocorre no reator TE-01).
Com esse tratamento, os debris e resíduos de células e excrementos dos microorganismos gerados em seu crescimento e ação de metabolização, são eliminados e o caldo alcança transparência expressa em HAZEM praticamente a 100% indicando a eliminação de todas as partículas que constituíam os resíduos celulares indicados acima. A esse processo de tratamento a enzimas, denominamos de í enzimatização .
Essa solução, após tratamento enzimático, recebe um bactericida como formol ou outra substância para permitir sua conservação (adição de bactericida ocorrendo no reator TE-01 ) .
As enzimas utilizadas no processo são produtos comerciais. Em termos desta invenção, optou-se pelas enzimas fornecidas pela empresa AB Enzimas Brasil Comercial Ltda. ligada à AB Enzymes GmbH, empresa anglo germânica .
As enzimas foram usadas em solução e da forma com que foram recebidas do fabricante especializado. A escolha da concentração de enzima a ser utilizada, ou seja, do volume de solução de enzima a ser aplicado em cada ensaio foi efetuada em função dos dados do fabricante quanto à sua atividade e ensaios prévios da performance individual de cada agente enzimático utilizado isoladamente ou em conjunto.
Optou-se finalmente por adotar o volume constante de 40 ml da solução de enzima para todas as enzimas utilizadas e para todas as operações realizadas, o que corresponde a 1000 PPM V/V da solução comercial do preparado" enzimático adicionados ao caldo fermentado (40 ml de enzima em 40 litros de caldo fermentado) .
As enzimas envolvidas são do tipo proteases e galacturanases . A protease utilizada foi a COROLASE® 9 da AB Enzimas Ltda. Tal preparado enzimático apresenta uma atividade mínima declarada de 840 uhb g-1. Duas poligalacturanases foram utilizadas quais sejam a ROHAPECT® DA12L e a ROHAPECT® MA Plus . A ROHAPECT® DA12L apresenta : uma atividade declarada de 50 PA. A ROHAPECT® MA Plus apresenta uma atividade declarada de 55 PA.
A unidade PA é o valor recíproco da quantidade em quilos requerida para depectinizar 100 litros de um suco de maçã padrão sob condições padrões (50 °C, pH 3,2; 1 hora).
Como dito acima, as soluções dessas enzimas foram sempre usadas a 1000 PPM (40 ml adicionados para 40 litros do meio de cultura no reator) . Os tempos de ação de enzimas, sejam aplicadas isoladamente, sejam em conjunto, foi sempre de 5 horas .
Um caldo de fermentação típico é uma solução pseudoplástica contendo entre 0,5 a 4% em peso do polissacarídeo biossintético, juntamente com pequenas quantidades de sais, carboidrato não reagido, células de Xanthomonas e outros "debris" insolúveis presentes normalmente na faixa de concentração de massa de 0,6 a 2,5%. Os sólidos insolúveis são difíceis de serem removidos do caldo que contém o biopolímero, e a presença desses materiais insolúveis faz com que essa suspensão tenha uma característica opaca ao invés de transparente. Para boa parte das aplicações de goma xantana, o fato de o caldo de TBR2009/000371
11
fermentação não ser transparente é altamente indesejável. Por exemplo, essas pequenas partículas tendem a entupir os poros das formações subterrâneas ou submarinas onde o petróleo está confinado quando a goma xantana é usada na viscosificação de fluido aquoso usado na recuperação de óleo de reservatórios de petróleo já maduros.
Em um processo típico para clarificação de um meio de cultura de fermentação de Xanthomonas, este é tratado com água para reduzir a viscosidade, sendo opcionalmente, a solução, suficientemente diluída, filtrada -para remoção dos sólidos em suspensão. Um sal como cloreto de potássio e um não solvente tal como metanol, etanol ou isopropanol são adicionados ao meio de cultura para flocular a goma na forma potássica sendo a goma então recuperada por centrifugação ou outra técnica de separação sólido/líquido. Subsequentes passos de dissolução, reprecipitação e lavagem são normalmente utilizadas. Em processos dessa natureza o solvente alcoólico é recuperado e reciclado.
Os carboidratos, fontes de carbono na fermentação com bactérias do género Xanthomonas, podem ser glicose, sacarose, frutose, galactose, amido solúvel, amido de milho, e outros. Tais carboidratos não são utilizados necessariamente em forma refinada, podendo-se usar melaço ou outras fontes com alto teor de carboidratos.
Na maioria dos casos, o biopolímero formado por fermentação em solução é separado do meio aquoso por precipitação ou secagem sendo recuperado no estado sólido.
No processo apresentado nessa patente o produto é o caldo concentrado base água sem a precipitação do biopollmero sólido nele contido.
Esse caldo aquoso concentrado tem aplicação direta na recuperação terciária de petróleo.
Economia significativa de toda a etapa de precipitação, secagem e armazenagem em silos é trazida por esse processo em que o produto é o polissacarideo base água na forma de caldo concentrado.
Os exemplos listados a seguir apresentam dados-chave desta invenção, sendo que a ordem de.¾ reagentes, quantidades, condições experimentais são apenas indicações desses exemplos e não devem ser consideradas como fatores de restrição à aplicação dessa invenção somente às condições aqui mencionadas.
Cada resultado de ensaio dos quatro ensaios mencionados no pedido de patente é, na verdade, a média de vinte e duas operações em continuo, em que todos os parâmetros foram mantidos constantes .
Os valores de absorbância das soluções após tratamento enzimático para cada ensaio estão representados nas tabelas de 2 a 5 referentes, respectivamente aos ensaios 1, 2, 3 e 4.
Os valores de Hazem de cada solução envolvida estão também representados nessas mesmas tabelas.
A curva de resposta das absorbâncias a 630 nm em função da concentração de células está também representada na tabela 1 a seguir.
Os dados mostram as melhorias na transparência obtidas em função do tratamento enzimático.
Os valores que foram apresentados no pedido de patente são os valores médios desses vinte e quatro ensaios para cada exemplo e que estão indicados nas tabelas 2 a 5. Tabela 1: Teor de células X absorbância a 630 NM
Figure imgf000014_0001
A faixa de linearidade dessa curva se estabelece de 0,50 a 3,00 g/kg de solução.
Na faixa de linearidade, a curva de absorbância x concentração em gramas /kg fornece o coeficiente linear e o coeficiente angular que foram introduzidos no aparelho em linha, a curva tem o coeficiente de correlação de 0,9999.
Muitos dos valores que constam nas tabelas 2 a 5, nos exemplos a seguir, se colocam fora da faixa de linearidade de medida. Assim, quando as tabelas apresentam valores de concentração de células superiores a 3,00 g/kg, esses representam apenas estimativas do valor real já que estão fora da faixa de linearidade da curva absorbância x concentração de células.
Exemplo 1
Preparação do inoculo
Células de Xanthomonas campestris de procedência da coleção ATCC, derivada de B-1459, selecionadas por diversas repicagens e conservadas em meio de crescimento YM, conforme mencionado no estado da técnica, composto de levedura, malte, ágar e peptona em frasco do tipo Ependorf foram integralmente transferidas para dois Erlemeyers de 400 ml contendo, cada um deles, 100 ml de meio YM e deixados crescer por 48 a 96 horas a 26 °C a 30 °C em shaker. Esse material foi conservado em geladeira (2).
Produção do biopolímero (F-01).
Em um reator de 50 litros dotado de agitação magnética, sensores de oxigénio, pH, dióxido;;..';de carbono, medidores de vazão de ar, foram introduzidos após assepsia plena, 40 litros do meio de produção consistindo de K2HP04, 100 g; MgS04.7H20, 4 g; CaC03, 0,4 g; (NH4)2S04, 40 g; Ácido Cítrico , 40 g; H3B03, 20 ml de solução 0,3%; Fe2Cl3.6H20, 20 ml de solução 0,24%; ZnS04.7H20, 20 ml de solução 0,6% em água contendo 800 g de sacarose (2%). A agitação foi mantida a 280 rpm por todo o processo. 0 pH foi ajustado a 7,2 com NaOH 4M e a pasteurização do meio a 115°C foi realizada por 25 min.
Após a temperatura atingir 28°C estando o pH a 7,11 e sendo os teores de C02 = 1,44 mg/l e 02 = 8,96 mg/l e a vazão de ar aproximadamente 10 Nl/min, adicionou-se 4 litros do inoculo preparado conforme indicado acima.
As condições de agitação e aeração foram mantidas por 91 horas à temperatura de 28-30 °C. Em todo o processo verifica-se que o teor de oxigénio medido está na faixa de 1 a 2 mg/l. 0 teor de dióxido de carbono na faixa de 20 a 60 mg/l. Nenhum controle externo de pH é aplicado, tendo ele variado na faixa de 7 à 4,58 até o fim do processo fermentativo. 0 teor de C02 mantendo-se de 1 até 25 mg/l e o teor de oxigénio na faixa de 2 até 8 mg/l. O caldo fermentado apresentou, ao final da fase de produção, uma viscosidade de 4720 Cp (6 RPM). Esse caldo de cultura contém teor baixo de sacarose em excesso ainda não consumida.
O produto separado por precipitação com isopropanol, expressamente para poder ser analisado na forma de goma xantana seca, apresenta teor de ácido pirúvico ligado da ordem de 2,56%.
A seguir, o caldo fermentado foi pasteurizado a 115 °C por 45 minutos. ;i
Após isso, foram adicionados 40 ml de solução de enzima protease coralase 7089 (AB ENZIMES) e o meio foi mantido entre 45 e 55 °C por cinco horas.
Nos exemplos de 2 a 4, a preparação do inoculo, a produção do biopolimero, a pasteurização e a adição de biocida foram conduzidos da mesma forma que no Exemplo 1. Diferenças existem na parte de ação enzimática.
Após isso, foram adicionados 25 ml de um biocida, solução a 20% (100 ppm) de formol.
Tabela 2: Valores Experimentais do Exemplo 1
A(INICIAL) Ccel(iniciaL)g/kg A (final) C cel(final)g/kg Hazen(INICIAL) Hazen (final)
1.15 3.46 0.195 0.856 221.35 115.03
1.10 3.34 ' 0.196 0.860 228.09 116.15
1.17 3.25 0.210 0.935 226,790 11 .78
1.16 3.18 0.216 0.945 225.12 112.02
1.09 3.31 0.218 0.949 227.08 117.78
1.31 3.56 0.179 0.787 225.15 111.56
0.945 2.99 0.173 0.756 214.78 10.45
1.11 3.13 0.214 0.945 224.17 118.18
1.15 3.45 0.197 0.867 219.26 115.78
1.08 3.27 . 0.179 0.807 221.09 116.89
1.21 3.76 0. 69 0.745 227.17 110.03
1.15 3.59 0.159 0.734 221.45 109.56
1.45 3.89 0.180 0.767 224.16 119.56
1.30 3.56 0.145 0.736 221.56 117.67
1.13 3.34 0.196 0.857 227.34 115.78
1.17 3.48 0.216 0.947 225.45 113.90
1.15 3.35 0.072 0.845 217.79 110.04
1.17 3.39 0.181 0.768 224.35 1 7.45
1.14 3.42 0.210 0.936 221.35 119.34
1.16 3.38 0.177 0.768 226.16 109.78
1.11 3.13 0.183 0.778 221.16 118.10
1.15 3.45 0.179 · 0.760 225.34 100.78 Valor médio de Hazen inicial = 220
Valor médio de Hazen final = 112 (Valor reduzido a 40,5% do valor inicial)
Redução no valor de Hazen = 50,5% em relação ao valor inicial valor médio de concentração de células final= 0,85 g/kg de caldo fermentado.
Exemplo 2
Mantendo as mesmas condições reacionais do exemplo 1, adicionou-se 40 ml de solução de enzima protease coralase (Tipo 2) e o meio foi mantido entre 45 °C e 55°C por cinco horas. Após isto, foram adicionados 40 ml de solução de enzima poligalacturanase ma roapect dagl(AB Enzimes) e o meio foi mantido entre 45 °C e 55 °C por cinco horas.
Tabela 3: Valores Experimentais do Exemplo 2
Figure imgf000017_0001
Valor médio de Hazen inicial = 220
Valor médio de Hazen final = 87 (Valor reduzido a 39% do valor inicial)
Redução no valor de Hazen = 61% em relação ao valor inicial
Valor médio de concentração de células final = 0,7g/Kg T/BR2009/000371
17 de caldo fermentado.
Exemplo 3
Mantendo as mesmas condições reacionais do exemplo 1, adicionou-se 40 ml de solução de enzima protease coralase (Tipo 1) e o meio foi mantido entre 45 °C e 55 °C por cinco horas. Após isto, foram adicionados 40 ml de solução de enzima poligalacturanase ma roapect dagl (AB Enzimes) e o meio foi mantido entre 45 °C e 55 °C por cinco horas.
Tabela 4 : Valores Experimentais do Exemplo.3 :
Figure imgf000018_0001
Valor médio de Hazen inicial = 220
Valor médio de Hazen final = 10 (Valor reduzido a 4 % do valor inicial);
Redução no valor de Hazen = 96 % em relação ao valor inicial;
Valor médio de concentração de células final = 0 , 2 g/kg de caldo fermentado.
Exemplo 4
Mantendo as mesmas condições reacionais do exemplo 1 , adicionou-se 40 ml de solução de enzima protease coralase 7089 (AB Enzimes) e 40 ml de solução de enzima P T/BR2009/000371
18 poligalacturanase roapect ma plus (AB Enzimes) e o meio foi mantido entre 45 °C e 55 °C por cinco horas.
Tabela 5 : Valores Experimentais do Exemplo 4 :
Figure imgf000019_0001
Valor médio de Hazen inicial = 220
Valor médio de Hazen final = 29 (Valor reduzido a 13% do valor inicial)
Redução no valor de Hazen = 87% em relação ao valor inicial
Valor médio de concentração de células final = 0,3g/Kg de caldo fermentado.
Medidas de transparência dos caldos fermentados
0 teor de células _é medido por absorbância da solução a 630 nm padronizado contra curva de resposta estabelecida com células de Xanthomonas submetidas à etapa de crescimento, pasteurização e depois secas em estufa a 105- 110 °C até peso constante. Esse material, em forma de massa seca, foi mantido em dessecador e utilizado para a quantificação de células nos meios de crescimento e de produção, por sua medida de absorbância a 630 nm.
A medida de HAZEN foi também utilizada, em cada caso, correlacionando-se os valores de absorbância a 630 nm com o valor de Hazen de cada suspensão.
Uma testemunha dd processo exemplo 1, não tratado enzimaticamente apresentou o valor HAZEN igual a 220 medido diretamente .
0 caldo correspondente ao exemplo 1 apresentou o valor 112, o que correspondeu a um aumento de transparência em relação à testemunha de 50,5%.
0 caldo correspondente ao exemplo 2 apresentou o valor 87, o que correspondeu a um aumento de transparência em relação à testemunha de 61%.
0 caldo correspondente ao exemplo 3 apresentou o valor 10, o que correspondeu a um aumento de transparência em relação à testemunha de 96%.
0 caldo correspondente ao exemplo 4 apresentou o valor
29, o que correspondeu a um aumento de transparência em relação à testemunha de 87%.
Em todos os casos observa-se que a ação conjunta de póligalacturanase e de protease reduz o teor de células a valores inferiores a 50% e transparência HAZEN das suspensões é levada a valores superiores a 85%.
Observação Geral
Em todos os ensaios dos quatro exemplos acima, os valores de absorbância iniciais estão, fora da faixa de linearidade da curva de resposta. Por isso não foi calculada uma taxa de redução baseada na concentração de células. No que diz respeito ao teor de células é evidente a redução que pode ser vista em valores caindo de 3,4g/kg a valores de 0,2, 0,4 g/kg nos diversos ensaios dos quatro exemplos apresentados. Assim, a quantificação pelo teor de células também demonstra, ao menos semi-quantitativamente, a eficiência do tratamento às enzimas, aqui apresentado em função da concentração de células sendo a expressão de redução dos debris e células mortas tomada apenas para o valor de Hazen e não para o valor de quantificação de células.
Com o valor de Hazen, resultados de remoção de células e debris tem os valores médios indicados em cada um dos ensaios, chegando a cair a 4% do valor da testemunha para o exemplo 4 e aos valores indicados nos demais "exemplos que sugerem também os significativos valores de ganho em transparência por cada um dos procedimentos.
Evidentemente, aspectos económicos, de praticidade de operação, de tempo de processo e outros ponderam para a escolha do sistema enzimático a ser adotado na unidade industrial .

Claims

REIVINDICAÇÕES
1. Processo industrial para produção de polissacarideo sob a forma de caldo concentrado base água caracterizado pelo fato de possuir as seguintes -etapas:
a) obtenção do polissacarideo hidrofilico através da fermentação de nutrientes adequados à base de carboidratos pela ação de microorganismos específicos especialmente pertencentes ao género Xanthomonas;
b) pasteurização do caldo fermentado; ,.(.
c) enzxmatização do caldo pasteurizado primeiramente com enzima da família das galacturanases e posteriormente com enzima da família das proteases; e
d) tratamento da solução enzimatizada com um bactericida.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dentre os polissacarídeos empregados encontram-se as gomas xantana, carragenana, pululana, pectinas, quitosana solúvel e algumas gelatinas aquo-solúveis .
3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o polissacarideo preferido é a goma xantana.
4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os microorganismos pertencentes ao género Xanthomonas incluem Xanthomonas campestris, Xanthomonas begoniae, Xanthomonas tranlucens, Xanthomonas vasculorum, Xanthomonas malvacearum,
Xanthomonas carotae, Xanthomonas incanae, Xanthomonas phaseoli , Xanthomonas vesicatória , Xanthomonas papavericola , Xanthomonas hedrae.
5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o microorganismo, preferido para a síntese da goma xantana é a Xanthomonas campestrxs .
6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o caldo pasteurizado possui uma viscosidade de 3000 a 6000 Cp.
7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o caldo, após ação de pasteurização, é tratado com enzimas Poligalacturanase e Protease em duas etapas em série às concentrações, temperaturas e duração adequadas .
8. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o caldo pasteurizado é submetido primeiramente à ação da enzima poligalacturanase com um teor de 80 a 240 ppm , melhor 90 a 150 ppm, ainda melhor 95 a 120 ppm, à temperatura de 26°C a 64°C, melhor de 35°C a 45°C e ainda melhor de 42°C a 48°C por tempo definido de 1 até 8 horas, melhor de 3 a 7 horas, melhor ainda de 4 a 6 horas.
9. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que após a enzimatização com a poligalacturanase, o caldo é submetido à ação da enzima protease com um teor de 10 a 1000 ppm.
10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7, 8 ou 9, carac e izado pelo fato de que após o tratamento com as enzimas, o caldo é agitado a temperatura 42°C a 48°C, e no mesmo pH, por mais 3 a 5 horas .
11. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a solução enzimatizada é tratada com uma bactericida, tal como formol.
12. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser um processo continuo.
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