CN106978433A - 一种以米粒作为培养基质的香菇转化方法 - Google Patents

一种以米粒作为培养基质的香菇转化方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种以米粒作为培养基质的香菇转化方法，包括：香菇菌丝接种、农杆菌活化培养、农杆菌侵染米粒‑香菇菌丝基质。本发明与现有的方法相比，操作方便，转化效率高，转化子易分离，具有良好的应用前景。

Description

一种以米粒作为培养基质的香菇转化方法
技术领域
本发明属于食用菌分子遗传转化领域，特别涉及一种以米粒作为培养基质的香菇转化方法。
背景技术
香菇是目前我国食用菌年产量最多的菇种，亦是居民日常膳食中最常见的菌菇，人们对香菇的需求量越来越多，对香菇的质量要求也越来越高。与此同时，近年来我国香菇工厂化栽培中对高温菇，硬质菇，白面菇等优质菇的需求越来越突出。想要培育出优质的栽培种，从根本上要搞清楚控制这些优良性状的分子基础。然而目前香菇基因组虽然已经测通并且注释完成，但是大量的基因功能仍然未知，这极大的阻碍的香菇新品种的培育。遗传转化技术是进行食用菌分子育种和基因功能研究的重要手段之一。稳定、高效的外源基因转化系统香菇重要基因功能验证的前提基础。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种以米粒作为培养基质的香菇转化方法，该方法与现有的方法相比，操作方便，转化效率高，转化子易分离，具有良好的应用前景。
本发明的一种以米粒作为培养基质的香菇转化方法，包括：
(1)将在固体培养基上培养的香菇菌丝，带培养基(50mm×50mm)一起挑入均质仪中，加入液体培养基，间歇打碎，得到液体菌丝；然后将液体菌丝接入米粒培养基中，20～25℃培养15-20天，期间每天摇匀，至米粒变白；
(2)将含有双元表达载体的农杆菌在含有相应抗生素的固体培养基上划线接种，28℃培养2～3天；再挑取单菌落接种于液体培养基(含抗生素)中，28℃、180～220r/min培养至OD600＝0.5～0.6；然后取农杆菌菌液重悬于诱导培养基(添加乙酰丁香酮AS 200umol/L)中，28℃、180～220r/min培养至OD600＝0.5～0.6；
(3)取步骤(1)中的米粒加入至容器中，加入诱导培养基，超声、浸泡，吸掉上清液；其中，超声频率为40～60KHz，功率为140～160W，时间为1min～2min；浸泡时间为10～15min；
(4)将步骤(2)中的农杆菌菌液加入步骤(3)中，超声、静置侵染，吸掉多余菌液，20～25℃培养72小时以上，期间每天摇匀；最后挑取单粒米转入诱导培养基平板(含相应抗生素)，20～25℃培养7～10天，即可；其中，超声频率为40～60KHz，功率为140～160W，时间为10s～20s；静置侵染时间为20～30min。
所述步骤(1)中的米粒培养基的配制方法为：将米清洗干净，蒸馏水浸泡至米微软，散开到纱布上，吸干水分，再装入三角瓶中，高温高压灭菌(120℃，30分钟)。
所述步骤(2)和(3)中的诱导培养基的配方为：K-buffer 1ml；M-N solution 2ml；1％CaCl20.1ml；0.01％FeSO4 1ml；20％NH4NO3 0.25m；Spore elements 0.5ml；50％甘油1ml；1mol/L pH5.3MES 4ml；2mol/L葡萄糖0.5ml；无菌ddH2O定容至100ml。
所述K-buffer的组成为：K2HPO4 20g，KH2PO4 14.5g，用KOH调pH值至7.0，无菌ddH2O定容至100ml。
所述M-N solution的组成为：MgSO4 .7H2O 3g，NaCl 1.5g，无菌ddH2O定容至100ml。
所述Spore elements的组成为：ZnSO4 .7H2O 500mg/L，CuSO4 .5H2O 500mg/L，H3BO3500mg/L，MnSO4 .H2O 500mg/L，NaMoO4 .2H2O 500mg/L，5种溶液等体积混匀，过滤除菌，4℃保存。
所述步骤(3)中的米粒、诱导培养基和农杆菌菌液的加入比例为1g:1.5ml:1.5ml。
有益效果
本发明将菌丝接种到米粒培养基上，每天摇动使菌丝在米粒上生长均匀，摇动时产生的撞击力能随机使附着在米粒上的菌丝产生伤口，更利于后期与农杆菌进行侵染反应；且后期每一粒米粒都可作为一个单独的转化个体，操作以及统计起来更加快捷方便；与现有的方法相比，操作方便，转化效率高，转化子易分离，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为转化子在诱导培养基平板上的生长状况(207-6代表菌株编号)；
图2为潮霉素引物PCR扩增结果；M:DL2000marker；1：质粒作为阳性对照；2：未转化的DNA作为阴性对照；3-11：转化子的潮霉素扩增。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1、小米粒培养基的制备
(1)将小米清洗干净，用蒸馏水浸泡20分钟至小米微软，散开到干净的纱布上，吸干水分；(2)称量30g，装入250ml的三角瓶中，高温高压灭菌(120℃，30分钟)。
2、香菇菌丝接种
(1)将在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上培养7天的香菇菌丝，带培养基(50mm×50mm)一起挑入均质仪中，加入100ml马铃薯葡萄糖(PDB)培养基，间歇打碎30s。
(2)将上述液体菌丝取10ml接入小米粒培养基中，25℃培养20天，期间每天摇，至米粒变白。
3、农杆菌的活化培养
(1)将含有双元表达载体GpiE的农杆菌在含有相应抗生素(利福平rif 20mg/L，卡那霉素Kan 50mg/L)的LB固体平板上划线接种，28℃培养2天；1L LB固体培养基配方：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15g；
(2)挑取单菌落接种于5mL LB液体培养基中(含利福平rif 20mg/L，卡那霉素Kan50mg/L)，28℃、200r/min培养至OD600＝0.5～0.6；1L LB液体培养基配方：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g；
(3)取200ul上述农杆菌菌液，重悬于5mL诱导培养基(添加乙酰丁香酮AS200umol/L)中，28℃、200r/min培养至OD600＝0.5～0.6。
诱导培养基的配方为：K-buffer 1ml；M-N solution 2ml；1％CaCl2 0.1ml；0.01％FeSO4 1ml；20％NH4NO3 0.25ml；Spore elements 0.5ml；50％甘油1ml；1mol/LpH5.3MES 4ml；2mol/L葡萄糖0.5ml；无菌ddH2O定容至100ml。
K-buffer的组成为：K2HPO4 20g，KH2PO4 14.5g，用KOH调pH值至7.0，无菌ddH2O定容至100ml。
M-N solution的组成为：MgSO4.7H2O 3g，NaCl 1.5g，无菌ddH2O定容至100ml。
Spore elements的组成为：ZnSO4.7H2O 500mg/L，CuSO4.5H2O 500mg/L，H3BO3500mg/L，MnSO4.H2O 500mg/L，NaMoO4 .2H2O 500mg/L，5种溶液等体积混匀，过滤除菌，4℃保存。4、农杆菌侵染小米粒-香菇菌丝基质
(1)取培养好的小米粒1g左右加入玻璃小试管中，加入诱导培养基(未添加乙酰丁香酮AS)1.5ml，用上海科导超声仪器有限公司的双频超声波清洗器超声1min(频率40KHz、功率160W)，静置10min，吸掉上清液；
(2)加入步骤3中摇好的农杆菌菌液1.5ml，用上海科导超声仪器有限公司的双频超声波清洗器超声10s(频率40KHz、功率160W)，静置侵染20min，吸掉多余菌液，20℃静置培养72小时以上，期间每天摇匀2次；
(3)将小米粒单粒转入诱导培养基平板(含潮霉素Hyg 5mg/L，头孢噻肟钠cef400mg/L，AS 200umol/L)，每个平板接25粒，25℃培养10天；
(4)统计能够长出菌丝的小米个数，把小米周围的菌丝重新挑到筛选培养基(Hyg10mg/L，cef 400mg/L)，平板中间设置没有被农杆菌侵染的菌丝作为对照，25℃培养，观察菌丝的生长情况，结果显示转化子都能正常的生长而对照不长。
5、转化子的筛选验证
(1)能够长出菌丝的转化子接到马铃薯葡萄糖培养基中，23℃～25℃下避光摇瓶培养，3d～4d后收集菌丝；
(2)用CTAB法提取上述菌丝的基因组DNA，检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度一致；
(3)对上述提取的DNA进行标记基因潮霉素Hyg的PCR扩增；
PCR扩增体系为：总体积20μL，包括：10×PCR buffer 2μL，25mmol/L MgCl2 2μL，10mmol/L dNTP 0.4μL，5U/μL Taq DNA酶0.2μL，10μmol/L Hyg正向引物和反向引物总体积各1μL，浓度20ng～30ng/μL提取的模板DNA 2μL，ddH2O 11.4μL；
PCR反应条件：94℃ 5min；94℃ 30second，56℃ 40second，72℃ 30second，30个循环；72℃ 8min。
所用潮霉素引物为：
Hyg-F：GATGTTGGCGACCTCGTATT；
Hyg-R：TCGTTATGTTTATCGGCACTTT；
(4)PCR产物送上海杰李生物技术公司测序验证；
(5)统计阳性转化率，转化率结果为30.17％，并保种。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海市农业科学院
上海炎地农业科技有限公司
<120> 一种以米粒作为培养基质的香菇转化方法
<130> 1
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gatgttggcg acctcgtatt 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcgttatgtt tatcggcact tt 22

Claims (7)

1.一种以米粒作为培养基质的香菇转化方法，包括：
(1)将在固体培养基上培养的香菇菌丝，带培养基一起挑入均质仪中，加入液体培养基，间歇打碎，得到液体菌丝；然后将液体菌丝接入米粒培养基中，20～25℃培养15-20天，期间每天摇匀，至米粒变白；
(2)将含有双元表达载体的农杆菌在含有相应抗生素的固体培养基上划线接种，28℃培养2～3天；再挑取单菌落接种于液体培养基中，28℃、180～220r/min培养至OD600＝0.5～0.6；然后取农杆菌菌液重悬于诱导培养基中，28℃、180～220r/min培养至OD600＝0.5～0.6；
(3)取步骤(1)中的米粒加入至容器中，加入诱导培养基，超声、浸泡，吸掉上清液；其中，超声频率为40～60KHz，功率为140～160W，时间为1min～2min；浸泡时间为10～15min；
(4)将步骤(2)中的农杆菌菌液加入步骤(3)中，超声、静置侵染，吸掉多余菌液，20～25℃培养72小时以上，期间每天摇匀；最后挑取单粒米转入诱导培养基平板，20～25℃培养7～10天，即可；其中，超声频率为40～60KHz，功率为140～160W，时间为10s～20s；静置侵染时间为20～30min。
2.根据权利要求1所述的一种以米粒作为培养基质的香菇转化方法，其特征在于：所述步骤(1)中的米粒培养基的配制方法为：将米粒清洗干净，蒸馏水浸泡至米微软，散开到纱布上，吸干水分，再装入三角瓶中，高温高压灭菌。
3.根据权利要求1所述的一种以米粒作为培养基质的香菇转化方法，其特征在于：所述步骤(2)和(3)中的诱导培养基的配方为：K-buffer 1ml；M-N solution 2ml；1％CaCl20.1ml；0.01％FeSO4 1ml；20％NH4NO3 0.25m；Spore elements 0.5ml；50％甘油1ml；1mol/LpH5.3MES 4ml；2mol/L葡萄糖0.5ml；无菌ddH2O定容至100ml。
4.根据权利要求3所述的一种以米粒作为培养基质的香菇转化方法，其特征在于：所述K-buffer的组成为：K2HPO4 20g，KH2PO4 14.5g，用KOH调pH值至7.0，无菌ddH2O定容至100ml。
5.根据权利要求3所述的一种以米粒作为培养基质的香菇转化方法，其特征在于：所述M-Nsolution的组成为：MgSO4·7H2O 3g，NaCl 1.5g，无菌ddH2O定容至100ml。
6.根据权利要求3所述的一种以米粒作为培养基质的香菇转化方法，其特征在于：所述Spore elements的组成为：ZnSO4·7H2O 500mg/L，CuSO4·5H2O 500mg/L，H3BO3500mg/L，MnSO4·H2O500mg/L，NaMoO4·2H2O 500mg/L，5种溶液等体积混匀，过滤除菌，4℃保存。
7.根据权利要求1所述的一种以米粒作为培养基质的香菇转化方法，其特征在于：所述步骤(3)中的米粒、诱导培养基和农杆菌菌液的加入比例为1g:1.5ml:1.5ml。
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