CN116333070A - 西藏灵芝免疫调节蛋白的制备方法及其应用 - Google Patents

西藏灵芝免疫调节蛋白的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

一种西藏灵芝免疫调节蛋白的制备方法及其应用，通过克隆得到西藏灵芝免疫调节蛋白基因后，通过基因重组构建重组真核表达载体pPIC9K::FIP‑gle‑His并线性化，再将重组真核表达载体转化到毕赤酵母GS115中形成毕赤酵母工程菌株，经发酵、表达和纯化得到西藏灵芝免疫调节蛋白FIP‑gle。本发明利用西藏灵芝免疫调节蛋白FIP‑gle基因序列，并通过酵母表达实现rFIP‑gle蛋白的系统制备，并将重组蛋白rFIP‑gle应用于影响巨噬细胞RAW 264.7分泌细胞因子TNF‑α。

Description

西藏灵芝免疫调节蛋白的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及的是一种生物工程领域的技术，具体是一种西藏灵芝免疫调节蛋白FIP-gle的制备方法及其应用。
背景技术
西藏灵芝(Ganoderma leucocontextum)俗称“白肉灵芝”、“藏灵芝”，在2013年对西藏大型真菌的调查中人们发现其与世界上任何已知的灵芝分类单元都不同，2015年发表鉴定其为新的灵芝种[LI TH,HU HP,DENG WQ,etal.Ganoderma leucocontextum,a newmember ofthe G.lucidum complexfrom southwestern China[J].Mycoscience,2015,56(1):81-5]，是近年来发现并报道的一种品质上佳的新型灵芝种质资源。近些年来，许多研究聚焦于一些从西藏白灵芝中分离而得的生物活性成分，诸如多糖类[GAO X,QI J,HO C-T,et al.Structural characterization and immunomodulatory activity of a water-soluble polysaccharide from Ganoderma leucocontextumfruitingbodies.Carbohydrate Polymers,2020,249:116874]、灵芝醇类[LI X,XIE Y,PENGJ,etal.Ganoderiol F purified from Ganoderma leucocontextum retards cellcycle progression byinhibiting CDK4/CDK6.Cell Cycle,2019,18(21):3030-43.]和三萜化合物等[CHEN H,ZHANG J,REN J,etal.Triterpenes and meroterpenes withneuroprotective effects from Ganoderma leucocontextum.Chemistry&Biodiversity,2018,15(5):e1700567]。对现有已经分离的活性成分的药理学研究表明：这些活性成分其具有抗肿瘤、抗氧化、抗衰老等功效，在疾病治疗和保健养生领域具有潜在的应用价值[CHUAN X,CHENG C,ZU-QIN C,etal.Potentiation of Neuritogenic Activity ofGanoderma leucocontextum on Rat Pheochromocytoma Cells[J].NATURAL PRODUCTRESEARCH AND DEVELOPMENT,2016,28(7):1135]；而对该灵芝的蛋白类成分的研究却未见相关报道。蛋白类成分是灵芝中重要的组成成分和活性成分之一，大多数已报道的从灵芝或其它食药用真菌中获得的真菌免疫调节蛋白(Fungal immunomodulatory proteins，以下简称FIPs)大部分均具有潜在的生物学活性和药理活性，尤其是在免疫调节和抗肿瘤活性方面。现有研究表明FIPs发挥抗肿瘤活性是通过两种方式进行的：一是对肿瘤细胞有着直接的细胞毒性，能杀死或抑制其生长；二是FIPs通过激发宿主的免疫调节反应(例如诱导细胞凋亡)间接发挥抗肿瘤活性[Li QZ,ZHENG YZ,ZHOU XW.Fungal immunomod ulatoryproteins:characteristic,potential antitumor activities and their molecularmechanisms.Drug Discovery Today,2019,24(1):307-314]。例如重组黑灵芝真菌免疫调节蛋白(rFIP-gat)在一定剂量下能降低MDA-MB-231乳腺癌细胞活力，诱导其凋亡[XU H,KONG Y-Y,CHEN X,et al.Recombinant FIP-gat,a Fungal Immunomodulatory Proteinfrom Ganoderma atrum,Induces Growth Inhibition and Cell Death in BreastCancer Cells[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2016,64(13):2690-8.]；而重组灵芝免疫调节蛋白(rFIP-glu,rFIP-SN,rFIP-gat)对一些胃癌细胞株表现出了不同的抑制作用。因此，不同的FIPs对同一肿瘤株的作用，以及同一FIPs对不同肿瘤细胞株的作用，还有大量人们未知的内容需要进一步探索和发现(许燕,胡明慧,高蓓蓉,周选围.灵芝真菌免疫调节蛋白在体外对不同胃癌细胞的抑制作用.药学实践杂志,2016,34(3):223-226)。
西藏高原的自然环境独特，由高寒灌木丛、高原草地和耐寒森林组成的生态系统，使得食用和药用真菌在生物学特性及子实体品质等方面和低海拔地区栽培的品种相比发生了巨大的变化。在外形方面，西藏灵芝有着紫红色至黑色的菌毛，菌盖白色或奶油白色，呈肾形、半圆形或扇形，表面有漆样光泽，具同心环纹，常具浅放射状皱纹，柄厚[LI TH,HUHP,DENG WQ,etal.Ganoderma leucocontextum,a new member of the G.lucidumcomplex from southwestern China.Mycoscience,2015,56(1):81-5]；其形态特征虽然与目前广泛栽培的赤灵芝(G.lucidum)十分相似，但他们在生物学特性存在显著的不同，例如，西藏灵芝的菌丝体表现出耐酸特性；菌丝体和子实体的生长温度均低于赤灵芝(G.lucidum)，相较于赤灵芝(G.lucidium)、紫灵芝(G.sinensis)等一般灵芝而言，西藏灵芝子实体最适的生长发育温度低，在20℃～25℃之间；总之，在对西藏灵芝的研究和利用中，除了灵芝中具有的一些基本的化学成分外，其蕴含的基因资源和应用并不清楚。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种西藏灵芝免疫调节蛋白的制备方法及其应用，利用西藏灵芝免疫调节蛋白(Fungal immunomodulatory protein fromGanoderma leucocontextum，FIP-gle)基因序列，并通过酵母表达实现rFIP-gle蛋白的系统制备，并将重组蛋白rFIP-gle应用于影响巨噬细胞RAW 264.7分泌细胞因子TNF-α。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一种西藏灵芝免疫调节蛋白的制备方法，通过克隆得到西藏灵芝免疫调节蛋白基因后，通过基因重组构建重组真核表达载体pPIC9K::FIP-gle-His并线性化，再将重组真核表达载体转化到毕赤酵母GS115中形成毕赤酵母工程菌株，经发酵、表达和纯化得到西藏灵芝免疫调节蛋白FIP-gle。
所述的西藏灵芝免疫调节蛋白基因，其核苷酸序列FIP-gle如SEQ ID NO.1所示。
所述的重组真核表达载体pPIC9K::FIP-gle-His，通过将FIP-gle基因序列连接于pPIC9K真核表达载体得到。
所述的发酵表达，通过将重组真核表达载体pPIC9K::FIP-gle-His转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，经酶切和酵母转化后将酵母转化子单克隆至液体培养基后发酵得到蛋白，再经过纯化处理得到。
所述的液体培养基，其配方为：1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、1％生物素、1％甲醇、0.1mol/L磷酸缓冲液。
所述的发酵，优选为发酵温度为30℃，诱导剂为1％甲发酵液体积的纯甲醇(每24h)，诱导时间为96h。
本发明涉及上述方法制备得到的西藏灵芝免疫调节重组蛋白的应用，具体为以2mg/L～16mg/L的有效浓度制备抗癌药剂，以促进巨噬细胞RAW 264.7分泌细胞因子TNF-α。
所述的有效浓度，优选为4mg/L。
技术效果
本发明通过同源克隆技术获得西藏灵芝免疫调节蛋白的编码基因FIP-gle，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；并构建得到含有FIP-gle基因的重组真核表达载体pPIC9K::FIP-gle-His；通过将上述载体转化到毕赤酵母中形成毕赤酵母工程菌株，经诱导发酵表达重组蛋白，再经分离纯化得到重组西藏灵芝免疫调节蛋白，即提供了一种西藏灵芝免疫调节蛋白的高效制备方法。
本发明在2mg/L～16mg/L范围内能够促进巨噬细胞RAW 264.7分泌细胞因子TNF-α，并且在4mg/L FIP-gle处理下，TNF-α的相对表达量最高，该结果暗示rFIP-gle在促进免疫制剂的开发中有潜在的应用价值。
附图说明
图1为西藏灵芝免疫调节蛋白基因FIP-gle克隆的PCR鉴定电泳图；
图中：泳道M：DNA Marker DL 2,000；泳道1～4：西藏灵芝免疫调节蛋白FIP-gle基因克隆的检测结果；
图2为pPIC9K::FIP-gle-His大肠杆菌转化子菌落PCR检测电泳图；
图中：泳道M：DNA Marker DL 2,000；泳道1：含有重组质粒pPIC9K::FIP-gle-His大肠杆菌转化子的检测结果；
图3为pPIC9K::FIP-gle-His转化酵母质粒酶切电泳图；
图中：泳道M：DNA Marker DL 15,000；泳道1：重组质粒pPIC9K::FIP-gle-His酶切前；泳道2～3：重组质粒pPIC9K::FIP-gle-His酶切后；
图4为毕赤酵母转化子菌落PCR鉴定示意图；
图中：泳道M：DNA Marker DL 2,000；泳道1～3：含有重组质粒pPIC9K::FIP-gle-His酵母转化子的检测结果；泳道0：阴性对照；
图5为FIP-gle毕赤酵母真核表达SDS-PAGE与Western blotting鉴定示意图；
图中：A毕赤酵母转化子发酵液的SDS-PAGE检测；B毕赤酵母转化子发酵液的Western blotting检测；泳道M：蛋白质标准分子量；泳道1～2：菌株所产FIP-gle；
图6为FIP-gle对巨噬细胞处理后的TNF-αmRNA相对表达量。
具体实施方式
本实施例包括以下步骤：
步骤1、克隆得到西藏灵芝免疫调节蛋白编码基因(FIP-gle)，具体包括：
1.1)基因组DNA的提取：本方法结合液氮研磨与酵母组DNA抽提试剂盒：取发酵好的西藏灵芝菌丝球置于洁净的100目细孔筛网上，蒸馏水冲洗三次后置于洁净陶瓷研钵中，加入液氮后迅速研磨至粉末状后利用酵母基因组DNA提取试剂盒(购于天根生化科技有限公司)提取DNA。
1.2)基因克隆：本方法基于灵芝免疫调节蛋白序列具有较高的保守性，根据现有的灵芝免疫调节蛋白LZ-8基因序列设计如SEQ ID NO.2和如SEQ ID NO.3所示的引物对，使用PCR扩增法从上述提取到的西藏灵芝基因组DNA克隆出FIP-gle基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。PCR反应体系和反应程序如表1和表2。
所述的引物对具体为：
FIP-gle_F：TACGTAGAATTCatgtccgacactgccttgatcttcag，其中：大写部分为EcoRⅠ酶切识别位点；
FIP-gle_R：atgatgGGGCCCgttccactgggcgatgatgaagtcg，其中：大写部分为ApaⅠ酶切识别位点。
表1 FIP-gle基因克隆PCR反应体系
Figure BDA0003920019000000041
表2 FIP-gle基因克隆PCR反应程序
Figure BDA0003920019000000042
Figure BDA0003920019000000051
PCR产物在1×TAE电泳缓冲液中经1％琼脂糖凝胶(已加入核酸染料)电泳分离后，在凝胶电泳成像系统进行紫外拍照，结果如图1所示。图1表明，2号泳道与4号泳道中扩增出的条带大小在250bp至500bp之间，初步判断成功从西藏灵芝总DNA中克隆出了西藏灵芝免疫调节蛋白基因FIP-gle。
经测序，基因大小约为333bp，设计的引物会在克隆出的基因条带两端带上额外的24bp长度，因此实际克隆出的片段大小约为350bp(如SEQ ID NO.1)。
步骤2)、利用毕赤酵母表达系统生产西藏灵芝免疫调节蛋白FIP-gle，具体包括：
2.1)FIP-gle酵母转化子的获得：利用限制性内切酶EcoR I和Apa I将质粒pPIC9K::X-His与含有FIP-gle基因的质粒T::FIP-gle于37℃酶切2h。将pPIC9K::His与FIP-gle连接，构建重组质粒pPIC9K::FIP-gle-His，并转入大肠杆菌DH5α感受态细胞。
经菌落PCR鉴定并送测序，如图2所示。而后进行重组真核表达载体线性化检测，将重组质粒pPIC9K::FIP-gle-His酶切前后作为对照，进行PCR鉴定并送测序，如图3所示。
提取质粒pPIC9K::FIP-gle-His，利用限制性内切酶Sac I于37℃酶切2h后，回收线性化的载体，并参照Pichia Expression Kit中提供的转化方法转化酵母GS115。转化后挑取酵母转化子进行PCR鉴定并送测序检验，结果如图4所示。
2.2)FIP-gle的表达、纯化和鉴定：挑取酵母转化子单克隆至BMGY液体培养基，于30℃以220rpm振荡培养至OD600为2～6；于室温以2,500×g离心5min以收集细胞，去上清，并将细胞重悬于BMMY液体培养基至OD600为1.0；每天向BMMY液体培养基中添加纯MeOH至终浓度为1％(V/V)；取出1mL培养基至1.5mL离心管用于SDS-PAGE和Western blotting检测。
将剩余培养基于室温以2,500×g离心5min以收集上清，并将上清经3.5kD透析袋透析，将透析袋内液冷冻干燥后用Lysis Buffer溶解；用5倍体积的Lysis Buffer平衡His60 Ni Superflow Resin柱；装载Lysis Buffer溶解的物质。用10倍体积Wash Buffer洗涤，2倍体积Elution Buffer洗脱并收集洗脱液后，再用5倍体积Elution Buffer清洗His60Ni Superflow Resin柱。洗脱液经3.5kD透析袋透析，将透析袋内液冷冻干燥，溶于PBS，备用。待测样品分别进行SDS-PAGE与Western blotting检测，鉴定FIP-gle蛋白，如图5所示。
将pPIC9K::FIP-gle-His大肠杆菌转化子经菌落PCR检测，电泳结果如图2所示，泳道1中扩增出了分子量在250-500bp之间的阳性条带，表明成功构建pPIC9K::FIP-gle-His重组真核表达载体。
对pPIC9K::FIP-gle-His转化酵母的质粒酶切电泳结果如图3所示，泳道1为未经酶切的环状质粒作为对照，泳道2、3中，经过酶切的重组真核表达载体移动速度较慢，与预期相符，表明已完成线性化，可以进行酵母转化。
对毕赤酵母转化子DNA进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图4所示，酵母转化子在800-900bp附近有明亮条带，可判断重组真核表达载体已转入酵母中，与预期相符。
通过SDS-PAGE及Western blotting检测证明酵母转化子的表达蛋白是正确的，结果如图5所示。
步骤3、应用西藏灵芝免疫调节蛋白FIP-gle调节巨噬细胞的细胞因子TNF-α分泌，具体包括：
3.1)细胞的处理：体外培养巨噬细胞24h，至细胞全部贴壁并处于对数生长期时使用2mg/L、4mg/L、8mg/L、16mg/L的rFIP-gle分别添加至细胞培养液，使用相同体积的PBS作为空白对照，使用4mg/L ConA作为阳性对照。
所述的体外培养是指：巨噬细胞RAW 264.7培养于含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养液(含有1％必需氨基酸以及1％L-谷氨酰胺)的T-25曲颈培养瓶中，将培养瓶放入细胞培养箱中培养，调整培养箱的相对湿度90％，CO2浓度为5％，温度设为37℃。优选地，巨噬细胞在消化吹打过程中应小心操作，尽量避免产生气泡，否则会因气泡破碎时产生的剪刀力伤害细胞，影响细胞正常计数，增加实验误差。
3.2)提取总RNA、反转录获得cDNA：按照TaKaRa MiniBEST Universal RNAExtraction Kit试剂盒说明书提取巨噬细胞RAW264.7总RNA。利用Fast Quant cDNA第一链合成预混Mix合成第一链cDNA，建立20μL的cDNA反应体系，5×FQ-RT Super Mix 4μL，RNA 1μg，RNase-Free ddH2O补至20μL；反应程序，37℃20min，85℃10s，10℃pause。
3.3)qRT-PCR检测TNF-α的mRNA表达：分别取4μg/mL浓度rFIP-gle以及等量的ConA孵育巨噬细胞24h后取细胞，ConA处理作为阳性对照，并以加入等量PBS的细胞处理作为阴性对照进行后续定量试验。于超净工作台吸掉培养液，加PBS清洗，取出于通风橱下加碱裂解液，枪头吹打并收在离心管中，提取RNA；使用管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参，对加入到逆转录cDNA反应中的RNA进行均一处理，对逆转录产物进行Real-timePCR，引物序列为：TNF-αF:5’-AAGGGGGACCAACTCAGC-3’；TNF-αR:5’-CGGACTCCGCAAAGTCTAAG-3’。在96孔板中加入20μL反应体系，qRT-PCR扩增条件为95℃30s，循环1次；95℃10s，55℃30s，72℃30s，循环40次。
如图6所示，为qRT-PCR评价不同浓度处理中巨噬细胞的细胞因子TNF-α的相对表达量的结果。
与现有技术相比，本方法通过基因工程技术手段，构建含有西藏灵芝免疫调节蛋白FIP-gle基因的重组表达载体，并将FIP-gle在毕赤酵母表达系统中成功表达并纯化，得到了重组FIP-gle。将纯化的FIP-gle处理巨噬细胞RAW 264.7，结果显示FIP-gle在2mg/L～16mg/L范围内能够促进巨噬细胞RAW264.7分泌细胞因子TNF-α，并且在4mg/L FIP-gle处理下，TNF-α的相对表达量最高。
上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。

Claims (7)

1.一种西藏灵芝免疫调节蛋白的制备方法，其特征在于，通过克隆得到西藏灵芝免疫调节蛋白基因后，通过基因重组构建重组真核表达载体pPIC9K::FIP-gle-His并线性化，再将重组真核表达载体转化到毕赤酵母GS115中形成毕赤酵母工程菌株，经发酵、表达和纯化得到西藏灵芝免疫调节蛋白FIP-gle；
所述的西藏灵芝免疫调节蛋白基因，其核苷酸序列FIP-gle如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的西藏灵芝免疫调节蛋白的制备方法，其特征是，所述的重组真核表达载体pPIC9K::FIP-gle-His，通过将FIP-gle基因序列连接于pPIC9K真核表达载体得到。
3.根据权利要求1所述的西藏灵芝免疫调节蛋白的制备方法，其特征是，所述的发酵表达，通过将重组真核表达载体pPIC9K::FIP-gle-His转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，经酶切和酵母转化后将酵母转化子单克隆至液体培养基后发酵得到蛋白，再经过纯化处理得到。
4.根据权利要求3所述的西藏灵芝免疫调节蛋白的制备方法，其特征是，所述的液体培养基，其配方为：1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、1％生物素、1％甲醇、0.1mol/L磷酸缓冲液。
5.根据权利要求1或3所述的西藏灵芝免疫调节蛋白的制备方法，其特征是，所述的发酵，发酵温度为30℃，诱导剂为1％甲发酵液体积的纯甲醇(每24h)，诱导时间为96h。
6.一种根据权利要求1-5中任一所述方法制备得到的西藏灵芝免疫调节重组蛋白的应用，其特征在于，以2mg/L～16mg/L的有效浓度制备抗癌药剂，以促进巨噬细胞RAW 264.7分泌细胞因子TNF-α。
7.根据权利要求6所述的西藏灵芝免疫调节重组蛋白的应用，其特征是，所述的有效浓度为4mg/L。
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