CN1954083A - 用于生产重组蛋白的翻译融合伙伴的快速筛选方法和由此筛选的翻译融合伙伴 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从各种遗传来源快速筛选能够诱导非可生产蛋白表达或分泌生产的合适翻译融合伙伴(TFPs)的方法，该非可生产蛋白难以以传统重组生产方法来生产，和使用该方法获得的诱导蛋白分泌的TFPs。

Description

用于生产重组蛋白的翻译融合伙伴的快速筛选方法和由此筛选的翻译融合伙伴

技术领域

本发明涉及从各种遗传来源快速筛选能够诱导非可生产蛋白表达或分泌生产的合适翻译融合伙伴(TFPs)的技术，该非可生产蛋白难以使用传统重组生产方法生产。

背景技术

需要开发使用重组微生物的高效率蛋白生产系统来分析通过人类基因组计划新近获得的人基因组序列数据和在基因组单元中鉴定的不同蛋白的功能，以及生产人医学领域中重要的蛋白产品。当选择一种表达系统生产来源于高等生物例如人的重组蛋白时，应当仔细考虑各种因素，包括宿主细胞的生长特性、蛋白表达水平、胞内和胞外表达的可能性、翻译后修饰的可能性、所表达蛋白的生物活性。作为代表性的微生物表达系统，主要使用大肠杆菌和酵母系统。大肠杆菌是有利的，因为已经开发了许多基于大肠杆菌的表达系统且大肠杆菌表达高水平异源蛋白。然而，大肠杆菌具有下列缺点：对于来源于高等真核生物的蛋白的重组生产，不能进行翻译后修饰、蛋白难以完全分泌到培养基中、缺乏折叠具有很多二硫键的蛋白的能力，和表达不溶形式蛋白如包涵体(Makrides，Microbial Rev.，1996，60，512)。此外，由于在人蛋白中医学上有价值的与疾病相关的蛋白主要是糖蛋白或膜蛋白，因此为了达到完全活性，它们需要糖基化和通过二硫键折叠成正确的三维结构。因此，这些蛋白不可能在大肠杆菌中生产，且基本上需要真核表达系统例如酵母。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是被证明对人体安全作为GRAS(公认安全(Generally Recognized As Safe))生物的真核微生物。酿酒酵母具有许多优点，包括易于基因操作、开发的表达系统多样和易于大规模培养。优点进一步包括酿酒酵母具有使来源于高等细胞的蛋白例如人蛋白分泌到细胞外的功能，和执行蛋白的翻译后修饰，例如糖基化。胞外分泌可以通过靶蛋白与蛋白分泌信号的人工融合而完成，且在蛋白分泌过程中，发生蛋白折叠或二硫键形成和糖基化，由此产生生物活性完全的重组蛋白。而且，由于可以直接从培养基中获得生物活性蛋白，因此，基于酿酒酵母的蛋白表达系统不需要进行成本效益低(cost-inefficient)的细胞破裂或重折叠，从而使用它们是很经济的(Eckart and Bussineau，Curr.Opin.生物技术(Biotechnol.)，1996，7，525)。

然而，尽管上面提及到了酿酒酵母的许多优点，但是与使用酿酒酵母分泌人蛋白系统相关的现有技术的问题包括蛋白分泌产量不均匀，即从无产量至几克/升，这取决于人蛋白种类，导致蛋白分泌产量几千以上的巨大差异，因此使其难以预测分泌产量。当异源蛋白以几克/升分泌时，认为这个蛋白产量是有成本效益的。相反，对于以低水平表达蛋白的生产，尤其是非常有价值的人治疗蛋白，蛋白的表达和分泌常常发生困难。为了解决这些问题，很多研究已集中在蛋白分泌中所包含的分泌因子。例如，在分子伴侣方面进行了很多研究，包括超表达分泌因子BiP(KAR2)的方法，其帮助内质网中(ER)最新合成的蛋白进行折叠(Robinson et al.，生物技术(Biotechnol.)prog.，1996，271，10017)，和超表达PDI(蛋白二硫键异构酶)的方法，其帮助形成半胱氨酸键(Robinson et al.，Bio/Technology，1994，12，381；Schultz et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1994，721，148；Hayano et al.，FEBS Lett.，1995，377，505)。而且，提高分泌的另一项研究是通过制备能诱导分泌并与已分泌的蛋白进行融合的融合伙伴来进行的(Gouka et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.，1997，47，1)。迄今为止，在提高异源蛋白分泌方面这些方法被认为是非常成功的。这些融合技术的分子机制很少被研究，但是这些融合技术已被试验证明可减少对翻译或翻译后的步骤的限制，包括促进蛋白转运和帮助蛋白折叠。

Kjeldsen等(Protein Expr.Purif.，1997，9，331)通过胰岛素前体与合成前导区融合提高了胰岛素分泌，其中所述的合成的前导区是-基于理论考虑为了达到胰岛素或胰岛素前体的有效分泌而制备的。合成前导区具有N-糖基化位点和BiP识别位点，因此它延长了融合蛋白在ER中停留的时间，从而引起胰岛素前体的正确折叠。而且，引入了另外的糖基化位点的合成前导区显著增加了胰岛素在黑曲霉(Aspergillus niger)和酿酒酵母中的分泌(Kjeldsen et al.，Protein Expr.Purif.，1998，14，309)。在泡盛曲霉(Aspergillus awamori)中(Ward et al.，Bio/Technology，1989，8，435)和当在酵母中表达疏水角质酶(cutinase)(Sagt et al.，Appl.Environ.Microbiol.2000，66，4940)时得到了类似的结果。重组蛋白的这种高产量分泌是引入增加重组蛋白在ER中可溶性和诱导蛋白正确折叠的糖基化位点的结果。

被分泌的蛋白已被用作融合伙伴。例如，与来自泡盛曲霉的葡糖淀粉酶的融合表达引起下列蛋白的分泌产量增加：牛凝乳酶原(Ward et al.，Bio/Technology，1989，8，435)、猪胰磷脂酶A2(Roberts et al.，Gene，1992，122，155)、人白介素-6(Contreraset al.，Bio/Technology 1991，9，378；Broekhuijsen et al.，J.Biotechnol.，1993，31，135)、母鸡卵清溶菌酶(Jeenes et al.，FEMS Microbiol Lett，1993，107，267)和人乳铁蛋白(Ward et al.，Bio/Technology，1995，13，498)。增加的分泌产量根据蛋白而变化，在5至1000倍的范围内。而且，人白介素-1β氨基末端24个氨基酸在酵母中用作融合伙伴引起人生长激素和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)(Lee et al.，Biotechnol.Prog.，1999，15，884)分泌产量增加。人白介素-1β分泌没有特定分泌信号(Muesch et al.，Trends Biochem.Sci.，1990，15，86)，且通过在酵母中分泌，它的重组生产非常有效(Baldari et al.，Protein Eng.，1987，1，433)。而且，根据最近的报道，蛋白中最初保有的融合伙伴是蛋白正确折叠必不可少的(Takahashi et al.，Appl Microbiol.Biotechnol.，2001，55，454)。为了在酿酒酵母中表达ROL，当与来自酿酒酵母的交配因子α的前导序列前体(pre-pro-leader sequence)融合的成熟形式米根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶(ROL)表达时，没有观察到ROL的分泌。然而，当ROL与前序列一起合成时，ROL适当地分泌。这些结果证明ROL的前序列是ROL自身折叠必不可少的。

如上所述，经过许多研究，已开发了各种分泌因子诱导重组蛋白的分泌。然而，虽然开发的分泌因子有效增加特定蛋白的分泌水平，但是他们不能用作所有蛋白分泌生产的一般方法。Dorner等报道了BiP在CHO细胞中超表达稍微降低了蛋白分泌(Dorner etal.，EMBO J.，1992，11，1563)，和BiP表达降低增加了蛋白分泌(Dorner et al.，Mol.cell.Biol.，1988，8，4063)。在酵母中，KAR2(BiP)的超表达没有提高植物甜味蛋白的分泌(Harmsen et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.，1996，46，365)。杆状病毒中BiP的超表达导致细胞溶解产物中可溶抗体水平增加，但是没有增加抗体的分泌产量(Hsu et al.，Protein Expr.Purif.，1994，5，595)。当另一个分泌因子PDI作为折叠酶(foldase)在黑曲霉中超表达时，葡糖淀粉酶的分泌没有增加(Wang and Ward，Curr.Genet.2000，37，57)。也报道了使用蛋白融合伙伴改善分泌所存在的问题是仅仅对特定蛋白的分泌效率增加。

发明内容

如上所述，许多研究已集中于分泌因子的效果，但是分泌因子对分泌水平具有不同影响，其取决于蛋白类型，因此不能应用于所有蛋白。因此，需要筛选特定适用于靶蛋白进行靶蛋白最大分泌的最佳分泌因子的技术。在这点上，本发明人开发了根据重组蛋白类型从基因单元快速筛选最佳分泌融合伙伴的技术。

因此，本发明旨在提供能够从包括酵母的各种遗传来源快速筛选合适的翻译融合伙伴(TFP)的方法，该翻译融合伙伴能够强烈诱导由于在酵母中表达水平低而不能大规模和低成本生产的蛋白的产生，并能够刺激使用该方法分泌生产非可生产蛋白的翻译融合伙伴。

附图简述

由下列详细说明书并结合附图将更清楚地理解本发明的上述和其它目的、特征和其它优点其中：

图1显示了删除转化酶基因的方法和选择性标记的敲除(pop-out)方法；

图2显示了转化酶活性的酶谱分析(泳道1、2和3：野生型酿酒酵母Y2805；和泳道4、5和6：转化酶缺陷菌株(酿酒酵母Y2805Δinv2)；

图3以照片显示了酵母细胞依碳源的生长(INV2：野生型酿酒酵母Y2805；和Δinv2：转化酶缺陷菌株(酿酒酵母Y2805Δinv2)；

图4显示了删除转化酶基因的Southern印迹结果(泳道1和2：酿酒酵母Y2805ura3 INV2；泳道3和4：酿酒酵母Y2805Δinv2U(URA3Δinv2)；和泳道5和6：酿酒酵母Y2805Δinv2(ura3Δinv2)；

图5以照片显示了酵母细胞在葡萄糖和蔗糖培养基上的生长；

图6显示了制备pYHTS-F0、F1和F2质粒的方法和制备酵母基因文库的方法；

图7显示了含有四个翻译融合伙伴任何一种的酵母细胞培养上清液的SDS-PAGE和Western印迹结果(泳道1：大小标记；泳道2：白介素-2；泳道3：含有pYIL-TFP1的酵母细胞培养上清液；泳道4：含有pYIL-TFP2的酵母细胞培养上清液；泳道5：含有pYIL-TFP3的酵母细胞培养上清液；泳道6：含有pYIL-TFP4的酵母细胞培养上清液)；

图8显示了通过Endo-H消化的糖基化分析结果，其中在SDS-PAGE上分析样品(泳道1(-)：含有pYIL-TFP1的酵母细胞培养上清液，未经Endo-H处理；泳道1(+)：含有pYIL-TFP1的酵母细胞培养上清液，经Endo-H处理；泳道2(-)：含有pYIL-TFP3的酵母细胞培养上清液，未经Endo-H处理；泳道2(+)：含有pYIL-TFP3的酵母细胞培养上清液，经Endo-H处理；泳道3(-)：含有pYIL-TFP4的酵母细胞培养上清液，未经Endo-H处理；泳道3(+)：含有pYIL-TFP4的酵母细胞培养上清液，经Endo-H处理)；

图9显示了Kex2p加工位点存在或不存在下，酵母细胞培养上清液的SDS-PAGE结果(泳道M：大小标记；泳道1：含有pYIL-TFP1的酵母细胞培养上清液；泳道2：含有pYIL-KRTFP1的酵母细胞培养上清液；泳道3：含有pYIL-TFP3的酵母细胞培养上清液；泳道4：含有pYIL-KRTFP3的酵母细胞培养上清液；泳道5：含有pYIL-TFP4的酵母细胞培养上清液；泳道6：含有pYIL-KRTFP4的酵母细胞培养上清液)；

图10是为分析TFP1的特性，TFP1基因已被部分删除的质粒的图式介绍；

图11显示了分析得自TFP1的翻译融合伙伴(TFP-1、2、3和4)分泌白介素-2能力的SDS-PAGE结果(泳道M：大小标记；泳道S：白介素-2；泳道1-1：含有pYIL-KRT1-1(也称为pYIL-KRTFP1-1)的酵母细胞培养上清液；泳道1-2：含有pYIL-KRT1-2(也称为pYIL-KRTFP1-2)的酵母细胞培养上清液；泳道1-3：含有pYIL-KRT1-3(也称为pYIL-KRTFP1-3)的酵母细胞培养上清液；泳道1：含有pYIL-KRTFP1的酵母细胞培养上清液；和泳道1-4：含有pYIL-KRT1-4(也称为pYIL-KRTFP1-4)的酵母细胞培养上清液)；

图12显示了含有pYIL-KRT1-4的重组酵母菌株分批补料发酵剖面图和分析依发酵时间分泌到培养基的蛋白的SDS-PAGE结果；

图13显示了SDS-PAGE和Western印迹结果，显示出翻译融合伙伴TFP1、2、3和4诱导非可生产蛋白人G-CSF的分泌(泳道M：大小标记、泳道1：含有pYGCSF-KRTFP1的酵母细胞培养上清液；泳道2：含有pYGCSF-KRTFP2的酵母细胞培养上清液；泳道3：含有pYGCSF-KRTFP3的酵母细胞培养上清液；和泳道4：含有pYGCSF-KRTFP4的酵母细胞培养上清液)；

图14显示了含有pYGCSF-TFP3的重组酵母菌株分批补料发酵剖面图和分析依发酵时间分泌到培养基的蛋白的SDS-PAGE结果；

图15显示了全长基因的分离，翻译融合伙伴TFP3是全长基因的一部分和通过被分离的基因和G-CSF基因之间融合位点的修饰G-CSF分泌提高((A)泳道T3：含有pYGCSF-KRTFP3的酵母细胞培养上清液，泳道T3-1：含有pYGCSF-KRTFP3-1的酵母细胞培养上清液，泳道T3-2：含有pYGCSF-KRTFP3-2的酵母细胞培养上清液，泳道T3-3：含有pYGCSF-KRTFP3-3的酵母细胞培养上清液，和泳道T3-4：含有pYGCSF-KRTFP3-4的酵母细胞培养上清液；和(B)泳道T3：含有pYGCSF-KRTFP3的酵母细胞培养上清液，泳道T3-1：含有pYGCSF-KRTFP3-1的酵母细胞培养上清液，泳道T3-1-1：含有pYGCSF-KRTFP3-1-1的酵母细胞培养上清液，泳道T3-1-2：含有pYGCSF-KRTFP3-1-2的酵母细胞培养上清液，和泳道T3-2：含有pYGCSF-KRTFP3-2的酵母细胞培养上清液)；

图16显示了用于通过翻译融合伙伴TFP3分泌生产工业酶CalB14的发酵培养基的SDS-PAGE结果(泳道M：大小标记；泳道1和2：20℃低温下含有pYGA-CalB14的酵母细胞培养上清液；和泳道12-58：含有pYGT3-CalB14的酵母细胞培养上清液)；

图17显示了在巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)补料培养时，在给定时间点收集的样品的SDS-PAGE结果，该酵母包含含翻译融合伙伴TFP1的G-CSF表达载体pGAP-TFP1-GCSF，或传统的G-CSF表达载体pGAP-MFalpha-GCSF(泳道Sc：10μl含有pYGCSF-KRTFP1的酿酒酵母培养上清液；和泳道6-24：含有pGAP-TFP1-GCSF或pGAP-MFalpha-GCSF的巴斯德毕赤氏酵母培养上清液200μl浓缩物)；

图18是pYIL-KRTFP1的略图；

图19是pYIL-KRTFP2的略图；

图20是pYIL-KRTFP3的略图；

图21是pYIL-KRTFP4的略图；

图22是pYIL-KRT1-3(也称为pYIL-KRTFP1-3)的略图；

图23是pYIL-KRT1-4(也称为pYIL-KRTFP1-4)的略图；

图24是pYGT3-1-1-GCSF的略图；和

图25是pYGT3-1-2-GCSF的略图。

本发明最佳实施方式

在一个方面，本发明涉及一种从基因文库筛选诱导非可生产X-R融合蛋白胞外分泌的翻译融合伙伴(TFP)的方法，该融合蛋白是通过为自动筛选将非可生产靶蛋白基因(X)与报道基因(R)连接，通过X-R融合产物与其它基因融合制备的。

在一个详细方面，本发明涉及一种筛选生产非可生产蛋白的合适翻译融合伙伴(TFP)的方法，包括：

(1)制备包括融合基因(X-R)的自动筛选载体，其中为自动筛选，将编码非可生产靶蛋白的基因(X)与报道基因(R)符合读框地连接；

(2)将包括诱导非可生产融合蛋白(X-R)分泌的TFP的基因文库与自动筛选载体连接产生TFP文库；

(3)用TFP文库转化无报道基因活性的细胞，检测报道蛋白活性；和

(4)从发挥报道蛋白活性的转化细胞分离基因并分析TFP性能。

如在此使用的术语“翻译融合伙伴(TFP)”是指与编码非可生产蛋白的基因融合并诱导非可生产蛋白分泌生产的基因。而且，“翻译融合伙伴蛋白”意思是具有由前述TFP基因编码的氨基酸序列的蛋白。

如在此使用的术语“非可生产蛋白”是指由于从人或各种生物重组生产蛋白的天然性能，难以在宿主细胞，如大肠杆菌或酵母中表达的蛋白。尤其是，对于本发明的目的，非可生产蛋白是指重组生产中，难以在真核宿主细胞如酵母中表达的蛋白。本发明的筛选方法和使用该筛选方法获得的翻译融合伙伴用于不能在原核细胞如大肠杆菌和真核细胞如酵母中重组生产的蛋白，以及可以在原核细胞如大肠杆菌中重组生产，但是由于它们在真核细胞如酵母中产量低而成本效益低的许多蛋白。如在此使用的术语“表达”意思是编码特定蛋白的基因转录和翻译产物被分泌和获得作为最终期望产物。

根据本发明的自动筛选的报道基因选自编码能够胞外分泌的蛋白的基因群，但不限于此，这些蛋白包括转化酶、蔗糖酶、纤维素酶、木聚糖酶、麦芽糖酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶和半乳糖苷酶。

在该筛选方法中，包括诱导非可生产的融合蛋白分泌的翻译融合伙伴的基因文库可以从各种来源获得，例如动物、植物和微生物，包括酵母或人。优选的是来自酵母的基因文库。对于基因文库的酵母包括假丝酵母属(Candida)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、汉逊氏酵母属(Hansenula)、克卢费氏酵母属(Kluyveromyces)、毕赤氏酵母属(Pichia)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、亚罗威阿酵母属(Yarrowia)、酵母属(Saccharomyces)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、根霉菌属(Rhizopus)、木霉属(Trichoderma)等等。基因文库可以是基因组(染色体)DNA或cDNA形式。

在一个实施方案中，当在重组生产中难以表达的非可生产蛋白(X)与转化酶(I)融合并在酵母细胞中表达时，因为在正常情况下分泌的转化酶的分泌被融合的低分泌的蛋白(X)所抑制，所以由于在仅含有蔗糖作为碳源的培养基上融合蛋白的表达水平低，酵母细胞不生长或它们的生长大大延迟。然而，当导入能够诱导X-I表达和分泌的有效翻译融合伙伴时，细胞在蔗糖培养基上迅速生长。根据这个原理，当非可生产蛋白和转化酶的X-I融合蛋白与从各种来源获得的翻译融合伙伴文库以TFP-X-I或X-I-TFP形式另外融合，导入酵母细胞并在其中表达时，选择在蔗糖培养基上迅速生长的细胞，因而允许从各种文库快速筛选最适于非可生产蛋白的TFP。

因此，在更优选方面，本发明涉及一种快速筛选用于生产非可生产蛋白的合适的翻译融合伙伴(TFP)的方法，包括：

(1)制备删除其内源转化酶基因INV2(I)的酵母突变株以开发使用酵母转化酶作为报道基因的自动筛选系统；

(2)制备酵母高产量选择(HTS)载体-含有基因(X-I)的pYHTS载体(pYHTS-F0、pYHTS-F1或pYHTS-F2)，其中转化酶基因(I)与非可生产蛋白基因(X)符合读框地融合且在酵母GAL10启动子控制下表达；

(3)制备能够在pYHTS载体中分泌转化酶和非可生产蛋白融合基因(X-I)的来自酵母基因的翻译融合伙伴文库；

(4)将该文库转化到步骤(1)制备的酵母突变株中和在仅含蔗糖作为碳源的培养基上进行自动筛选；

(5)通过培养在蔗糖培养基上生长的酵母细胞检测分泌到培养基的蛋白；和

(6)从酵母细胞分离基因并分析翻译融合伙伴的性能。

本发明人制备了转化酶缺陷酵母突变株并发现通过与转化酶融合的蛋白在删除其转化酶基因的酵母菌株中的表达，转化酶可以用作自动筛选的标记。然后，本发明人制备了用于自动筛选翻译融合伙伴的载体-pYHTS-F0、F1和F2，使用非可生产蛋白、人白介素-2，将得自酵母的切割染色体DNA与该载体连接产生翻译融合伙伴文库，并从TFP文库发现适合低分泌蛋白人白介素-2的TFP蛋白-TFP1、TFP2、TFP3和TFP4。

仅使用蔗糖作为碳源，酵母细胞需要酵母INV2基因编码的转化酶。如在此使用的术语“使用转化酶的自动筛选系统”意思是指当删除了酵母菌株染色体INV2基因时，根据导入载体的INV2基因的表达选择在蔗糖培养基上生长的酵母菌株的系统。

转化酶已被用作报道蛋白。例如，美国专利6,228,590和EP 0 907 727 B1公开了筛选诱导缺乏天然分泌信号序列并因此不能被分泌的转化酶分泌的融合伙伴的方法。相比之下，本发明使用用于筛选能够诱导非可生产融合蛋白表达的翻译融合伙伴的转化酶，其中转化酶与非可生产蛋白融合。结果，表达转化酶的转化体数量显著减少，因此给出真假阳性之间更好的鉴别。因而，本发明允许快速鉴定适用于非可生产蛋白特异的翻译融合伙伴。

本发明获得的翻译融合伙伴TFP1、TFP2、TFP3和TFP4及其衍生物可以应用于大规模生产的商品化的各种蛋白。这些蛋白包括但不限于细胞因子(例如白介素)、血清蛋白(例如凝血因子包括因子VII、VIII和IX)、免疫球蛋白、细胞因子受体、乳铁蛋白、干扰素(例如干扰素-α、-β、-γ)、集落刺激因子(例如GM-CSF、G-CSF)、磷脂酶活化蛋白(PLAP)、胰岛素、肿瘤坏死因子(TNF)、生长因子(例如组织生长因子和上皮生长因子，如TGFα或TGFβ、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF))、激素(例如促卵泡素、促甲状腺素、抗利尿激素、色素性和甲状旁腺激素、黄体生成素释放激素及其衍生物)、降钙素、降钙素基因相关肽(CGPR)、脑啡肽、促生长因子、红细胞生成素、下丘脑释放因子、催乳素、绒毛膜促性腺激素、组织纤溶酶原激活物、生长激素释放肽(GHPR)、胸腺体液因子(THF)和抗癌和抗菌肽。并且，这些蛋白可以包括酶，通过碳水化合物特异性酶、蛋白水解酶、脂肪酶、氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和连接酶示例。酶的具体实例包括但不限于天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺苷脱氨酶、过氧化物歧化酶、内毒素酶、过氧化氢酶、胰凝乳蛋白酶、尿酸酶、二磷酸腺苷酶、酪氨酸酶和胆红素氧化酶。碳水化合物特异性酶的实例包括葡萄糖氧化酶、葡萄糖酶(glucodase)、半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶和葡糖苷酸酶。

非可生产蛋白基因是编码具有人医学或工业重要性、需要重组生产的上述蛋白的基因，和从来源于各种植物、动物和微生物，包括人的基因分离或化学合成的基因。

本发明的自动筛选载体包括启动子基因、删除了翻译起始和终止密码子的编码靶蛋白的基因、和与编码靶蛋白的基因符合读框融合的报道基因。启动子基因优选选自包括GAPDH、PGK、ADH、PHO5、GAL1和GAL10的组。

在本发明的自动筛选法中，待转化的宿主细胞包括但不限于酵母如假丝酵母属、德巴利酵母属、汉逊氏酵母属、克卢费氏酵母属、毕赤氏酵母属、裂殖酵母属、亚罗威阿酵母属和酵母属种，真菌如曲霉属、青霉属、根霉菌属和木霉属种，和细菌如埃希氏杆菌属(Escherichia)和芽胞杆菌属(Bacillus)种。

根据本发明的生产非可生产蛋白的合适TFP的快速筛选方法优选用于不表达或低水平表达的非可生产蛋白的生产。而且，该方法可以用于筛选能够增加低水平表达蛋白的表达水平的TFP。如在本发明的一个实施方案中，当转化酶用作报道子时，根据细胞在蔗糖培养基上的生长率选择细胞，因此允许鉴别更有效的TFPs。

在另一方面，本发明涉及用于快速筛选刺激非可生产蛋白白介素-2的分泌生产的合适融合伙伴的载体-pYHTS-F0、F1和F2。这些筛选载体包括非可生产蛋白人白介素-2和转化酶的融合基因，并且含有在白介素-2基因氨基末端具有三个不同阅读框架的BamHI识别位点。

在本发明的一个实施方案中，为了快速筛选刺激人白介素-2在酵母细胞中分泌生产的合适融合伙伴，随机切割酵母染色体DNA并被插入三个筛选载体(pYHTS-F0、F1和F2)。用所得筛选载体转化缺乏转化酶的酵母菌株，选择在蔗糖培养基上生长的菌落以鉴定能够将非可生产白介素-2和转化酶的融合蛋白分泌到培养基的合适融合伙伴。

人白介素-2是一种高度疏水的蛋白，难以在酵母细胞中表达，因为由强烈启动子引起的大规模表达重组蛋白在ER中不是快速折叠成活性形式，而是形成可能阻断ER作用的聚集体。因而，当与白介素-2融合时，转化酶也不分泌，并且酵母细胞不能在蔗糖培养基上生长。能够有效分泌这些融合蛋白的翻译融合伙伴可以通过在白介素-2基因上游插入酵母基因组文库，并将该文库转化到酵母菌株中和选择在蔗糖培养基上生长的转化体而鉴定。

在一个实施方案中，为了获得诱导非可生产蛋白白介素-2分泌的融合伙伴，本发明人从在蔗糖培养基上生长的转化体分离基因，该基因再转化到大肠杆菌中并回收四个不同的质粒(pYHTS-TFP1、TFP2、TFP3和TFP4)。获得了质粒中携带的四个不同翻译融合伙伴基因TFP1(SEQ ID NO.2)、TFP2(SEQ ID NO.4)、TFP3(SEQ ID NO.6)和TFP4(SEQID NO.8)，和相应氨基酸序列分别用SEQ ID NOS.1、3、5和7表示。

转化酶基因在获得的载体pYHTS-TFP1、TFP2、TFP3和TFP4中被删除，并将翻译终止密码子插入白介素-2基因中，由此产生pYIL-TFP1、TFP2、TFP3和TFP4。由于这些载体以与翻译融合伙伴融合的形式分泌白介素-2，因此插入Kex2p蛋白酶的识别位点以允许自动除去翻译融合伙伴，由此产生pYIL-KRTFP1、KRTFP2、KRTFP3和KRTFP4。而且，人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)与翻译融合伙伴TFP1至TFP4融合，由此分别产生载体pYGCSF-TFP1至pYGCSF-TFP4。这些载体证明TFPs在除了人白介素-2的其他蛋白的分泌生产中也是有效。

另一方面，当传统表达-分泌系统(AMY，淀粉酶分泌信号)用于在重组酵母菌株—即CalB14突变株中进行大规模分泌生产时，CalB14在30℃的最适酵母培养温度下不能被有效分泌，而是在22℃的低温下被分泌，其中CalB14突变株通过野生型假丝酵母属南极洲脂肪酶B(CalB)的分子进化，特异活性提高了约6倍，并且由于CalB14在工业应用中的应用远景吸引了很多兴趣。由于传统系统具有大规模发酵时酵母生长率低和发酵罐温度控制尤其是在夏天的成本高的问题，需要允许在最适培养温度分泌生产的分泌系统。在本发明中，通过制备携带与TFP3融合的CalB的pYGT3-CalB4载体解决了这些问题。

因此，在进一步的方面，本发明涉及由SEQ ID NO.1表示的翻译融合伙伴TFP1蛋白或其类似物。本发明还涉及编码由SEQ ID NO.1表示的翻译融合伙伴TFP1蛋白或其类似物的基因。本发明的范围包括具有SEQ ID NO.1表示的氨基酸序列或与其具有优选75％、更优选85％、甚至更优选90％和最优选95％或更高同源性的氨基酸序列的翻译融合伙伴TFP1蛋白。本发明的范围还包括具有编码SEQ ID NO.1表示的翻译融合伙伴TFP1蛋白的DNA序列，或与其具有优选75％、更优选85％、甚至更优选90％和最优选95％或更高同源性的DNA序列的基因。优选，该基因是SEQ ID NO.2的基因。此外，本发明涉及包含该基因的重组载体。优选，重组载体中携带的基因是SEQ ID NO.2的基因。重组载体的实例包括pYIL-TFP1、pYIL-KRTFP1、pYGCSF-TFP1、pYGCSF-KRTFP1和pGAP-TFP1-GCSF。更进一步，本发明涉及用该重组载体转化的细胞。用pYIL-KRTFP1转化的大肠杆菌于2003年11月11日保藏在KCTC(韩国典型培养物保藏中心)，和指定保藏号KCTC 10544BP。

在又另一个方面，本发明涉及由SEQ ID NO.3表示的翻译融合伙伴TFP2蛋白或其类似物。本发明还涉及编码由SEQ ID NO.3表示的翻译融合伙伴TFP1蛋白或其类似物的基因。本发明的范围包括具有SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列或与其具有优选75％、更优选85％、甚至更优选90％和最优选95％或更高同源性的氨基酸序列的翻译融合伙伴TFP2蛋白。本发明的范围还包括具有编码SEQ ID NO.3表示的翻译融合伙伴TFP2蛋白的DNA序列，或与其具有优选75％、更优选85％、甚至更优选90％和最优选95％或更高同源性的DNA序列的基因。优选，该基因是SEQ ID NO.4的基因。此外，本发明涉及包含该基因的重组载体。优选，重组载体中携带的基因是SEQ ID NO.4的基因。该重组载体的实例包括pYIL-TFP2、pYIL-KRTFP2、pYGCSF-TFP2和pYGCSF-KRTFP2。更进一步，本发明涉及用该重组载体转化的细胞。用pYIL-KRTFP2转化的大肠杆菌于2003年11月11日保藏在KCTC(韩国典型培养物保藏中心)，和指定保藏号KCTC 10545BP。

在又另一个方面，本发明涉及由SEQ ID NO.5表示的翻译融合伙伴TFP3蛋白或其类似物。本发明还涉及编码由SEQ ID NO.5表示的翻译融合伙伴TFP3蛋白或其类似物的基因。本发明的范围包括具有SEQ ID NO.5表示的氨基酸序列或与其具有优选75％、更优选85％、甚至更优选90％和最优选95％或更高同源性的氨基酸序列的翻译融合伙伴TFP3蛋白。本发明的范围还包括具有编码SEQ ID NO.5表示的翻译融合伙伴TFP3蛋白的DNA序列，或与其具有优选75％、更优选85％、甚至更优选90％和最优选95％或更高同源性的DNA序列的基因。优选，该基因是SEQ ID NO.6的基因。此外，本发明涉及包含该基因的重组载体。优选，重组载体中携带的基因是SEQ ID NO.6的基因。该重组载体的实例包括pYIL-TFP3、pYIL-KRTFP3、pYGCSF-TFP3、pYGCSF-KRTFP3和pYGT3-CalB14。更进一步，本发明涉及用该重组载体转化的细胞。用pYIL-KRTFP3转化的大肠杆菌于2003年11月11日保藏在KCTC(韩国典型培养物保藏中心)，和指定保藏号KCTC 10546BP。

在又另一个方面，本发明涉及由SEQ ID NO.7表示的翻译融合伙伴TFP4蛋白或其类似物。本发明还涉及编码由SEQ ID NO.7表示的翻译融合伙伴TFP4蛋白或其类似物的基因。本发明的范围包括具有SEQ ID NO.7表示的氨基酸序列或与其具有优选75％、更优选85％、甚至更优选90％和最优选95％或更高同源性的氨基酸序列的翻译融合伙伴TFP4蛋白。本发明的范围还包括具有编码SEQ ID NO.7表示的翻译融合伙伴TFP4蛋白的DNA序列，或与其具有优选75％、更优选85％、甚至更优选90％和最优选95％或更高同源性的DNA序列的基因。优选，该基因是SEQ ID NO.8的基因。此外，本发明涉及包含该基因的重组载体。优选，重组载体中携带的基因是SEQ ID NO.8的基因。该重组载体的实例包括pYIL-TFP4、pYIL-KRTFP4、pYGCSF-TFP4和pYGCSF-KRTFP4。更进一步，本发明涉及用该重组载体转化的细胞。用pYIL-KRTFP4转化的大肠杆菌于2003年11月11日保藏在KCTC(韩国典型培养物保藏中心)，和指定保藏号KCTC 10547BP。

如在此用于翻译融合伙伴蛋白或基因的术语“类似物”意思是当翻译融合伙伴基因与编码非可生产蛋白的基因融合时，通过诱导非可生产蛋白分泌生产而发挥翻译融合伙伴活性的功能等同物。在TFP蛋白的情况下，该类似物可以包括例如具有相同性能的氨基酸之间的置换(例如用另一疏水性氨基酸取代一疏水性氨基酸、用另一亲水性氨基酸取代一亲水性氨基酸、用另一碱性氨基酸取代一碱性氨基酸、用另一酸性氨基酸取代一酸性氨基酸)、氨基酸的缺失和插入或其组合。

对于本发明的翻译融合伙伴蛋白的置换类似物，通常不改变蛋白或肽活性的蛋白和肽中的氨基酸置换是本领域已知的(H.Neurath，R.L.Hill，The Proteins，AcademicPress，New York，1979)。最常发生的在双方向上置换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。

此外，对于本发明的翻译融合伙伴蛋白的缺失类似物，使用基因组文库(染色体文库)或cDNA文库鉴定的翻译融合伙伴基因的全部序列的一部分缺失可能不影响或可能刺激非可生产蛋白的分泌。本发明人研究了翻译融合伙伴TFP1、TFP2、TFP3和TFP4的缺失类似物片段对非可生产蛋白分泌的影响。携带删除富含丝氨酸/丙氨酸序列、N-糖基化位点或将二者都删除的TFP1的载体不分泌非可生产蛋白。相比之下，携带已删除5’-UTR(5’非翻译区)的TFP1的载体(pYIL-KRT1-4)使非可生产蛋白的表达水平增加三倍以上。而且，当另外删除3’末端(pYIL-KRT1-3)时，诱导非可生产蛋白的分泌。因此，本发明5’-UTR的翻译融合伙伴缺失类似物和3’末端部分删除的TFPs包括在本发明范围内，只要它们不反面影响非可生产蛋白的分泌。

在一个详细方面，本发明涉及由SEQ ID NO.9表示的翻译融合伙伴TFP1-3蛋白或其类似物。本发明还涉及编码由SEQ ID NO.9表示的翻译融合伙伴TFP1-3蛋白或其类似物的基因。本发明的范围包括具有SEQ ID NO.9表示的氨基酸序列或与其具有优选75％、更优选85％、甚至更优选90％和最优选95％或更高同源性的氨基酸序列的翻译融合伙伴TFP1-3蛋白。本发明的范围还包括具有编码SEQID NO.9表示的翻译融合伙伴TFP1-3蛋白的DNA序列，或与其具有优选75％、更优选85％、甚至更优选90％和最优选95％或更高同源性的DNA序列的基因。此外，本发明提供了携带该基因的重组载体。优选，重组载体中携带的基因是编码SEQ ID NO.9表示的翻译融合伙伴TFP1-3的基因。该重组载体的示例是pYIL-KRT1-3(也称作pYIL-KRTFP1-3)。更进一步，本发明涉及用该重组载体转化的细胞。用pYIL-KRTFP1-3转化的大肠杆菌于2003年11月11日保藏在KCTC(韩国典型培养物保藏中心)，和指定保藏号KCTC 10548BP。

在另一个详细方面，本发明涉及由SEQ ID NO.10表示的基因编码的翻译融合伙伴TFP1-4蛋白或其类似物。本发明还涉及编码由SEQ ID NO.10表示的翻译融合伙伴TFP1-4蛋白或其类似物的基因。本发明的范围包括具有SEQ ID NO.10表示的基因编码的氨基酸序列或与其具有优选75％、更优选85％、甚至更优选90％和最优选95％或更高同源性的氨基酸序列的翻译融合伙伴TFP1-4蛋白。本发明的范围还包括具有SEQ ID NO.10表示的DNA序列，或与其具有优选75％、更优选85％、甚至更优选90％和最优选95％或更高同源性的DNA序列的基因。本发明提供了包含编码翻译融合伙伴TFP1-4并由SEQ ID NO.10表示或其类似物的基因的重组载体。而且，本发明提供了包含具有编码翻译融合伙伴TFP1-4并由SEQ ID NO.10表示的DNA序列，或与其具有优选75％、更优选85％、甚至更优选90％和最优选95％或更高同源性的DNA序列的基因的重组载体。该重组载体的示例是pYIL-KRT1-4(也称作pYIL-KRTFP1-4)。此外，本发明提供了用该重组载体转化的细胞。用pYIL-KRT1-4转化的大肠杆菌于2003年11月11日保藏在KCTC(韩国典型培养物保藏中心)，和指定保藏号KCTC 10549BP。

此外，对于本发明的翻译融合伙伴蛋白的插入类似物，某些序列添加至使用基因组文库或cDNA文库鉴定的翻译融合伙伴基因的全部序列或发挥活性的一部分序列可能不影响或可能刺激非可生产蛋白的分泌。本发明人研究了翻译融合伙伴的插入类似物对非可生产蛋白分泌的影响。TFP3的两个插入类似物(104个氨基酸)、TFP3-3(189个氨基酸)和TFP3-4(222个氨基酸)降低了分泌产量。相比之下，将26个氨基酸的N-糖基化位点添加至TFP3制备的TFP3-1与TFP3相比，使G-CSF的分泌增加约三倍。而且，将4个氨基酸添加至TFP3-1制备的TFP3-1-1(134个氨基酸)和将13个氨基酸添加至TFP3-1制备的TFP3-1-2(143个氨基酸)大大降低了分泌过程中未用Kex2p加工的融合蛋白水平，但G-CSF的分泌产量没有降低。因此，本发明翻译融合伙伴的插入类似物，其具有增加了N-糖基化位点和允许用Kex2p蛋白酶方法切割融合部位的区域，都包括在本发明范围内，只要它们不反面影响非可生产蛋白的分泌。

在一个详细方面，本发明提供了由SEQ ID NO.40表示的翻译融合伙伴TFP3-1-1蛋白或其类似物。本发明还提供了编码由SEQ ID NO.40表示的翻译融合伙伴TFP3-1-1蛋白或其类似物的基因。本发明的范围包括具有SEQ ID NO.40表示的氨基酸序列或与其具有优选75％、更优选85％、甚至更优选90％和最优选95％或更高同源性的氨基酸序列的翻译融合伙伴TFP3-1-1蛋白。本发明的范围还包括具有编码SEQ ID NO.40表示的翻译融合伙伴TFP3-1-1蛋白的DNA序列，或与其具有优选75％、更优选85％、甚至更优选90％和最优选95％或更高同源性的DNA序列的基因。优选，该基因是SEQ ID NO.41的基因。此外，本发明提供了包含该基因的重组载体。优选，该重组载体中携带的基因是SEQID NO.41的基因。该重组载体的示例是pYGT3-1-1-GCSF。更进一步，本发明提供了用该重组载体转化的细胞。用pYGT3-1-1-GCSF转化的大肠杆菌于2004年12月21日保藏在KCTC(韩国典型培养物保藏中心)，和指定保藏号KCTC 10753BP。

在另一个详细方面，本发明提供了由SEQ ID NO.42表示的翻译融合伙伴TFP3-1-2蛋白或其类似物。本发明还提供了编码由SEQ ID NO.42表示的翻译融合伙伴TFP3-1-2蛋白或其类似物的基因。本发明的范围包括具有SEQ ID NO.42表示的氨基酸序列或与其具有优选75％、更优选85％、甚至更优选90％和最优选95％或更高同源性的氨基酸序列的翻译融合伙伴TFP3-1-2蛋白。本发明的范围还包括具有编码SEQID NO.42表示的翻译融合伙伴TFP3-1-2蛋白的DNA序列，或与其具有优选75％、更优选85％、甚至更优选90％和最优选95％或更高同源性的DNA序列的基因。优选，该基因是SEQ ID NO.43的基因。此外，本发明提供了包含该基因的重组载体。优选，该重组载体中携带的基因是SEQID NO.43的基因。该重组载体的示例是pYGT3-1-2-GCSF。更进一步，本发明提供了用该重组载体转化的细胞。用pYGT3-1-2-GCSF转化的大肠杆菌于2004年12月21日保藏在KCTC(韩国典型培养物保藏中心)，和指定保藏号KCTC 10754BP。

如在此用于翻译融合伙伴蛋白或基因的术语“同源性”意欲表示与野生型氨基酸序列和野生型核苷酸序列的相似性。在蛋白的情况下，“同源性”包括与本发明TFP蛋白的氨基酸序列具有优选75％或更高，更优选85％或更高，甚至更优选90％或更高和最优选95％或更高同一性的氨基酸序列。典型地，蛋白同系物可以包括与靶蛋白相同的活性部位。在基因的情况下，“同源性”包括与编码本发明TFP蛋白的DNA序列具有优选75％或更高，更优选85％或更高，甚至更优选90％或更高和最优选95％或更高同一性的DNA序列。同源性评估可以用肉眼或使用市场上可买到的程序来进行。使用市场上可买到的计算机程序，两个或更多序列之间的同源性可以用百分比(％)来表示，和可以估计邻近序列之间的同源性(％)。

根据本发明鉴定的用于非可生产蛋白分泌生产的翻译融合伙伴以与编码非可生产蛋白的基因融合的形式使用，并可以插入载体用于非可生产蛋白的分泌生产。如在此使用的术语“载体”是指DNA构建体，该DNA构建体含有与能够控制蛋白在合适宿主中表达的调节序列和为促进其它基因操作或优化蛋白表达而引入的序列操作连接的DNA序列。这种调节序列包括进行转录控制的启动子、为转录控制选择性添加的操纵子、合适的mRNA核糖体结合位点和转录/翻译的序列控制终止子。用于插入外源基因的这种载体可以是质粒、病毒、粘粒等等。该载体包括克隆载体和表达载体。克隆载体是其中插入外源DNA的可复制质粒，并将外源DNA递送入随其转染的宿主细胞。表达载体典型地意思是其中插入外源DNA片段，通常是双链DNA片段的载体。“外源DNA”是指不是天然存在于宿主细胞中的异种DNA。表达载体能够不依赖于宿主细胞中的宿主染色体DNA而复制，使得可以产生插入的外源DNA。如本领域通常已知的，为了增加转染基因在宿主细胞中的表达水平，该基因应当与在选择作为表达系统的宿主细胞中有作用的转录和翻译调节序列操作连接。

术语“转化”如在此对于使用含有翻译融合伙伴的重组载体所用的转化，其意思是将DNA导入合适的宿主细胞，使得DNA可复制，或作为染色体外元件或通过染色体整合。根据本发明的对转化有用的宿主细胞可以是原核的或真核的。此外，典型地可以使用具有外源DNA转化率高和导入DNA的表达水平高的宿主细胞。宿主细胞的实例包括原核和真核细胞例如埃希氏杆菌属种(Escherichia sp.)、假单胞菌属种(Pseudomonassp.)、芽胞杆菌属种(Bacillus sp.)、链霉菌属种(Steptomyces sp.)、真菌和酵母、昆虫细胞，如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf9)和动物细胞如CHO、COS 1、COS7、BSC 1、BSC 40和BMT 10。而且，酵母包括假丝酵母属、德巴利酵母属、汉逊氏酵母属、克卢费氏酵母属、毕赤氏酵母属、裂殖酵母属、亚罗威阿酵母属、酵母属种可以优选用作根据本发明的非可生产蛋白大规模生产的宿主细胞。

在又另一个方面，本发明涉及使用前述TFP蛋白重组生产非可生产蛋白的方法。

重组生产非可生产蛋白的方法包括制备表达载体，该表达载体中插入与编码TFP蛋白的基因融合的非可生产蛋白编码基因，和培养用该重组表达载体转化的转化体。详细来说，本发明涉及重组生产非可生产蛋白的方法，使用具有由SEQ ID NO.1、3、5、7、9、40或42表示的氨基酸序列，或与其具有优选75％，更优选85％，甚至更优选90％和最优选95％或更高同源性的氨基酸序列的蛋白，或使用具有由SEQ ID NO.10表示的基因编码的氨基酸序列，或与其具有优选75％或更高，更优选85％或更高，甚至更优选90％或更高和最优选95％或更高同源性的氨基酸序列的蛋白。优选，SEQ ID NO.1表示的蛋白由SEQ ID NO.2表示的基因编码，SEQ ID NO.3表示的蛋白由SEQID NO.4表示的基因编码，SEQ ID NO.5表示的蛋白由SEQ ID NO.6表示的基因编码，SEQ ID NO.7表示的蛋白由SEQ ID NO.8表示的基因编码，SEQ ID NO.40表示的蛋白由SEQ ID NO.41表示的基因编码，SEQ ID NO.42表示的蛋白由SEQ ID NO.43表示的基因编码。

通过下列实施例可以更好的理解本发明，这些实施例以举例说明的方式阐述，但不能解释为对本发明的限制。

实施例1：转化酶缺陷酵母突变株的制备

为快速筛选非可生产蛋白的翻译融合伙伴，通过使用酵母转化酶作为报道子评价蔗糖培养基中的细胞生长来建立自动筛选系统。

要求转化酶活性有缺陷的酵母菌株在转化后的筛选时使用载体中所含转化酶基因作为报道基因。因此，酵母染色体DNA中INV2基因被删除。为了制备诱导基因删除的盒，用EcoRI和XhoI消化pRB58质粒(Carlson et al.，Cell，1982，20，145)-，和回收INV2编码基因并引入pBluescript KS+(Stratagene，美国)的EcoRI/XhoI位点，由此产生pBIΔBX。如图1所示，在其两个末端都具有190bp(Tc190)重复序列的URA3基因被插入pBIΔBX中所含INV2基因的HindIII-XbaI位点，由此产生pBIU。用EcoRI和XhoI消化pBIU，并转化啤酒酵母Y2805Δgal1(Mat a ura3 INV2 pep4::HIS3 gal1 can1)菌株(SK Rhee，韩国生命科学和生物技术研究院(Korea Research Institute ofBioscience and Biotechnology))。在缺乏尿嘧啶的选择培养基中选择转化体Y2805Δgal1Δinv2U(Mat a inv2::URA3 pep4::HIS3 gal1 can1)。

评价所选择的转化细胞以确定它们是否完全丧失转化酶活性。在分别包含葡萄糖和蔗糖作为唯一碳源的两种培养基中培养单一菌落。结果，与对照相比，菌落在葡萄糖培养基中正常生长，而在蔗糖培养基中生长非常缓慢。为了研究分泌到培养基中的转化酶的量，培养INV2+菌株和Δinv2菌株。在SDS-PAGE上分离培养上清液中所含的蛋白，和在蔗糖溶液中孵育凝胶30分钟并进行使用染料TTC(2，3，5-氯化三苯四唑)的酶谱分析。如图2所示，发现Δinv2菌株丧失了它的大部分转化酶活性。然而，该突变株具有在蔗糖培养基中以非常缓慢的速率生长的问题。据信这是因为通过线粒体的功能，细胞通过糖异生部分生长。因此，为解决这个问题，向培养基中添加抗霉素A-线粒体电子转运抑制剂来阻断细胞生长。结果，在抗霉素A存在下，突变株的生长完全被抑制(图3)。

为了再转化所选择的菌株-带有含TFP文库的URA3载体的Y2805Δgal1Δinv2U(Mat a inv2::URA3 pep4::HIS3 gal1 can1)，有必要除去用于删除INV2基因的URA3基因。为进行此过程，在含有5-氟乳清酸(5-FOA)的培养基中培养细胞并选择丧失URA3基因的细胞，由此获得URA3敲除的删除菌株-Y2805Δgal1Δinv2(Mat a ura3inv2::Tc190 pep4::HIS3 gal1 can1)(图1)。进行Southern印迹证实染色体上INV2基因的删除，正如所料，和URA3基因的敲除(图4)。当用EcoRI处理酿酒酵母Y2805的染色体DNA并用INV2基因作为探针通过Southern印迹进行分析，检测到约4.3kb的片段。当插入URA3基因(Y2805Δgal1Δinv2U)时，大小增加到约5.0 kb，和当URA3基因被敲除(Y2805Δgal1Δinv2)时降至约3.7 kb。如图4所示，正如所料，INV2基因明显被删除，并且丧失(敲除)了URA3基因。

实施例2：通过与转化酶融合鉴定自动筛选系统

通过与转化酶融合的蛋白的表达，使用在酵母中高水平表达的人蛋白-人血清白蛋白(HSA)和非可生产蛋白-人白介素-2(IL-2)，评价转化酶基因缺陷菌株在蔗糖培养基中被自动筛选的可能性。

首先，如下制备其中白蛋白与转化酶融合的pGHSA-INV2载体。为了将SfiI识别序列插入HSA基因两端，使用正义引物和反义引物，每个引物具有SfiI识别序列，分别是JH97(Sfi-HAS-正向引物)(SEQ ID NO.11)和JH119(Sfi-HSA-反向引物)(SEQ ID NO.12)，pYHSA5(Kang et al.，J.Microbiol.Biotechnol.，1998，8，42)作为模板和Pfu聚合酶(Stratagene，美国)，进行PCR。PCR条件包括1个循环的94℃5分钟，和25个循环的94℃30秒、55℃30秒和72℃2分钟，随后是最后1个循环的72℃7分钟。得到大约1.8kb的PCR产物，其是白蛋白基因。分开地，相同条件下使用一组引物通过PCR扩增转化酶基因，JH99(Sfi-INV-正向)(SEQ ID NO.13)和JH100(SalI-INV-反向引物)(SEQ ID NO.14)，和pRB58作为模板。用SfiI/SalI处理扩增的转化酶基因，并与PstI/SfiI处理的白蛋白基因一起插入PstI/SalI消化的pBluescript(Stratagene，美国)。然后，用SacI/PstI消化pYHSA5以切除含有GAL启动子和一部分白蛋白基因的片段。这个片段，以及包含一部分白蛋白基因和转化酶基因的从上面制备的质粒切除的PstI-SalI插入物共同连接入YEGα-HIR525载体的SacI/SalI位点(Choi et al.，Appl Microbiol Biotechnol.，1994，42，587)，由此产生pGHSA-INV2。

如下制备IL-2和转化酶的融合表达载体。通过PCR扩增IL-2基因，使用一组引物JH106(Sfi-IL2-正向引物)(SEQ ID NO.15)和JH107(Sfi-IL2-反向引物)(SEQ ID NO.16)，和pT7-hIL-2(JK Jung，Korea Research Institute of Bioscience andBiotechnology)作为模板。扩增的白介素基因插入pBluescript(Stratagene，美国)的EcoRV位点，由此产生pBKS-IL2。通过SfiI消化的线性化形式pBKS-IL2和包含GAL启动子和INV分泌信号的从pGHSA-INV2切除的SacI-SfiI插入物共同连接入pGHSA-INV2的SacI/SfiI位点，由此产生pGIL2-INV2。

表达白蛋白和转化酶的融合蛋白的pGHSA-INV2载体、表达IL-2和转化酶的融合蛋白的pGIL2-INV2，和仅仅表达转化酶的pRB58逐个转化删除其内源转化酶基因并因此不能在蔗糖培养基中生长的酵母菌株(Y2805Δinv2)。转化细胞涂布在含葡萄糖作为碳源的培养基(UD)和含蔗糖作为碳源的培养基(YPSA)上，并观察它们的生长(图5)。当用正常表达转化酶的pRB58载体转化细胞时，它们在两种碳源下正常生长。而且，当用其中转化酶与引起转化酶高水平表达的白蛋白融合的pGHSA-INV2载体转化细胞时，使用两种碳源它们生长得都很好。相比之下，当用其中转化酶与引起转化酶低表达的IL-2融合的pGIL2-INV2载体转化细胞时，它们在葡萄糖培养基上正常生长，而在蔗糖培养基上很少生长。据信不能在蔗糖培养基中生长的pGIL2-INV2转化细胞是由于IL-2不能从细胞中分泌和导致与其融合的转化酶分泌阻断的结果。这些结果表明使用外源转化酶基因导入由于其内源转化酶基因的删除而不能在蔗糖培养基上生长的酵母突变株(Y2805Δinv2)和在其中分泌或不分泌，使得酵母细胞的自动筛选成为可能。

实施例3：使用非可生产蛋白人IL-2制备翻译融合伙伴筛选载体

为了使用其中IL-2与转化酶融合的pGIL2-INV2载体获得能够诱导融合蛋白分泌的合适翻译融合伙伴，制备具有用于制备文库的三个阅读框的载体pYHTS-F0、F1和F2(图6)。

使用具有三个阅读框和BamHI识别位点的正义引物，JH120(BamHI-IL2-1-正向引物)(SEQ ID NO.17)、JH121(BamHI-IL2-2-正向引物)(SEQ ID NO.18)和JH122(BamHI-IL2-3-正向引物)(SEQ ID NO.19)，反义引物，JH123(INV-1-反向引物)(SEQID NO.20)，pGIL2-INV2作为模板和Pfu聚合酶(Stratagene，美国)，进行PCR。PCR条件包括1个循环的94℃3分钟，和25个循环的94℃30秒、55℃30秒和72℃1分钟，随后是最后1个循环的72℃7分钟。获得约1.2kb的PCR产物，含有IL-2基因和一部分转化酶基因。分开地，在相同条件下，使用一组引物，JH124(INV-正向引物)(SEQ IDNO.21)和JH95(INV-2-反向引物)(SEQ ID NO.22)，和pGIL2-INV2作为模板，进行PCR，由此获得含有一部分转化酶基因的约0.9kb的片段。从琼脂糖凝胶纯化PCR产物。具有三个阅读框的三个1.2kb片段中的每一个与0.9kb片段混合后，使用正义引物，JH120(SEQ ID NO.17)、JH121(SEQ ID NO.18)和JH122(SEQ ID NO.19)，和反义引物，JH95(SEQID NO.22)进行第二次PCR。通过琼脂糖电泳获得约2.1kb的三个片段。用BamHI和SalI消化三个回收的2.1kb片段并逐个插入BamHI和SalI二者消化的pGIL2-INV2，由此产生pYHTS-F0、F1和F2。

实施例4：从酵母基因组制备合适的翻译融合伙伴文库

使用来自酿酒酵母Y2805(SK Rhee，韩国生命科学和生物技术研究院)和多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)DL-1(ATCC26012)的染色体DNA制备翻译融合伙伴文库。用Sau3AI部分消化每种染色体DNA后，从琼脂糖凝胶纯化从0.5kb至1.0kb范围的DNA片段，并与用BamHI消化和小牛肠磷酸酶处理的pYHTS-F0、F1和F2载体的混合物连接(图6)。然后，用连接的DNA转化大肠杆菌DH5α，涂布到含氨苄青霉素的LB培养基(1％胰蛋白胨(Bacto-tryptone)、0.5％酵母浸膏、1％NaCl)上，并在37℃培养一天。使用从酵母染色体DNA制备的文库DNA，获得约5×10⁴个转化体的文库。使用无菌蒸馏水回收全部转化体，和使用质粒提取试剂盒(Bioneer，韩国)从回收的转化体分离文库DNA。

实施例5：适于非可生产蛋白人IL-2的翻译融合伙伴的自动筛选

使用醋酸锂方法(Hills et al.，Nucleic Acids Res.1991，19，5791)，将实施例4中制备的文库DNA转化啤酒酵母Y2805Δgal1Δinv2(Mat a ura3 inv2::Tc190pep4::HIS3 gal1 can1)。然后，将转化细胞涂布在缺乏尿嘧啶的UD基本培养基(0.67％无氨基酸的酵母氮源(yeast nitrogen base、适当浓度的各种氨基酸的混合物、2％葡萄糖)和YPGSA培养基上(1％酵母浸膏、2％蛋白胨、2％蔗糖、0.3％半乳糖、1μg/ml抗霉素A)，并在30℃培养5天。下表1中给出了在每种培养基上出现的菌落数量，其中比较了导入翻译融合伙伴前后转化体的数量。当仅用用于制备文库的载体(pYHTS-F0、F1和F2)转化酵母细胞时，葡萄糖培养基上约形成1×10⁴个菌落，但是正如所料蔗糖培养基上没有细胞生长。相比之下，当用酵母基因组文库转化酵母细胞时，约11个转化体在蔗糖培养基上生长，表明在导入的翻译融合伙伴帮助下，转化酶被分泌。

表1

导入Y2805Δgal1Δinv2(宿主细胞)的DNA	转化体数量
			UD基本培养基(葡萄糖)	YPSGA(葡萄糖)
	-pYHTS载体pYHTS+基因组文库(酿酒酵母)pYHTS+基因组文库(多形汉逊氏酵母)	0~1×104 ~1×104 ~1×104			00101

实施例6：翻译融合伙伴的分析

蔗糖培养基上生长的转化体在YPD培养基(1％酵母浸膏、2％蛋白胨、2％葡萄糖)中培养24小时。收获培养细胞后，裂解它们以分离导入的质粒。分离的质粒再转化大肠杆菌。从转化的大肠杆菌中再次分离质粒，通过限制性酶图谱评定基因插入并进行DNA测序分析。结果，发现该质粒含有具有不同序列的四个基因，其充当翻译融合伙伴(表2：插入质粒的新的翻译融合伙伴，其中所述质粒是从在蔗糖培养基中生长的转化体中分离出来的)。

表2

质粒	翻译融合伙伴	酵母基因	融合的氨基酸数量(总氨基酸数量)	特征
					pYHTS-TFP1pYHTS-TFP2pYHTS-TFP3pYHTS-TFP4	TFP1TFP2TFP3TFP4	Yar066wYar026cYjl158c未知	105(203)117(169)104(227)50(未知)	PRE，N-gly，富含Ser，GPIPRE，N-glyPRE-PRO，O-gly，PIRPRE

6-1.翻译融合伙伴1(TFP1)

本发明人发现翻译融合伙伴1(TFP1)(SEQ ID NO.2)能够将IL-2和转化酶的融合蛋白有效分泌到胞外环境。TFP1基因与酿酒酵母基因Yar066w相同。Yar066w基因类似于α-1，4-葡聚糖-葡糖苷酶(STA1)基因并编码含有糖基-磷脂酰肌醇(GPI)锚定的蛋白。功能未知的Yar066w基因与功能未知的酿酒酵母基因Yol155c和Yil169c分别具有70.3％和72.7％序列相似性。在Yar066w基因编码的氨基酸序列中，与IL-2融合的区域由203个氨基酸残基总数中的105个氨基酸残基组成，并含有用于蛋白分泌的23个氨基酸残基的分泌信号、N-糖基化位点和富含丝氨酸/丙氨酸的序列。

6-2.翻译融合伙伴2(TFP2)

本发明人发现翻译融合伙伴2(TFP2)(SEQ ID NO.4)能够将IL-2和转化酶的融合蛋白有效分泌到胞外环境。TFP2基因与酿酒酵母基因Yar026c相同。Yar026c基因功能未知。在Yar026c基因编码的氨基酸序列中，与IL-2融合的区域由169个氨基酸残基总数中的117个氨基酸残基组成，并含有用于蛋白分泌的19个氨基酸残基的分泌信号和三个N-糖基化位点。

6-3.翻译融合伙伴3(TFP3)

本发明人发现翻译融合伙伴3(TFP3)(SEQ ID NO.6)能够将IL-2和转化酶的融合蛋白有效分泌到胞外环境。TFP3基因与酿酒酵母基因Yjl158c(PIR4/CIS3)相同。Yjl158c基因编码与细胞壁共价连接的O-甘露糖基化蛋白。Yjl158c基因被认为是参与细胞分裂的Cik1基因缺陷突变株的多拷贝抑制基因。在Yjl158c基因编码的氨基酸序列中，与IL-2融合的区域由227个氨基酸残基总数中的104个氨基酸残基组成，并含有用于蛋白分泌的包括23个氨基酸残基的前分泌信号(pre-secretory signal)和包括41个氨基酸残基的前分泌信号(pro-secretory signal)、含Lys-Arg序列的Kex2p的切割位点和PIR重复序列。

6-4.翻译融合伙伴4(TFP4)

本发明人发现翻译融合伙伴4(TFP4)(SEQ ID NO.8)能够将IL-2和转化酶的融合蛋白有效分泌到胞外环境。TFP4基因来源于多形汉逊氏酵母且功能未知。与IL-2融合的区域由50个氨基酸残基组成，其含有18个氨基酸残基的蛋白分泌信号。

实施例7：融合蛋白分泌到培养基的分析

为评价由蔗糖培养基中生长的酵母细胞分泌的蛋白，含有实施例6描述的四个翻译融合伙伴的酵母细胞在YPDG培养基(1％酵母浸膏、2％蛋白胨、2％葡萄糖、0.3％半乳糖)中培养40小时。除去细胞后，用丙酮(终浓度：40％)沉淀溶于剩余培养上清液中的总蛋白并用SDS-PAGE分析。然而，每个翻译融合伙伴不是表现为单一条带，因为在与转化酶融合的状态下它具有过度糖基化。为解决这个问题，从每个载体(pYHTS-TFP1、2、3和4)除去转化酶，将翻译终止密码子引入IL-2基因。简言之，为从每个载体获得包括IL-2基因、含GAL启动子、TFP和翻译终止密码子的片段，使用一组引物JH132(SacI-GAL-正向引物)(SEQ ID NO.23)和JH137(IL2-Term-反向引物)(SEQ ID NO.24)进行PCR。用SacI/SalI逐个消化扩增的基因片段并插入SacI/SalI消化的YEGα-HIR525载体，由此产生pYIL-TFP1、2、3和4。四个IL-2表达载体逐个转化酵母细胞。根据与上述相同方法培养所得单一菌落，并用SDS-PAGE分析培养上清液(图7)。如图7所示，在含IL-2表达载体除了pYIL-TFP2之外的酵母细胞培养上清液中发现了不同大小的明显蛋白带。使用抗IL-2抗体通过Western印迹法证实了这些条带(图7)，由此表明每个诱导分泌的融合蛋白以与IL-2融合的状态存在。然而，SDS-PAGE上融合蛋白的大小与从每个翻译融合伙伴和IL-2基因分子量预测的不同。这个差异被认为是由于融合蛋白的糖基化。因此，用Endo-H消化每个融合蛋白并用SDS-PAGE分析(图8)。在氨基酸序列上，发现TFP1具有一公认的N-糖基化序列(氨基酸残基28-30)，和含有公认的O-糖基化序列的TFP3。发现TFP4没有糖基化序列。如所预料，在pYIL-TFP1表达的蛋白情况下，发现Endo-H消化后分子量大大降低，表明pYIL-TFP1表达的蛋白是N-糖基化的。相比之下，Endo-H消化时pYIL-TFP3表达的蛋白分子量没有改变，因为该蛋白是O-糖基化的。而且，pYIL-TFP4表达的蛋白分子量没有改变。

实施例8：由Kex2p切割的真正蛋白在细胞中的生产

为了生产TFP-IL-2融合蛋白，该蛋白由实施例7中使用的载体表达并以与天然人IL-2相同的真正形式分泌到培养基中，将酵母细胞它们自己产生的Kex2p蛋白酶所识别的切割位点(Leu-Asp-Lys-Arg)插入TFP和IL-2之间，以便从细胞中自动除去TFP。为将Kex2p切割位点引入pYIL-TFP1，使用pYIL-TFP1作为模板，用两组引物中的每一组进行PCR，JH132(SEQ ID NO.23)和HY22(TFP1-LDKR-反向引物)(SEQ ID NO.25)、HY23(TFP1-LDKR-正向引物)(SEQ ID NO.26)和JH137(SEQ ID NO.24)。使用扩增产物作为模板，用一组引物JH132(SEQ ID NO.23)和JH137(SEQ ID NO.24)进行第二次PCR，该扩增产物是经电泳和从凝胶中回收的含GAL启动子和TFP1的片段和含IL-2基因的另一个片段。用SacI/SalI消化第二次扩增的GAL启动子-TFP1-IL2片段并插入SacI/SalI消化的YEGα-HIR525载体，由此产生pYIL-KRTFP1。而且，为将Kex2p切割位点引入pYIL-TFP2，根据与上所述相同的方法，使用pYIL-TFP2作为模板，用两组引物进行PCR，JH132(SEQ ID NO.23)和HY20(TFP2-LDKR-反向引物)(SEQ ID NO.27)，与HY21(TFP2-LDKR-正向引物)(SEQID NO.28)和JH137(SEQ ID NO.24)。使用两个扩增的基因片段作为模板，用一组引物进行第二次PCR，JH132(SEQ ID NO.23)和JH137(SEQID NO.24)。用SacI/SalI消化第二次扩增的片段并插入SacI/SalI消化的YEGα-HIR525载体，由此产生pYIL-KRTFP2。此外，为将Kex2p切割位点引入pYIL-TFP3，根据与上所述相同的方法，使用pYIL-TFP3作为模板，用两组引物进行PCR，JH132(SEQ ID NO.23)和HY17(TFP3-LDKR-反向引物)(SEQ ID NO.38)，和HY18(TFP3-LDKR-正向引物)(SEQ IDNO.39)和JH137(SEQ ID NO.24)。使用两个扩增的基因片段作为模板，用一组引物进行第二次PCR，JH132(SEQ ID NO.23)和JH137(SEQ ID NO.24)。用SacI/SalI消化第二次扩增的片段并插入SacI/SalI消化的YEGα-HIR525载体，由此产生pYIL-KRTFP3。然而进一步地，为将Kex2p切割位点引入pYIL-TFP4，根据与上所述相同的方法，使用pYIL-TFP4作为模板，用两组引物进行PCR，JH132(SEQ ID NO.23)and HY24(TFP4-LDKR-反向引物)(SEQ ID NO.29)，和HY25(TFP4-LDKR-正向引物)(SEQ ID NO.30)和JH137(SEQID NO.24)。使用两个扩增的基因片段作为模板，用一组引物进行第二次PCR，JH132(SEQID NO.23)和JH137(SEQ ID NO.24)。用SacI/SalI消化第二次扩增的片段并插入SacI/SalI消化的YEGα-HIR525载体，由此产生pYIL-KRTFP4。

在四个载体当中，pYIL-KRTFP1、pYIL-KRTFP3和pYIL-KRTFP4逐个导入2805Δgal1Δinv2酵母菌株中。挑选单一菌落并在YPDG培养基(1％酵母浸膏、2％蛋白胨、2％葡萄糖、0.3％半乳糖)中培养40小时。除去细胞后，将剩余培养上清液进行SDS-PAGE。如图9所示，发现分泌的蛋白与天然人IL-2大小相同。在诱导人IL-2分泌生产的三个TFPs当中，发现TFP1在真正的IL-2分泌生产中是最有效的。

pYIL-KRTFP1、pYIL-KRTFP2、pYIL-KRTFP3和pYIL-KRTFP4载体于2003年11月11日保藏在国际保藏当局KCTC(韩国典型培养物保藏中心；52，Oun-dong、Yusong-ku，Taejon，韩国)，和指定保藏号分别为KCTC 10544BP、10545BP、10546BP和10546BP。

实施例9：翻译融合伙伴1(TFP1)的特征分析

评价被认为诱导IL-2分泌生产最有效的翻译融合伙伴的TFP1，以确定TFP1序列上存在的任何特定序列，分泌信号(a)、N-糖基化位点(b)、富含丝氨酸/丙氨酸的序列(c)、其余序列(d)和5’-UTR(5’-非翻译区)(e)上是否直接影响非可生产蛋白IL-2的分泌。为进行此过程，如图10所示，制备每个特定序列被删除的TFP1基因缺失突变体。首先，为从TFP1序列除去没有独特性质的其余序列(d)，使用pYIL-KRTFP1作为模板，用一组引物进行PCR，JH143(XbaI-TFP1-d-反向引物)(SEQ ID NO.31)和JH132(SEQ ID NO.23)。扩增的DNA片段含有TFP1-1，其GAL启动子和TFP1序列的(d)序列被删除。为从TFP1序列除去其余序列(d)和富含丝氨酸/丙氨酸的序列(c)，使用pYIL-KRTFP1作为模板，用一组引物进行PCR，JH142(XbaI-TFP1-c-反向引物)(SEQ ID NO.32)和JH132(SEQ IDNO.23)。扩增的片段含有TFP1-2，其GAL启动子、(c)序列和(d)序列被删除。而且，为从TFP1序列除去(d)序列、(c)序列和N-糖基化位点(b)，使用pYIL-KRTFP1作为模板，用一组引物进行PCR，JH141(XbaI-TFP1-b-反向引物)(SEQ ID NO.33)和JH132(SEQ IDNO.23)。扩增的片段含有TFP1-3，其GAL启动子、(c)、(d)和(b)序列被删除。为将Kex2p切割位点引入IL-2基因，使用pYIL-KRTFP1作为模板，用一组引物进行PCR，JH140(SpeI-XbaI-LDKR-正向引物)(SEQ ID NO.34)和JH137(SEQ ID NO.24)。纯化扩增的IL-2片段，用SpeI和SalI消化，并与三个获得的片段(TFP1-1、2和3)中的每一个一起用SacI和XbaI消化，插入SacI和SalI预先消化的YEGα-HIR525载体，由此分别产生如图10所示的pYIL-KRT1-1、pYIL-KRT1-2和pYIL-KRT1-3。为除去TFP1的5’-UTR，使用pYIL-KRTFP1作为模板，用一组引物HY38(TFP1-UTR-正向引物)(SEQ ID NO.35)和JH137(SEQ ID NO.24)进行PCR。纯化扩增的基因，用BamHI/SalI消化，并与SacI/BamHI消化的GALL0启动子一起连接入SacI/SalI消化的YEGα-HIR525载体，由此产生pYIL-KRT1-4(图10)。

四个质粒pYIL-KRT1-1、pYIL-KRT1-2、pYIL-KRT1-3和pYIL-KRT1-4转化酵母细胞。培养单一菌落，并将培养上清液进行SDS-PAGE。如图11所示，仅仅在含全部分泌序列、N-糖基化位点和富含丝氨酸/丙氨酸序列的pYIL-KRT1-3转化的细胞培养上清液中发现IL-2条带。在删除富含丝氨酸/丙氨酸序列的pYIL-KRT1-2转化的细胞和富含丝氨酸/丙氨酸序列和N-糖基化位点都删除的pYIL-KRT1-1转化的细胞培养上清液中没有观察到IL-2条带。这些结果表明存在于TFP1中的三个特征序列(分泌序列、N-糖基化位点和富含丝氨酸/丙氨酸的序列)是有效诱导IL-2分泌所必需的。而且，当TFP1的5’-UTR被删除时，蛋白表达水平增加约三倍以上。

pYIL-KRT1-3和pYIL-KRT1-4载体于2003年11月11日保藏在国际保藏当局KCTC(韩国典型培养物保藏中心；52，Oun-dong、Yusong-ku，Taejon，韩国)，和指定保藏号分别为KCTC 10548BP和10549BP。

实施例10：使用翻译融合伙伴TFP1-4的人IL-2发酵生产

在5-L发酵罐中通过分批补料培养法培养pYIL-KRT1-4载体转化的重组酵母菌株，以评价其诱导IL-2分泌生产的能力。待接种于发酵罐的种子培养物在烧瓶中培养，使用种子培养基(6.7％无氨基酸的酵母氮源、0.5％酪蛋白氨基酸和2％葡萄糖)。当使用发酵培养基(4％酵母浸膏、1％蛋白胨、2％葡萄糖)作为最初发酵培养基的培养物OD600达到约15时，根据细胞生长速率以各种补充量分批补料培养基(15％酵母浸膏、30％葡萄糖、30％半乳糖)。约64小时培养期后，培养物OD600达到约200。在给定时间点收集5μl培养基并用SDS-PAGE确定分泌的蛋白(图12)。与标准样品相比，发现约500mg/L IL-2分泌到培养基中。通过氨基末端序列分析发现酵母发酵中作为分泌产物产生的IL-2具有Ala-Pro-Thr-Ser-Ser-Ser的氨基末端序列，表明它与人体中分泌的天然IL-2相同。

实施例11：翻译融合伙伴TFP1至4分泌人G-CSF能力的比较

为了确定使用非可生产蛋白人IL-2获得的四个翻译融合伙伴(TFP1、2、3和4)在其它非可生产人蛋白分泌中是否有效，将四个TFPs中的每一个与非可生产蛋白人G-CSF融合，在酵母细胞中表达并评价它的分泌。如下获得人G-CSF基因。使用人cDNA文库用一组引物JH144(GCSF-正向引物)(SEQ ID NO.36)和JH145(GCSF-反向引物)(SEQ ID NO.37)进行PCR。用XbaI/SalI消化扩增的基因并插入pYIL-KRTFP1、2、3和4中每一个的XbaI/SalI位点，由此产生pYGCSF-TFP1、2、3和4。

为在酵母细胞中表达人G-CSF，pYGCSF-TFP1、2、3和4载体转化酵母细胞。分离单一菌落并培养，将培养上清液进行SDS-PAGE和使用抗G-CSF抗体的Western印迹。图13中给出了结果。每一TFPs产生了作为分泌产物的G-CSF，并发现TFP1和TFP3有效诱导G-CSF的分泌生产。尤其是，用抗G-CSF抗体(Chemicon，美国)的Western印迹证明TPF3在G-CSF的分泌生产中是最有效的。因此，因为根据蛋白类型，证明四个TFPs中的每一个发挥了最大分泌效率，所以认为本发明的四个TFPs作为能够分泌除IL-2和G-CSF之外的各种非可生产蛋白的翻译融合伙伴是非常有效的。

实施例12：使用翻译融合伙伴TFP3的人G-CSF发酵生产

在5-L发酵罐中通过分批补料培养法培养实施例11中制备的pYGCSF-TFP3载体转化的重组酵母菌株，以评价其诱导人G-CSF分泌生产的能力。待接种于发酵罐的种子培养物在烧瓶中培养，使用种子培养基(6.7％无氨基酸的酵母氮源、0.5％酪蛋白氨基酸和2％葡萄糖)。当使用发酵培养基(4％酵母浸膏、1％蛋白胨、2％葡萄糖)作为最初发酵培养基的培养物OD600达到约15时，根据细胞生长速率以各种补充量分批补料培养基(15％酵母浸膏、30％葡萄糖、30％半乳糖)。约64小时培养期后，培养物OD600达到约200。在给定时间点收集5μl培养基并用SDS-PAGE确定分泌的蛋白(图14)。与标准样品相比，发现约300mg/L人G-CSF分泌到培养基中。通过氨基末端序列分析发现酵母发酵中作为分泌产物产生的人G-CSF具有Thr-Pro-Leu-Gly-Pro的氨基末端序列，表明它与人体中分泌的天然G-CSF相同。

实施例13：翻译融合伙伴TPF3衍生物对人G-CSF的分泌效率分析

由于发现TFP3对实施例11中G-CSF最佳分泌是最有效的，因此通过PCR从酿酒酵母基因组获得全部TFP3衍生基因Yjl158c(CIS3)。如图15所示，制备了具有不同长度的六个TFP3衍生物TFP3-1、2、3和4、TFP3-1-1(SEQ ID NO.40)和TFP3-1-2(SEQ IDNO.42)。主要获得的TFP3由Yjl158c(CIS3)227个氨基酸总数中的104个氨基酸组成。制备了长度逐渐增加的产物TFP3-1(130个氨基酸)、TFP3-2(157个氨基酸)、TFP3-3(189个氨基酸)和TFP3-4(222个氨基酸)。TFP3衍生物逐个与G-CSF基因连接，和Kex2p切割位点插入融合位点。如图15的A板所示，与TFP3相比另外含有26个氨基酸的TFP3-1使G-CSF分泌增加约三倍，因为它与TFP3相比，含有N-糖基化位点。相比之下，当TFP3长度进一步增加时，G-CSF分泌率没有变化，或在TFP3-3和TFP3-4的情况下，发现G-CSF分泌率减少。

此外，如图15的A板所示，Kex2p没有完全切割的未处理形式的TFP3-1-GCSF融合蛋白以随表达和分泌效率增加而增加的方式分泌到培养基。考虑这是因为糖部分添加到两个基因融合位点中存在的许多O-糖基化位点，打断了Kex2p切割融合位点的步骤。在这点上，制备了与TFP3相比添加了4个氨基酸的TFP3-1-1(134个氨基酸)，和与TFP3相比添加了13个氨基酸的TFP3-1-2(143个氨基酸)并评价了它们分泌G-CSF的能力和以融合形式表达的降低。如图15的B板所示，TFP3-1-1和TFP3-1-2与G-CSF的融合形式大大减少，而G-CSF分泌没有减少。这些结果表明通过靶蛋白和每个获得的TFPs之间融合位点的精心操作，靶蛋白分泌率可以更加提高。

两个G-CSF表达载体，分别含有翻译融合伙伴TFP3-1-1和TFP3-1-2的pYGT3-1-1-GCSF和pYGT3-1-2-GCSF分别于2004年12月21日保藏在国际保藏当局KCTC(韩国典型培养物保藏中心；52，Oun-dong、Yusong-ku，Taejon，韩国)，并指定保藏号分别为KCTC 10753BP和KCTC 10754BP。

实施例14：使用翻译融合伙伴TFP3的工业脂肪酶分泌生产

XbaI/SalI消化pYGA-CalB14(ES Choi，韩国生命科学和生物技术研究院)获得的CalB基因插入G-CSF表达载体pYGCSF-KRTFP3的XbaI/SalI位点，由此产生pYGT3-CalB14。将pYGT3-CalB14载体与pYGA-CalB14载体的与培养温度有关的CalB14分泌率相比较。当使用TFP3生产作为分泌产物的CalB14时，其分泌率比传统表达系统在30℃最适培养温度下高两倍以上(表3：含有每个表达载体的酵母细胞依培养温度的CalB活性)

表3

	脂肪酶活性
			30℃	22℃
	pYGA-CalB14(AMY)	295			885
pYGT3-CalB14(TFP3)			1922	874

在5-L发酵罐中通过分批补料培养法在30℃最适温度下培养含pYGT3-CalB14载体的重组酵母菌株，以评价其诱导CalB14分泌生产的能力。当使用发酵培养基(4％酵母浸膏、1％蛋白胨、2％葡萄糖)的培养OD600达到约15时，根据细胞生长速率以各种补充量分批补料培养基(15％酵母浸膏、30％葡萄糖、30％半乳糖)。重组酵母菌株生长非常快速和不改变培养温度下将CalB14高效率分泌到培养基。蛋白活性和浓度分析显示约1.5-2.0g/L CalB14分泌到培养基，因此使得成本效益高的大规模生产CalB14成为可能(图16)。

实施例15：翻译融合伙伴TFP1在巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)中活性评价

为了确定本发明开发的TFPs是否在另一种酵母-巴斯德毕赤氏酵母中有功能，用BglII/EcoRI消化另一个巴斯德毕赤氏酵母载体pPIC9(Invitrogen，美国)以除去AOX启动子，其中插入了使用BglII-GAP-正向引物(SEQ ID NO.44)和GAP-EcoRI-反向引物(SEQID NO.45)获得的GAP(3-磷酸甘油醛脱氢酶)启动子，由此产生pPIC9-GAP。用EcoRI-NotI消化这个载体并与每个EcoRI-NotI消化的Mfalpha(交配因子α)-GCSF和TFP1-GCSF基因连接，由此产生pGAP-MF-GCSF和pGAP-TFP1-GCSF。用SalI逐个消化这些载体并转化巴斯德毕赤氏酵母GS115(Invitrogen，美国)。转化细胞在烧瓶中培养，并用SDS-PAGE分析培养上清液G-CSF分泌以选择最后的转化体。使用发酵培养基(4％酵母浸膏、1％胰蛋白胨(bactopeptone)、4％甘油)，在发酵罐中分批培养每个载体转化的所选转化体。在给定时间点收集样品，并用SDS-PAGE分析G-CSF分泌(图17)。如图17所示，TFP1比Mfalpha分泌效率高。这些结果表明得自酿酒酵母的TFPs在巴斯德毕赤氏酵母中也非常有用。

工业实用性

本发明通过快速筛选和使用合适的TFPs，允许以成本效益高的方式大规模生产不能重组生产或低水平表达的各种蛋白。

I.微生物鉴定
			交存人给与的鉴定符号埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)DH5@/pYIL-KRTFP3	国际保藏单位给与的保藏号：KCTC 10546BP
II.科学说明和/或所建议的分类学命名
			上述I所鉴定的微生物附有：[x]科学说明[ ]所建议的分类学命名(标有X是可获得的)
III.接收和受理
			该国际保藏单位于2003年11月11日接受并受理上述I中所命名的微生物
IV请求.转化的受理
			上述I所命名的微生物于由该国际保藏单位接收并请求将原始保存转化成由其受理的布达佩斯条约下的保存
V.国际保藏单位
			名称：韩国典型培养物保藏中心地址：韩国生命工学研究院(KRIBB)韩国大田305-333宇松区欧洞#52		有权代表被授权的国际保藏单位的人的签名帕克永锡局长日期：2003年11月15日

I.微生物鉴定
			交存人给与的鉴定符号埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)DH5@/pYIL-KRTFP4	国际保藏单位给与的保藏号：KCTC 10547BP
II.科学说明和/或所建议的分类学命名
			上述I所鉴定的微生物附有：[x]科学说明[ ]所建议的分类学命名(标有X是可获得的)
III.接收和受理
			该国际保藏单位于2003年11月11日接受并受理上述I中所命名的微生物
IV请求.转化的受理
			上述I所命名的微生物于由该国际保藏单位接收并请求将原始保存转化成由其受理的布达佩斯条约下的保存
V.国际保藏单位
			名称：韩国典型培养物保藏中心地址：韩国生命工学研究院(KRIBB)韩国大田305-333宇松区欧洞#52		有权代表被授权的国际保藏单位的人的签名帕克永锡局长日期：2003年11月15日

I.微生物鉴定
			交存人给与的鉴定符号埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)DH5@/pYIL-KRT1-3	国际保藏单位给与的保藏号：KCTC 10548BP
II.科学说明和/或所建议的分类学命名
			上述I所鉴定的微生物附有：[x]科学说明[ ]所建议的分类学命名(标有X是可获得的)
III.接收和受理
			该国际保藏单位于2003年11月11日接受并受理上述I中所命名的微生物
IV请求.转化的受理
			上述I所命名的微生物于由该国际保藏单位接收并请求将原始保存转化成由其受理的布达佩斯条约下的保存
V.国际保藏单位
			名称：韩国典型培养物保藏中心地址：韩国生命工学研究院(KRIBB)韩国大田305-333宇松区欧洞#52		有权代表被授权的国际保藏单位的人的签名帕克永锡局长日期：2003年11月15日

I.微生物鉴定
			交存人给与的鉴定符号埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)DH5@/pYIL-KRT1-4	国际保藏单位给与的保藏号：KCTC 10549BP
II.科学说明和/或所建议的分类学命名
			上述I所鉴定的微生物附有：[x]科学说明[ ]所建议的分类学命名(标有X是可获得的)
III.接收和受理
			该国际保藏单位于2003年11月11日接受并受理上述I中所命名的微生物
IV请求.转化的受理
			上述I所命名的微生物于由该国际保藏单位接收并请求将原始保存转化成由其受理的布达佩斯条约下的保存
V.国际保藏单位
			名称：韩国典型培养物保藏中心地址：韩国生命工学研究院(KRIBB)韩国大田305-333宇松区欧洞#52		有权代表被授权的国际保藏单位的人的签名帕克永锡局长日期：2003年11月15日

I.微生物鉴定
			交存人给与的鉴定符号埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)DH5@/pYGT3-1-1-GCSF	国际保藏单位给与的保藏号：KCTC 10753BP
II.科学说明和/或所建议的分类学命名
			上述I所鉴定的微生物附有：[x]科学说明[ ]所建议的分类学命名(标有X是可获得的)
III.接收和受理
			该国际保藏单位于2004年12月21日接受并受理上述I中所命名的微生物
IV请求.转化的受理
			上述I所命名的微生物于由该国际保藏单位接收并请求将原始保存转化成由其受理的布达佩斯条约下的保存
V.国际保藏单位
			名称：韩国典型培养物保藏中心地址：韩国生命工学研究院(KRIBB)韩国大田305-333宇松区欧洞#52		有权代表被授权的国际保藏单位的人的签名帕克永锡局长日期：2004年12月27日

I.微生物鉴定
			交存人给与的鉴定符号埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)DH5@/pYGT3-1-2-GCSF	国际保藏单位给与的保藏号：KCTC 10754BP
II.科学说明和/或所建议的分类学命名
			上述I所鉴定的微生物附有：[x]科学说明[ ]所建议的分类学命名(标有X是可获得的)
III.接收和受理
			该国际保藏单位于2004年12月21日接受并受理上述I中所命名的微生物
IV请求.转化的受理
			上述I所命名的微生物于由该国际保藏单位接收并请求将原始保存转化成由其受理的布达佩斯条约下的保存
V.国际保藏单位
			名称：韩国典型培养物保藏中心地址：韩国生命工学研究院(KRIBB)韩国大田305-333宇松区欧洞#52		有权代表被授权的国际保藏单位的人的签名帕克永锡局长日期：2004年12月27日

I.微生物鉴定
			交存人给与的鉴定符号埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)DH5@/pYIL-KRTFP2	国际保藏单位给与的保藏号：KCTC 10545BP
II.科学说明和/或所建议的分类学命名
			上述I所鉴定的微生物附有：[x]科学说明[ ]所建议的分类学命名(标有X是可获得的)
III.接收和受理
			该国际保藏单位于2003年11月11日接受并受理上述I中所命名的微生物
IV请求.转化的受理
			上述I所命名的微生物于由该国际保藏单位接收并请求将原始保存转化成由其受理的布达佩斯条约下的保存
V.国际保藏单位
			名称：韩国典型培养物保藏中心地址：韩国生命工学研究院(KRIBB)韩国大田305-333宇松区欧洞#52		有权代表被授权的国际保藏单位的人的签名帕克永锡局长日期：2003年11月15日

I.微生物鉴定
			交存人给与的鉴定符号埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)DH5@/pYIL-KRTFP1	国际保藏单位给与的保藏号：KCTC 10544BP
II.科学说明和/或所建议的分类学命名
			上述I所鉴定的微生物附有：[x]科学说明[ ]所建议的分类学命名(标有X是可获得的)
III.接收和受理
			该国际保藏单位于2003年11月11日接受并受理上述I中所命名的微生物
IV请求.转化的受理
			上述I所命名的微生物于由该国际保藏单位接收并请求将原始保存转化成由其受理的布达佩斯条约下的保存
V.国际保藏单位
			名称：韩国典型培养物保藏中心地址：韩国生命工学研究院(KRIBB)韩国大田305-333宇松区欧洞#52		有权代表被授权的国际保藏单位的人的签名帕克永锡，局长日期：2003年11月15日

序列表

<110>韩国生命科学和生物技术研究院

<120>用于生产重组蛋白的翻译融合伙伴的快速筛选方法和由此筛选的翻译融合伙伴

<150>KR10-2004-0003610

<151>2004-01-17

<150>KR10-2004-0003957

<151>2004-01-19

<160>45

<170>KopatentIn 1.71

<210>1

<211>105

<212>PRT

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<220>

<221>肽

<222>(1)..(105)

<223>TFP1

<400>1

Met Phe Asn Arg Phe Asn Lys Phe Gln Ala Ala Val Ala Leu Ala Leu

 1               5                 10                   15

Leu Ser Arg Gly Ala Leu Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Ser Thr Ser Ser

             20                  25                 30

Ala Asp Leu Ser Ser Ile Thr Ser Val Ser Ser Ala Ser Ala Ser Ala

         35                   40                  45

Thr Ala Ser Asp Ser Leu Ser Ser Ser Asp Gly Thr Val Tyr Leu Pro

     50                  55                  60

Ser Thr Thr Ile Ser Gly Asp Leu Thr Val Thr Gly Lys Val Ile Ala

 65                   70                  75                   80

Thr Glu Ala Val Glu Val Ala Ala Gly Gly Lys Leu Thr Leu Leu Asp

                 85                   90                  95

Gly Glu Lys Tyr Val Phe Ser Ser Asp

            100                 105

<210>2

<211>430

<212>DNA

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<220>

<221>基因

<222>(1)..(430)

<223>TFP1

<400>2

gatcgtcata ttcactcttg ttctcataat agcagtccaa gttttcatct ttgcaagctt    60

tactatttct ttctttttat tggtaaactc tcgcccatta caaaaaaaaa agagatgttc   120

aatcgtttta acaaattcca agctgctgtc gctttggccc tactctctcg cggcgctctc   180

ggtgactctt acaccaatag cacctcctcc gcagacttga gttctatcac ttccgtctcg   240

tcagctagtg caagtgccac cgcttccgac tcactttctt ccagtgacgg taccgtttat   300

ttgccatcca caacaattag cggtgatctc acagttactg gtaaagtaat tgcaaccgag   360

gccgtggaag tcgctgccgg tggtaagttg actttacttg acggtgaaaa atacgtcttc   420

tcatctgatc                                                          430

<210>3

<211>117

<212>PRT

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<220>

<221>肽

<222>(1)..(117)

<223>TFP2

<400>3

Met Thr Pro Tyr Ala Val Ala Ile Thr Val Ala Leu Leu Ile Val Thr

 1               5                   10                  15

Val Ser Ala Leu Gln Val Asn Asn Ser Cys Val Ala Phe Pro Pro Ser

             20                 25                  30

Asn Leu Arg Gly Lys Asn Gly Asp Gly Thr Asr Glu Gln Tyr Ala Thr

        35                  40                  45

Ala Leu Leu Ser Ile Pro Trp Asn Gly Pro Pro Glu Ser Leu Arg Asp

     50                  55                  60

Ile Asn Leu Ile Glu Leu Glu Pro Gln Val Ala Leu Tyr Leu Leu Glu

  65                    70              75                  80

Asn Tyr Ile Asn His Tyr Tyr Asn Thr Thr Arg Asp Asn Lys Cys Pro

                85                  90                   95

Asn Asn His Tyr Leu Met Gly Gly Gln Leu Gly Ser Ser Ser Asp Asn

            100                 105                 110

Arg Ser Leu Asn Asp

115

<210>4

<211>424

<212>DNA

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<220>

<221>基因

<222>(1)..(424)

<223>TFP2

<400>4

gatctcattg gattcaagag aaagaaactc tatactggcg ccaaattagc agtgtcaaat    60

ttcgaaaagg tgatgacgcc ctatgcagta gcaattaccg tggccttact aattgtaaca   120

gtgagcgcac tccaggtcaa caattcatgt gtcgcttttc cgccatcaaa tctcagaggc   180

aaaaatggag acggtactaa tgaacagtat gcaactgcac tactttctat tccctggaat   240

ggacctcctg agtcattgag ggatattaat cttattgaac tcgaaccgca agttgcactc   300

tatttgctcg aaaattatat taaccattac tacaacacca caagagacaa taagtgccct   360

aataaccact acctaatggg agggcagttg ggtagctcat cggataatag gagtttgaac   420

gatc                                                                424

<210>5

<211>104

<212>PRT

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<220>

<221>肽

<222>(1)..(104)

<223>TFP3

<400>5

Met Gln Phe Lys Asn Val Ala Leu Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Ser

 1               5                   10                 15

Ala Thr Ala Ser Ala Glu Gly Tyr Thr Pro Gly Glu Pro Trp Ser Thr

            20                   25                  30

Leu Thr Pro Thr Gly Ser Ile Ser Cys Gly Ala Ala Glu Tyr Thr Thr

         35                 40                  45

Thr Phe Gly Ile Ala Val Gln Ala Ile Thr Ser Ser Lys Ala Lys Arg

     50                 55                   60

Asp Val Ile Ser Gln Ile Gly Asp Gly Gln Val Gln Ala Thr Ser Ala

 65                  70                  75                  80

Ala Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ser Gln Ala Gln Ala Thr Thr Thr Ala

                 85                  90                  95

Thr Pro Thr Ser Ser Glu Lys Ile

            100

<210>6

<211>642

<212>DNA

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<220>

<221>基因

<222>(1)..(642)

<223>TFP3

<400>6

gatcccgcct agcccttcca gcttttcttt ttcccctttt gctacggtcg agacacggtc    60

gcccaaaaga aacgggtcag cgtgtactgc gccaaaaaaa ttcgcgccga tttaagctaa   120

acgtccacaa acaaaaacaa aaataagaaa taggttgaca gtgggtgaaa aattctcgaa   180

ggtttcatct ccaaacagtc agtatataag tattcgggaa agagagccaa tctatcttgt   240

ggtgggtcta tcttaacctt ctctttttgg cagtagtaat tgtaaatcaa gacacataaa   300

actatttcac tcgctaaact tacatctaaa atgcaattca aaaacgtcgc cctagctgcc   360

tccgttgctg ctctatccgc cactgcttct gctgaaggtt acactccagg tgaaccatgg   420

tccaccttaa ccccaaccgg ctccatctct tgtggtgctg ccgaatacac taccaccttt   480

ggtattgctg ttcaagctat tacctcttca aaagctaaga gagacgttat ctctcaaatt   540

ggtgacggtc aagtccaagc cacttctgct gctactgctc aagccaccga tagtcaagcc   600

caagctacta ctaccgctac cccaaccagc tccgaaaaga tc                      642

<210>7

<211>50

<212>PRT

<213>多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)

<220>

<221>肽

<222>(1)..(50)

<223>TFP4

<400>7

Met Arg Phe Ala Glu Phe Leu Val Val Phe Ala Thr Leu Gly Gly Gly

 1              5                   10                  15

Met Ala Ala Pro Val Glu Ser Leu Ala Gly Thr Gln Arg Tyr Leu Val

            20                   25                  30

Gln Met Lys Glu Arg Phe Thr Thr Glu Lys Leu Cys Ala Leu Asp Asp

         35                 40                  45

Lys Ile

50

<210>8

<211>179

<212>DNA

<213>多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)

<220>

<221>基因

<222>(1)..(179)

<223>TFP4

<400>8

gatccgcttt ttattgcttt gctttgctaa tgagatttgc agaattcttg gtggtatttg    60

ccacgttagg cggggggatg gctgcaccgg ttgagtctct ggccgggacc caacggtatc   120

tggtgcaaat gaaggagcgg ttcaccacag agaagctgtg tgctttggac gacaagatc    179

<210>9

<211>71

<212>PRT

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<220>

<221>肽

<222>(1)..(71)

<223>TFP1-3

<400>9

Met Phe Asn Arg Phe Asn Lys Phe Gln Ala Ala Val Ala Leu Ala Leu

 1               5                   10                  15

Leu Ser Arg Gly Ala Leu Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Ser Thr Ser Ser

            20                  25                  30

Ala Asp Leu Ser Ser Ile Thr Ser Val Ser Ser Ala Ser Ala Ser Ala

         35                  40                  45

Thr Ala Ser Asp Ser Leu Ser Ser Ser Asp Gly Thr Val Tyr Leu Pro

     50                 55                  60

Ser Thr Thr Ile Ser Gly Asp

 65                 70

<210>10

<211>329

<212>DNA

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<220>

<221>基因

<222>(1)..(329)

<223>TFP1-4

<400>10

ggatccatgt tcaatcgttt taacaaattc caagctgctg tcgctttggc cctactctct    60

cgcggcgctc tcggtgactc ttacaccaat agcacctcct ccgcagactt gagttctatc   120

acttccgtct cgtcagctag tgcaagtgcc accgcttccg actcactttc ttccagtgac   180

ggtaccgttt atttgccatc cacaacaatt agcggtgatc tcacagttac tggtaaagta   240

attgcaaccg aggccgtgga agtcgctgcc ggtggtaagt tgactttact tgacggtgaa   300

aaatacgtct tctcatctga tcctctaga                                     329

<210>11

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>JH97(Sfi-HSA-正向引物)

<400>11

ccggccatta cggccgtgat gcacacaaga gtgag    35

<210>12

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>JH119(Sfi-HSA-反向引物)

<400>12

ccggccgagg cggcctaagc ctaaggcag    29

<210>13

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>JH99(Sfi-INV-正向引物)

<400>13

gggcggccgc ctcggcccta gataaaaggt caatgacaaa cgaaactagc    50

<210>14

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>JH100(SalI-INV-反向引物)

<400>14

ccgtcgactt actattttac ttcccttact tg    32

<210>15

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>JH106(Sfi-IL2-正向引物)

<400>15

gcggccatta cggccgtgca cctacttcaa gttctac    37

<210>16

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>JH107(Sfi-IL2-反向引物)

<400>16

gcggccatta cggccgtgca cctacttcaa gttctac    37

<210>17

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>JH120(BamHI-IL2-1-正向引物)

<400>17

cgggatccgc acctacttca agttct    26

<210>18

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>JH121(BamHI-IL2-2-正向引物)

<400>18

cgggatcctg cacctacttc aagttct    27

<210>19

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>JH122(BamHI-IL2-3-正向引物)

<400>19

cgggatcctt gcacctactt caagttct

<210>20

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>JH123(INV-1-反向引物)

<400>20

ccattgaagg aaccaacaaa at    22

<210>21

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>JH124(INV-正向引物)

<400>21

attttgttgg ttccttcaat gg    22

<210>22

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>JH95(INV-2-反向引物)

<400>22

ggctcgagct attttacttc ccttacttg    29

<210>23

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>JH132(SacI-GAL-正向引物)

<400>23

gggagctcat cgcttcgctg att    23

<210>24

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>JH137(IL-2-Term-反向引物)

<400>24

ccgtcgactt aagttagtgt tgagatg    27

<210>25

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HY22(TFP1-LDKR-反向引物)

<400>25

gaacttgaag taggtgccct tttatctaga ggatcagatg agaagac    47

<210>26

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HY23(TFP1-LDKR-正向引物)

<400>26

tcttctcatc tgatcctcta gataaaaggg cacctacttc aagttc    46

<210>27

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HY20(TFP2-LDKR-反向引物)

<400>27

gaacttgaag taggtgccct tttatctaga ggatcgttca aactcc    46

<210>28

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HY21(TFP2-LDKR-正向引物)

<400>28

ggagtttgaa cgatcctcta gataaaaggg cacctacttc aagttc    46

<210>29

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HY24(TFP4-LDKR-反向引物)

<400>29

gaacttgaag taggtgccct tttatcaagg atcttgtcgt ccaaagc    47

<210>30

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HY25(TFP4-LDKR-正向引物)

<400>30

gctttggacg acaagatcct tgataaaagg gcacctactt caagttc    47

<210>31

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>JH143(XbaI-TFP1-d-反向引物)

<400>31

cctctagaat caccgctaat tgttgtg    27

<210>32

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>JH142(XbaI-TFP1-c-反向引物)

<400>32

cctctagagg tgctattggt gtaagag    27

<210>33

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>JH141(XbaI-TFP1-b-反向引物)

<400>33

cctctagaac cgagagcgcc gcgagag    27

<210>34

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>JH140(SpeI-XbaI-LDKR-正向引物)

<400>34

ggactagtct agataaaagg gcacc    25

<210>35

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HY38(TFP1-UTR-正向引物)

<400>35

gaatttttga aaattcaagg atccatgttc aatcgtttta ac    42

<210>36

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>JH144(GCSF-正向引物)

<400>36

cctctagata aaaggacccc cctgggccct gcc    33

<210>37

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>JH145(GCSF-反向引物)

<400>37

ggcagctgga tgtattttac atggggag    28

<210>38

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HY17(TFP3-LDKR-反向引物)

<400>38

gaacttgaag taggtgccct tttatcaagg atcttttcgg agc    43

<210>39

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HY18(TFP3-LDKR-正向引物)

<400>39

gctccgaaaa gatccttgat aaaagggcac ctacttcaag ttc    43

<210>40

<211>134

<212>PRT

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<220>

<221>肽

<222>(1)..(134)

<223>TFP3-1-1

<400>40

Met Gln Phe Lys Asn Val Ala Leu Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Ser

 1               5                   10                  15

Ala Thr Ala Ser Ala Glu Gly Tyr Thr Pro Gly Glu Pro Trp Ser Thr

            20                   25                  30

Leu Thr Pro Thr Gly Ser Ile Ser Cys Gly Ala Ala Glu Tyr Thr Thr

         35                 40                  45

Thr Phe Gly Ile Ala Val Gln Ala Ile Thr Ser Ser Lys Ala Lys Arg

     50                 55                   60

Asp Val Ile Ser Gln Ile Gly Asp Gly Gln Val Gln Ala Thr Ser Ala

 65                  70                  75                  80

Ala Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ser Gln Ala Gln Ala Thr Thr Thr Ala

                85                   90                  95

Thr Pro Thr Set Ser Glu Lys Ile Ser Ser Ser Ala Ser Lys Thr Ser

            100                 105                 110

Thr Asn Ala Thr Ser Ser Ser Cys Ala Thr Pro Ser Leu Lys Asp Ser

        115                 120                 125

Ser Cys Lys Asn Ser Gly

    130

<210>41

<211>402

<212>DNA

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<220>

<221>基因

<222>(1)..(402)

<223>TFP3-1-1

<400>41

atgcaattca aaaacgtcgc cctagctgcc tccgttgctg ctctatccgc cactgcttct    60

gctgaaggtt acactccagg tgaaccatgg tccaccttaa ccccaaccgg ctccatctct   120

tgtggtgctg ccgaatacac taccaccttt ggtattgctg ttcaagctat tacctcttca   180

aaagctaaga gagacgttat ctctcaaatt ggtgacggtc aagtccaagc cacttctgct   240

gctactgctc aagccaccga tagtcaagcc caagctacta ctaccgctac cccaaccagc   300

tccgaaaaga tctcttcctc tgcatctaaa acatctacta atgccacatc atcttcttgt   360

gccactccat ctttgaaaga tagctcatgt aagaattctg gt                      402

<210>42

<211>143

<212>PRT

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<220>

<221>肽

<222>(1)..(143)

<223>TFP3-1-2

<400>42

Met Gln Phe Lys Asn Val Ala Leu Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Ser

 1               5                   10                  15

Ala Thr Ala Ser Ala Glu Gly Tyr Thr Pro Gly Glu Pro Trp Ser Thr

            20                   25                  30

Leu Thr Pro Thr Gly Ser Ile Ser Cys Gly Ala Ala Glu Tyr Thr Thr

         35                  40                 45

Thr Phe Gly Ile Ala Val Gln Ala Ile Thr Ser Ser Lys Ala Lys Arg

     50                 55                  60

Asp Val Ile Ser Gln Ile Gly Asp Gly Gln Val Gln Ala Thr Ser Ala

 65                  70                  75                  80

Ala Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ser Gln Ala Gln Ala Thr Thr Thr Ala

                 85                  90                  95

Thr Pro Thr Ser Ser Glu Lys Ile Ser Ser Ser Ala Ser Lys Thr Ser

            100                 105                 110

Thr Asn Ala Thr Ser Ser Ser Cys Ala Thr Pro Ser Leu Lys Asp Ser

        115                 120                 125

Ser Cys Lys Asn Ser Gly Thr Leu Glu Leu Thr Leu Lys Asp Gly

    130                 135                 140

<210>43

<211>429

<212>DNA

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<220>

<221>基因

<222>(1)..(429)

<223>TFP3-1-2

<400>43

atgcaattca aaaacgtcgc cctagctgcc tccgttgctg ctctatccgc cactgcttct    60

gctgaaggtt acactccagg tgaaccatgg tccaccttaa ccccaaccgg ctccatctct   120

tgtggtgctg ccgaatacac taccaccttt ggtattgctg ttcaagctat tacctcttca   180

aaagctaaga gagacgttat ctctcaaatt ggtgacggtc aagtccaagc cacttctgct   240

gctactgctc aagccaccga tagtcaagcc caagctacta ctaccgctac cccaaccagc   300

tccgaaaaga tctcttcctc tgcatctaaa acatctacta atgccacatc atcttcttgt   360

gccactccat ctttgaaaga tagctcatgt aagaattctg gtaccttaga attgaccttg   420

aaggacggt                                                           429

<210>44

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>BglII-GAP-正向引物

<400>44

gcaagatctg gatccttttt tgtag    25

<210>45

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>GAP-EcoRI-反向引物

<400>45

aagaattctt gatagttgtt caattg    26

Claims (17)

1.一种筛选生产非可生产蛋白的翻译融合伙伴(TFP)的方法，包括：

(1)制备包括融合基因(X-R)的自动筛选载体，其中编码非可生产靶蛋白的基因(X)与报道基因(R)符合读框地连接用于自动筛选；

(2)将包括能诱导非可生产融合蛋白(X-R)分泌的TFP的基因文库与自动筛选载体连接产生TFP文库；

(3)用TFP文库转化无报道基因活性的细胞，检测报道蛋白活性；和

(4)从发挥报道蛋白活性的转化细胞分离基因并分析TFP性能。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的报道基因是选自转化酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、半乳糖苷酶、蔗糖酶、纤维素酶、木聚糖酶和麦芽糖酶的基因。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述的非可生产蛋白选自细胞因子、血清蛋白、免疫球蛋白、干扰素、集落刺激因子、干细胞因子(SCF)、磷脂酶活化蛋白(PLAP)、胰岛素、肿瘤坏死因子(TNF)、生长因子、乳铁蛋白、激素、降钙素、降钙素基因相关肽(CGPR)、脑啡肽、促生长因子、红细胞生成素、下丘脑释放因子、催乳素、绒毛膜促性腺激素、组织纤溶酶原激活物、生长激素释放肽(GHPR)、胸腺体液因子(THF)、抗癌或抗菌肽、碳水化合物特异性酶、蛋白水解酶、脂肪酶、氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和连接酶。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述的具有TFP的基因文库来源于假丝酵母属(Candida)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、汉逊氏酵母属(Hansenula)、克卢费氏酵母属(Kluyveromyces)、毕赤氏酵母属(Pichia)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、亚罗威阿酵母属(Yarrowia)、酵母属(Saccharomyces)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、根霉菌属(Rhizopus)、和木霉属(Trichoderma)。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述的无报道基因活性的细胞选自假丝酵母属(Candida)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、汉逊氏酵母属(Hansenula)、克卢费氏酵母属(Kluyveromyces)、毕赤氏酵母属(Pichia)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、亚罗威阿酵母属(Yarrowia)、酵母属(Saccharomyces)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、根霉菌属(Rhizopus)、和木霉属(Trichoderma)。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述的筛选载体包含启动子基因、删除了翻译起始和终止密码子的编码靶蛋白的基因、和与编码靶蛋白的基因符合读框融合的报道基因。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述的筛选载体中含有的启动子选自GAPDH、PGK、ADH、PHO5、GAL1和GAL10。

8.一种筛选翻译融合伙伴的方法，包括：

(1)制备删除其内源转化酶基因INV2(I)的酵母突变株；

(2)制备含有基因(X-I)的酵母高产量选择(HTS)载体，其中转化酶基因(I)与非可生产蛋白基因(X)符合读框地融合且在酵母GAL10启动子控制下表达；

(3)制备能够分泌pYHTS载体中转化酶和非可生产蛋白融合基因(X-I)的来自酵母基因的翻译融合伙伴文库；

(4)将该文库转化步骤(1)制备的酵母突变株并在仅含蔗糖作为碳源的培养基上进行自动筛选；

(5)通过培养在蔗糖培养基上生长的酵母细胞检测分泌到培养基上的蛋白；和

(6)从酵母细胞分离基因并分析翻译融合伙伴的性能。

9.一种翻译融合伙伴(TFP)蛋白，选自：

(a)翻译融合伙伴TFP1蛋白，其中所述的翻译融合伙伴TFP1蛋白具有SEQ ID NO.1表示的氨基酸序列或与其具有90％或更高同源性且发挥翻译融合伙伴TFP1蛋白活性的氨基酸序列；

(b)翻译融合伙伴TFP2蛋白，其中所述的翻译融合伙伴TFP2蛋白具有SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列或与其具有90％或更高同源性且发挥翻译融合伙伴TFP2蛋白活性的氨基酸序列；

(c)翻译融合伙伴TFP3蛋白，其中所述的翻译融合伙伴TFP3蛋白具有SEQ ID NO.5表示的氨基酸序列或与其具有90％或更高同源性且发挥翻译融合伙伴TFP3蛋白活性的氨基酸序列；

(d)翻译融合伙伴TFP4蛋白，其中所述的翻译融合伙伴TFP4蛋白具有SEQ ID NO.7表示的氨基酸序列或与其具有90％或更高同源性且发挥翻译融合伙伴TFP4蛋白活性的氨基酸序列；

(e)翻译融合伙伴TFP1-3蛋白，其中所述的翻译融合伙伴TFP1-3蛋白具有SEQ IDNO.9表示的氨基酸序列或与其具有90％或更高同源性且发挥翻译融合伙伴TFP1-3蛋白活性的的氨基酸序列；

(f)翻译融合伙伴TFP1-4蛋白，其中所述的翻译融合伙伴TFP1-4蛋白具有SEQ IDNO.10表示的氨基酸序列或与其具有90％或更高同源性且发挥翻译融合伙伴TFP1-4蛋白活性的氨基酸序列；

(g)翻译融合伙伴TFP4蛋白，其中所述的翻译融合伙伴TFP4蛋白具有SEQ ID NO.40表示的氨基酸序列或与其具有90％或更高同源性且发挥翻译融合伙伴TFP3-1-1蛋白活性的氨基酸序列；和

(h)翻译融合伙伴TFP4蛋白，其中所述的翻译融合伙伴TFP4蛋白具有SEQ ID NO.42表示的氨基酸序列或与其具有90％或更高同源性且发挥翻译融合伙伴TFP3-1-2蛋白活性的氨基酸序列；

10.一种翻译融合伙伴(TFP)基因，选自：

(a)编码由SEQ ID NO.1表示的翻译融合伙伴TFP1蛋白的DNA或与其具有90％或更高同源性且编码发挥翻译融合伙伴TFP1蛋白活性的蛋白的DNA；

(b)编码由SEQ ID NO.3表示的翻译融合伙伴TFP2蛋白的DNA或与其具有90％或更高同源性且编码发挥翻译融合伙伴TFP2蛋白活性的蛋白的DNA；

(c)编码由SEQ ID NO.5表示的翻译融合伙伴TFP3蛋白的DNA或与其具有90％或更高同源性且编码发挥翻译融合伙伴TFP3蛋白活性的蛋白的DNA；

(d)编码由SEQ ID NO.7表示的翻译融合伙伴TFP4蛋白的DNA或与其具有90％或更高同源性且编码发挥翻译融合伙伴TFP4蛋白活性的蛋白的DNA；

(e)编码由SEQ ID NO.9表示的翻译融合伙伴TFP1-3蛋白的DNA或与其具有90％或更高同源性且编码发挥翻译融合伙伴TFP1-3蛋白活性的蛋白的DNA；

(f)由SEQ ID NO.10表示的DNA或与其具有90％或更高同源性且编码发挥翻译融合伙伴TFP1-4蛋白活性的蛋白的DNA；

(g)编码由SEQ ID NO.40表示的翻译融合伙伴TFP3-1-1蛋白的DNA或与其具有90％或更高同源性且编码发挥翻译融合伙伴TFP3-1-1蛋白活性的蛋白的DNA；和

(h)编码由SEQ ID NO.42表示的翻译融合伙伴TFP3-1-2蛋白的DNA或与其具有90％或更高同源性且编码发挥翻译融合伙伴TFP3-1-2蛋白活性的蛋白的DNA。

11.根据权利要求10所述的翻译融合伙伴(TFP)基因，该基因选自SEQ ID NOS.2、4、6、8、41和43的DNA。

12.一种重组载体，包含选自权利要求10(a)至(h)所述的DNA的基因。

13.根据权利要求12所述的重组载体，该重组载体包含选自SEQ ID NOS.2、4、6、8、41和43的DNA的基因。

14.根据权利要求6所述的载体，其中该载体选自pYIL-KRTFP1(KCTC 10544BP)、pYIL-KRT1-3(KCTC 10548BP)、pYIL-KRT1-4(KCTC 10549BP)、pYIL-KRTFP2(KCTC10545BP)、pYIL-KRTFP3(KCTC 10546BP)、pYGT3-1-1-GCSF(KCTC 10753BP)、pYGT3-1-2-GCSF(KCTC 10754BP)和pYIL-KRTFP4(KCTC 10547BP)。

15.用权利要求12所述的重组载体转化的转化体。

16.根据权利要求15所述的转化体，该转化体选自假丝酵母属(Candida)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、汉逊氏酵母属(Hansenula)、克卢费氏酵母属(Kluyveromyces)、毕赤氏酵母属(Pichia)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、亚罗威阿酵母属(Yarrowia)、酵母属(Saccharomyces).

17.一种制备非可生产蛋白的方法，包括构建携带编码非可生产蛋白的基因的表达载体，所述的编码非可生产蛋白的基因与编码权利要求9所述的翻译融合伙伴(TFP)蛋白的基因融合，和培养用该重组表达载体转化的酵母细胞。

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