KR100940349B1 - 락토바실러스 브레비스 ｆｓｂ-1을 이용하여 면역활성이 우수한 엑소폴리사카라이드의 생산방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명에는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1을 이용한 엑소폴리사카라이드 생산방법의 최적 조건이 개시되어 있다.
본 발명의 방법에 따르면 탈지분유 함량, 곡류분말 배지의 종류, 배양시간 및 배양온도 등의 배양조건을 조절함으로써, 엑소폴리사카라이드를 고수율로 생산할 수 있다.
유산균, EPS, 면역 활성, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)

Description

락토바실러스 브레비스 ＦＳＢ-1을 이용하여 면역활성이 우수한 엑소폴리사카라이드의 생산방법{METHOD OF PRODUCING EXOPOLYSACCHARIDE FROM CULTURE OF LACTOBACILLUS BREVIS FSB-1 HAVING EXCELLENT IMMUNE-ACTIVITY}
본 발명은 유산균 균주 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1을 이용하여 엑소폴리사카라이드를 생산하는 방법에 관한 것이다.
다양한 다당류(polysaccharides)들은 식물, 조류, 세균들에 의해서 생산되고 있는데, 이들 중 식물기원 다당류는 셀룰로오스, 펙틴, 녹말이 있고, 조류기원 다당류는 아가, 카라기난, 알지네이트가 있으며, 세균기원 다당류는 덱스트란, 젤란, 플루난, 잔탄이 있다고 보고되고 있다(Sutherland, 1998).
최근 유산균(Lactic Acid Bacteria; LAB)은 발효식품들의 관능특성에 영향을 줄 수 있는 아로마, 향미료, 효소 등과 같은 물질들을 생산할 뿐만 아니라, 몇몇 유산균(LAB)에서는 발효식품들의 물성(rheology), 조직감(texture), 점성제(viscofying), 당화(sweetening), 안정성(stability), 수분결합제(water-binding agents), 젤화(gelling), 농축특성(thickening properties) 등에 영향을 줄 수 있는 엑소폴리사카라이드(exopolysaccharide; EPS)를 생산하는 것으로 보고되고 있다(Arskold 등, 2007; Harding 등, 2005; Macedo 등, 2002; Martensson 등, 2003; Desai 등, 2006).
이러한 엑소폴리사카라이드는 구조와 합성기작에 따라 헤테로폴리사카라이드와 호모폴리사카라이드의 두 그룹으로 분류된다. 헤테로폴리사카라이드는 다중당 타입(multiple sugar type)으로 구성되며 여러 종류의 글리코실트랜스퍼라아제 (glycosyltransferase enzyme)들에 의해 합성되어지는 반면, 호모폴리사카라이드는 일반적으로 수크라아제 효소(sucrase enzyme)에 의해 단독의 기질인 수크로스로부터 합성되어진다. 이러한 수크라아제 타입 효소들은 글루코스 잔기 (glucan) 또는 프럭토스 잔기(fructan)로 구성된 다당류를 합성하며(Arskold 등, 2007), 식품 또는 의약품 산업의 첨가물로써 다양하게 응용되어 왔다(Arskold 등, 2007; Harding 등, 2005; Martensson, 2003; Desai 등, 2006).
또한 엑소폴리사카라이드는 산업적인 유용성 측면의 물리적인 특성뿐만 아니라 인체에 유효한 생리적 특성인 면역증진(immunity stimulation), 항궤양 활성(anti-ulcer activity), 혈중 콜레스테롤 감소(cholesterol reduction) 등의 유용한 효과를 나타낸다고 보고되어 왔으며, 일반적으로 안정한(Generally Recognized as Safe; GRAS) 물질로 인식되어 왔다(Desai 등, 2006; Martensson 등, 2003).
따라서 엑소폴리사카라이드의 생산성을 높이는 균주 개발(Desai 등, 2006)과 발효조건의 최적화 작업이 요구된다(Arskold 등, 2007).
엑소폴리사카라이드를 식품산업에 응용하기 위해서는 세포생산성(cellular productivity)이 적어도 10 ~ 15 g/L가 되어야 하는데, 발효조건의 최적화에 영향을 줄 수 있는 인자들로는 탄소원, 질소원, 무기질, 비타민 등의 배지 조성, 온도, pH 등이 있다고 보고되고 있다(Arskold 등, 2007; Macedo 등, 2002).
마르텐슨(Martensson) 등은 락토바실러스 브레비스(락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)) G-77을 이용하여 엑소폴리사카라이드의 생산능을 측정한 결과, α와 β-글루칸을 가진 엑소폴리사카라이드를 생산하였다고 보고한 바 있다.
데사이(Desai) 등(2006)은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 이용하여 엑소폴리사카라이드의 생산능을 보고한 바 있으며, Kim 등(2002)은 김치로부터 분리한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)이 면역활성 중 항보체 활성이 우수하였다고 보고한 바 있다.
그러나, 엑소폴리사카라이드의 생산에 영향을 줄 수 있는 인자들에 대한 연구는 아직 진행되지 않았다.
본 발명은 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1 유산균 균주를 이용하여 엑소폴리사카라이드를 생산하는 방법에 있어서, 생산최적화를 위한 배양조건을 제공하는 락토바실러스 브레비스 ＦＳＢ-1을 이용하여 면역활성이 우수한 엑소폴리사카라이드의 생산방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명의 일 측면에 따른 엑소폴리사카라이드(Exopolysaccharide; EPS) 생산방법은 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1 유산균 균주(기탁번호 : KCTC 11520BP)를 곡류분말 배지 또는 5 ~ 15%(w/v) 탈지분유 배지를 이용하여 배양함으로써, 엑소폴리사카라이드(Exopolysaccharide; EPS)를 생산 수율을 증가시키는 것을 특징으로 한다.
아울러, 본 발명의 다른 일 측면에 따를 엑소폴리사카라이드는 상술한 방법으로 형성한 것을 특징으로 한다.
다음으로, 상기 특징에 대한, 본 발명의 구체적 해결 수단을 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1 및 락토바실 러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)의 유산균 균주를 배양배지, 배양온도 및 배양시간을 달리하여 실험함으로써, 엑소폴리사카라이드 생산을 위한 최적의 조건을 구축하고자 하였다.
우선, 배양 배지로서 탈지분유를 각각 5%(w/v), 10%(w/v) 및 15%(w/v) 함유하는 배지를 제조하여, 균주를 접종하고 37℃에서 24시간 동안 100rpm으로 진탕배양하였다.
그 결과를 표 1과 2에 각각 나타내었으며, 이에 따르면, 탈지분유의 농도에 따른 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1과 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)의 배양액 중 엑소폴리사카라이드 수용액의 고형분 함량(%)과 총당 함량(mg/mL)은 탈지분유의 농도가 증가함에 따라 함께 증가하는 경향을 보였으며(표 2), MRS broth(유산균 배양용 배지)에서 생육한 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1과 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)의 엑소폴리사카라이드 수용액의 고형분 함량(%)과 총당 함량(mg/mL)은 15%(w/v)의 탈지분유의 엑소폴리사카라이드 수용액보다는 작고 10%(w/v)의 탈지분유보다는 높은 함량을 보였다.
또한, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1과 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)의 MRS broth에서의 셀(cell) 생육이 탈지분유에서의 생육속도보다 활발하게 진행된다는 것을 확인할 수 있다(표 1). 그러나 대사산물로써 생산되는 엑소폴리사카라이드의 함량(고형분과 총당 함량)은 MRS broth에서 생육한 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1과 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)의 배양액보다 15%(w/v) 탈지분유의 배양액에서 훨씬 높은 수준의 값들을 보였으므로, 15%(w/v) 탈지분유 배지가 엑소폴리사카라이드 생산에 효과적임을 알 수 있었다.
한편, 배양 온도가 엑소폴리사카라이드의 생산에 미치는 영향을 측정하기 위하여 15%(w/v) 탈지분유 배지에서 배양온도를 30, 35 및 40℃로 각각 다르게 하고, 진탕 배양기에서 100 rpm으로 진탕하면서 24시간 동안 배양한 후, 각 온도별 배양액에 대한 pH, 생균수와 엑소폴리사카라이드의 생산량을 측정하였다(표 3 및 4 참조).
배양온도에 따른 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1과 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 각각의 엑소폴리사카라이드 수용액에 대한 고형분과 총당 함량은 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1의 경우, 배양온도가 증가함에 따라 고형분과 총당 함량이 함께 증가하는 결과를 보였으나(p<0.05), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)의 엑소폴리사카라이드 수용액은 고형분과 총당 함량이 35℃에서 가장 낮은 값을, 30℃에서 가장 높은 값을 보였다(p<0.05, 표 4).
이어, 앞선 실험에서 선택된 배지조건(15%(w/v) 탈지분유)과 온도 조건(락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1과 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 각각 40 및 30℃)에서 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1과 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)를 배양시간을 달리하여 배양하였다. 즉, 락토바실러스 브레비 스(Lactobacillus brevis) FSB-1의 배양시간은 0, 12, 18, 24, 30, 36 및 48시간이었으며, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)의 배양시간은 0, 12, 24, 36 및 48시간이었다. 각 균주의 배양시간에 따른 배양액의 pH, 생균수와 고형분 함량 및 엑소폴리사카라이드 생산량을 각각 측정하여 표 5와 도 1 내지 4에 각각 나타내었다.
그 결과, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1의 배양액 중 EPS 수용액의 고형분 함량은 0시간에서 12시간까지는 감소하고 이 후 30시간까지 지속적으로 증가하는 경향을 보이다가 다시 감소하는 경향을 보였다(도 1). 배양시간에 따른 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1의 배양액으로부터의 EPS 수용액 중 총당 함량도 배양시간에 따른 고형분 함량의 경향과 같은 경향을 보였다(도 3). 반면 배양시간에 따른 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)의 배양액 중 엑소폴리사카라이드 수용액의 고형분 함량과 총당 함량은 0시간에서부터 48시간까지 지속적으로 감소하는 경향을 보였다(도 2 및 도 4).
이상의 결과로부터 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1는 15%(w/v) 탈지분유 배지에서 35 내지 45℃, 12시간 내지 48시간, 바람직하게는 40℃에서 12 내지 30 시간 배양함으로써 엑소폴리사카라이드를 최적으로 생산할 수 있음을 알 수 있었다. 특히, 36~48시간에는 항보체 활성이 있는 엑소폴리사카라이드가 생산되는 것으로 나타났다(표 6 참조).
한편, 엑소폴리사카라이드의 생산능이 우수한 곡물을 선별하기 위하여 배양배지로서, 5%(w/v) 곡류분말 배지를 이용하여 락토바실러스 브레비 스(Lactobacillus brevis) FSB-1을 40℃에서 30시간 동안 배양한 후 배양액의 pH와 생균수를 측정한 결과는 표 7과 같다.
이에 따르면, 검은콩, 보리, 흑미, 옥수수, 대두, 수수, 율무 및 찹쌀현미 8종의 곡류분말을 배지로 활용한 결과, 가장 낮은 pH를 보인 곡물은 대두였으며, 가장 높은 pH를 보인 것은 찹쌀현미였다.
각 곡물종류에 따른 균주 배양액들로부터 엑소폴리사카라이드 수용액을 획득한 후 고형분과 엑소폴리사카라이드 함량을 측정한 결과는 도 5 및 6에 나타내었다. 대조군으로 15%(w/v) 탈지분유 배지를 사용하여 얻어진 고형분과 엑소폴리사카라이드 함량을 비교한 결과, 비교적 높은 수준의 고형분 함량을 보인 곡물은 검은콩, 보리 및 대두였으며, 높은 수준의 총당 함량은 보인 곡물은 검은콩, 보리 및 찹쌀현미였다. 면역활성 측정결과에서는 다른 곡물들에 비해 대두와 율무가, 높은 항보체 활성을 보였다.
따라서, 검은콩, 보리, 흑미, 옥수수, 대두, 수수, 율무 및 찹쌀현미로부터 구성되는 군으로부터 선택되는 하나의 곡류분말 배지를 3 내지 8%(w/v), 바람직하게는 5%(w/v) 농도로 함유하는 곡류분말 배지를 이용하여 유산균을 발효시킴으로써 엑소폴리사카라이드를 고수율로 생산할 수 있음을 확인하였다.
상기 엑소폴리사카라이드는 면역증진(immunity stimulation), 항궤양 활성(anti-ulcer activity), 혈중 콜레스테롤 감소(cholesterol reduction) 등의 유용한 효과를 나타내므로 식품이나 의약품 등의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면 탈지분유 함량, 곡물 종류, 배양시간 및 배양온도를 조절함으로써 엑소폴리사카라이드를 고수율로 생산할 수 있으며, 이와 같이 생산된 엑소폴리사카라이드는 식품이나 의약품 등의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.
본 연구에서는 엑소폴리사카라이드의 생산성이 높은 균주 개발을 위해 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1과 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)의 엑소폴리사카라이드 생산능을 측정하였다. 또한 본 균주들을 이용한 엑소폴리사카라이드 생산최적화를 위해 우선 탈지분유를 이용한 배지의 농도, 배양온도, 배양시간 등과 엑소폴리사카라이드 생산성과의 관계를 규명하고, 상기 엑소폴리사카라이드 생산의 조건을 활용하여 검은콩, 보리, 수수, 흑미, 찹쌀현미 등과 같은 다양한 곡류들을 첨가한 배지에서의 엑소폴리사카라이드 생산능을 검토하였다. 또한, 생산된 엑소폴리사카라이드의 항보체 활성, 마이토젠(mitogen) 활성 및 사이토카인(cytokine) 활성과 같은 면역활성능을 검토하였다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 통해 본 발명의 구성 및 작용을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이는 본 발명의 바람직한 예시로 제시된 것이며 어떠한 의미로도 이에 의해 본 발명이 제한되는 것으로 해석될 수는 없다. 여기에 기재 되지 않은 내용은 이 기술 분야에서 숙련된 자이면 충분히 기술적으로 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략하기로 한다.
실시예 1: 탈지분유 배지를 이용한 엑소폴리사카라이드 생산을 위한 최적조건 확립
1-1: 사용균주 및 배지
본 실험에 사용된 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1은 경기대학교 대학원 식품미생물학 실험실에서 김치로부터 분리 및 동정하여 보관 중인 균주로서, 본 발명자의 이전 연구에서 대장내 점착능과 각종 면역활성이 우수한 특성을 가지고 있다. 아울러, 상기 유산균 균주는 현재 한국생명공학연구원의 유전자은행(KCTC)에 기탁되었고, 2009년 6월 18일자로 기탁번호 KCTC 11520BP를 부여 받아 영구 보존 중이다.
상기 유산균 균주를 본 발명의 핵심 구성으로 세포외다당체(엑소폴리사카라이드) 생산능 및 생산된 엑소폴리사카라이드의 면역활성 측정에 사용하였으며, 이에 대한 대조균주로는 이전 연구에서 높은 면역 활성이 인정된 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 사용하였다. 엑소폴리사카라이드의 최적 생산조건 확립을 위해 사용된 배지는 탈지분유(Difco, St. Louis, USA)를 사용하였다.
1-2: 엑소폴리사카라이드의 생산을 위한 최적조건 확립
가. 탈지분유의 농도가 엑소폴리사카라이드의 생산에 미치는 영향
탈지분유 5, 10 및 15 g을 250 mL 삼각플라스크에 넣은 후 증류수 100 mL를 가해 녹인 다음, 121℃에서 15분간 멸균하여 배지로 사용하였다. 탈지분유 액체배지 100 mL에, 활성화시킨 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1과 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 1%가 되도록 각각 접종한 후, 진탕배양기(DX9, Han Young, Korea)에서 100 rpm으로 진탕하면서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이 후 각각의 탈지분유 농도에 따른 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1과 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)의 각 균주 배양액에 대하여 pH, 생균수와 엑소폴리사카라이드의 생산량을 각각 측정하여 표 1과 2에 각각 나타내었다.
나. 배양온도가 엑소폴리사카라이드의 생산에 미치는 영향
상기 '가.'의 조건에서 실험한 결과로부터, 즉 탈지분유의 농도에 따른 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1과 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)의 배양 후 최대의 엑소폴리사카라이드 생산량을 보이는 탈지분유의 농도를 각각 선택하였다. 선택된 최적의 탈지분유의 농도를 가진 액체배지를 가)와 동일한 방법으로 제조한 후, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1과 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 배지 100 mL에 대하여 각각 1%가 되도록 접종하였다. 배양 온도가 엑소폴리사카라이드의 생산에 미치는 영향을 측정하기 위하여 배양온도의 조건을 30, 35 및 40℃로 각각 다르게 하고, 진탕배양기에서 100 rpm으로 진탕하면서 24시간 동안 배양한 후, 각 온도 별 배양액에 대한 pH, 생균수와 엑소폴리사카라이드의 생산량을 측정하여 표 3 및 4에 각각 나타내었다.
다. 배양시간이 엑소폴리사카라이드의 생산에 미치는 영향
상기 '나.'의 결과로부터, 즉 최적의 엑소폴리사카라이드 생산량을 보이는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1과 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)의 배양온도를 각각 선택하였다. 즉, 가)의 결과에서는 탈지분유의 최적의 농도를, 나)의 결과에서는 최적의 배양온도를 각각 선택한 다음 최적의 탈지분유 농도와 배양온도에서 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1과 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)의 배양시간을 달리하였다. 즉, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1의 배양시간은 0, 12, 18, 24, 30, 36 및 48시간이었으며, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)의 배양시간은 0, 12, 24, 36 및 48시간이었다. 각 균주의 배양시간에 따른 배양액의 pH, 생균수와 엑소폴리사카라이드 생산량을 각각 측정하여 표 5와 도 1 내지 4에 각각 나타내었다.
라. 배양액의 pH와 생균수
배양액의 pH는 pH meter (950, orion Co., Ltd., USA)를 이용하여 측정하였으며, 생균수는 각각의 조건에서 배양된 배양액을 생리식염수를 이용하여 serial dilution을 실시한 후, 멸균된 MRS agar에 1 mL를 분주하여 spreading method로 37 ℃에서 48시간 동안 배양 후 각각 계수하였다.
마. 엑소폴리사카라이드의 분리
엑소폴리사카라이드의 분리는 Levander 등(2002)의 방법에 기초하여 분리하였다. 즉 배양액 100 mL의 10%에 해당하는 트리클로로아세트산을 첨가하여 충분히 혼합한 다음 4℃, 5,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액 양의 4 배에 해당하는 95% 알코올을 서서히 부은 후 4℃에서 6~12시간 동안 방치하여 침전물(엑소폴리사카라이드)을 형성시켰다. 형성된 침전물을 4℃, 5,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 회수한 다음 증류수 100 mL에 녹여서 엑소폴리사카라이드 수용액을 제조한 후 4℃에서 냉장보관하면서 이후의 분석을 실시하였다.
바. 엑소폴리사카라이드의 정량
엑소폴리사카라이드의 함량은 고형분 및 총당 함량으로 측정하였다. 고형분 함량은 A.O.A.C.법 (1976)에 준하여, 즉 엑소폴리사카라이드 수용액을 105℃에서 6~12시간 동안 건조시킨 후 항량의 무게를 측정하여 구하였다. 총당 함량은 phenol-sulfuric acid법으로 측정하였다(DuBois 등, 1956).
사. 엑소폴리사카라이드의 항보체 활성 측정
정상 혈청(Normal human serum, NHS)의 조제
실험실의 건강한 성인을 대상으로 채혈하여 실온에서 30분씩 방치한 다음 혈액을 응고시킨 후 4℃, 3,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 분리한 혈청을 1 mL씩 나누어 -70℃ 냉동고에서 보관하면서 실험에 사용하였다.
보체계 활성화능 측정
보체계 활성화능은 항보체 활성으로 측정되었다. 항보체 활성은 Mayer법(Kabat과 Mayer, 1971)에 근거하여, 시료에 의해 보체를 활성화한 후 잔존하는 보체에 의한 적혈구 용혈활성에 근거를 둔 보체고정시험(complement fixation test)을 이용하여 측정되었다. 즉, 정상인의 혈청과 500μM Ca++, 2 mM Mg++이 함유된 gelatin veronal buffered saline(GVB++ buffer, pH 7.4, (주)일본동결건조연구소) 및 시료를 각각 50μM씩 혼합하여 37℃에서 30분간 1차 반응시킨 후, 이 반응액에 GVB++ buffer를 350μM씩 첨가하고 이를 10~160배까지 연속하여 희석하였다. 여기에 GVB++ buffer 750μM와 양혈(Komed, Co., Ltd., Korea)과 hemolysin(Sigma Chemical Co., USA)으로 제조된 양의 감작적혈구(IgM-sensitized sheep erythrocyte, EA Cell, 1×108 cells/mL)를 각각 250μM씩 가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시키고 4℃의 phosphate buffered saline(PBS) 2.5 mL를 가하여 반응을 정지시켰다. 각 반응액을 4℃, 2500 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 얻은 다음, Microtiter Reader(Molecular Devices, USA)를 이용하여 412 nm에서 흡광도 를 측정하였다. 항보체 활성은 50% 총보체 용혈에 대한 저지율(ITCH50, inhibition of 50% total complement hemolysis)로 나타내었다.
1-3: 실험결과
탈지분유의 농도가 엑소폴리사카라이드의 생산에 미치는 영향
탈지분유의 농도에 따른 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1과 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)의 배양액 pH와 생균수의 결과는 표 1에 나타내었다. 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1은 탈지분유의 농도가 증가함에 따라 pH가 감소한 반면, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)은 탈지분유의 농도가 증가함에 따라 pH도 함께 증가하였다. 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1과 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)의 배양액의 생균수는 탈지분유의 농도와 관계없이 비슷한 수준의 값을 보였다.
MRS broth(유산균 배양용 배지)에서 배양된 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1과 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)에 대한 각각의 배양액 pH는 탈지분유의 모든 배양액(5%(w/v), 10%(w/v), 15%(w/v))보다 훨씬 낮은 pH 값인 4.91과 4.08의 값을 각각 보였다. 또한 생균수도 전 농도의 탈지분유 배양액보다 높은 값인 1.1×109와 6.9×109 cfu/mL를 각각 보였다.
탈지분유의 농도에 따른 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1과 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)의 배양액 중 엑소폴리사카라이드 수용액의 고형분 함량(%)과 총당 함량(mg/mL)은 탈지분유의 농도가 증가함에 따라 함께 증가하는 경향을 보였으며(표 2), MRS broth에서 생육한 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1과 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)의 엑소폴리사카라이드 수용액의 고형분 함량(%)과 총당 함량(mg/mL)은 15%(w/v)의 탈지분유의 엑소폴리사카라이드 수용액보다는 작고 10%(w/v)의 탈지분유보다는 높은 함량을 보였다.
또한, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1의 15%(w/v) 탈지분유 배양액의 엑소폴리사카라이드 수용액의 고형분 함량(%)과 총당 함량(mg/mL)은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)의 15%(w/v) 탈지분유 배양액의 엑소폴리사카라이드 수용액보다 높은 수준의 값을 보였으며, 이 결과는 p<0.05수준에서 유의적인 차이를 보였다. 위의 각 균주에 따른 pH와 생균수의 결과들로 미루어 볼 때, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1과 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)이 MRS broth에서의 cell 생육이 탈지분유에서의 생육속도보다 활발하게 진행된다는 것을 확인할 수 있다. 그러나 대사산물로써 생산되는 엑소폴리사카라이드의 함량(고형분과 총당 함량)은 MRS broth에서 생육한 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1과 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)의 배양액보다 15%(w/v) 탈지분유의 배양액에서 훨씬 높은 수준의 값들을 보였다. 따라서 cell의 성장과 엑소폴리사카라이드의 생산과의 관계는 반드시 비례하지는 않는다는 사실을 확인할 수 있었으며, 최적의 엑소폴리사카라이드 생산을 위한 탈지분유의 농도는 5 ~ 15%(w/v)였다.
[표 1]
탈지분유 농도에 따른 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1 및 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 배양액의 pH 및 생균수(cfu/mL) 측정
균주 락토바실러스 브레비스( Lactobacillus brevis ) FSB-1 Lactobacillus plantarum
배지 pH 생균수(cfu/mL) pH 생균수(cfu/mL)
MRS broth 4.91 1.1×109 4.08 6.9×109
5%(w/v) 탈지분유 6.42 1.4×107 4.27 1.7×109
10%(w/v) 탈지분유 6.28 2.0×107 4.79 1.9×109
15%(w/v) 탈지분유 6.09 1.7×107 5.07 1.8×109
* 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1 및 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)은 37℃에서 24시간 동안 100rpm으로 진탕배양하였다.
[표 2]
탈지분유 농도에 따른 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1 및 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 배양액의 고형분 함량(%) 및 총 EPS(총당) 함량(mg/mL)
균주 락토바실러스 브레비스( Lactobacillus brevis ) FSB-1 Lactobacillus plantarum
배지 고형분 함량(%) EPS(총당)(mg/mL) 고형분 함량(%) EPS(총당)(mg/mL)
MRS broth 0.068±0.001b 0.517±0.101b 0.054±0.002b 0.363±0.054b
5%(w/v) 탈지분유 0.007±0.001c 0.102±0.009b 0.017±0.004d 0.112±0.017c
10%(w/v) 탈지분유 0.040±0.007c 0.367±0.043b 0.031±0.001c 0.289±0.020b
15%(w/v) 탈지분유 0.338±0.000a 5.548±0.726a 0.065±0.003a 0.604±0.109a
* 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1 및 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)는 37℃에서 24시간 동안 100rpm으로 진탕배양하였다.
* 유의차 p<0.05 ; 같은 문자로 표시된 평균은 유의하게 차이 나지 않음.
배양온도가 엑소폴리사카라이드의 생산에 미치는 영향
엑소폴리사카라이드의 생산량이 가장 우수했던 탈지분유 15%(w/v)농도에서 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1과 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)를 각 배양 온도별(30, 35, 40℃)로 배양한 배양액의 pH와 생균수를 측정한 결과(표 3), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1은 배양 온도에 따른 pH와 생균수의 차이가 거의 없었다. 반면 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)은 각 배양 온도에 따른 pH의 변화는 30℃에서 가장 높은 값인 5.10을, 35℃에서 가장 낮은 4.67의 값을 보였다. 그러나 각 배양온도에 따라 생균수는 큰 차이를 보이지 않았다. 배양온도에 따른 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1과 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 각각의 엑소폴리사카라이드 수용액에 대한 고형분과 총당 함량은 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1의 경우, 배양온도가 증가함에 따라 고형분과 총당 함량이 함께 증가하는 결과를 보였으나(p<0.05), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)의 엑소폴리사카라이드 수용액은 고형분과 총당 함량이 35℃에서 가장 낮은 값을, 30℃에서 가장 높은 값을 보였다(p<0.05). 즉, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1의 경우와 마찬가지로 고형분 함량이 높은 것이 총당 함량도 함께 높은 값을 보였다(표 4). 따라서 엑소폴리사카라이드의 최대 생산량을 보이는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1의 최적 배양온도는 40℃를, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)의 최적 배양온도는 30℃를 선택한 후 이후의 실험을 수행하였다.
[표 3]
배양 온도에 따른 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1 및 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 배양액의 pH 및 생균수(cfu/mL) 측정
균주 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1 Lactobacillus plantarum
온도 pH 생균수(cfu/mL) pH 생균수(cfu/mL)
30℃ 5.80 2.4×108 5.10 2.0×109
35℃ 5.85 1.9×108 4.67 2.6×109
40℃ 5.84 1.9×108 4.75 1.7×109
* 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1 및 락토바실러스 플 란타룸(Lactobacillus plantarum)를 15%(w/v) 탈지분유 배지를 이용하여 37℃에서 24시간 동안 100rpm으로 진탕배양하였다.
[표 4]
배양 온도에 따른 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1 및 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 배양액의 고형분 함량(%) 및 총 EPS(총당) 함량(mg/mL)
균주 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1 Lactobacillus plantarum
온도 고형분 함량(%) EPS(총당)(mg/mL) 고형분 함량(%) EPS(총당)(mg/mL)
30℃ 1.439±0.018c 30.148±0.787c 1.176±0.025a 31.195±3.311a
35℃ 1.601±0.031b 38.100±1.874b 0.123±0.006c 2.091±0.064c
40℃ 1.855±0.039a 43.719±1.402a 0.800±0.014b 19.591±1.433b
* 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1 및 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)은 15%(w/v) 탈지분유 배지를 이용하여 37℃에서 24시간 동안 100rpm으로 진탕배양하였다.
* 유의차 p<0.05 ; 같은 문자로 표시된 평균은 유의하게 차이 나지 않음.
배양시간이 엑소폴리사카라이드의 생산에 미치는 영향
배양시간에 따른 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1과 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)의 배양액의 pH와 생균수(cfu/mL)에 대한 결과는 표 5와 같다. 배양시간이 증가함에 따라 락토바실러스 브레비 스(Lactobacillus brevis) FSB-1과 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)의 배양액의 pH는 감소하는 경향을 보인 반면, 생균수(cfu/mL)는 배양시간이 증가함과 따라 함께 증가하는 경향을 보였다. 배양시간에 따른 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1의 배양액 중 엑소폴리사카라이드 수용액의 고형분 함량은 0시간에서 12시간까지는 감소하다가 이후 30시간까지 지속적으로 증가하는 경향을 보이다가 다시 감소하는 경향을 보였다(도 1). 배양시간에 따른 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1의 배양액으로부터의 엑소폴리사카라이드 수용액 중 총당 함량도 배양시간에 따른 고형분 함량의 경향과 같은 경향을 보였다(도 3). 반면 배양시간에 따른 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)의 배양액 중 엑소폴리사카라이드 수용액의 고형분 함량과 총당 함량은 0시간에서부터 48시간까지 지속적으로 감소하는 경향을 보였다(도 2 및 도 4).
이 결과들로 미루어 볼 때, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1의 경우, 초기 0시간의 배양액 중에서 측정된 고형분과 총당 함량은 15%(w/v) 탈지분유 속에 포함되어 있는 고형분과 당이 측정된 것으로서 배양시간 12시간까지는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1의 생육을 위해 이용하여 감소하는 경향을 나타내었던 것으로 추측되며, 이 후 30시간까지는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1의 생육과 더불어 대사산물로써 EPS를 꾸준히 생산함으로써 증가추세를 보이다가 다시 감소하는 경향을 보인 것으로 판단되었다. 반면, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)은 0시간에서 가장 높은 수준의 고형분과 엑소폴리사카라이드 함량을 보였다가 배양시간이 지남에 따라 지속적인 감소 경향을 보인 것으로 보아 대사산물로써 엑소폴리사카라이드를 생산하지 않는 것으로 판단되었다.
[표 5]
발효 시간에 따른 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1 및 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 배양액의 pH 및 생균수(cfu/mL) 측정
균주 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1 Lactobacillus plantarum
발효 시간(hr) pH 생균수(cfu/mL) pH 생균수(cfu/mL)
0 6.05 3.0×107 5.99 7.0×107
12 5.92 5.6×107 5.79 8.1×108
18 5.82 8.2×107 - -
24 5.63 2.9×108 5.04 2.6×109
30 5.85 8.0×107 - -
36 5.61 5.5×108 4.72 3.2×109
48 4.34 9.8×108 4.35 3.6×109
* 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1 및 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)는 15%(w/v) 탈지분유 배지를 이용하여 40℃에서 100rpm으로 진탕배양하였다.
* 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)은 15%(w/v) 탈지분유 배지를 이용하여 30℃에서 100rpm으로 진탕배양하였다.
배양시간에 따른 엑소폴리사카라이드 수용액의 항보체 활성 측정 결과
배양시간에 따른 엑소폴리사카라이드 수용액 각각의 항보체 활성 측정 결과, 0에서 30시간까지의 엑소폴리사카라이드 수용액은 항보체 활성의 차이를 크게 보이지 않았으나, 36~48시간의 엑소폴리사카라이드 수용액은 이에 비해 높은 항보체 활성을 보였다(p<0.05). 그러나 양성대조군인 PSK보다는 낮은 수준의 항보체 활성을 보였다. 따라서 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1은 15%(w/v) 탈지분유를 배지로 활용하여 배양할 경우 배양온도 40℃에서 배양시간 48시간 부근에 항보체 활성이 있는 엑소폴리사카라이드를 생산하는 것으로 판단되었다.
[표 6]
배양 시간에 따른 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1 배양액의 수용성 엑소폴리사카라이드 분획의 항보체 활성(ITCH50, %)
발효 시간(hr) 항보체 활성1 )(ITCH50, %) 발효시간(hr) 항보체 활성1 )(ITCH50, %)
대조군 3.092±5.035b, 2) 24 3.843±3.953b
0 7.888±4.034b 30 3.914±3.107b
12 2.941±1.621b 36 9.930±0.367b
18 4.887±0.415b 48 29.115±2.669a
PSK3 ) 69.099±3.992
* 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1의 배양 조건은 15%(w/v) 탈지분유를 이용하여 100rpm으로 40℃에서 진탕배양하고, 샘플 및 PSK의 농도가 1000 ㎍/mL에서 측정되었다. 1)항보체 활성은 Mayer의 방법에 의해 총 보체 용혈의 50% 억제로 측정되었다. 2)데이타는 두 분리된 실험의 평균값±SD로 표현되었다. 3) Coliolus versicolar 유래의 공지된 면역 활성 폴리사카라이드인 폴리사카라이드-K(PSK)가 양성대조군으로 사용되었다.
* 유의차 p<0.05 ; 같은 문자로 표시된 평균은 유의하게 차이 나지 않음.
실시예 2: 곡류분말 배지에서의 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1의 엑소폴리사카라이드 생산능 측정
1-1: 사용균주 및 배지
곡물을 배지로 활용한 엑소폴리사카라이드의 생산능 검토를 위해 사용된 균주는 실시예 1과 같이 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1이었다. 곡류분말 배지 제조를 위해 사용된 곡물로는 검은콩(black bean), 보리(barley), 흑미(black rice), 옥수수(corn), 대두(soybean), 수수(millet), 율무(adlay) 및 찹쌀 현미(waxy brown rice)가 사용되었다.
1-2: 곡류분말 배지를 이용한 엑소폴리사카라이드 생산 조건 확립
가. 배양액의 제조
각각의 곡류 분말 5 g을 250 mL 삼각 플라스크에 넣은 후 증류수 100 mL를 가해 녹인 다음, 121℃에서 15분간 멸균하여 EPS의 생산을 위한 배지로 사용하였다. 상기에서 제조된 곡류 배지 100 mL에 활성화시킨 락토바실러스 브레비 스(Lactobacillus brevis) FSB-1을 1%가 되도록 각각 접종한 후, 진탕배양기(DX9, Han Young, Korea)에서 100 rpm으로 진탕하면서 40℃에서 30시간 동안 배양하였다.
나. 배양액의 pH와 생균수
배양액의 pH는 pH meter (950, orion Co., Ltd., USA)를 이용하여 측정하였으며, 생균수는 각각의 조건에서 배양된 배양액을 생리식염수를 이용하여 점진 희석(serial dilution) 후 멸균된 MRS agar(유산균 배양용 배지)에 1 mL를 분주하여 spreading method로 37℃에서 48시간 동안 배양하였다.
다. 곡류 배지를 이용한 균 배양액으로부터 엑소폴리사카라이드의 분리
엑소폴리사카라이드의 분리는 Levander 등(2002)의 방법에 기초하여 분리하였다. 전분의 제거를 위해 배양액 100 mL의 0.5%에 해당하는 아밀라아제를 첨가하여 충분히 혼합한 다음 70℃에서 6~12시간 동안 처리하였다. 12,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액 양의 4 배에 해당하는 95% 알코올을 서서히 부은 후 4℃에서 6~12시간 동안 방치하여 침전물 (EPS)을 형성시켰다. 형성된 침전물을 4℃, 5,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 회수한 다음 증류수 100 mL에 녹여서 엑소폴리사카라이드 수용액을 제조한 후 4℃에서 냉장보관하면서 이 후의 분석을 실시하였다.
라. 엑소폴리사카라이드의 정량
엑소폴리사카라이드의 함량은 고형분 및 총당 함량으로 측정하였으며 실시예 1-바.의 경우와 동일하다.
마. 생산된 엑소폴리사카라이드의 면역 활성 측정
엑소폴리사카라이드의 항보체 활성
정상 혈청(Normal human serum, NHS)의 조제와 보체계 활성화능은 실시예 1-사.와 같이 측정하였다.
마이토젠(mitogen) 활성 측정
ICR mouse(웅성, 6주령)를 치사시킨 후 비장을 적출하여 RPMI 1640-FBS 배지가 들어 있는 페트리 디쉬에 담근 후, 주사기의 고무마개와 화염멸균한 100 및 200 mesh 금속망을 이용하여 마쇄 및 여과를 실시하여 비장세포액을 얻었다. 이 세포액을 저장액 용혈법(0.2% NaCl 용액, 3 mL로 약 20초간 처리)을 이용하여 적혈구를 제거한 다음, RPMI 1640-FBS 배지로 2~3회 세척한 후, 세포수가 5.0×106 cells/mL가 되도록 조절하였다. 이 세포액을 microtiter plate에 90 μL씩 분주하고 각 시료를 10 μL씩 첨가하여 37℃, CO2 incubator에서 3일 동안 배양하였다. 비장 림프구의 증식정도는 MTT법(Zheng 등, 2002)을 이용하여 측정되었다. 즉, 각 well의 세포배양액에 발색시약 MTT 용액(Methylthiazoletetrazolium, Sigma Chemical Co., USA) 50 μL를 첨가하여 CO2 incubator에서 5시간 동안 배양하였다. 형성된 MTT- formazan 침전을 회수한 후, 0.04 N HCl/isopropanol(시약 1급) 100 μL를 이용하여 재차 용해시킨 다음, Microtiter Reader(Molecular Devices, USA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
Relative mitogenic activity = Absorbance sample /Absorbance negative control × 100
사이토카인(cytokine) 활성 측정
사이토카인 활성측정은 샌드위치 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)법을 이용하였다. 분석 하루 전, anti-cytokine mAb(anti-mouse cytokine monoclonal-antibody)를 coating buffer(0.1 M Carbonate, pH 9.5)에 섞어 96 well ELISA plate(NuncTM immuno plate)에 100 ㎕ 씩 분주하고 4℃에서 6~12시간 반응시켜 well 표면에 부착시켰다. 다음 날 plate를 PBST(PBS with 0.05% Tween 20)로 3회 세척 후, assay diluent(PBS with 10% FBS)를 200 ㎕씩 분주하고 실온에서 1시간 방치하여 항체가 붙지 않은 well 표면을 blocking하였다. 이후 PBST로 각 well을 3회 세척하고 표준물질인 recombinant mouse cytokine를 연속 희석한 용액 또는 5일 간 배양한 Peyer's patch 반응 상등액인 시료를 50 ㎕ 씩 분주하고 assay diluent를 50 ㎕ 분주하여 실온에서 90분 동안 배양시켰다. 반응 상등액을 제거하고 assay diluent를 50 ㎕ 씩 분주하여 well 표면을 30분 동안 blocking 시킨 후, PBST로 5회 세척하였다. 이렇게 처리된 plate에 biotinylated anti-cytokine mAb와 avidin-horseradish peroxidase의 conjugate를 assay diluent에 희석하여 분주하고 1시간 동안 반응시켰다. 이후 각 well에 존재하는 상등액을 제거하고 PBST로 7회 세척한 후 TMB substrate (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine 와 hydrogen peroxide, Pharmingen) 첨가하여 30분 배양하였으며, 50 ㎕ 2 N H2SO4를 첨가하여 반응을 중지하고 405 nm에서 microplate reader(Molecular Devices, USA)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
Relative cytokine activity = Absorbance sample /Absorbance negative control × 100
바. 통계 처리
실험결과는 SPSS version 12.0 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA)을 이용하여 분석하였고 Duncan's multiple range test로 유의수준 p<0.05로 유의성을 검증하였다.
1-3: 실험 결과
엑소폴리사카라이드의 생산능이 우수한 곡류분말 배지의 선정
엑소폴리사카라이드의 생산능이 우수한 곡물을 선별하기 위하여 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1을 40℃에서 30시간 동안 배양한 후 배양액의 pH와 생균수를 측정한 결과는 표 7과 같다.
검은콩, 보리, 흑미, 옥수수, 대두, 수수, 율무 및 찹쌀현미 8종의 곡류분말을 배지로 활용한 결과, 가장 낮은 pH를 보인 곡물은 대두였으며, 가장 높은 pH를 보인 것은 찹쌀현미였다. 반면, 배양액 중의 가장 낮은 생균수를 보인 곡물은 찹쌀현미였으며, 가장 높은 생균수를 보인 곡물은 수수였다. 이 결과로 미루어 볼 때 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1이 가장 잘 생육할 수 있는 곡물은 수수 및 대두인 것으로 판단되었다.
각 곡물종류에 따른 균주 배양액들로부터 엑소폴리사카라이드 수용액을 획득한 후 고형분과 총당 함량을 측정한 결과는 도 5 및 6에 나타내었다. 15%(w/v) 탈지분유 및 다른 곡물들과 비교해 볼 때 비교적 높은 수준의 고형분 함량을 보인 곡물은 검은콩, 보리 및 대두였으며, 높은 수준의 총당 함량은 보인 곡물은 검은콩, 보리 및 찹쌀현미였다.
곡류분말 배지의 종류에 따른 EPS 수용액의 면역 활성
면역활성 측정결과 다른 곡물들에 비해 대두와 율무가, 높은 항보체 활성을 보였다. 특히, 대두는 양성대조군인 PSK와 거의 같은 수준의 높은 항보체 활성을 보였다. 또한 검은콩, 보리, 흑미, 옥수수 및 수수의 항보체 활성도 비교적 높은 수준의 항보체 활성을 보였다(표 8).
마이토젠(mitogen) 활성 측정결과는 비교적 보리, 대두 및 수수가 높은 활성을 보였으며, 양성대조군(LPS)과 비교해 볼 때 비교적 높은 수준의 활성을 보였다(도 7). 그러나 양성대조군의 농도는 10 ㎍/mL이고, 각 곡물시료의 농도는 1,000㎍ /mL로써 농도 차이를 감안할 때 높은 활성을 보였다고 보기에는 부족하였다.
사이토카인(cytokine) 활성 측정 결과, 보리와 흑미가 비교적 높은 활성을 보였으나 양성대조군과 비교해 볼 때 낮은 수준의 활성을 보였다(도 8).
따라서 곡물을 배지로 활용하여 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1를 배양한 후 얻어진 EPS 수용액 중의 면역활성을 측정한 결과, 마이토젠 및 사이토카인 활성보다는 항보체활성이 상대적으로 매우 우수한 것으로 판단되었다.
위의 결과들로부터 검은콩, 보리 및 찹쌀현미 3 종류의 곡류분말이 높은 수준의 엑소폴리사카라이드 생산량(고형분과 총당함량) 및 면역 활성이 우수한 엑소폴리사카라이드 생산을 위한 곡물들로 선택될 수 있음을 확인하였다.
[표 7]
다양한 곡류분말에 따른 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1의 배양액의 pH와 생균수(cfu/mL) 측정
곡류분말 pH 생균수 (cfu/mL) 곡류분말 pH 생균수 (cfu/mL)
검은콩 4.22 7.2×108 대두 3.62 6.5×108
보리 4.28 5.2×108 수수 3.67 9.3×108
흑미 3.87 3.0×108 율무 3.66 4.9×108
옥수수 3.89 5.4×108 찹쌀현미 4.49 7.2×107
* 각각의 곡류분말에 대한 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1의 배양액은 온도 40℃에서 30 시간동안 100rpm으로 진탕배양하였다.
[표 8]
다양한 곡류분말에 따른 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1 배양액의 수용성 엑소폴리사카라이드 분획의 항보체 활성(ITCH50, %)
곡류분말 항보체 활성1 )(ITCH50, %) 곡류분말 항보체 활성1 )(ITCH50, %)
검은콩 34.348±0.286d, 2) 대두 66.669±1.414a
보리 37.546±1.557cd 수수 44.812±0.383bc
흑미 43.662±1.396bcd 율무 51.486±7.648b
옥수수 38.786±0.835cd 찹쌀현미 24.353±7.450e
PSK3 ) 69.135±2.781
* 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1의 배양 조건은 각각의 5%(w/v) 곡류분말 배지로 이용하여 100rpm으로 40℃에서 진탕하면서 30시간 동안 배양하고, 샘플 및 PSK의 농도가 1000 ㎍/mL에서 측정되었다. 1)항보체 활성은 Mayer의 방법에 의해 총 보체 용혈의 50% 억제로 측정되었다. 2)데이타는 두 분리된 실험의 평균값±SD로 표현되었다. 3) Coliolus versicolar 유래의 공지된 면역 활성 폴리사카라이드인 폴리사카라이드-K(PSK)가 양성대조군으로 사용되었다.
* 유의차 p<0.05 ; 같은 문자로 표시된 평균은 유의하게 차이 나지 않음.
도 1은 발효 시간에 따른 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1의 배양액으로부터 얻어진 엑소폴리사카라이드 수용액의 고형분 함량(%)을 나타낸 것이고,
도 2는 발효 시간에 따른 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)의 배양액으로부터 얻어진 엑소폴리사카라이드 수용액의 고형분 함량(%)을 나타낸 것이고,
도 3은 발효 시간에 따른 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1의 배양액으로부터 얻어진 엑소폴리사카라이드 수용액의 엑소폴리사카라이드 함량(mg/ml)을 나타낸 것이고,
도 4는 발효 시간에 따른 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)의 배양액으로부터 얻어진 엑소폴리사카라이드 수용액의 엑소폴리사카라이드 함량(mg/ml)을 나타낸 것이고,
도 5는 곡류분말의 종류에 따른 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1의 배양액으로부터 얻어진 엑소폴리사카라이드 수용액의 고형분 함량(%)을 나타낸 것이고,
도 6은 곡류분말의 종류에 따른 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1의 배양액으로부터 얻어진 엑소폴리사카라이드 수용액의 엑소폴리사카라이드 함량(mg/ml)을 나타낸 것이고,
도 7은 곡류분말의 종류에 따른 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1의 배양액으로부터 얻어진 엑소폴리사카라이드 수용액의 상대적인 마이토젠 활성(%)을 나타낸 것이고,
도 8은 곡류분말의 종류에 따른 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1의 배양액으로부터 얻어진 엑소폴리사카라이드 수용액의 상대적인 사이토카인 활성(%)을 나타낸 것이다.

Claims (6)

  1. 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) FSB-1 유산균 균주(기탁번호 : KCTC 11520BP)를 검은콩, 보리, 수수, 대두 및 찹쌀현미로부터 구성되는 군으로부터 선택되는 하나를 사용하되 3 ~ 8%(w/v) 농도로 이루어진 곡류분말 배지 또는 10 ~ 15%(w/v) 탈지분유 배지에 접종시킨 후, 30 내지 45℃의 온도에서 12 내지 48시간 동안 배양하여, 엑소폴리사카라이드(Exopolysaccharide; EPS)의 생산수율을 증가시키는 것을 특징으로 하는 엑소폴리사카라이드의 생산방법.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013082915A1 (zh) * 2011-12-06 2013-06-13 光明乳业股份有限公司 一株产胞外多糖的短乳杆菌及其应用
KR101444216B1 (ko) 2012-11-20 2014-09-26 대한민국 세포외 다당생성 활성을 나타내는 프로바이오틱 락토바실러스브레비스 jsb22 균주

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR900006506A (ko) * 1988-10-19 1990-05-08 띠에리 깡 미생물을 이용한 탄소원의 발효에 의한 다당류의 제조 방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR900006506A (ko) * 1988-10-19 1990-05-08 띠에리 깡 미생물을 이용한 탄소원의 발효에 의한 다당류의 제조 방법

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biopolym.(2005)Vol.77, pp 98-106.
Eur. Food Res. Technol. (2002)Vol.214, pp 405-407.*
Int. J. Food Sci. Technol (2006)Vol.41, pp973-979.

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013082915A1 (zh) * 2011-12-06 2013-06-13 光明乳业股份有限公司 一株产胞外多糖的短乳杆菌及其应用
KR101444216B1 (ko) 2012-11-20 2014-09-26 대한민국 세포외 다당생성 활성을 나타내는 프로바이오틱 락토바실러스브레비스 jsb22 균주

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