KR20120138995A - 새송이버섯을 이용하여 재조합 인간 혈소판 유래 성장인자를 생산하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재조합 인간 혈소판유래 성장인자의 유전자를 함유한 백터를 도입시켜 형질전환된 새송이버섯으로부터 인간 혈소판유래 성장인자를 생산하는 방법 및 이 방법에 의해 제조된 재조합 인간 혈소판유래 성장인자에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 형질전환 균사체의 대량생산 체계 확립과 생산된 균사체의 단백질 정제 및 생물학적 활성연구가 병행되어지면 재조합 인간 혈소판유래 성장인자의 생산을 위한 새로운 재조합 단백질 생산 시스템으로의 활용이 가능할 것으로 사료되어진다.

Description

새송이버섯을 이용하여 재조합 인간 혈소판 유래 성장인자를 생산하는 방법{Process for producing hPDGF-BB using Pleurotus eryngii}

본 발명은 새송이 버섯에 재조합 인간 혈소판 유래 성장인자(hPDGF-BB)를 함유하는 백터를 형질전환시키고 형질전환된 새송이 버섯으로부터 재조합 hPDGF-BB을 생산하는 방법에 관한 것이다.

최근에 생명공학이 발달하면서, 유용한 단백질을 미생물이나 정제가 쉬운 동물에서 발현시킴으로써 산업화를 도모하고 있다. 예를 들어 대장균(E. coli), 효모(P. pastoris) 혹은 양이나 젖소의 젖으로 생산되고 있다. 하지만 양이나 젖소의 경우 모체(host)의 유지 비용이 많이 들기 때문에 산업화에 난점이 있으며, 대장균의 경우 균에서 생산된 제품이라는 비관적인 인식과 완벽한 단백질의 구조가 형성되는 후-번역(post-translation)이 이루어지지 않아 정작 완벽한 단백질로써의 기능을 못하는 경우가 있다. 그래서 후-번역이 일어나는 진핵생물인 효모가 산업화에 유리하다. 산업화 단계는 S. cerevisiae 혹은 P. pastoris와 같은 효모가 산업화에 이용되는데, 이러한 효모 역시 대장균처럼 액체 배양이 가능하며, 대규모의 배양공정이 가능하다는 장점을 지니고 있다.

바이오 의약품 개발 초기에 Amgen, Chiron, Genentech 등 다수의 제약 회사에서 효모를 숙주로 사용하기 위한 많은 연구가 진행되었으나, 단백질 종류에 따라 분비가 불가능하거나 분비 생산성이 매우 낮은 문제점 때문에 개발이 지연되고 왔고 결과적으로 미국과 유럽에서 효모를 이용한 단백질의약품의 생산 예는 다른 발현시스템에 비하여 상대적으로 적은 편이다. 이러한 여러가지 문제로 인하여 현재 새로운 생물 공장의 필요성이 대두 되고 있으며, 그 중에서 시도 되어지고 있는 미생물이 담자균류(Basidiomycetes) 즉, 버섯(mushroom)을 이용하여 단백질을 생산하는 기술을 개발하는 것이다. 그러나 현재까지 버섯을 이용한 연구로는 양송이버섯을 이용한 하이크로마이신 B 포스포트랜스퍼라아제(hygromycin B phosphotransferase, hph) 유전자, EGFP(enhanced green fluorescent protein) 유전자의 형질전환연구 및 느타리버섯, 팽이버섯, 표고버섯, 재먹물버섯을 이용한 유전자 클로닝의 시도가 전부라 할 수 있을 만큼 연구범위가 한정적이고 상업적으로 이용 가능한 실용적인 단백질 생산에 관한 연구는 아직까지 이루어지지 않고 있다.

전통적으로 버섯은 식용 및 약용식품으로 여겨져 왔으며, 그로 인해 분자생물학적 연구가 많이 진행되지 못한 것은 부정할 수 없는 현실이다. 버섯은 분류학상으로 고등균류 중 진균류(Eumycetes)에 속하며, 대부분은 담자균류에 속한다. 이러한 버섯은 독특한 맛과 향이 뛰어나 기호성이 높은 식품으로 이용되어져 왔고, 당질, 단백질, 비타민, 아미노산, 무기질 등과 같이 인체에 중요한 각종 영양소를 골고루 함유하고 있으며, 광범위한 약리 작용도 나타내므로 예로부터 전통식품 및 민간약의 제제로서 널리 이용되어져 왔을 뿐만 아니라 항암활성, 면역증강 등의 효능작용 때문에 최근에는 기능성 식품 및 의약품 소재로 많이 이용되고 있다.

새송이버섯(Pleurotus eryngii)은 주름버섯목 느타리버섯과에 속하는 식용 버섯으로 백색목재부후균의 일종이다. 이 버섯의 원산지는 남유럽 일대이며 북아프리카, 중앙아시아, 남러시아 등지에도 분포하고 있는 것으로 알려져 있다. 또한 떡갈나무와 벚나무의 그루터기에서 자생하는 사물기생균으로서 당근류에 속하는 몇몇 식물의 조직에서도 생장이 가능한 조건기생균(반활물기생균)이라는 보고가 있으며, 산형과, 분과, 부처꽃과 등 초본식물의 뿌리에 질병을 유발시키는 병원균으로도 보고되어 있다. 새송이버섯은 자실체의 균사조직이 치밀하여 육질감이 뛰어나 맛이 탁월하고 자연산 송이와 식미가 거의 유사하며, 영양적인 측면에서도 비타민C가 풍부하고 필수아미노산을 다양하게 함유하고 있으므로 개발의 가치가 매우 높다.

생산량이 한정된 호르몬, 항체, 백신 및 생체기능성 단백질과 같은 유용 단백질을 미생물 숙주세포에서 대량 생산하여 의약품으로 개발하는 재조합 단백질 의약품 생산기술은 미생물을 세포공장(cell factory)으로 활용하는 대표적인 미생물 이용기술로 부상되었다. 더욱이 인류의 보건 복지가 향상됨에 따라 난치성 질환의 치료를 위한 고순도의 단백질성 의약품에 대한 수요가 기하급수적으로 증가되고 있어서 저렴한 비용으로 대량생산이 가능한 미생물 발현시스템을 이용한 재조합 의약품 생산기술 개발은 미래 의약산업의 성장에 크게 기여할 것으로 예측되고 있다. 또한 인간 게놈 프로젝트의 완성 이후 신약 개발을 위한 신규 단백질 수요가 폭발적으로 증가하며 단백질 구조 및 기능 분석을 위한 초고속 발현 시스템에 대한 수요도 급증하고 있는 상황이다.

그러나 많은 경우, 의약품으로 개발될 잠재성 높은 인체 유래의 단백질들은 기존 미생물 기반 발현 기술로는 발현 효율이 매우 저조하므로 이들 난 발현 단백질(difficult-to-express proteins) 관련 문제들을 해결하기 위한 혁신적인 기술 개발의 필요성이 대두되고 있으며, 의약용 단백질의 후번역 수식(post-translational modification)은 치료 효능, 체내 안정성 및 면역 부작용 등에 중요한 영향을 미친다는 사실이 알려지면서, 생산량(quantity) 보다 원형 단백질과 동일하거나 그 이상의 품질(quality)을 지닌 단백질을 생산할 수 있는 기술의 개발이 중요해지고 있는 실정이다. 또한, 미생물 활용 재조합 의약용 단백질 개발 분야의 경우 생산기술의 근간이 되는 신규 고발현 시스템 개발, 유전체 정보 기반의 고기능 숙주세포 재설계, 고성능 생산균주의 대량 배양에 관한 분자생물공정 기술 개발 등이 국제시장 개방과 함께 국가 경쟁력 강화를 위한 중요한 분야로 대두되고 있다.

현재까지 새송이버섯에서 유용한 물질을 생산하는 유전자를 도입하는 유전육종시스템은 시도된 바가 매우 드물고 성공한 사례를 찾아보기가 어려웠다.

논문명 : Expression and production of therapeutic recombinant human platelet-derived growth factor-BB in Pleurotus eryngii. (Choi J.H. et. al., Applied Biochemistry and Biotechnology, 2011) (online first - ABB DOI: 10.1007/s12010-011-9279-y)

이에 본 발명자들은 새송이버섯으로부터 재조합 hPDGF-BB 단백질을 효율적으로 회수하기 위하여 종래 식물의 형질전환방법으로 주로 사용되어져 왔던 아그로박테리움 투메파시엔스 매개 형질전환(Agrobacterium tumefaciens mediated transformation) 방법을 새송이버섯에 접목하는 새로운 버섯형질전환 기술을 개발하고자 예의 연구한 결과, 재조합 hPDGF-BB 유전자를 함유하는 벡터를 이용하여 hPDGF-BB를 버섯 형질전환에 의해 더욱 용이하게 생성할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명은 재조합 인간 혈소판유래 성장인자(이하, "hPDGF-BB"라고도 한다)의 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환된 새송이버섯으로부터 재조합 hPDGF-BB를 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 목적은, 추가의 일면에 있어서, 상기 방법에 의해 제조된 hPDGF-BB 단백질을 제공하는 데 있다.

본 발명에 따르면, 형질전환 균사체의 대량생산체계 확립과 생산된 균사체의 단백질 정제 및 생물학적 활성연구가 병행되어지면 hPDGF-BB 단백질 생산을 위한 새로운 미생물 생산 시스템으로의 활용이 가능할 것으로 사료되어진다.

도 1은 프라이머 조합을 이용하여 형질전환된 대장균(E. coli)으로부터 인간 혈소판유래 성장인자(hPDGF)의 PCR 검출 결과를 나타내는 개략도 및 전기영동사진.
도 2는 벡터 pCAMBIA-1304 중의 인간 혈소판유래 성장인자(hPDGF)의 뉴클레오타이드 서열 분석 결과를 나타내는 도면.
도 3은 프라이머 조합을 이용하여 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스(A. tumefaciens)로부터 인간 혈소판유래 성장인자(hPDGF)의 PCR 검출 결과를 나타내는 개략도 및 전기영동사진.
도 5는 진공침투후 형질전환 에세이의 GUS 조직 화학적 분석 결과를 나타내는 사진.
도 6은 프라이머를 사용하여 형질전환된 새송이버섯 게놈 DNA로 부터의 hPDGF 검출 결과를 나타내는 사진.
도 7은 형질도입 버섯으로부터 단리한 게놈 DNA의 서던 블롯 혼성화 결과를 나타내는 전기영동 사진.
도 8은 프라이머를 사용한 형질전환 새송이버섯의 cDNA로 부터의 hPDGF의 PCR 검출을 나타내는 전기영동 사진.
도 9는 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타내는 전기영동 사진.
도 10은 Ni-스핀 컬럼 및 웨스턴 블롯 분석; 변성 조건에 따른 단백질 정제 결과를 나타내는 사진.
도 11은 정제된 rhPDGF-BB의 MALDI-TOF 질량 분광광도계 분석 결과를 나타내는 그라프도.
도 12는 정제 및 표준 rhPDGF-BB의 생물학적 활성을 나타내는 그라프도.

본 발명은 인간 혈소판 유래 성장인자의 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환된 새송이버섯으로부터 인간 혈소판 유래 성장인자(hPDGF-BB)를 생산하는 방법 및 이 방법에 의해 제조된 재조합 인간 혈소판 유래 성장인자를 제공한다.

구체적으로 본 발명은

a) 인간 혈소판 유래 성장인자의 유전자를 함유하는 벡터를 구축하는 단계,

b) 아그로박테리움 진공 침투(Agrobacterium vacuum infiltration) 방법을 이용하여 구축된 분비 벡터를 새송이버섯(Pleurotus eryngii)에 형질전환시키는 단계,

c) 얻어진 형질전환체의 유전자 발현 여부를 확인하기 위하여 각각의 게놈(genomic) DNA를 분리하여 프라이머(primer)를 이용한 PCR을 실시하여 재조합 단백질의 형질전환균사체를 확인하거나 또는 서던 블롯(southern blot)과 노던 블롯(northern blot)을 실시하여 형질전환체의 유전자 발현여부를 확인하는 단계, 및

d) 최종적으로 형질전환균사체로부터 재조합 단백질을 분리하는 단계

를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 혈소판 유래 성장인자에 대한 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환된 새송이버섯(Pleurotus eryngii)으로부터 인간 혈소판 유래 성장인자의 생산 방법을 제공한다.

이를 위하여 먼저 본 발명에 따라 인간 혈소판 유래 성장인자에 대한 유전자를 함유하는 발현벡터 제작하였다. 새송이 버섯 형질전환을 위해 hPDGF 유전자가 포함된 발현벡터를 제작하여 E. coli와 A. tumefaciens에 형질전환시켜 최종적으로 두가지의 벡터를 제작하였다. 제작된 발현벡터를 유전자의 프라이머(primer)와 벡터의 프라이머를 서로 엇갈려 사용하여 결과를 얻음으로 삽입된 유전자의 진위여부 및 재조합 균주(recombinant strain)를 최종적으로 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 토대로 도입하고자 했던 각각의 유전자의 형질전환이 정확하게 이루어졌음을 최종적으로 확인할 수 있었다. 얻어진 결과를 토대로 아그로박테리움(Agrobacterium)으로 구축되어진 각각의 유전자 벡터가 최종 형질전환된 것을 확인하였으며, 버섯으로 형질전환 시키기 위한 벡터의 구축이 확립되었음을 확인할 수 있었다. 또한 기존에 식물의 형질전환에 이용되었던 pCambia 벡터를 미생물에 접목하여 확인한 결과로써 식물에 이용되던 벡터가 버섯에도 접목 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명에 의하여 재조합 유전자 형질전환체를 분석하고, 재조합 단백질을 발현시켰다. 아그로박테리움 진공 침투(Agrobacterium vacuum infiltration) 방법을 통한 형질전환 후 항생제 선별배지에서 분리한 각각의 형질전환 균사체들의 형질전환 유무를 확인하기 위하여 균사체에서 게놈(genomic) DNA를 분리하여 프라이머를 이용한 PCR을 실시한 결과 양성 대조군(positive control)으로 쓰였던 각각의 유전자 증폭 영역의 크기와 일치하는 결과를 보여주었다. 반면, 비형질전환 균사체의 경우에서는 유전자의 증폭이 이루어지지 않음을 확인하였다. 위의 결과들로 비추어 볼 때 GUS의 조직화학적 분석에서 보여졌던 결과들이 단지 Agrobacterium에서 기인한 결과가 아닌 형질전환된 버섯에서 나타난 결과임을 재차 확인할 수 있었다.

향후 형질전환 균사체의 대량생산체계 확립과 생산된 균사체의 단백질정제 및 생물학적 활성연구가 병행되어지면 인간 재조합 단백질 생산을 위한 새로운 미생물 생산시스템으로의 활용이 가능할 것으로 사료되어진다.

현재 재조합 단백질은 생산된 단백질이 얼마나 인체단백질에 가까운지(authenticity)와 생산된 단백질이 얼마나 순수하게 생산되는지가 가장 중요한 변수로 인식되고 있다. 따라서 고부가가치의 단백질을 고품질, 고효율로 대량 생산할 수 있는 시스템의 개발이 현재 절실히 요구 되어지고 있다.

이에 본 발명에서는 이러한 시대적 추세에 따라 기존에 단백질 생산에 있어 여러가지 문제점을 내재한 미생물을 이용한 재조합 단백질 생산이 아닌 미생물과 식물의 장점을 두루 갖춘 버섯을 이용한 새로운 재조합 단백질 생산시스템을 개발하고자 하였다.

본 발명에서 사용한 새송이 버섯에서 재조합 단백질을 생산하기 위하여 먼저 발현벡터를 구축을 실시한 결과, 1차적으로 E. coli DH5α와 Agrobacterium tumefaciens GV3101 균주에 hGH가 포함된 벡터 구축을 완성하였다. 구축된 발현벡터를 버섯에 형질전환 시키기 위하여 아그로박테리움 진공 침투 방법을 이용하였다. 아그로박테리움 진공 침투 방법을 이용한 버섯형질 전환을 실시하여 일차적으로 하이그로마이신(hygromycin) 내성을 가진 형질전환체를 얻을 수 있었다. 얻어진 형질전환체의 유전자 발현 여부를 확인하기 위하여 각각의 게놈(genomic) DNA를 분리하여 프라이머를 이용한 PCR을 실시하여 hPDGF 형질전환체를 확인하였다. 또한 서던 블롯과 노던 블롯을 실시하여 형질전환체의 유전자 발현여부를 확인할 수 있었다. 위의 방법으로 형질전환을 실시하여 형질전환버섯균사체를 얻을 수 있었다.

따라서, 개발된 형질전환 방법을 통하여 생산되는 재조합 단백질을 기능성식품 원료에 응용하여 "Food as Medicine" 의 개념으로 개발한다면 높은 부가가치를 창출할 수 있을 것으로 보여진다. 그리고 향 후 지속적인 연구를 통하여 버섯에서 보다 자연 원형상태에 가까우면서 생리활성이 유지된 상태로 재조합 단백질을 생산하며 그 생산성을 극대화 하기 위한 공동의 노력이 생리학자, 분자 유전학자, 그리고 발효기술자간의 연계적 연구를 통해 계속적으로 유지된다면, 우리의 전통적인 먹거리인 버섯이 재조합 의약품 생산을 위한 숙주 시스템으로서의 새로운 모델이 될 것으로 사료된다.

<실시예>

이하, 본 발명은 다음의 대표적인 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명되나, 본 발명이 이들 실시예에 의해 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.

균주 및 유전자

본 실험에 사용된 균주는 조선대학교 생명공학과 신경분자생물학실험실에서 분양받은 E. coli DH5α와 (주)넥스젠 중앙연구소로부터 분양받은 Agrobacterium tumafaciens GV3101를 사용하였으며, 균주의 증식을 위하여 사용된 배지로는 LB 배지(1% bacto tryptone, 0.5% bacto yeast extract, 1% NaCl)를 사용하였다. 또한 단백질발현 시스템 개발을 위해 사용된 새송이버섯의 자실체는 전북 김제에 소재한 송이농산으로부터 제공받아 사용하였다. 형질전환을 위해 사용된 유전자인 hPDGF는 한국생명공학연구원 21C Frontier Human Gene Bank에서 구입하여 사용하였으며, pCambia1304 벡터는 BioForge로부터 구입하여 사용하였다.

실시예 1: 벡터 제작( Vector construction )

(1) 재조합 hPDGF 유전자 발현벡터 제작

새송이 버섯에서 인간 hPDGF 유전자를 발현시키기 위하여 식물형질전환 벡터로 많이 사용되는 pCambia1304 벡터를 도 1(1)에 나타낸 바와 같이 제작하였다. 도 1(1)은 hPDGF 유전자를 발현하는 pCAMBIA1304(hPDGF) 벡터의 구축을 나타내는 도면이다.

(2) PCR을 이용한 벡터 구축 확인

구축된 벡터를 증명하기 위한 한 방법으로 PCR을 실시하였다. 프라이머는 총 4가지를 이용한 크로스 프라이머(cross primer) PCR을 실시하였다. 1번은 한국생명공학연구원 21C Frontier Human Gene Bank에서 구입한 hPDGF를 PDGF내에 존재하는 한쌍의 primer(hPDGF-BB F2 (GTTCCCTGACCATTGCTGAG, 서열번호 1) , R2 (GGCTTCTTCCGCACAATCTC, 서열번호 2), Genotech(Korea), gene reference(BC029822))를 이용하여 PCR한 결과 238 bp의 결과를 얻을 수 있었고, 이와 동일하게 구축된 벡터를 실시한 결과도 동일한 238 bp를 확인할 수 있었다. 이는 구축된 벡터 내에 PDGF 유전자가 존재함을 의미한다. 3번과 4번은 PDGF의 프라이머 하나(hPDGF-BB F3 (CTTCCAAAACCTGCTTCCTT, 서열번호 3), Genotech(Korea), gene reference(BC029822))와 pCAMBIA1304의 프라이머 하나(pCAMBIA1304 R1 (CCCAGGCTTTACACTTTAGT, 서열번호 4), Genotech(Korea), gene reference(AF234300))를 이용하였고, PDGF의 프라이머 하나(hPDGF-BB R2 (GGCTTCTTCCGCACAATCTC)) 와 pCAMBIA-1304 벡터의 프라이머 하나(pCAMBIA1304 F1 (CCCAGGCTTTACACTTTAGT, 서열번호 5), Genotech(Korea), gene reference(AF234300))를 이용한 크로스 프라이머로 PCR을 수행하였는데, 각각 391 bp와 912 bp의 PCR 밴드를 확인할 수 있었다. pCMABIA-1304 벡터에 hPDGF 유전자가 구축된 것을 증명하는 밴드는 5번과 6번을 비교하여 증명하였다. 5번은 구축괸 벡터를 pCAMBIA-1304 프라이머로 PCR하였는데 hPDGF 유전자가 들어가 있어서 3,060 bp의 밴드를 보여주지만 pCAMBIA-1304 벡터는 362 bp로 약 2,698 bp의 외래 유전자가(hPDGF gene) 구축되었음을 증명하였다.(도 1 참조). 도 1(2)는 프라이머 조합을 이용하여 형질전환된 대장균(E. coli)으로부터 인간 혈소판유래 성장인자(hPDGF)의 PCR 검출 결과를 나타내는 전기영동사진이다. 레인 M: 100 bp 마커; 레인 1: 프라이머 F2, R2를 사용한 대조군(hPDGF); 레인 2: 프라이머 F2, R2를 사용한 형질전환된 DNA; 레인 3: 프라이머 F1, R2를 사용한 형질전환된 DNA; 레인 4: 프라이머 F2, R1을 사용한 형질전환된 DNA; 레인 5: 프라이머 F1, R1을 사용한 형질전환된 DNA.

(3) 서열분석

버섯 형질전환에 들어가기에 앞서 구축되어진 벡터의 완성여부를 최종적으로 확인하고자 (주)마크로젠에 시퀀싱(sequencing)을 의뢰하여 아래와 같은 결과를 얻을 수 있었다(도 2참조). 도 2는 벡터 pCAMBIA-1304 중의 인간 혈소판유래 성장인자(hPDGF)의 뉴클레오타이드 서열 분석 결과를 나타내는 도면이다.

이 결과를 보면 플라스미드 DNA가 깨끗해서 각 뉴클레오타이드 피크가 정확히 나왔으며, hPDGF 유전자가 247 bp부터 정확하게 구축되었음을 확인하였다. 그리고 최종적 산물인 아미노산으로 발현을 할 경우, aa 22?25에 "MITNS" 부분은 LcaZ' gene 부분인데 이를 출발 코돈(start codon)으로 발현이 시작되어 aa 83?313에서 hPDGF gene 부분인, "MNRCW ALFLS LCCYL RLVSA EGDPI PEELY EMLSD HSIRS FDDLQ RLLHG DPGEE DGAEL DLNMT RSHSG GELES LARGR RSLGS LTIAE PAMIA ECKTR TEVFE ISRRL IDRTN ANFLV WPPCV EVQRC SGCCN NRNVQ CRPTQ VQLRP VQVRK IEIVR KKPIF KKATV TLEDH LACKC ETVAA ARPVT RSPGG SQEQR AKTPQ TRVTI RTVRV RRPPK GKHRK FKHTH D"(서열번호 6)가 발현될 것이다.

실시예 2: 아그로박테리움( Agrobacterium ) 형질전환체 제작

hPDGH 유전자를 새송이 버섯에 형질전환시켜 재조합 단백질생산 연구를 수행하고자 pCAMBIA-1304에 hPDGF가 구축된 형질전환용 벡터를 사용하였다. 대장균 (E. coli) DH5α에 도입된 재조합 균주의 플라스미드 DNA를 분리하여 Freeze-thaw법에 의하여 Agrobacterium tumefaciens GV3101에 형질전환시켰다.

50㎖ LB 배지에 Agrobacterium을 접종하여 28℃, 120rpm 조건으로 OD₆₀₀ 값이 0.5~1.0 이 될 때까지 진탕 배양한 후 얼음에 넣어 5분간 냉각시키고, 3,200 rpm에서 15분간 원심분리하여 침전된 세포에 20Mm CaCl₂ 1㎖을 가하여 현탁하고, 여기에 미리 Qiagen minipreps kit로 분리해 놓은 각각의 DNA를 첨가하고 액체 질소에 넣어 급냉시킨 다음 37℃ 배양기에서 5분간 반응하였다. 반응 후 400㎕의 LB 배지를 첨가하여 28℃에서 4시간 배양하였다. 배양액을 100 ㎍/㎖ 카나마이신이 함유된 LB 고체배지에 도말하여 28℃에서 배양하였다. 배양 후 48시간이 지난 뒤 LB 고체배지에 형성된 콜로니를 100 ㎍/㎖ 카나마이신 함유 LB 액체 배지에서 증식시켜 버섯 형질전환의 매개체로 사용하였다[참조: Freeze-thaw method, Holster et al., 1978)].

(2) 아그로박테리움 형질전환 PCR

형질전환 선별배지에서 kanamycin 저항성을 나타낸 single colony를 분리동정하였다. 각각의 유전자 도입여부를 확인하고자 Agrobacterium plasmid quick screen법에 의하여 DNA를 분리한 후 2쌍의 primer를 사용하여 cross primer PCR을 수행한 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 hPDGF유전자 제작 primer 사이즈인 238 bp의 크기에서 밴드가 증폭되어짐이 확인되었다.

도 3은 프라이머 조합을 이용하여 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스(A. tumefaciens)로부터 인간 혈소판유래 성장인자(hPDGF)의 PCR 검출 결과를 나타내는 개략도 및 전기영동사진이다. 레인 M: 100 bp 마커; 레인 1: 프라이머 F2, R2를 사용한 대조군(hPDGF); 레인 2: 프라이머 F2, R2를 사용한 형질전환된 DNA;레인 3: 프라이머 F1, R2를 사용한 형질전환된 DNA; 레인 4: 프라이머 F3, R1을 사용한 형질전환된 DNA; 레인 5: 프라이머 F1, R1을 사용한 형질전환된 DNA.

실시예 3: 진공 침투( vacuum infiltration )에 의한 버섯 형질전환

재조합 DNA가 도입된 Agrobacterium을 LB배지에 접종하여 28℃, 120rpm 조건으로 48시간 배양하여 OD₆₀₀ 1.8~2.0까지 증식시킨 후 4600 rpm에서 30분간 원심분리하여 Agrobacterium cell을 준비하였다. 상기 Agrobacterium cell에 동량의 10Mm MgCl₂를 가하여 현탁한 후 다시 4600 rpm에서 30분간 원심분리하였다. 원심분리된 cell에 적정량의 10Mm MgCl₂를 가하여 최종적으로 OD₆₀₀ 1.0으로 조정하였다.

송이농산으로부터 제공받은 새송이버섯은 자실체 부분을 무균적으로 0.5 x 0.5㎝의 크기로 절단하고, 절단한 버섯조직을 OD₆₀₀ 1.0으로 조정하여 상기 Agrobacterium 현탁액에 넣고 진공건조기(vacuum desiccator)에서 서서히 진공상태로 만들어 주면서 Agrobacterium 현탁액이 버섯조직에 충분히 침투되도록 약 15분 동안 진공상태를 유지시켰다. 진공상태가 해제된 후 현탁액 상부에 떠 있던 버섯조직이 밑으로 가라앉는 것을 확인하였다.

버섯조직 표면에 남아있던 과잉의 수분을 와트만(whatman) No.2 여과지를 이용하여 최대한 제거하고 페트리접시에 담아 파라필름으로 밀봉한 후 10일 동안 25℃ 암 조건에서 종배양(subculture) 하였다. 이때 페트리접시 안에 수분이 과잉으로 발생하면 파라필름을 벗겨내어 무균적으로 수분을 제거해준다. 1차 배양이 끝난 버섯조직을 30㎍/㎖ 하이그로마이신과 40㎍/㎖ 세포탁심이 함유된 LB 고체배지에서 형질전환체 성장을 유도하였다.

형질 전환된 균사체를 유도한 결과 배양 10일 후 비형질전환 버섯조직은 균사체 성장이 이루어지지 않았으나, 형질전환된 버섯조직은 선별배지 표면에서 균사체 성장이 이루어짐을 확인할 수 있었다. 또한, 대조군으로 사용된 일반 새송이 버섯 조직은 항생제가 함유된 배지에서 성장이 이루어지지 않음을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 형질전환체 선별-버섯 균사체 오염률과 발생률 확인

진공침투(vacuum infiltration) 후 버섯 조각을 약 10일 정도 25℃에서 암 배양 시켜서 균사체를 활성화시켰고 활성화된 균사체를 갖는 버섯 조각을 각각 50 μg/ml 하이그로마이신과 100 μg/ml 세포탁심이 들어있는 선별 배지(selection medium)에 올려 25℃의 인큐베이터(incubator)에서 약 2주 동안 배양시켰다. 결과를 보면, 하이그로마이신 선별 배지에서는 67개의 버섯 조각 중 29개가 아그로박테리움에 의해 오염되어 43.3%의 오염률을 보였고 하이그로마이신 + 세포탁심 선별 배지 에서는 85개의 버섯 조각 중 30개가 아그로박테리움에 의해 오염되어 35.3%의 오염률을 보였다. 또한 하이그로마이신 선별 배지에서 오염되지 않은 버섯 조각 38개 중 37개의 버섯 조각에서 활성화된 균사체가 자라나서 97.4%의 균사체 형성률을 보였고 하이그로마이신 + 세포탁심 선별 배지에서는 오염되지 않은 버섯 조각 55개 중 55개의 버섯 조각에서 활성화된 균사체가 자라나서 100%의 균사체 형성률을 보였다. 따라서 선별 배지에 하이그로마이신만 넣어서 선별하는 것보다는 하이그로마이신과 세포탁심을 함께 넣어서 만든 선별 배지가 오염률이 보다 적으며 균사체의 활성화에는 지장이 없음을 보여주었다(도 4 참조). 도 4는 진공침투 후 선별 배지 상의 오염률과 균사체 형성률을 나타내는 그라프도이다. A: 오염률; B: 균사체 g여성률(H; 하이그로마이신 첨가 PDA 배지, H+C; 하이그로마이신 + 세포탁심 첨가 PDA 배지).

실시예 5: 형질전환체의 재분화

아그로박테리움 진공 침투 방법으로 형질전환 실시 후 각각의 선별 배지에서 성장한 형질전환 균사체를 하이그로마이신 50㎍/㎖ 이 함유된 LB 고체배지에 재접종하여 최종적으로 형질전환체를 선별하였으며, 순수분리한 형질전환체를 PDA(potato extract 20%, dextrose 2%, agar 1.5%) 배지에 보관하여 사용하였다.

실시예 6: 형질전환 균사체 액체배양

각각의 형질전환 균사체 액체배양은 PDB(potato extract 20%, dextrose 2%)배지를 250㎖ 플라스크에 100㎖씩 분주하여 121℃, 1.5기압에서 20분간 가압살균 후 배지를 조제하였다. 최종적으로 순수분리 선별된 균사체 선단을 백금이로 0.7 ㎝ x 0.7㎝씩 3부분을 절단하여 액체배지에 접종한 후, 진탕 배양기에서 25 ㅁ 1℃, 120 rpm으로 10일간 배양을 실시하였다.

실시예 7: GUS 활성의 조직화학적 분석

GUS 활성의 조직화학적 분석은 Jefferson 등의 방법에 따라서 실시하였다[참조문헌: (Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fusion system, Jefferson, et al., 1987). 아그로박테리움 진공침투( Agrobacterium vacuum infiltration)를 실시한 후 7일 동안 25℃에서 암 배양을 실시한 Agrobacterium infection 버섯 조직의 일부를 임의로 선발하여 5-bromo-4-chloro-3-indoleglucuronide (X-Gluc, Duchefa, Netherland)가 포함된 용액을 넣어 37℃에서 24 시간 반응시킨 다음, 조직에 나타나는 청색의 색으로 GUS 발현 여부를 관찰하였다. negative control로 사용된 비교군은 비형질전환 큰느타리버섯의 조직도 같은 방법에 따라 GUS 활성의 조직화학적 분석을 실시하였다. 관찰 결과, 도 5와 같이 pCAMBIA-1304(hPDGF) 벡터가 도입된 버섯의 조직의 끝부분과 일부분에서 청색을 띠며 발현하는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 비형질전환 새송이버섯의 조직의 색은 기질용액에 전혀 반응하지 않아 버섯 본래의 색을 보였다. 도 5는 진공침투후 형질전환 에세이의 GUS 조직 화학적 분석 결과를 나타내는 사진이다. 1: 야생형; 2?5: 벡터 pCAMBIA-1304를 함유하는 A. tumefaciens GV3101 시료의 형질전환 조직.

실시예 8: 형질전환 균사체의 유전자 도입 확인

버섯에 형질전환된 새로운 재조합 DNA의 삽입여부를 확인하기 위하여 하이그로마이신 항생제 배지에서 재분화시킨 버섯 균사체의 일부를 취하여 PDB 배지에 배양하였다. PDB 배지에서 배양된 균사체를 CTAB 법으로 게놈 DNA를 분리한 후, 각각의 프라이머를 사용하여 PCR을 실시한 후 1% 아가로스 겔에서 전기영동을 실시한 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6은 프라이머를 사용하여 형질전환된 새송이버섯 게놈 DNA로 부터의 hPDGF 검출 결과를 나타내는 사진이다. 레인 M: 100 bp 마커; 레인 1: 양성 대조군(hPDGF); 레인 2: 증류수만 함유; 레인 3: 증류수 + hPDGF 프라이머; 레인 4: 음성 대조군(야생형); 레인 5: 음성 대조군(형질전환체-pCAMBIA-1304 단독); 레인 6?11: 추정 형질전환체 버섯으로부터 단리된 게놈 DNA.

도 6의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 확인한 결과 유전자 증폭이 예상되었던 크기에 해당하는 238 bp(hPDGF)의 밴드가 프라이머에 의해 증폭되었음이 확인되었다. 음성 대조군(negative control)으로 사용된 비교군은 비형질전환 큰느타리버섯 균사체의 게놈 DNA이고 여기에서는 제작한 프라이머에 의해 증폭이 일어나지 않았다. 또한 증류수와 프라이머가 오염되지 않았음을 확인하기 위해 음성 대조군으로 PCR에서 사용했던 증류수와 프라이머만을 넣어서 증폭시켜봤지만 어떠한 밴드도 나타나지 않았다.

실시예 9: 서던 블롯 분석( Southern blot analysis )

먼저, 서던 블롯(southern blot)을 수행하기 위해 Dig DNA Labeling and Detection kit(Roche, Germany)를 사용하였다. 시료는 재조합 새송이 자실체에서 분리한 genomic DNA를 사용하였고 음성 대조군으로 비형질전환 균사체를 사용하였으며, 양성 대조군으로는 형질전환 대장균을 사용하였다. 이 시료와 대조군들은 각각 genomic DNA 단리 키트(식물 DNA 단리 미니 키트, Geneall)와 플라스미드 DNA 단리 키트(QiAprep Spin Miniprep kit, Qiagen)를 사용하여 분리하였다. 각각의 시료를 준비하여 먼저 DNA 제한효소 처리와 DNA 전기영동을 수행하였다. DNA 제한효소 처리는 샘플과 두 개의 대조군을 제한효소 KpnⅠ으로 2시간마다 같은 유닛(unit)을 넣어 37℃에서 총 6시간을 반응시켜 절단된 DNA를 준비하였다. 절단된 DNA는 제한효소의 불활성화 단계를 거쳐, 6ⅹ DNA loading buffer(0.25% Bromophenol blue, 0.25% Xylene cyanol, 15% Ficoll)와 함께 1% 아가로스 겔에 부하하여 전기영동을 수행하였다. 전기영동을 마친 겔은 탈퓨린 용액(0.2 N HCl)을 넣어 15분간 흔들어서 브로모페놀 블루가 노란색으로 변색될 때까지 반응시켰다. 반응 후 증류수로 세척하여 다시 변성 용액(0.5 M NaOH, 1 M NaCl)을 넣어 15분간 흔들어서 브로모페놀 블루가 푸른색으로 다시 변색되는 것을 확인하였고 증류수로 세척하였다. 겔에 다시 중화 용액(0.5 M Tris-HCl, pH 7.5, 3 M NaCl)을 넣어 15분간 흔들어서 반응시켜 준 후, 증류수로 세척하였고 10ⅹ SSC(1.5 M NaCl, 0.15 M 소듐 시트레이트)에 잠시 담가놓았다. 모세관 이동(참조문헌: Capillary transfer, Efficient transfer of large DNA fragments from agarose gels to diazobenzyloxymethyl-paper and rapid hybridization by using dextran sulfate, Wahl et al., 1979; Hydridization of nucleic acids immobilized on solid supports, Meinkoth and Wahl, 1984)를 위해 DNA 이동 탱크(transfer tank)에 이동 용액(transfer solution, 10ⅹSSC)을 적정량 채우고 탱크의 중앙에 3MM 종이, 겔, 나일론 멤브레인(Amersham Biosciences, Bucking-hamshire, UK), 3MM paper를 차례로 올려놓고, 그 위로 멤브레인 부분를 제외한 나머지 전체 부분을 랩으로 감싸서 멤브레인의 부분에서만 흡수작용이 일어나도록 종이 타월을 올렸다. 그 위로 약 500 g 무게의 물건을 올려 흡수과정을 고정시켰다. 이동(transfer)은 10 시간 동안 수행하였으며, 3시간마다 종이타월을 교환해 주었다. 이동이 끝난 후 겔과 멤브레인을 분리하였고 멤브레인을 실온에서 10분간 건조시켰다. 건조된 멤브레인은 80℃의 오븐(oven)에서 2시간 동안 열처리 반응을 시켜준 후, UV 광(light)을 10분간 처리하여 DNA 픽싱(fixing)을 수행하였다. DNA 픽싱을 마친 멤브레인은 키트(kit)의 매뉴얼에 따라 블록킹(blocking) 과정과 프로브(probe)를 이용한 혼성화(hybridization) 과정, 항체 처리과정, 세척 과정과 마지막으로 발색과정을 거쳐 밴드의 발색 여부를 확인하였다. Dig-probe의 합성은 (1) PCR 분석에서 수행한 PCR 프로그램을 이용하였고, PCR을 수행한 pCAMBIA1304-hPDGF-BB plasmid DNA와 dig labeling mix를 kit의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 그 결과, 재조합 새송이 자실체에서 분리한 게놈 DNA에서는 프로브 DNA와 특이적으로 반응한 부위에서 밴드가 4번째 시료인 6 레인(도 7)에서 발현되는 것을 확인하였다. 도 7은 형질도입 버섯으로부터 단리한 게놈 DNA의 서던 블롯 혼성화 결과를 나타내는 전기영동 사진이다. 게놈 DNA는 KpnⅠ으로 분해하고, 분해된 DNA 시료는 Dig-labeled hPDGF-BB 절편으로 프로빙하였다. 레인 1: 비형질전환 음성 대조군, 레인 2: 플라스미드 hPDGF pCAMBIA1304 (hPDGF-BB; 양성 대조군), lane 3-6: 형질도입 버섯의 게놈 DNA

따라서, PCR 분석에서 확인된 재조합 새송이 자실체의 게놈 DNA의 PCR 산물과 서던 블롯(southern blot) 분석에서 프로브 DNA에 특이적으로 발현한 밴드의 결과를 보면, hPDGF-BB 유전자가 정확하게 발현되었음을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과로, 유전자 도입이 성공적으로 이루어진 후에 균사체의 재발생 과정에서 외래의 유전자가 다음 세대에서도 안정적으로 발현되는 것을 확인하였다.

실시예 10: 전체 RNA 분리 및 cDNA 합성과 유전자 도입 확인

전체 RNA를 분리하기 위하여 모든 시약과 초자기구류는 diethylpyrocar-bonate(DEPC)로 처리하였고, RNA는 Trizol reagent를 이용하여 분리하였다. 형질전환균사체 및 비형질전환 균사체 100 mg을 막자사발에 넣고 액체질소를 가하여 급냉시킨 후 막자를 이용하여 곱게 분쇄하였다. 분쇄된 각각의 시료에 Trizol reagent 1 ml을 첨가하여 균질화한 후, 0.2 ml 클로로포름을 혼합하여 실온에서 5분간 반응시킨 다음 12,000 rpm으로 4℃에서 15분간 원심분리하였다. 상층액을 새로운 에펜도르프 튜브에 옮긴 후 0.5 ml의 이소프로판올을 첨가하여 4℃에서 한 시간 반응시켰다. 반응 후 12,000 rpm 으로 4℃에서 10분간 원심분리하여 얻은 펠릿에 75% 에탄올 1 ml을 첨가하여 혼합한 후 7,500 rpm으로 원심분리하여 RNA 펠릿을 얻었다. 이 RNA 펠릿을 클린 벤취에서 건조시켰으며, RNase free-water에 녹여 순도를 측정한 후 -20℃에 보관하여 cDNA 합성에 이용하였다. cDNA 합성을 위해 moloney murin leukemia virus (MMLV) 및 oligo dT primers을 사용하였고 매뉴얼을 따라 cDNA 합성하였다.

형질전환 균사체와 비형질전환 균사체에서 분리한 RNA를 사용하여 cDNA합성에 이용하였다. 게놈 DNA에서 유전자 도입 확인을 위해 사용한 PCR 조건과 방법으로 동일하게 PCR을 수행하였다. 합성된 cDNA를 이용하여 PCR을 실시한 결과 원하는 크기의 유전자가 238 bp의 band로 증폭된 것을 확인하였다(도 8 참조).

도 8은 프라이머를 사용한 형질전환 새송이버섯의 cDNA로 부터의 hPDGF의 PCR 검출을 나타내는 전기영동 사진이다. 레인 M: 100 bp 래더(ladder) 마커; 레인 1: 양성 대조군(hPDGF); 레인 2?6: 형질전환된 새송이버섯 균사체의 cDNA; 레인 7: 음성 대조군(비형질전환된 새송이 버섯 균사체의 cDNA).

실시예 11: 형질전환 균사체의 단백질 분리 및 분석

PDB(Potato Dextrose Broth)에서 키운 버섯 균사체를 여과지에 걸러서 배지를 모두 제거한 뒤 회수한 형질전환 균사체 및 비형질전환 균사체 100 mg을 막자사발에 넣고 액체질소를 가하여 급냉시킨 후 막자를 이용하여 곱게 분쇄하였다. 분쇄된 각각의 시료에 6 M Urea, 50mM Sodium phosphate(pH7.4), 0.3 M Guanidium hydrochloride, 0.1% Triton-X100, 1 mM EDTA lysis buffer에 현탁한 후 4℃에서 5분 동안 잘 녹인 후 12,000 rpm, 30분 동안 원심분리 후 상층액을 회수하였다. 회수된 상층액에서 불순물을 제거하기 위해 10,000 rpm, 4℃, 10분간 원심분리하였고 상층액을 회수한 후 시료로 사용하였다. 융합 단백질을 정제하기 위해 Ni-NTA(nickel nitrilotriacetic acid)을 이용하였다.

(가) 단백질 정량

시료 단백질의 정량은 BCA법으로 정량하였다. BCA 단백질 정량 kit을 이용하였고 A solution과 B solution을 49:1 비율로 잘 섞은 후 시료와 함께 넣어 30분 반응시킨 후 OD₅₆₂에서 측정하였다. 표준단백질은 소 혈청 알부빈(BSA)을 사용하였다. 정량한 결과 추정 형질전환체 시료(p32)의 조 추출물에서 TSP에서 제조합 단백질은 최종적으로 2.32%가 정제되었음을 확인하였다(표 1 참조).

새송이버섯으로부터 정제된 융합 rhPDGF-BB 단백질 수율

정제 단계	시료	조 추출물	재조합 단백질
용적	500 mg	0.4 ml	0.4 ml
총 가용성단백질(mg)	-	89.32 mg	2.07mg
hPDGF-BB(㎍)	-	-	5.18㎍/㎕
TSP 수율(%)	100%	17.87%	2.32%

(나) 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)

단백질 수준에서의 hPDGF의 발현유무를 확인하기 위하여 각각의 항체를 처리하여 분석하였다. 분리된 단백질을 12%의 분리 겔과 스태킹 겔로 이루어진 SDS-PAGE 겔 상에서 전기영동 하였다. SDS-PAGE에서 전기영동된 단백질을 폴리아크릴아미드 겔로부터 PVDF(Poluvinylidene difluoride) 멤브레인으로 이동(transfer)하기 위하여 PVDF 멤브레인을 메탄올에 담가 쉐이커(shaker) 위에 올려놓고 30분 동안 진탕하여 활성화시켰다. 30분 후 이동 완충액(transfer buffer, 0.25 M tris base, 1.92 M glycine, 400 ml methanol/L, pH8.3)에서 5분 동안 반응 후 얼음으로 4℃ 조건을 만들고 이동(transfer) 박스에 완충액을 채운 후 카세트에 차례로 스펀지, 3 MM 종이 2장, PVDF 멤브레인, 겔, 3 MM 종이, 스펀지를 올리고 카세트를 닫은 후 이동(transfer) 박스에 넣고 160 mA로 50분 동안 실시하였다. 이동을 끝낸 멤브레인은 블로킹 완충액(5% 탈지유, TBS-T(20 mM Tris-HCl, pH7.5, 137 mM NaCl, 0.1% Tween 20)에 담가 한 시간 동안 진탕기(shaker) 위에 올려놓고 진탕(shaking)하여 블로킹 반응을 시켜주었다. 한 시간 후 TBS-T buffer로 30초간 5회 세척한 후 10분간 1회 세척하고 1:2000 비율로 TBS-T buffer에 희석한 일차 항체로 실온에서 90분 반응시켰다. 반응 후 동일한 방법으로 세척 후 1:5000의 비율로 TBS-T buffer에 희석한 2차 항체를 실온에서 45분 처리하였다. 양고추냉이 퍼록시다아제 공액(HRP) 2차 항체에 의한 반응을 확인하기 위해 West-zol을 처리한 후 X-ray film에 감광하여 단백질 밴드를 확인하고, 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9는 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타내는 전기영동 사진이다. A. 레인 M: 단백질 크기 마커; 레인 1: 야생형 버섯; 레인 2: 형질전한체-단독 pCAMBIA-1304 벡터. B. 레인 M: 단백질 크기 마커; 레인 1: 야생형 버섯; 레인 2?6: 추정 형질전환체(p32, p33, p34, p35, p36). C. 레인 M: 단백질 크기 마커; 레인 1: 야생형 버섯; 레인 2: 형질전환체-단독 pCAMBIA-1304 벡터; 레인 3: 추정 형질전환체(p32). D. 레인 M: 단백질 크기 마커; 레인 1: 야생형 버섯; 레인 2: 형질전환체-단독 pCAMBIA-1304 벡터; 레인 3: 대장균에서 형질전환체의 융합 단백질; 레인 4: 추정 형질전환체(p32).

SDS-PAGE 전기영동을 수행한 결과 (a)와 (b)에서 보는 바와 같이 형질전환 버섯 균사체와 비형질전환 버섯 균사체, 그리고 벡터만을 형질전환시킨 형질전환 버섯의 음성 대조군 균사체의 단백질 양상을 확인할 수 있었다. SDS-PAGE 겔 상에서는 차이가 나타나지 않았고 버섯 균사체의 단백질 전개양상만을 확인하였다. 단백질이 정확하게 발현되었는지 확인하기 위해 Western blot을 수행한 결과 (c)와 (d)에서 보는 바와 같이 약 30 kDa에서 약 32 kDa에 해당되는 예상 단백질 band를 확인하였고 단백질이 발현됨을 확인하였다(도 9 참조).

(다) 융합 단백질 정제 및 분석

융합 단백질을 정제하기 위해 His-taq이 있는 발현 벡터에서 발현되는 단백질만을 선택적으로 잡아내는 레진(resin), Ni-NTA(nickel nitrilotriacetic acid)을 이용해서 융합 단백질을 정제하였다. PDB에서 키운 버섯 균사체를 여과지에 걸러서 배지를 모두 제거한 뒤 회수한 형질전환 균사체 및 비형질전환 균사체 500 mg을 막자사발에 넣고 액체질소를 가하여 급냉시킨 후 막자를 이용하여 곱게 분쇄하였다. 분쇄된 시료에 용해 완충액(8 M urea, 0.1 M NaH₂PO₄, 0.01 M Tris-Cl, pH 8.0) 400 μl을 넣고 잘 섞은 후 5분동안 4℃에 방치하였다. 그리고 12,000 rpm으로 30분 동안 원심분리한 후 상층액 전부를 미리 차갑게 해두고 용해 완충액(8 M urea, 0.1 M NaH₂PO₄, 0.01 M Tris-Cl, pH 8.0)로 평행화 시켜놓은 Ni-NTA 컬럼에 넣은 후 4℃에서 2분 동안 2000 rpm 으로 원심분리하였다. 원심분리로 받은 단백질은 4℃에 보관하고 컬럼에 세척 완충액(8 M urea, 0.1 M NaH₂PO₄, 0.01 M Tris-Cl, pH 6.3) 400 μl을 넣고 4℃에서 2분 동안 2,000 rpm으로 원심분리하여 세척해주었다. 그리고 이 세척을 한 번 더 해주고 난 후 용출 완충액(8 M urea, 0.1 M NaH₂PO₄, 0.01 M Tris-Cl, pH 4.5) 200 μl을 넣고 4℃에서 2분 동안 2,000 rpm으로 원심분리하여 용출 하였다. 이렇게 정제된 융합 단백질은 BCA법으로 정량하였고 각 단백질 시료의 농도는 13.45 μg/μl, 12.89 μg/μl, 6.11 μg/μl, 7.98 μg/l, 9.78 μg/μl임을 확인하였고 TSP에 각각 4.54%, 5.14%, 3.85%, 4.90%, 4.79%의 Recombinant hPDGF-BB가 있음을 확인하였다(표 2 및 도 10 참조).

새송이버섯으로부터 정제된 융합 rhPDGF-BB 단백질의 생산

시료	TSP(mg/ml)	재조합 hPDGF-BB
		μg/μl	백분률(%)
p32	296.03	13.45	4.54
p33	250.76	12.89	5.14
p34	158.82	6.11	3.85
p35	162.79	7.98	4.90
p36	204.37	9.78	4.79
야생형	136.13	-	-

도 10은 Ni-스핀 컬럼 및 웨스턴 블롯 분석; 변성 조건에 따른 단백질 정제 결과를 나타내는 사진이다. A 레인 1: 단백질 크기 마커; 레인 2: 6 x his-tagged 융합 단백질 추출물; 레인 3: 야생형 버섯; 레인 4: 6 x his-tagged 융합 단백질, B 레인 2: 6 x his-tagged 융합 단백질 추출물; 레인 3: 야생형 버섯; 레인 4: 6 x his-tagged 융합 단백질.

(라) MALDI-TOF 질량 분광광도계를 이용한 재조합 단백질의 질량분석

Ni-NTA(nickel nitrilotriacetic acid)을 이용해서 단백질을 정제한 후, 진공 소형원심분리기로 튜브 안에서 단백질을 말리는 과정을 수행하였다. 이 튜브 안의 융합 단백질의 정확한 질량을 확인하기 위해 voyager Biospectrometry Workstation (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 질량을 측정하였다. 그 결과, 32,329 Da 의 질량을 얻을 수 있었다(도 11 참조).

도 11은 정제된 rhPDGF-BB의 MALDI-TOF 질량 분광광도계 분석 결과를 나타내는 그라프도이다. 얻어진 질량은 32,329 Da이었다. 얻어진 펩티드들을 추출하고 진공 원심분리기 내에서 건조시켰다. 시료들은 0.1% (v/v) 트리플루오로아세트산 (TFA)을 첨가하여 산성화시키고 실온에서 수분 동안 방치하여 증발을 통하여 물방울 용적을 줄였다. 기질 (1% α-cyano-4-hydroxycinnamic acid in 1:1 (v/v) H2O/ACN solution containing 0.1% (v/v) TFA)을 첨가하고, 시료를 실온에서 건조시켰다. 모든 측정은 Voyager Biospectrometry Workstation (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 matrix-assisted laser/desorption ionization combined with time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) 상에서 대한민국 전주 소재의 한국기초과학연구소에서 수행하였다.

(마) 재조합 단백질의 Bioactivity assay

형질전환 균사체에서 native condition으로 얻은 총 단백질의 biological activity 측정을 위해 쥐의 섬유모세포인 NIH-3T3 세포(ATCC, Rockville, MD, U.S.A)를 이용하였고, karumuri et al.,(2007) 방법(Simple, rapid, high-purity preparation of recombinant human platelet-derived growth factor-BB, Nagaraju N. Karumuri, et. al., Biotechnol Lett, 2007)에 따라 수행하였다. 세포는 10% FBS(fetal bovine serum), penicillin(100 units/ml), streptomycin(100 μl/ml)을 포함한 DMEM 배지(GIBCO, Gaithersburg, U.S.A)에서 37℃와 5% CO₂의 조건으로 배양하였고, 2일마다 한번씩 새로운 배지로 갈아주었다. 세포 생장은 BrdU(bromodeoxy-uridine) cell proliferation ELISA kit(Roche Diagnostics, Germany)로 측정하여 분석하였다. Bioassay를 위해 세포는 1 ⅹ 10⁴cell/well의 밀도로 96-well plate에 올려 10% FBS를 포함한 DMEM 배지를 첨가하여 배양하였다. 세포를 FBS가 없는 DMEM 배지에서 48시간 동안 반응시킨 후, 각각 0.1 ng/ml, 0.5 ng/ml, 1 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml의 rhPDGF-BB 농도로 세포에 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양 후, 세포에 BrdU를 37℃에서 2시간 동안 처리하여 표지하였다. 표지된 세포는 kit의 Fixdenat 용액을 사용하여 고정시켰고, peroxidase conjugated anti-BrdU antibody을 첨가하여 배양하였다. 여기에 3, 3', 5, 5',-tetramethylbenzidine을 첨가한 후, VERSAmax absorbance microplate reader(Molecular Devices, U.S.A)를 이용하여 OD₃₇₀-OD₄₉₂으로 측정한 정량값을 구하였다. 양성대조군으로 rhPDGF-BB standard form을 같은 방법으로 세포에 처리하여 비교하였다. 그 결과, 도 12와 같은 그래프의 결과를 얻었으며 각 농도에서 세포의 성장이 증가됨을 확인하였고 세포의 증가율이 50% 가 되는 rhPDGF-BB의 ED₅₀값이 8.49 ng/ml 임을 확인하였다. 이로써 형질전환 균사체에서 얻은 recombinant crude 단백질 내 재조합 단백질 hPDGF-BB가 생물학적 활성을 갖고 있음을 확인할 수 있었다. 도 12는 정제 및 표준 rhPDGF-BB의 생물학적 활성을 나타내는 그라프도이다. 데이터는 3회의 독립적인 측정값의 표준ㅁSD으로 나타냈다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 의하여 개발된 식물형질전환 방법을 통하여 생산되는 인간 혈소판유래 성장인자를 기능성식품 원료에 응용하여 "Food as Medicine" 의 개념으로 개발한다면 높은 부가가치를 창출할 수 있을 것으로 보여진다. 그리고 향 후 지속적인 연구를 통하여 버섯에서 보다 자연 원형상태에 가까우면서 생리활성이 유지된 상태로 재조합 성장인자를 생산하며 그 생산성을 극대화 하기 위한 공동의 노력이 생리학자, 분자 유전학자, 그리고 발효기술자간의 연계적 연구를 통해 계속적으로 유지된다면, 우리의 새송이 버섯이 재조합 의약품 생산을 위한 숙주 시스템으로서의 새로운 모델이 될 것으로 사료된다.

hPDGF: 인간 혈소판 유래 성장인자

<110> Chosun University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Process for producing hPDGF-BB using Pleurotus eryngii <130> pkr-0246 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gttccctgac cattgctgag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ggcttcttcc gcacaatctc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cttccaaaac ctgcttcctt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cccaggcttt acactttagt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cccaggcttt acactttagt 20 <210> 6 <211> 231 <212> PRT <213> human platelet derived growth factor <400> 6 Met Asn Arg Cys Trp Ala Leu Phe Leu Ser Leu Cys Cys Tyr Leu Arg 1 5 10 15 Leu Val Ser Ala Glu Gly Asp Pro Ile Pro Glu Glu Leu Tyr Glu Met 20 25 30 Leu Ser Asp His Ser Ile Arg Ser Phe Asp Asp Leu Gln Arg Leu Leu 35 40 45 His Gly Asp Pro Gly Glu Glu Asp Gly Ala Glu Leu Asp Leu Asn Met 50 55 60 Thr Arg Ser His Ser Gly Gly Glu Leu Glu Ser Leu Ala Arg Gly Arg 65 70 75 80 Arg Ser Leu Gly Ser Leu Thr Ile Ala Glu Pro Ala Met Ile Ala Glu 85 90 95 Cys Lys Thr Arg Thr Glu Val Phe Glu Ile Ser Arg Arg Leu Ile Asp 100 105 110 Arg Thr Asn Ala Asn Phe Leu Val Trp Pro Pro Cys Val Glu Val Gln 115 120 125 Arg Cys Ser Gly Cys Cys Asn Asn Arg Asn Val Gln Cys Arg Pro Thr 130 135 140 Gln Val Gln Leu Arg Pro Val Gln Val Arg Lys Ile Glu Ile Val Arg 145 150 155 160 Lys Lys Pro Ile Phe Lys Lys Ala Thr Val Thr Leu Glu Asp His Leu 165 170 175 Ala Cys Lys Cys Glu Thr Val Ala Ala Ala Arg Pro Val Thr Arg Ser 180 185 190 Pro Gly Gly Ser Gln Glu Gln Arg Ala Lys Thr Pro Gln Thr Arg Val 195 200 205 Thr Ile Arg Thr Val Arg Val Arg Arg Pro Pro Lys Gly Lys His Arg 210 215 220 Lys Phe Lys His Thr His Asp 225 230

Claims (1)

1. a) 인간 혈소판 유래 성장인자의 유전자를 함유하는 벡터를 구축하는 단계,
   b) 아그로박테리움 진공 침투(Agrobacterium vacuum infiltration) 방법을 이용하여 구축된 분비 벡터를 새송이버섯(Pleurotus eryngii)에 형질전환시키는 단계,
   c) 얻어진 형질전환체의 유전자 발현 여부를 확인하기 위하여 각각의 게놈(genomic) DNA를 분리하여 프라이머(primer)를 이용한 PCR을 실시하여 재조합 단백질의 형질전환균사체를 확인하거나 또는 서던 블롯(southern blot)과 노던 블롯(northern blot)을 실시하여 형질전환체의 유전자 발현여부를 확인하는 단계, 및
   d) 최종적으로 형질전환균사체로부터 재조합 단백질을 분리하는 단계
   를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 혈소판 유래 성장인자의 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환된 새송이버섯(Pleurotus eryngii)으로부터 인간 혈소판 유래 성장인자의 생산 방법.

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