CN115850411A - 一种食用菌抗螨凝集素蛋白PoLec2及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及食用菌害虫防治技术领域，尤其是一种食用菌抗螨凝集素蛋白PoLec2及其编码基因和应用，该蛋白为如下A1、A2或A3中的任一种：A1)氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示的蛋白质；A2)将SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有相同功能的蛋白质；A3)在A1或A2的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。本发明的食用菌抗虫性相关蛋白PoLec2及其编码基因可用于调控食用菌的抗虫性、食用菌品种选育和遗传改良。

Description

一种食用菌抗螨凝集素蛋白PoLec2及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及食用菌害虫防治技术领域，具体领域为一种食用菌抗螨凝集素蛋白PoLec2及其编码基因和应用。

背景技术

食用菌是指肉眼可见、子实体赤手可得的可食大型真菌。作为优质食物，食用菌逐渐被大众青睐，成为了餐桌常客。随着消费需求的增加，中国食用菌经历了飞速发展，栽培种类与日俱增，已经由传统的平菇、香菇、黑木耳等几个大宗食用菌逐渐发展为30余种。菌种生产技术、栽培管理技术和设备设施也发生了质的飞跃，全国食用菌总产量和产值直线上升，占全球75％以上，成为了促进农民增收、农村致富、推进农业产业结构调整的重要抓手。

腐食酪螨是一种重要的食用菌害螨，其体型微小，容易随通风系统传播；通体半透明，在遮荫的食用菌栽培中极难在虫害发生的早期发现。它以培养料和菌丝为食，繁殖速度惊人，大规模爆发可导致食用菌产量骤减乃至绝收。此外，该害螨会藏匿于培养料中，且对一般的化学农药产生较高抗性，故通常需要多次喷施高剂量的农药才能将其杀死，严重影响生产安全和食品安全。

培育抗病虫的食用菌品种被公认为是防治病虫害最经济有效的方法。因此，研究与利用食用菌抗腐食酪螨的基因，从基因工程的途径改造食用菌，使得食用菌具有自身对害虫抵抗力，是从根本上解决虫害更为高效且绿色安全的途径。

食用菌已经进化出不同的防御策略，用于与其他微生物竞争营养并保护自己免受动物的捕食。与植物相似，食用菌的主要防御策略是化学防御，即通过其产生损害捕食者的发育、生长或繁殖的物质，这些防御效应包括具有杀虫或拒食或趋避的蛋白和次生代谢物质，其中具有杀虫活性的毒素包括：凝集素(Lectins)、α-鹅膏毒素(α-matoxin)和溶血素(例如Aegerolysins、pleurotolysins等)等。尽管这些毒素在整个真菌王国中分布广泛，且有过诸多如杀线虫、蚊虫类的报道，但是在平菇中尚未发现类似杀虫活性的凝集素蛋白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种食用菌抗螨凝集素蛋白PoLec2及其编码基因和应用。发明人经过研究发现，在平菇中具有一种抗螨凝集素蛋白PoLec2，该蛋白在食用菌害虫防治中具有潜在应用价值。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种食用菌抗螨凝集素蛋白PoLec2，为如下A1、A2或A3中的任一种：

A1)氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白质；

A2)将SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1或A2的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

其中，所述标签包括Poly-Arg、His、HA、FLAG-tag、AviTag、Strep-tag II、c-Myc中的任一种。

其中，所述A2的蛋白质氨基酸序列与如SEQ ID NO：1所示蛋白质的氨基酸序列的同一性≥75％。具体的，可以为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

其中，所述A2的蛋白质可通过人工合成，也可先合成其编码基因再进行生物异源表达得到。

一种食用菌抗螨凝集素蛋白PoLec2的编码基因，其序列如SEQ ID NO：2所示；或者，将SEQ ID NO：2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连接标签的编码序列得到。

其中，所述标签包括Poly-Arg、His、HA、FLAG-tag、AviTag、Strep-tag II、c-Myc中的任一种，其序列如下表所示。

本发明所述食用菌抗螨凝集素蛋白PoLec2的编码基因可用于在制备含有所述编码基因的重组载体、基因表达盒、重组微生物、转基因食用菌细胞及转基因食用菌组织。具体可包括下述任一项生物材料的应用：

1)编码PoLec2的核酸分子；

2)含有上述核酸分子的重组载体；

3)含有上述核酸分子的表达盒

4)含有上述核酸分子的重组微生物；

5)含有上述核酸分子的转基因食用菌细胞；

6)含有上述表达盒的转基因食用菌细胞；

7)含有上述重组载体的转基因食用菌细胞；

8)含有上述核酸分子的转基因食用菌组织；

9)含有上述表达盒的转基因食用菌组织；

10)含有上述重组载体的转基因食用菌组织；

上述应用中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码PoLec2蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的PoLec2蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码PoLec2蛋白质且具有PoLec2蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

其中，“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的SEQID NO:2的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，所述的含有编码PoLec2蛋白质的核酸分子的表达盒(PoLec2基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达PoLec2蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动PoLec2基因转录的启动子，还可包括终止PoLec2基因转录的终止子。

进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织和发育特异的启动子，以及诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：T7、gpdA、tub、act、cbh1、glaA等。

可用现有的表达载体构建含有所述PoLec2基因表达框的重组载体。所述食用菌表达载体包括根癌农杆菌载体和可用于粒子轰击、聚乙二醇(PEG)介导、脂质体介导、电刺激、显微注射的载体等。如pET-28a、pET-28b、pCAMBIA1303、pEGFP-N1、pSilent-1、pCT74、pBARGPE1、pCAMBIA1302、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb等。

所述食用菌表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用本发明的基因构建食用菌表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因食用菌细胞或食用菌组织进行鉴定及筛选，可对所用食用菌表达载体进行加工，如加入可在食用菌中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因、赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因食用菌的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化菌株。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒可为pCAMBIA1303载体。

进一步的，所述重组载体可为pCAMBIA1303-PoLec2。所述pCAMBIA1303-PoLec2能表达SEQ ID No:1所示的PoLec2蛋白质，该蛋白质的表达由构巢曲霉的组成型启动子gpdA驱动。所述pCAMBIA1303-PoLec2为向pCAMBIA1303载体的多克隆位点插入SEQ ID No:2所示的DNA片段得到的重组载体。

进一步的，所述pCAMBIA1303-PoLec2具体为将pCAMBIA1303载体NcoI和BstEII识别序列之间的小片段替换为序列表的序列2所示DNA片段得到的重组载体。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia)，欧文氏菌(Erwinia)，根癌农杆菌属(Agrobacterium)(如GV3101)，黄杆菌属(Flavobacterium)，产碱菌属(Alcaligenes)，假单胞菌属(Pseudomonas)，芽胞杆菌属(Bacillus)等。真菌可来自裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，酿酒酵母属(Saccharomyces)，毕赤酵母属(Pichia)等。

所述食用菌可为担子菌门下食用菌或子囊菌门下可食用或药用的大型真菌；

提高受体食用菌中PoLec2的含量可通过向所述受体食用菌中导入B1)所述核酸分子实现。

上述方法中，所述PoLec2的编码基因可先进行如下修饰，再导入受体食用菌中，以达到更好的表达效果：

1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体食用菌所偏爱的密码子，在保持本发明所述PoLec2的编码基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合食用菌偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现食用菌中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；

2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在食用菌中已知的有效的序列进行修饰；

3)与各种食用菌表达的启动子连接，以利于其在食用菌中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的时期而定；尽管证明了来源于子囊菌门下食用菌的许多启动子在担子菌门下食用菌中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择子囊菌门下食用菌启动子用于子囊菌门下食用菌中的表达，担子菌门下食用菌的启动子用于担子菌门下食用菌中的表达；

4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；

所述PoLec2的编码基因可利用含有所述PoLec2的编码基因的重组表达载体导入受体食用菌。所述重组表达载体具体可为所述pCAMBIA1303-PoLec2。

所述目的食用菌应理解为不仅包含PoLec2蛋白或其编码基因被改变的第一代食用菌，也包括其组织分离和子代。对于所述目的食用菌，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述目的食用菌包括分离的组织、担孢子、完整菌株和细胞。

上述方法中，所述受体食用菌可为担子菌门下食用菌或子囊菌门下可食用或药用的大型真菌；

本发明所述食用菌抗螨凝集素蛋白PoLec2或食用菌抗螨凝集素蛋白PoLec2的编码基因可用于调控食用菌抗虫性、食用菌品种选育和遗传改良，具体可包括下述任一项应用：

1)调控食用菌抗虫性；

2)制备调控食用菌抗虫性产品：包括PoLec2或本发明上述的生物材料；

3)培育易感型和抗虫型食用菌；

4)制备培育易感型和抗虫型食用菌产品；

5)培育凝集素含量增加或降低食用菌；

6)制备培育凝集素含量增加或降低食用菌产品；

其中，所述调控食用菌抗虫性的产品可以以PoLec2或上述的生物材料为其活性成分，还可以将PoLec2或上述的生物材料与具有相同功能的物质组合在一起作为其活性成分。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明鉴定得到的凝集素PoLec2基因可以调控平菇的抗螨性；将抗螨相关的PoLec2凝集素蛋白导入平菇中可提高感虫品种的抗螨性。

(2)本发明的食用菌抗虫性相关蛋白PoLec2及其编码基因可以调控食用菌的抗虫性；将食用菌抗虫性相关蛋白的编码基因导入食用菌中可以使食用菌的抗虫性均增加。

(3)本发明的食用菌抗虫性相关蛋白PoLec2及其编码基因可以应用于食用菌品种选育和遗传改良。

附图说明

图1为pCAMBIA1303-PoLec2转化野生型389菌株的阳性菌株相对表达量检测；

图2为腐食酪螨在阳性转基因菌株与野生型菌株中饲养21天种群数量变化；

图3为阳性转基因菌株的抗螨鉴定。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5’末端核苷酸，末位均为相应DNA的3’末端核苷酸。

平菇389菌株和45菌株，公众可从江苏省农业科学院蔬菜研究所获得。

实施例1 PoLec2蛋白及其编码基因在调控平菇抗虫性中的应用

本实施例提供了一种来源于抗螨菌株-45的凝集素蛋白质，其名称为PoLec2，在凝集素中PoLec2的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。

一、PoLec2全长cDNA序列克隆

利用UniLectin在线凝集素基因(https://www.unilectin.eu/mycolec/)预测软件对平菇389基因组(PRJNA327267)进行分析，共预测到10多个基因。根据来自Bleuler-Martinez等(Bleuler-Martinez,S.et al.Structure-function relationship of anovel fucoside-binding fruiting body lectin from Coprinopsis cinereaexhibiting nematotoxic activity.Glycobiology,2022,32,600-615；Pohleven,J.etal.Basidiomycete Clitocybe nebularis is rich in lectins with insecticidalactivities.Appl Microbiol Biotechnol 2011,91,1141-1148)报道的具有β-sandwich的杀虫凝集素的结构特征，剔除了其预测的其他类型候选基因，将剩余的一个蛋白质序列列为平菇抗腐食酪螨的候选基因，并暂定名为“PoLec2”。

根据基因组和生物信息学分析结果，设计引物1对(SEQ ID No:9-10所示)，lec2F:5’ATGCATGACATTAGTACTTAT 3’和lec2R:5’CTATGCGAGAGGGATGACTAC 3’，从抗腐食酪螨的平菇45菌株中克隆并获得其的全长cDNA序列，测序验证序列准确后进入下步实验。

二、重组载体的构建

将pCAMBIA1303载体的NcoI和BstEII识别序列之间的小片段，利用擎科生物公司的无缝克隆试剂盒

SoSoo Cloning Kit Ver.2，替换为lecF:5’ccgcttgagcagacatcaccATGCATGACATTAGTACTTAT 3’和lecR:5’aattcgagctggtcaccaatCTACGCGAGCGGGATCACCG3’，如SEQ ID No：3-4所示，扩增得到的cDNA分子，得到重组载体，将得到的序列正确的重组载体记为pCAMBIA1303-PoLec2。

pCAMBIA1303-PoLec2含有SEQ ID No：2所示的DNA片段以及构巢曲霉的组成型启动子gpdA，能表达SEQ ID No：1所示的PoLec2蛋白质，该蛋白质的表达由构巢曲霉的组成型启动子gpdA驱动。

三、转PoLec2基因平菇的构建及鉴定

将pCAMBIA1303-PoLec2转化大肠杆菌DH5α后进行质粒制备和保藏，质粒转化入农杆菌GV3101后，通过农杆菌介导方式转化平菇389菌丝体。

菌丝的转化：

(1)将平菇菌块接种到PDA培养基中，28℃培养至5d；

(2)用5mm打孔器打孔，每两个平板的菌块接种于100ml的CYM液体培养基，28℃避光静置培养2d；

(3)将带有目的质粒的农杆菌在含抗生素(Rif和Kan)的LB固体培养基上划线培养，28℃倒置培养两天；

(4)挑单菌落接种于10ml含抗生素(Rif和Kan)的LB液体培养基中，28℃、180rpm震荡培养2d；

(5)取0.7mL上述菌液到100ml含抗生素(Rif和Kan)LB液体培养基中，28℃、180rpm震荡培养18h；

(6)4500rpm、4℃离心15min收集菌体，使用12ml IM培养基重悬菌体于三角瓶中，28℃、90rpm避光诱导培养5h；

(7)将CYM液体培养基中的糙皮侧耳菌块用无菌水冲洗，将其倒放入诱导培养完毕后的农杆菌菌液中，28℃静置培养5h；

(8)取共培养的菌块倒入50ml离心管中，去除IM培养基，将菌块转移至铺有玻璃纸的IM平板中，28℃培养3-5d后将玻璃纸连同菌块一起转移至CYM固体培养基上(含90μg/mLHyg和300μg/mL Cef)，培养约20d，可见抗性菌丝的生长；

(9)将上述菌丝转移至新的固体CYM培养基中(含90μg/mL Hyg)，将能够继续生长的菌丝转接到PDA培养基上培养，用于DNA的提取和目的基因表达量的检测。

转化子gDNA提取参照试剂盒说明书进行。根据过表达质粒上潮霉素的序列设计引物进行PCR验证引物序列(SEQ ID No:5-6)如下：

Hyg-F CGACAGATCCGGTCGGCATCTACTCTATTTCTT(5’-3’)

Hyg-R TCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGG(5’-3’)

PoLec2基因的PCR验证引物(SEQ ID No:7-8)如下：

PoLec2-Q1F GAGCACCGACACCTTCATCA(5’-3’)

PoLec2-Q1R AATCCCCACTTGCTGTCGTC(5’-3’)

选择β-actin基因为内参基因。

RT-PCR程序如下：

95℃预变性2min，(95℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸30s)×30个循环，融解曲线：60℃-95℃每2.2℃/s读板一次生成融解曲线。

PCR产物进行琼脂糖电泳，通过跟对应质粒的扩增结果比对，初步筛选阳性转化子，然后将扩增得到的产物进行测序验证。

阳性菌株相对表达量检测结果如图1所示。

四、PoLec2过表达抗虫效果鉴定

待测菌株：389菌株(野生型，WT)、T5代阳性转PoLec2基因菌株(L1、L6)。

1、阳性转基因菌株对螨虫生长发育、种群增长的影响

将上述待测菌株的麦粒种分别置于25mL培养瓶内，每瓶放入0.3g，一个品种为一组实验，每组实验进行5次重复。开始前，通过100目标准筛冲洗腐食酪螨成螨于新的培养瓶内，26℃，80％ RH产卵24h。随后用0号毛刷收集一日龄的螨虫卵，并在显微镜下将其置于培养瓶的麦粒上。每个培养瓶内收集30个同龄卵，培养于26℃，80％ RH环境下。每天于显微镜下详细记录所有养虫瓶内的卵孵化情况和每一发育阶段的螨虫数，持续21天，死亡的未成熟和成熟个体的记录被用来计算死亡率。

2、阳性转基因菌株的菌丝体对腐食酪螨的抗性评价

取待测菌株接种于6连扳的细菌培养皿中，待菌丝长满备用。收集螨虫饥饿24h，放置约1500头螨虫，盖上盖子用封口膜封闭，取食48h观察其为害程度分析统计其抗虫性。

结果如表1、图2和图3所示。结果表明，与野生型相比，腐食酪螨在阳性转PoLec2基因菌株上的种群增长显著下降(如图2所示)，且阳性转基因菌株的抗虫性提高(如图3所示，从高感提高到高抗)，由此可见，从实际上，PoLec2的过量表达也使平菇获得了抗虫性。

表1腐食酪螨在阳性转基因菌株与野生型菌株中的发育历期

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种食用菌抗螨凝集素蛋白PoLec2，其特征在于，为如下A1、A2或A3中的任一种：

A1)氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白质；

A2)将SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1或A2的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.根据权利要求1所述的食用菌抗螨凝集素蛋白PoLec2，其特征在于：所述标签包括Poly-Arg、His、HA、FLAG-tag、AviTag、Strep-tag II、c-Myc中的任一种。

3.根据权利要求1所述的食用菌抗螨凝集素蛋白PoLec2，其特征在于：所述A2的蛋白质氨基酸序列与如SEQ ID NO：1所示蛋白质的氨基酸序列的同一性≥75％。

4.根据权利要求1所述的食用菌抗螨凝集素蛋白PoLec2，其特征在于：所述A2的蛋白质可通过人工合成，也可先合成其编码基因再进行生物异源表达得到。

5.一种食用菌抗螨凝集素蛋白PoLec2的编码基因，其特征在于：其序列如SEQ ID NO：2所示；

或者，将SEQ ID NO：2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连接标签的编码序列得到。

6.根据权利要求5所述的食用菌抗螨凝集素蛋白PoLec2的编码基因，其特征在于：所述标签包括Poly-Arg、His、HA、FLAG-tag、AviTag、Strep-tag II、c-Myc中的任一种。

7.一种重组表达载体或表达盒，其含有如权利要求5或6所述的食用菌抗螨凝集素蛋白PoLec2的编码基因。

8.权利要求7所述的重组表达载体或表达盒在构建转基因食用菌细胞或组织中的应用。

9.一种重组微生物，其含有如权利要求5或6所述的食用菌抗螨凝集素蛋白PoLec2的编码基因。

10.权利要求1-4任一所述食用菌抗螨凝集素蛋白PoLec2或权利要求5或6所述食用菌抗螨凝集素蛋白PoLec2的编码基因在调控食用菌抗虫性、食用菌品种选育和遗传改良中的应用。

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