CN106290533A - 酱油渣蛋白质的定向降解方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及酱油渣蛋白质定向降解的两种方法，属生物技术领域。本发明通过研究酱油渣蛋白质的组成，开发出酱油渣定向降解的方法，包括两步法酶解和微生物双菌分步发酵法。选择纤维素酶和碱性蛋白酶对酱油渣蛋白质分步水解法，得到酱油渣蛋白质的最大利用率为62.45％；选用香菇菌丝体和米曲霉对酱油渣进行分步发酵，得到酱油渣蛋白质的最大利用率为60.70％。该方法有助于酱油成曲蛋白酶的优化，提高原料利用率，减少酱油渣的生成量，同时为酱油渣的饲料化应用提供了新的思路。

Description

酱油渣蛋白质的定向降解方法

本发明所属的技术领域

本发明提供酱油渣蛋白质的定向降解方法，包括两步酶解法和微生物双菌分步发酵法，属生物技术领域。

发明的背景技术

酱油渣是酿造酱油后产生的废渣，我国是酱油生产和消费大国，而生产酱油会产生大量的废渣(每公斤酱油约产生0.67公斤的酱油渣)。酱油渣一般呈深棕色，其干基粗蛋白质含量约25％、粗脂肪约9.7％、粗纤维约13.5％、灰分约10.5％，此外还含有丰富的异黄酮。由此可见，酱油渣中仍然含有大量的可再利用成分。但酱油渣的含水量高，微生物易生长繁殖，不易贮藏，若不进行及时处理会造成环境污染。目前低盐固态酱油渣小部分作为肥料或饲料低价出售，产品附加值较低。高盐稀态酱油渣常浸泡后当三淋油使用，利用后仍会产生大量残余酱油渣。

如何将这一大宗“废渣”变废为宝，引起了大家的广泛关注。目前对酱油渣的开发利用主要有两种方案。其一是利用外加酶制剂或复合菌群发酵技术提高酱油原料利用率，减少酱油渣的生成，其二是利用酱油渣为原料通过后续工艺处理，拓展其应用范围，提高其附加值。如用酱油渣生产有机肥料和饲料，利用酱油渣提取保健因子、膳食纤维和油脂等。

蛋白质原料利用率与酱油酿造过程中原料蛋白质成分的降解并成为可溶性成分密切相关。酿造过程中蛋白质的降解是在蛋白酶系的作用下完成的。提高酶活力、丰富酶系成为近半个世纪以来人们关注的重点。主要研究工作集中在菌株诱变提高蛋白酶活力、多种菌制曲、酶制剂应用。研究外源性酶制剂对酱油渣进行酶解处理的效果，相对应的提高成曲中相同类型的酶活力，可以提高原料的利用率，并为实现酱油渣资源高效综合利用的目标奠定基础。

酱油渣中含有丰富的蛋白质，是很好的动物蛋白质饲料。同时酱渣中还含有丰富的异黄酮，研究表明异黄酮对禽畜及其产品具有重要营养作用。目前将酱油渣开发为优质饲料大致是将酱油渣先行预处理再接种适宜的微生物，将培养料中的粗纤维降解转化成小分子物质、脂肪和蛋白质等营养成分，从而提高酱渣的营养价值和消化利用率。酱油渣微生物饲料化的研究工作主要集中在筛选和构建合适的菌株，采用单菌种或混合菌种发酵方式，探索一步或多步发酵工艺对酱油渣进行发酵。研究结果表明，固态发酵适合酱油渣的发酵克服了酱油渣水分含量过大等问题。酱油渣发酵后应用显著提高了饲用价值，在养殖业中的应用有良好的应用前景。

但目前国内外对酱油渣蛋白质的研究尚未受到足够重视，因此对酱油渣蛋白质不能做到针对性的有效利用。通过研究酱油渣蛋白质的组成，开发酱油渣定向降解的方法，有助于酱油生产中原料利用率的提高 及酱油渣饲料化，一方面可以减少酱渣对环境的污染，另一方面实现变废为宝，生产出具有品质较好的饲料，实现资源的合理利用，具有较好的经济效益。

本发明所解决的问题

本发明以酱油渣为研究对象，通过研究酱油渣蛋白质的组成，开发出酱油渣定向降解的方法，包括两步酶解法和微生物双菌分步发酵法。酶法降解酱油渣蛋白质，为优化酱油成曲中的酶系，提高酱油原料的利用率及减少酱油渣的产生量有重大意义；微生物双菌分步发酵酱油渣，为酱油渣的饲料化应用研究提供新的思路。

发明内容

本发明提供了酱油渣中的蛋白质成分的分析方法及结果。

酱油渣蛋白质的特征在于：通过有机溶剂提取、离液盐处理、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和液相色谱-质谱/质谱联用技术，显示酱油渣主要是几种蛋白质的混合物，主要包括大豆和小麦的细胞壁蛋白、糖蛋白、种子蛋白、抗热蛋白及球蛋白经微生物酶解后的片段。

本发明还提供了酱油渣蛋白质定向降解的方法。

本发明之酱油渣蛋白质定向降解的方法之一，先用纤维素酶作用酱油渣，最佳作用条件为酶反应pH值为5.0，作用温度为55℃，作用时间为1h，酶的添加量80U/g；接着用碱性蛋白酶的作用酱油渣，最佳作用条件为酶反应pH值为8.0，作用温度为65℃，作用时间为2h，酶的添加量2000U/g。酱油渣蛋白质经两步酶解后蛋白质利用率为62.45％。

本发明之酱油渣蛋白质定向降解的方法之二，先采用香菇菌菌丝接种于酱油渣上，培养温度为28℃，培养时间为7d；接着接入米曲霉孢子进行培养，培养温度为培养温度为28℃，培养时间为24h。所得产品风味较好，蛋白质的利用率为48.6％，加上菌体蛋白的含量12.1％，综合利用率为60.7％。

本发明的优点：

1.本发明中的酱油渣蛋白质的组成，基本反映了酱油渣中蛋白质的实际情况，对酱油渣的有效利用有重要的参考价值。

2.本发明根据酱油渣蛋白质的组成，定向进行酱油渣的降解，蛋白质利用率高，效果明显。

3.本发明选用的酶制剂合理，且均已工业化生产，实际操作简单，对酱油渣进一步有效利用有重大意义，且芽孢杆菌在酱油酿造的微生物群系中占有很大比例，枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的选用，有助于酱油成曲蛋白酶的优化，提高原料利用率，减少酱油渣的生成量。

4.本发明选用的香菇菌丝体，其发酵产物有较好的提高免疫力的功效；米曲霉为饲料中可以添加的益生菌，米曲霉发酵可以很好的提取香菇菌丝中的风味物质，有助于产品适口性的提高。接种不需要调节水分与pH值，工业化生产简单易行，成本较低。

具体实施方式

实施实例1

酱油渣中蛋白质成分的分析

酱油渣中的蛋白质成分进行了分离鉴定，为找到更好的利用酱油渣，特别是其中蛋白质成分的方法，对其中的蛋白质来源和结构特征等相关内容进行全面和深入的研究尤为重要。实验中采用液氮研磨，有机溶剂洗涤，离液盐提取的方法，对酱油渣的蛋白质进行了分离；用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE、液相色谱-质谱/质谱联用(LC-MS-MS)技术对酱油渣蛋白质进行鉴定分析。

酱油渣蛋白质的提取

称取新鲜酱油渣，加入液氮磨碎，重复研磨至组织完全破碎。

将磨碎的酱油渣放于冻存管中，加入-20℃预冷的甲醇(添加蛋白酶抑制剂)，轻轻摇动并离心以除去杂质并沉淀蛋白质，用吸管小心的移除上清液，重复该步骤，直至离心上清液由黄色变为无色。用纸巾吸干沉淀上的甲醇。

将甲醇提取后的沉淀加入适量-20℃预冷的丙酮(添加蛋白酶抑制剂)，轻轻摇动轻摇动并离心以沉淀蛋白质，用吸管小心的移除上清液，重复该步骤3次，于室温放置1h使丙酮挥干，并称重。

每mg重量的沉淀加入4ul的高序列离液盐(有些盐，很容易破坏水、大分子或者生命系统的结构，这些盐就叫做离液盐，而离液序列就是这种破坏结构能力的高低)，于室温(15-30℃)放置30min，离心上清液即为提取的蛋白质。

酱油渣蛋白质的鉴定分析

丙烯酰胺与双丙烯酰胺比例为30∶1，浓缩胶和分离胶的浓度分别为4％和10％，样品进样前95℃加热5min，样品进样量15μL。电泳结束后凝胶在0.25％的考马斯亮兰溶液(R-250)中染色，在7％的乙酸溶液(甲醇∶乙酸∶水＝227∶37∶236(V∶V∶V))中脱色。最后电泳图使用JEDA扫描设备进行扫描。

将SDS-PADE电泳后的三条主要带白带切下，放于去离子水中，并用胰蛋白酶降解后，进行液相色谱-质谱/质谱联用(LC-MS-MS)技术进行鉴定和氨基酸特征分析。结果显示酱油渣主要是11S球蛋白的酸性亚基(A1a，A2，A1b，A4)及碱性亚基(B2，B1a，B1b，B3，B4).这说明酱油发酵过程中蛋白酶活力不足或者酶与底物没有充分接触。

实施实例2

酶对酱油渣蛋白质的降解作用

根据酱油渣中蛋白质的组成情况，我们采用选择纤维素酶和碱性蛋白酶对酱油渣蛋白质分解的实验，其中纤维素酶选取了多种常用的纤维素酶和蛋白酶，其中来源于木霉的纤维素酶1作用效果最好，来源于枯草芽孢杆菌的碱性蛋白酶作用效果最好。

影响酶作用效果的主要因素为作用温度、作用时间、反应pH值、酶的添加量，因此，对这四个因素进行正交优化实验，以找到酶制剂的最佳作用条件；选择L9(3⁴)正交表进行试验，根据试验结果知，碱性蛋白酶的最佳作用条件为酶反应pH值为8.0，作用温度为65℃，作用时间为2h，酶的添加量6000U/g。经验证试验可知，优化后的蛋白质利用率为35.63％，比未优化前提高了10.03％；选择L9(3⁴)正交表进行试验，先用纤维素酶作用，然后用碱性蛋白酶测得蛋白质利用率，正交试验结果分析可见纤维素酶的最佳作用条件为酶反应pH值为5.0，作用温度为55℃，作用时间为1h，酶的添加量80U/g。经验证试验可知，优化后的蛋白质利用率为62.45％，比未优化前提高了22.17％。

实施实例3

微生物对酱油渣蛋白质的降解作用分析

酱油渣蛋白质降解菌株的初步筛选

选用了杏鲍菇、金针菇、平菇(农平1号)、平菇(特白平菇)、香菇、木耳、猴头菇、银耳菌、鸡腿菇、饲料发酵菌、青贮饲料菌、米根霉3.010、毛霉3.2778、少孢根霉、霉豆渣菌株、腐乳毛霉、东北霉菌-源自米曲、东北霉菌-源自豆芽，及木霉40316、40144、41226、13049、40932、米曲霉3.042，以酱渣为底物，进行发酵实验，提取可溶性蛋白后测定残余物质的全氮含量，来评价微生物对酱油渣蛋白的利用情况，结果见表1，这些真菌在酱渣上均有生长较好，说明这些菌的分泌的酶类能进一步的将酱渣分解，其中木霉13049对酱渣的利用率最高，蕈菌类香菇对酱渣的利用率较高，香菇菌丝在生长的同时，改善了酱渣的风味，有利于酱油渣饲料化的开发。

表1微生物对酱油蛋白质的利用情况

酱油渣蛋白质降解菌株的组合发酵优化

通过优选第一步发酵结果，采用香菇与米曲霉组合培养，通过优化发酵时间、发酵温度等因素，得到最优的酱油渣蛋白质降解方案，结果发现香菇菌菌丝接种于酱油渣上，培养温度为28℃，培养时间为7d；接着接入米曲霉孢子进行培养，培养温度为培养温度为28℃，培养时间为24h。所得产品风味较好，蛋白质的利用率为48.6％，加上菌体蛋白的含量12.1％，综合利用率为60.7％。

Claims (5)

1.酱油渣蛋白质的提取分析方法，其特征是采用有机溶剂提取、离液盐处理、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和液相色谱-质谱/质谱联用技术分析酱油渣蛋白质。

2.酱油渣蛋白质的定向降解方法，其特征在于包括两步酶解法和微生物双菌分步发酵法。

3.根据权利要求2所述的两步酶解法，其特征在于先用来源于木霉的纤维素酶作用酱油渣，最佳作用条件为酶反应pH值为5.0，作用温度为55℃，作用时间为1h，酶的添加量80U/g；接着用来源于枯草芽孢杆菌的碱性蛋白酶作用酱油渣，最佳作用条件为酶反应pH值为8.0，作用温度为65℃，作用时间为2h，酶的添加量2000U/g。

4.根据权利要求2所述的微生物双菌分步发酵法，其特征在于先采用香菇菌菌丝接种于酱油渣上，培养温度为28℃，培养时间为7d；接着接入米曲霉孢子进行培养，培养温度为培养温度为28℃，培养时间为24h。

5.根据权利要求4所述的微生物双菌分步发酵酱油渣的用途，其特征在于用于酱油渣饲料化开发。