KR20160072448A - 새송이버섯의 라카아제 프로모터를 함유하는 형질전환용 분비벡터를 이용한 인간 성장 호르몬 단백질 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 새송이버섯 형질전환용 분비 벡터 및 이를 이용한 인간 성장 호르몬 단백질 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 새송이버섯으로 부터 라카아제 프로모터 및 신호서열 유전자를 분리하여 버섯 형질전환에 적합한 발현 컨스트럭트를 포함하는 분비 벡터 및 이를 이용한 형질전환 버섯으로부터 성장 호르몬 단백질 등의 다양한 목적 단백질을 성공적으로 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 재조합 발현 벡터는 다양한 산업적 유용 단백질을 버섯, 특히 새송이 버섯에서 대량생산 시스템으로서 활용에 기여할 수 있다.
Description
본 발명은 새송이버섯 형질전환용 재조합 벡터 및 이를 이용한 목적 단백질 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 새송이버섯으로 부터 분리한 라카아제(laccase) 프로모터 및 신호서열 유전자를 이용한 분비 벡터로 형질전환된 새송이 버섯으로부터 재조합 인간 성장 호르몬 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
유용 단백질 소재는 인체 치료용뿐만 아니라 산업용으로도 사용함으로써 그 활용 폭이 점점 확대되고 있어, 전 세계적으로 그 중요성이 부각되고 있다. 그러나 이러한 유용 단백질들은, 특히 동물 유래의 단백질의 경우 생체에서 미량으로 만들어지기 때문에 치료 목적으로 단백질을 사용하기 위해서는 대량 생산이 필요할 뿐만 아니라, 혈액에서 분리하는 단백질의 경우에는 바이러스 등의 감염 위험성, 잠재적인 암 유발인자의 잔류 가능성 등과 같은 심각한 문제점을 가지고 있다. 상기의 여러 가지 문제점을 해결하기 위하여 유용 단백질의 유전자를 미생물 등의 단백질 발현 숙주 세포에서 대량으로 생산하는 유전자 재조합 기술을 이용함으로써 해결할 수가 있다. 유전자 재조합 기술은 산업적, 의학적으로 중요한 기능을 갖는 단백질(효소, 호르몬, 성장인자 등)을 미생물, 효모 등의 세포에 해당 유전자를 도입하여 목적하는 단백질을 합성하도록 하는 기술로서 생체 유래 생리 활성 단백질의 대량생산이 가능하게 하는 기술이다. 재조합 단백질 제품으로 1982년 Genentech 사가 대장균에서 생산한 사람 인슐린이 FDA의 승인받아 최초로 판매된 이래로, 산업자원부의 산업기술개발 사업보고서에 의하면 단백질 제품은 2005년 기준 약 130여 종의 단백질 제품이 판매되고 있으며, 세계 시장 규모는 약 500억 달러에서, 2011년에는 1,100억 달러에 이를 것으로 예측되고 있는 고부가가치의 산업으로 전 세계적으로 100개 이상의 다국적기업이 참여하고 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 유전자 재조합 기술을 이용한 단백질 생산은 단백질 시장에 매우 빠른 속도로 확장되고 있다. 재조합 단백질은 사용 목적, 단백질의 종류 및 생산 규모에 따라 여러 종류의 발현시스템을 사용하여 생산되고 있으며 대표적으로 많이 쓰이는 세포는 대장균이나 효모와 같은 미생물을 이용하거나 곤충세포, 동물세포, 식물세포를 이용하고 있다. 특히, 대장균을 이용한 단백질 발현은 유전자 조작이 쉽고, 균체의 성장 속도가 빠르며, 배양이 용이하고, 비교적 많은 양으로 생산하여 경제적인 방법으로 단백질 합성이 가능하다. 그러나 당화 단백질(glycoprotein)과 같은 진핵세포 유래의 단백질을 생산하고자 할 경우에는 대장균이 당화 단백질을 합성하지 못하고 많은 단백질의 경우 접힘(folding)이 제대로 이루어지지 않는 봉입체(inclusion body) 형태의 불용성 단백질로 생산되어 생물학적 활성을 갖게 하기 위해서는 재접힘(refolding) 공정이 필요하고, 분비 단백질의 생산이 어려움 등의 여러 가지 문제점을 가지고 있다. 초기의 재조합 단백질 의약품은 주로 대장균에서 생산하였으나 기술이 발전함에 따라 2000년대에는 대장균에서 생산한 재조합 단백질의 비율이 감소한 반면, 효모나 곤충, 식물 및 동물세포에서의 생산이 증가하고 있다. 동물세포나 곤충세포의 경우에는 인체 유래 단백질을 대부분 완전한 활성형의 단백질로 생산이 가능하다는 장점을 가지고 있으나 배양 시간이 길며, 배양 조건이 까다롭고, 배지의 가격이 비싸다는 문제점을 가지고 있다. 식물을 이용하여 생산한 재조합 단백질은 인체 유래 유용 단백질들의 생물학적 활성에 필수적인 당화, 인산화 등과 같은 화학적 수식 작용을 가지고 있다. 또한 생물학적 안전성을 갖는 단백질을 생산할 수 있다는 장점을 가지고 있으며, 당(sugar)과 염(salt)을 주 배지 성분으로 사용하여 경제적인 면에서도 저렴하게 생산이 가능하나 느린 성장속도, 낮은 수율 등의 단점들을 지니고 있다(Biotechnol. Bioeng. 1997, 56, 473-484). 상기의 재조합 단백질의 생산 시스템이 가지고 있는 여러 가지 문제점들로 인하여 현재 새로운 재조합 단백질의 생산 시스템의 필요성이 대두 되고 있다.
버섯은 분류학상으로 고등균류 중 진균류(Eumycetes)에 속하며, 대부분은 담자균류에 속한다. 새송이버섯은 남유럽 일대, 북아프리카, 동아시아, 남러시아 등지에 분포하고 있으며 식용으로 널리 사용되어 왔고, 학명은 Pleurotus eryngii이며, 분류학적으로 진정담자균강, 동담자균아강(모균아강), 주름버섯목, 느타리과에 속하는 담자균류(Basidiomycetes)의 일종이다. 일반명은 왕굴버섯(King Oyster Mushroom) 또는 초원버섯(Boletus of the Steppes)이며, 우리나라에서는 큰느타리버섯 또는 왕느타리버섯으로 알려져 왔다. 이 버섯은 죽은 나무의 그루터기 또는 줄기에 부착하여 자생하는 기생균으로서 몇몇 식물의 조직에서도 생장이 가능하며, 산형과, 분과, 부처꽃과 등 초본식물의 뿌리에 질병을 유발시키는 병원균으로 보고되어 있다.
한편, 그람 음성 박테리아인 아그로박테리움 투메파시언스(Agrobacterium tumefaciens)은 식물에 뿌리혹병(crown gall)을 일으키는 식물 병원성 균으로 알려져 있다. 아그로박테리움 투메파시언스는 식물 세포 염색체 DNA에 끼어들어갈 수 있는 Ti 플라스미드 DNA를 가지고 있어 목적하고자 하는 유전자를 식물로 도입하는데 많이 이용되고 있다. Ti 플라스미드에는 Ti DNA 운송, 식물세포 염색체 DNA에 삽입되는 과정에 필요한 여려 가지 vir gene 들을 가지고 있으며, 아세토시린곤(acetosyringone)과 같은 방향족 화합물(phenolic compounds)에 의하여 유도되어 Ti 플라스미드 DNA가 식물세포로 운송되어 단일사슬 DNA 형태로 숙주세포의 염색체 DNA에 삽입되는 과정을 거친다 (Plant Physiol, 2000, 124, 13631371). 아그로박테리움으로 매개하여 식물의 형질전환은 식물에 유전자를 도입하기 위하여 오래 동안 사용되어 왔으며, 식물에 돌연변이 도입에도 사용되어 왔으며, 백색부후균의 형질전환 방법으로도 이용되고 있다. 또한 아스퍼질러스(Aspergillus; 누룩곰팡이), 푸사리움(Fusarium; 곰팡이)와 트리코더마(Trichoderma; 곰팡이) 등과 같은 여러 가지 곰팡이 에도 성공적인 형질전환 방법으로 사용되어 왔다(Nature Biotechn., 1998, 16, 839-842; J. Appl. Microbiol, 2002, 92, 189-195; Symbiosis. J, 2006, 41, 71-79). 그러나 현재까지 버섯류에서 유용한 단백질을 생산하는 유전자를 도입하는 형질전환시스템은 시도된 연구가 매우 제한적이어서, 유용 재조합 단백질 생산에 관한 산업화 연구는 아직까지 많이 이루어지지 않고 있다.
유용 단백질 중 하나인 성장 호르몬(growth hormone)은 뇌하수체전엽에서 217개의 아미노산으로 구성된 단백질로 합성된 후, N-말단 부분의 리더서열(leader peptide)이 제거되어 191개(N-말단 알라닌) 또는 190개(N-말단 페닐알라닌) 길이의 분자량이 약 22,000 달톤에 달하는 단백질로 전환되어 생물학적 활성을 갖는다(Pro. Natl. Acad. Sci. 1977, 74, 2432-2436). 성장호르몬의 분비조절은 시상하부(hypothalamus)에서 분비되는 성장호르몬 방출 호르몬(growth hormone releasing hormone, GHRH)에 의해 자극받고, 소마토스타틴(somatostatin)에 의해 분비가 억제된다. 분비된 성장호르몬은 간에서 인슐린유사 성장인자-1(insulin-like growth factor-1, IGF-1)의 생산을 유도하여 단백질, 탄수화물, 지방 및 무기물 대사 조절에 관여하여 성장을 촉진시키는 기능을 하는 단백질로서(Nature, 1982, 300, 611-615), 성장호르몬이 결여된 왜소증 환자의 치료 및 축산업에서 동물의 성장을 촉진하는데 이용이 되고 있다.
본 발명은 유용한 재조합 단백질을 생산할 수 있는 형질전환 백색부후균을 얻기 위하여 아그로박테리움을 이용하여 새송이버섯의 형질전환 방법 및 이러한 방법에 의해 얻은 새송이버섯 형질전환체를 제공하며, 짧은 시간 내에 활성을 갖는 재조합 인간 성장 호르몬 단백질을 대량생산할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 새송이 버섯 형질전환용 분비 벡터 및 이를 이용한 목적 단백질 제조방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 새송이버섯으로부터 분리한 프로모터 및 신호서열 유전자를 이용하여 형질전환에 적합한 발현 컨스트럭트를 포함하는 분비 벡터를 구축하였고, 분비 벡터를 이용하여 인간 성장 호르몬 단백질을 생산할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 버섯을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 버섯에서 인간 성장 호르몬 단백질 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명자들은 새송이 버섯 형질전환용 분비 벡터 및 이를 이용한 목적 단백질 제조방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 새송이버섯으로부터 분리한 프로모터 및 신호서열 유전자를 이용하여 형질전환에 적합한 발현 컨스트럭트를 포함하는 분비 벡터를 구축하였고, 분비 벡터를 이용하여 인간 성장 호르몬 단백질을 생산할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 버섯을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 버섯에서 인간 성장 호르몬 단백질 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
과제 해결 수단
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 특징은, 새송이버섯 형질전환용 분비 벡터를 제공하는데 있다.
그 결과, 새송이버섯 형질전환에 적합한 발현 컨스트럭트를 포함하는 벡터를 구축하였고, 이를 이용하여 버섯을 형질전환시켜 성공적으로 목적 단백질을 생산하였다.
본 발명의 버섯 형질전환용 재조합 벡터에서 라카아제 프로모터(laccase promoter)와 라카아제 신호서열 (laccase signal peptide) 및 본 연구의 대상 유용 유전자인 인간 성장 호르몬 유전자가 이용된다.
본 발명자들은 재조합 벡터 내 발현 컨스트럭트에서 목적 단백질 코딩 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합되어(operatively linked to) 목적 단백질의 발현을 가능하게 하는 프로모터로서 라카아제 프로모터가 가장 적합한 것으로 선택하였다.
본 발명의 제조합 벡터에서, 목적 단백질 코딩 뉴클레오타이드 서열은 다양한 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 예를 들어, 호르몬, 수용체, 성장인자, 사이토카인, 키모카인, 항체 및 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고, 바람직하게는 성장 호르몬이고, 보다 바람직하게는 인간 성장 호르몬이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터는 선택 표지로서 항생제(예: 네오마이신, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 등) 내성 유전자(예: 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (npt), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 (hpt), 등)를 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 분비 벡터는 버섯의 형질전환에 이용되며, 형질전환은 바람직하게는 아그로박테리움 매개 형질전환(Agrobacterium-mediated transformation)이다. 아그로박테리움 매개 형질전환은 Ti 플라스미드의 T-DNA로부터의 좌우 경계 서열이 일반적으로 요구된다. 본 발명에 있어서 재조합 벡터를 아그로박테리움에 도입하는 방법은 당업자에게 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있으며, 예를 들면 입자 충격법(particle bombardment), 전기천공법(electroporation), 형질감염법(transfection), 리튬아세테이트법(lithium acetate method) 및 열충격법(heat shock) 등이 있다.
본 발명에 있어서 상기 재조합 벡터를 도입하기 위한 형질전환용 균주로는 아그로박테리움을 사용하며, 이때 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 또는 아그로박테리움 라이조게네스(Agrobacterium rhizogenes)를 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는 아그로박테리움 투메파시엔스이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 버섯은 담자균류이며, 가장 바람직하게는 새송이버섯이다. 본 발명에 있어서 담자균류의 예로는 신령버섯(Agaricus blazei), 삿갓버섯, 그물버섯(Suillus bovinus), 수염바늘버섯(Climacodon septentrionalis), 팽나무버섯(Flammulina velutipes), 소혀버섯(Fistulinahepatica), 목이(Auricularia auricula), 망태버섯(Dictyophora indusiata), 개암버섯(Naematoloma sublateritium), 독청버섯아재비(Stropharia rugosoannulata), 먹물버섯(Coprinus comatus), 수실노루궁뎅이(Hericium ramosum), 표고버섯(Lentinus edodes), 알버섯(Rhizopogon rubescens), 흰목이(Tremella fuciformis), 만가닥버섯(Lyophyllum ulmarium), 넓은옆버섯(Pleurocybella porrigens), 노랑느타리버섯(Pleurotus cornucopiae), 저령(Dendropolyporus umbellatus), 플레우로토스 드라이너스(Pleurotus dryinus),동충하초(Cordyceps), 나도팽나무버섯(Pholiota nameko), 뽕나무버섯(Armillaria mellea), 뽕나무버섯부치(Armillaria tabescens), 왕송이(Tricholoma giganteum), 글로에오스테레움 인카나툼(Gloeostereum incarnatum), 혓바늘목이(Pseudohydnum gelatinosum), 검은비늘버섯(Pholiota adiposa), 금빛비늘버섯(Pholiota aurivella), 젖버섯아재비(Lactarius hatsudake), 느타리(Pleurotus ostreatus), 복령(Wolfporia cocos), 풀버섯(Volvariella volvacea), 느티만가닥버섯(Hypsizigus marmoreus), 마이셀렙토도노이데스 에이치소니(Myceleptodonoides aitchisonii), 땅찌만가닥버섯(Lyophyllum shimeji), 잎새버섯(Grifola frondosa), 덕다리버섯(Laetiporus sulphureus), 잣버섯(Lentinus lepideus), 양송이(Agaricus bisporus), 송이(Tricholomamatsutake), 영지버섯(Ganoderma lucidum), 참부채버섯(Panellus serotinus), 민자주방망이버섯(Lepistanuda), 그물버섯(Boletus edulis), 노루궁뎅이버섯(Hericium erinaceum), 버들송이버섯(Agrocybe cylindracea)이 있다.
본 발명에서 이용하는 새송이버섯은 분류학적으로 진정담자균강, 동담자균아강(모균아강), 주름버섯목, 느타리과에 속하는 담자균류의 일종이며 일반명은 왕굴버섯(King Oyster Mushroom) 또는 초원버섯(Boletus of the Steppes)이다. 또한 대한민국에서는 큰느타리버섯 또는 왕느타리버섯으로 공지되어 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 버섯에서 목적 단백질 제조방법을 제공한다:
(a) 상기 재조합 벡터로 버섯의 분생자(conidia)를 형질전환시키는 단계; 및
(b) 상기 형질전환된 버섯의 분생자를 배양하여 상기 목적 단백질을 발현하는 버섯의 균사체를 수득하는 단계.
본 발명의 방법은 상기 재조합 벡터를 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 버섯 형질전환에 적합한 발현 컨스트럭트를 포함하는 벡터 및 이를 이용한 형질전환 버섯으로부터 성장 호르몬 단백질 등의 목적 단백질을 성공적으로 제조하는 방법을 제공한다.
(b) 본 발명의 재조합 발현 벡터는 버섯을 형질전환 하는 데에 매우 적합하며, 다양한 단백질을 버섯, 특히 새송이 버섯에서 발현 및 수득할 수 있도록 한다.
또한, 대량생산이 가능한 단백질 발현시스템 확립으로 산업적으로 활용이 가능하게 한다.
도 1은 본 발명에 따른 재조합 인간 성장 호르몬을 포함하는 벡터의 제작과정을 나타내는 도면,
도 2는 본 발명에 따라 재조합 인간 성장 호르몬을 포함하는 벡터의 DNA를 주형으로 하여 PCR로 분석한 hGH 유전자를 확인한 전기영동 사진,
도 3는 본 발명에 따른 재조합 인간 성장 호르몬을 포함하는 벡터로 형질전환 방법을 나타내는 도면,
도 4는 본 발명에 따라 재조합 인간 성장 호르몬을 포함하는 벡터로 형질전환된 새송이버섯 형질전환체의 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR로 분석한 hGH 유전자를 확인한 전기영동 사진.
도 5은 본 발명에 따라 재조합 인간 성장 호르몬을 포함하는 벡터로 형질전환된 새송이버섯 균사체를 배양하였을 때 발현된 hGH 단백질을 웨스턴블럿 방법으로 분석한 사진이다.
도 2는 본 발명에 따라 재조합 인간 성장 호르몬을 포함하는 벡터의 DNA를 주형으로 하여 PCR로 분석한 hGH 유전자를 확인한 전기영동 사진,
도 3는 본 발명에 따른 재조합 인간 성장 호르몬을 포함하는 벡터로 형질전환 방법을 나타내는 도면,
도 4는 본 발명에 따라 재조합 인간 성장 호르몬을 포함하는 벡터로 형질전환된 새송이버섯 형질전환체의 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR로 분석한 hGH 유전자를 확인한 전기영동 사진.
도 5은 본 발명에 따라 재조합 인간 성장 호르몬을 포함하는 벡터로 형질전환된 새송이버섯 균사체를 배양하였을 때 발현된 hGH 단백질을 웨스턴블럿 방법으로 분석한 사진이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
<실시예 1> 재조합 단백질을 생산하는 벡터 제조
<1-1> 벡터의 제조
대장균 배양액으로부터 알칼리 분리 방법(alkaline lysis method) 에 따라 분리한 pCAMLacPS 벡터를 HpaI으로 37℃에서 2시간 동안 반응시키고 아가로스 겔 전기영동으로 약 10.9 kb 크기의 DNA 단편을 아가로스 겔로부터 추출하였다.
<1-2> hGH 유전자의 제조
인간 성장호르몬 유전자의 경우 hGH가 클로닝 되어있는 pGEMT-hGH 플라스미드로부터 HpaI로 37에서 2시간 동안 반응시키고 아가로스 겔 전기영동으로 약 0.57 kb 크기의 DNA 단편을 아가로스 겔로부터 추출하여 pCAMLacPS 벡터에 클로닝할 hGH 유전자 DNA로 사용하였다.
<1-3> 재조합 유전자 벡터의 제조
상기 실시예 <1-1>에서 제조한 접착 말단(cohesive end)을 갖는 pCAMLacPS 벡터와 상기 실시예 <1-2>에서 제조한 hGH 유전자를 Sam Brook 등의 방법에 따라 pCAMLacPS 벡터와 hGH 유전자 단편을 라이게이션(ligation)하고 라이게이션 반응액을 대장균(E. coli XL-1 Blue MRF')에 형질전환 하였다(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1972, 69, 2110-2114). LB 배지에 접종한 E. coli XL-1 Blue MRF'를 600 nm에서 흡광도가 약 0.5가 될 때까지 37℃에서 200 rpm으로 교반하면서 배양하고, 3500 rpm으로 10분간 원심분리하여 대장균을 회수하고 차가운 0.1 M CaCl2 용액으로 간단하게 세척하여 준 후, 얻어진 대장균을 1/10 부피의 차가운 0.1 M CaCl2 용액에 잘 현탁하여 얼음에서 30분 동안 방치하였다. 원심분리하여 CaCl2로 처리된 대장균을 회수하여 1/2 부피의 차가운 0.1 M CaCl2 용액에 잘 현탁하였다. 대장균 현탁액 200 ㎕에 상기의 방법으로 각각 제조한 라이게이션 반응액을 잘 혼합하여 주고, 얼음에서 30분 동안 방치하고 42℃에서 1분 동안 열 충격을 가한 후 얼음에서 2분 동안 방치하였다. 이 반응액에 0.5 ㎖의 LB 배지를 가하고 37℃에서 1시간 동안 방치하고, 이 용액으로부터 0.1 ㎖을 50 ㎍/㎖의 카나마이신(kanamycin)을 포함하는 LB 한천 배지에 도말하고 37℃에서 하루 동안 배양하여 콜로니(colony)가 생성되도록 하였다. 선별된 콜로니로부터 알카리 분해법으로 재조합 벡터를 분리하고, hGH 유전자가 클로닝되어 있는 클론은 PCR을 이용하여 약 0.57 kb 크기의 DNA 밴드를 을 확인하였으며 제조된 재조합 벡터를 pCAMLacPS-hGH로 명명하였다(도 1 및 도 2 참조).
<실시예 2> 형질전환
<2-1> 아그로박테리움의 형질전환
새송이버섯(Pleurotus eryngii)에 상기 실시예 1에서 제조한 pCAMLacPS-hGH를 도입시키기 위하여 아그로박테리움에 의한 형질전환 방법을 사용하였다(Plasmid, 1978, 1, 456-467). YEP 배지(1% Bacto tryptone, 1% yeast extract, 0.5% NaCl)에 접종한 아그로박테리움 투메파시언스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404를 600 nm에서 흡광도가 약 0.5 가 될 때까지 37℃에서 200 rpm으로 교반하면서 배양하고, 배양액을 얼음에서 10분간 방치하여 냉각시켰다. 3500 rpm으로 10분간 원심분리하여 균을 회수하고 1 의 차가운 20 mM CaCl2 용액에 잘 현탁하고, 아그로박테리움 현탁액 200 ㎕에 상기의 방법으로 각각 제조한 재조합 벡터 pCAMLacPS-hGH 용액을 잘 혼합하여 주고, 혼합액을 액체 질소에 방치하여 급속 냉동시킨 후, 얼려진 각 혼합액을 37℃에서 5분 동안 방치하여 녹여 주었다. 그런 후, 혼합액의 10배 부피의 YEP 배지를 가하여 28℃에서 2시간 동안 잘 저어 주면서 균을 배양하였다. 3500 rpm으로 10분간 원심분리하여 균을 회수하고, 균을 0.3 의 YEP 배지에 잘 현탁시키고, 이 중 0.1 ㎖을 취하여 50 ㎍/㎖의 카나마이신을 포함하는 YEP 한천 배지에 도말하고 37℃에서 하루 동안 배양하여 콜로니(colony)가 생성되도록 하였다. 선별된 콜로니로부터 알카리 분해법으로 각 재조합 벡터를 분리하고, 실시예 1-3에 기재한 방법으로 hGH 유전자가 클로닝되어 있는 클론을 확인하였으며(도 2 참조), DNA 시퀀싱에 의하여 재조합 벡터에 삽입된 유전자의 서열을 최종적으로 확인되었다.
<2-2> 아그로박테리움 투메파시언스에 의한 새송송버섯의 형질전환
아그로박테리움 투메파시언스에 의한 새송이버섯의 형질전환은 Michielse 등의 방법을 약간 수정하여 사용하였다(Nat. Protoc, 2008, 3, 16711678). 간단하게, 상기 실시예 1에서 제조한 pCAMLacPS-hGH로 형질전환된 아그로박테리움 LBA4404를 50 /의 카나마이신을 포함하는 5 의 최소배지(0.2% 글루코오스(glucose), 0.205% 다이포타슘 포스페이트(dipotassium phosphate; K2HPO4), 0.145% 모노포타슘 포스페이트(monopotassium phosphate; KH2PO4), 0.015% 소듐클로라이드(sodium choloride; NaCl), 0.05% 마그네슘 설페이트(magnesium sulfate; MgSO47H2O), 0.01% 칼슘클로라이드 헥사하이드레이트(calcium chloride hexahydrate; CaCl26H2O), 0.00025% 페러스 설페이트(ferrous sulfate; FeSO47H2O), 0.05% 암모늄 설페이트(ammonium sulfate; (NH4)2SO4))접종하고 28℃에서 2일 동안 잘 저어주면서 배양하였다. 아그로박테리움 배양액을 600 nm에서 흡광도가 약 0.5가 되게 유도배지(induction medium) (10 mM 글루코오스, 0.205% 다이포타슘 포스페이트, 0.145% 모노포타슘 포스페이트, 0.015% 소듐클로라이드, 0.05% 마그네슘 설페이트, 0.01% 칼슘클로라이드 헥사하이드레이트, 0.00025% 페러스 설페이트, 0.05% 암모늄 설페이트, 0.5% 글라이세롤(glycerol), 200 uM 아세토시린곤(acetosyringone), 40 mM 모르폴리노에탄설폰산(2-morpholinoethanesulfonic acid; MES)으로 희석하고 같은 조건에서 3시간 동안 더 배양하여 준 후, 동일한 부피의 새송이버섯 분생자 현탁액(conidial suspension, 106 conidia/)과 혼합하여 주었다(Eur. Mol. Biol. Organ, 1995, 14, 3206-3214). 이 혼합액 200 ㎕를 3 MM filter paper(왓트만사, 미국)에 가하고, 200 uM의 아세토시린곤을 포함하는 유도배지 및 아세토시린곤을 포함하지 않는 유도배지에 각각 상기의 이 필터페이퍼를 담가두고 28℃에서 2일 동안 공동배양(co-cultivation)하였다. 각 공동배양 후에, 3 MM 필터페이퍼에서 자란 버섯균(새송이버섯; Pleurotus eryngii) 및 미생물균(아그로박테리움 투메파시언스)을 200 uM 세포탁심을 포함하는 PDA(potato dextrose agar) 배지로 옮겨 아그로박테리움을 죽게 하였다. PDA 배지 상에서 자란 각 형질전환된 새송이버섯의 분생자(conidia)를 멸균수에 현탁하고 200 uM 세포탁심을 포함하는 PDB 배지(0.4% 감자전분(Potato Starch), 2% 덱스트로즈(Dextrose))에 접종하고 28℃에서 100 rpm으로 진탕배양하였다. PDB 배지에서 자란 새송이버섯 형질전환체를 원심분리하여 회수하고, 여러 가지 분석을 위하여 사용하였다.
<실시예 3> 형질전환된 새송이버섯의 염색체 DNA 분석
상기 실시예 2에 의하여 얻어진 새송이버섯 형질전환체를 200 uM 세포탁심을 포함하는 PDB 배지에서 배양하고, 회수한 균사체로부터 염색체 DNA를 변형한 헥사데실트리메틸 암모늄 브로마이드(hexadecyltrimethylammonium bromide; CTAB) 방법(FOCUS, 1990, 12, 13-15)으로 분리하였다. 간단하게, 상기 실시예 2에서 얻어진 새송이버섯 균사체 0.1g 을 0.5 의 DNA 추출 완충액(0.1 M Tris-Cl (pH 9), 20 mM 에틸렌다이아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA), 1.4 M 염화나트륨(NaCl), 2% 헥사데실트리메틸 암모늄 브로마이드, 1% 폴리에텔렌 글리콜(polyethylene glycol), 0.2% 베타-머캡토에탄올(-mercaptoethanol))를 가하여 조직을 파쇄하고, 74℃에서 70분간 열처리 하였다. 상기의 용액을 200 ㎕의 클로로포름/이소아밀알콜(chloroform/isoamyl alcohol) (24:1)로 추출하고, 0에서 30분간 방치한 후, 15,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 상층액을 회수하였으며, 용출 추출과정을 한 번 더 반복하였다. 상층액을 회수하고 0.55배 부피의 이소프로판올(isopropanol)을 가하고 상온에서 5분간 방치한 후, 15,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 침전물을 회수하여, 염색체 DNA를 얻었다. DNA 침전물을 50 ㎕의 40 ㎍/㎖의 리보핵산가수분해효소 A(RNase A)를 포함하는 TE(Tris-EDTA) 용액에 녹여, 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR)의 주형 DNA로 사용하였다. 이 염색체 DNA를 주형으로 하여 hGH 유전자 분석은 PCR 하여 hGH 유전자의 도입을 확인하였으며, 약 0.57 kb 크기의 DNA 밴드를 확인하여(도 4), hGH 유전자로 형질전환 여부를 확인하였으며 최종적으로 각 중합효소 연쇄 반응 산물을 클로닝하여 DNA 서열을 분석하여 최종적으로 정확한 서열의 유전자로 형질전환 되었음을 확인하였다.
<실시예 4> 형질전환된 새송이버섯 균사체에서 hGH gene 의 발현 확인
pCAMLacPS-hGH 벡터로 형질전환된 새송이버섯 균사체를 PDB 배지에서 접종하고 25℃에서 5일 동안 100 rpm으로 진탕배양으로 배양하였다. 이 균 배양액 1 ㎖을 50 ㎖의 Mushroom Complete 배지(0.2% 트립톤(Bacto tryptone), 0.2% 효모추출물(yeast extract), 2% 글루코오스, 0.05% 마그네슘 설페이트)를 포함하는 250 의 삼각플라스크에 접종하고 25℃에서 7일 동안 100 rpm으로 진탕배양 하였다. 각 시간대별로 균사체를 회수하고, 회수한 균사체를 균사체 1 g 당 3 ㎖의 초음파 파쇄 버퍼(buffer)(10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.2 M NaCl, 5 mM 베타-머캡토에탄올)에 현탁하고, 균질기(homogenizer) 및 초음파 파쇄기로 새송이버섯 균사체를 파쇄하였다. 균사체를 파쇄 후, 15,000 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 상층액을 회수하여 단백질 발현 분석 시료로 사용하였다. 세포 추출액 0.5 ㎖에 동일한 부피의 99% 에탄올을 가하여 잘 섞어준 후, -20℃에서 30분간 방치하고 12,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 단백질 침전물을 회수하고, 이 침전물은 공기 중에 약 30분 간 방치하여 건조시켰다. 건조한 단백질 추출물은 20 ㎕의 증류수에 잘 현탁시키고 20 ㎕의 2X SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 샘플 버퍼(0.1 M Tris-HCl (pH 6.8), 0.2 M 디티오트레이톨(Dithiothreitol; DTT), 4% SDS, 20% 글리세롤, 0.2% 브로모페놀블루(bromophenolblue))를 가하고, 100℃에서 5분간 가열하여 단백질 전기영동(SDS-PAGE)방법으로 확인하였다(Nature, 1970, 227, 680-685). 일정한 전기장에서 분리가 끝난 젤은 쿠마시 브릴리언트 블루 용액(Coomassie brilliant blue)에 넣어 1시간 정도 염색한 후 탈색용액(30% 메탄올, 10% 아세트산)에 옮겨 탈색하여 생산된 단백질을 확인하였다. 또한 SDS-PAGE를 전개한 단백질을 PVDF(Polyvinylidene fluoride) 막(membrane)으로 이동시킨 후 토끼에서 제조한 anti-hGH 항체를 이용하여 형질전환된 새송이버섯 균사체 배양액에서 발현된 hGH 단백질을 공지의 항체 블럿 방법으로 확인하였다. 그 결과, 본 발명의 pCAMLacPS-hGH로 형질전환된 새송이버섯 균사체 배양액은 배양 시간이 지남에 따라 분자량 약 21 kDa의 hGH 단백질의 발현됨을 확인하였다(도 5 참조).
Claims (5)
- 다음을 포함하는 버섯 형질전환용 재조합 벡터:
(a) 라카아제 프로모터(laccase promoter);
(b) 라카아제 신호서열 (laccase signal peptide)
- 상기 제 1 항의 재조합 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 속 미생물.
- 상기 제 1 항의 재조합 벡터로 형질전환된 버섯.
- 제 1 항에 있어서, 상기 목적 단백질은 인간 성장 호르몬(human growth hormone)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 3 항에 있어서, 상기 버섯은 새송이버섯인 것을 특징으로 하는 형질전환된 버섯.
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CN106978433A (zh) * | 2017-03-29 | 2017-07-25 | 上海市农业科学院 | 一种以米粒作为培养基质的香菇转化方法 |
-
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- 2014-12-15 KR KR1020140180054A patent/KR20160072448A/ko not_active Application Discontinuation
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