CN101451140A - 一种匍匐型地被菊遗传转化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种匍匐型地被菊遗传转化的方法，属于菊花分子育种领域。以菊花品种“钟山红枫”RNA为模板扩增合成DREBa基因，克隆到T－载体，双酶切获取的DREBa基因目的片段与pCAMBIA 1301连接，而后转化农杆菌，获得含有重组质粒pCAMBIA1301－DREBa的农杆菌菌液；无菌苗叶圆片用农杆菌液侵染10min，共培养3d、脱菌培养3d、筛选培养获得具潮霉素抗性的生根苗。经PCR检测证实外源基因已转入地被菊基因组DNA中。本发明首次针对匍匐型地被菊建立了其遗传转化体系，为地被菊分子育种工作提供了理论基础和实验依据，将有效推动其分子育种进程。

Description

一种匍匐型地被菊遗传转化的方法

一、技术领域

本发明涉及一种匍匐型地被菊遗传转化的方法，专用于匍匐型地被菊分子育种工作，属于菊花分子育种领域。

二、背景技术

地被菊是一类同时具备绿化、美化、彩化和香化综合功能的独特地被植物，株型低矮或匍匐，但匍匐型品种目前还奇缺，其推广应用前景极为广阔，倍受园林部门关注。因而筛选、培育具有优良性状的匍匐型地被菊新品种有着巨大的实用价值和经济意义。

近年来，随着植物基因工程的发展，分子育种克服了常规育种的种种限制，为利用新的基因资源改良菊花品种提供了新的手段和途径。农杆菌介导法以其易操作、低费用、高效率、插入DNA片段大、稳定性好、转基因拷贝数低等优点，成为转基因策略中的首选方法。自Lemieux利用农杆菌介导法诞生第1株转基因菊花以来，农杆菌介导的遗传转化技术已经在菊花遗传转化方面获得了成功。但菊花转基因还存在对基因型依赖性强、转化频率低、转化后外植体再生困难、重复性差、转化细胞不易成苗等问题，因此，针对不同类型菊花品种建立遗传转化体系，已成为大范围菊花分子育种首要解决的问题。

匍匐型地被菊的遗传转化研究至今未见报道，因此，系统深入研究其遗传转化条件，建立专门针对匍匐型地被菊的遗传转化体系，可为地被菊分子育种工作提供理论基础和实验依据，有效推进匍匐型地被菊分子育种进程。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的是针对根癌农杆菌介导的菊花转基因存在的基因型依赖性强、转化频率低、转化后外植体再生困难、重复性差、转化细胞不易成苗等问题，专门对匍匐型地被菊的遗传转化条件进行了系统深入研究，建立了一套适用于匍匐型地被菊的遗传转化体系，为匍匐型地被菊分子育种奠定基础。

技术方案

一种匍匐型地被菊遗传转化的方法，包括：

1)无菌苗的获得

于秋末取匍匐型地被菊脚芽，洗涤剂清洗15min，流水冲洗2h，滤纸吸干水分，无菌条件下依次用体积比为70％的乙醇浸泡30s，质量百分比为0.1％的升汞溶液消毒6min，无菌水冲洗4次，切取0.5cm带腋芽的茎段，接种于MS+细胞分裂素6-BA1.0mg·L^-1+生长素NAA 0.1mg·L^-1培养基上诱导腋芽萌发，不定芽长至2cm左右时切下转入生根培养基1/2MS+生长素NAA 0.1mg·L^-1获得无菌苗；

2)农杆菌悬浮液制备

菊花‘钟山红枫’DREBa基因的克隆、植物表达载体构建与农杆菌转化

①DREBa基因克隆与连接

以菊花品种‘钟山红枫’RNA为模板进行RT-PCR(Reverse transcription PCR，以RNA为模板反转录合成双链cDNA的PCR)扩增合成DREBa基因的cDNA开放阅读框ORF(Open Reading Frame)，扩增引物如下(下划线部分为酶切位点，BamH I和Kpn I分别为酶切正向引物和反向引物的内切酶)：

                  BamH I

正向引物：5’-CGCGGATCCATGGATATCGAATCACACTAC-3’

                  Kpn I

反向引物：5’-CGGGGTACCTCACTAAGAACACCACAACGA-3’

用琼脂糖凝胶电泳回收纯化以上RT-PCR目的产物片段872bp，与T-载体(T-easy Vector)连接后转化大肠杆菌DH5α感受态，进行LB+50mg·L^-1氨苄青霉素平板培养，培养条件为37℃和16h，挑取白色克隆接种于LB培养基进行液体培养，培养条件为37℃和16h，提取含有DREBa基因片段的T-载体质粒，测序验证；

②pCAMBIA1301-DREBa植物表达载体构建与DH5α转化

用BamH I和Kpn I双酶切连接到T-载体的DREBa基因，电泳回收目的片段，与用BamHI和Kpn I双酶切过的植物表达载体pCAMBIA 1301连接，转化大肠杆菌DH5α感受态，挑取阳性克隆接种于LB培养基进行液体培养，培养条件为37℃和16h，提取质粒，BamHI和KpnI双酶切鉴定pCAMBIA1301-DREBa重组质粒；

③pCAMBIA1301-DREBa植物表达载体农杆菌转化与鉴定

pCAMBIA1301-DREBa重组质粒采用液氮冷冻法转化农杆菌LBA4404感受态菌株，于YEP+50mg·L^-1卡那霉素+50mg·L^-1利福平固体培养基划板培养，培养条件为28℃和48h，挑取单克隆于YEP+50mg·L^-1卡那霉素+50mg·L^-1利福平液体培养基震荡培养，培养条件为28℃和12h，震荡速度200r·min^-1，采用碱裂解法提取重组质粒并进行双酶切检测，经酶切验证含有pCAMBIA1301-DREBa重组质粒的农杆菌菌液则可用于下一步的叶盘侵染。添加终浓度20％(体积比)的甘油至农杆菌菌液，-80℃长期保存；

将-80℃保存的农杆菌菌液常温化冻后于YEP+50mg·L^-1卡那霉素+50mg·L^-1利福平固体培养基划板培养，培养条件为28℃和48h，挑取单克隆接种于30ml YEP+50mg·L^-1卡那霉素+50mg·L^-1利福平液体培养基震荡培养，培养温度为28℃，震荡速度200r·min^-1，至农杆菌长至对数生长期即OD₆₀₀为0.5时，将菌液倒入无菌离心管中，4000rpm离心10min，收集菌体沉淀，用等量30ml MS液体培养基重悬，备用；

3)遗传转化体系建立

在超净工作台上，25天苗龄的无菌苗顶端2-4片幼嫩叶片切成5mm²大小，在黑暗条件下进行下述培养：在MS+细胞分裂素6-BA 1.0mg·L^-1+生长素NAA 1.0mg·L^-1培养基上预培养3d，在上述制备的农杆菌悬浮液中侵染10min，用无菌滤纸吸干叶面菌液，放置于MS+细胞分裂素6-BA 1.0mg·L^-1+生长素NAA 1.0mg·L^-1上25℃共培养3d，转入脱菌培养基MS+细胞分裂素6-BA 1.0mg·L^-1+生长素NAA 1.0mg·L^-1+羧苄青霉素Carb 350mg·L^-1上脱菌培养3d，然后转入筛选培养基MS+细胞分裂素6-BA 1.0mg·L^-1+生长素NAA 1.0mg·L^-1+潮霉素Hyg 8mg·L^-1+羧苄青霉素Carb 250mg·L^-1上培养至诱导出愈伤组织，之后转入低选择压的筛选培养基MS+细胞分裂素6-BA 1.0mg·L^-1+生长素NAA 1.0mg·L^-1+潮霉素Hyg 6mg·L^-1+羧苄青霉素Carb 150mg·L^-1上继续培养至萌发不定芽点，以上黑暗培养时温度均为26±2℃，共培养时除外；

切取带有不定芽点的愈伤块转入不加抗生素的再生培养基MS+细胞分裂素6-BA 1.0mg·L^-1+生长素NAA 1.0mg·L^-1上，在温度为26±2℃，光照时间为16h·d^-1的条件下培养，待不定芽长至2.0cm左右时，切下不定芽转入生根筛选培养基1/2MS+生长素NAA 0.1mg·L^-1+潮霉素Hyg 7mg·L^-1，获得具有潮霉素抗性的生根苗，将生根苗转入1/2MS+生长素NAA 0.1mg·L^-1培养基中正常生根；

4)转基因植株的获得

待抗性植株长出8-10片叶时，取其嫩叶，采用CTAB法提取基因组DNA。根据潮霉素磷酸转移酶基因HPT两端序列合成扩增反应引物Hyg-F(正向序列)和Hyg-R(反向序列)

Hyg-F：5′-CGTCTGTCGAGAAGTTTC-3′

Hyg-R：5′-TACTTCTACACAGCCATC-3′

分别以抗性植株和未转化的野生植株的DNA为模板，以Hyg-F和Hyg-R为引物，进行PCR扩增，PCR鉴定结果显示抗性植株在近1000bp下方扩增出一条清晰的条带，未转化野生植株则没有扩增出相应的条带，扩增产物经测序分析表明与潮霉素磷酸转移酶基因HPT核苷酸序列一致(950bp)，证实外源基因已转入地被菊基因组DNA中。

有益效果

本发明提供的匍匐型地被菊遗传转化体系建立的方法，与现有技术相比具有如下优点和积极效果：

1.本发明首次针对地被菊中奇缺的匍匐型品种，对其遗传转化条件进行了系统深入的研究，为后续的匍匐型地被菊分子育种工作提供了最基本的方法。

2.遗传转化体系建立中，对影响遗传转化的条件如预培养时间、农杆菌侵染时间、共培养时间、脱菌培养时间进行了摸索，获得了最佳遗传转化组合。

3.在筛选方式上，针对匍匐型地被菊对筛选抗生素(潮霉素)敏感的问题，采用了高选择压长时间筛选抗性芽点，无选择压恢复抗性芽分化和生长，再高选择压筛选抗性不定芽并结合生根筛选的多次筛选方法，取得了较好效果，提高了转化体再生率。

4.在脱菌方法上，基于脱菌抗生素(羧苄青霉素)对匍匐型地被菊叶片再生的强烈抑制作用，在遗传转化初期使用高浓度脱菌抗生素抑制农杆菌过度生长，在筛选的后期降低脱菌素浓度，在有效抑制农杆菌滋生的同时获得较高的转化体再生率。

四、附图说明

图1-2匍匐型地被菊叶盘再生过程.

     左→右依次为：脱分化期；初分化期；分化期；不定芽长至2-3cm时

图3不同浓度潮霉素对地被菊叶盘再生的影响

   A：0mg·L^-1；B：3mg·L^-1；C：5mg·L^-1；

   D：8mg·L^-1；E：10mg·L^-1；F：20mg·L^-1

图4不同浓度潮霉素对地被菊不定芽生根的影响

   A：0mg·L^-1；B：3mg·L^-1；C：5mg·L^-1；

   D：8mg·L^-1；E：10mg·L^-1；F：20mg·L^-1

图5抗性植株筛选过程

   左→右依次为：抗性愈伤筛选；抗性芽筛选；抗性芽恢复生长；生根筛选；经

   PCR检测正常生根的转基因植株

图6转基因植株PCR检测

   M：分子量标记；0：质粒阳性对照；WT：野生植株；1-7：抗性植株

五、具体实施方式

1)无菌苗的获得

于秋末取匍匐型地被菊品种‘雨花勋章’(中国菊花研究网，http://www.chrysanthemum.cn)生长健壮的地下脚芽，洗涤剂清洗15min，流水冲洗2h，滤纸吸干水分，无菌条件下依次用体积比为70％的乙醇浸泡30s，质量百分比为0.1％的升汞溶液消毒6min，无菌水冲洗4次，切取0.5cm带腋芽的茎段，接种于MS+细胞分裂素6-BA 1.0mg·L^-1+生长素NAA 0.1mg·L^-1培养基上诱导腋芽萌发，不定芽长至2cm左右时切下转入生根培养基1/2MS+生长素NAA 0.1mg·L^-1获得无菌苗；

2)农杆菌悬浮液制备

菊花‘钟山红枫’DREBa基因的克隆、植物表达载体构建与农杆菌转化

①DREBa基因克隆与连接

以菊花品种‘钟山红枫’(中国菊花研究网，http://www.chrysanthemum.cn)RNA[总RNA提取方法参照J.萨姆布鲁克等著，分子克隆实验指南(第三版)(上册)，北京科学出版社]为模板进行RT-PCR(Reverse transcription PCR，以RNA为模板反转录合成双链cDNA的PCR)扩增合成DREBa基因的cDNA开放阅读框ORF(Open Reading Frame)[洪波等，AtDREB1A基因在菊花中的异源表达提高了植株对干旱和盐渍胁迫的耐性，中国科学C辑，2006，36(3)：223-231]，扩增引物如下(下划线部分为酶切位点，BamHI和Kpn I分别为酶切正向引物和反向引物的内切酶)：

                 BamH I

正向引物：5’-CGCGGATCCATGGATATCGAATCACACTAC-3’

                  Kpn I

反向引物：5’-CGGGGTACCTCACTAAGAACACCACAACGA-3’

扩增体系(25μL)：

10×buffer 2.5μL，25mM MgCl₂ 1.5μL，2.5mM dNTP 2.0μL，20μM正向引物1.0μL，20μM反向引物1.0μL，Taq酶1U，Template cDNA 1.0μL，ddH₂O 16.0μL。

扩增程序：

95℃ 5min；94℃ 1min，60℃ 1min，72℃ 1min，35 cycles；72℃ 10min。4℃保存。

用琼脂糖凝胶电泳回收纯化以上RT-PCR目的产物片段872bp，与T-载体(T-easyVector)连接后转化大肠杆菌DH5α感受态，进行LB+50mg·L^-1氨苄青霉素平板培养，培养条件为37℃和16h，挑取白色克隆接种于LB液体培养基进行培养，培养条件为37℃和16h，提取含有DREBa基因片段的T-载体质粒，测序验证；

②pCAMBIA1301-DREBa植物表达载体构建与DH5α转化

用BamH I和KpnI双酶切连接到T-载体的DREBa基因，电泳回收目的片段，与用BamH I和Kpn I双酶切过的植物表达载体pCAMBIA 1301[高秀丽，微测序基因芯片检测质粒pCAMBIA 1301，中国水稻科学，2005，19(2)：181-186]连接，转化大肠杆菌DH5α感受态，挑取阳性克隆接种于LB培养基进行液体培养，培养条件为37℃和16h，提取质粒，BamHI和KpnI双酶切鉴定pCAMBIA1301-DREBa重组质粒；

③pCAMBIA1301-DREBa植物表达载体农杆菌转化与鉴定

pCAMBIA1301-DREBa重组质粒采用液氮冷冻法[朱锦辉，根癌农杆菌感受态细胞的制备以及质粒ProkII对其转化的研究，西北农林科技大学学报(自然科学版)，2006，34(7)：92-95]转化农杆菌LBA4404感受态菌株，于YEP+50mg·L^-1卡那霉素+50mg·L^-1利福平固体培养基划板培养，培养条件为28℃和48h，挑取单克隆于YEP+50mg·L^-1卡那霉素+50mg·L^-1利福平液体培养基震荡培养，培养条件为28℃和12h，震荡速度200r·min^-1，采用碱裂解法(杨献光，碱裂解法提取质粒DNA的研究，生物技术通报，2006，6：24-26)提取重组质粒并进行双酶切检测。经酶切验证含有pCAMBIA1301-DREBa重组质粒的农杆菌菌液则可用于下一步的叶盘侵染。添加终浓度20％(体积比)的甘油至农杆菌菌液，-80℃长期保存；

将-80℃保存的农杆菌菌液常温化冻后于YEP+50mg·L^-1卡那霉素+50mg·L^-1利福平固体培养基划板培养，培养条件为28℃和48h，挑取单克隆接种于30ml YEP+50mg·L^-1卡那霉素+50mg·L^-1利福平液体培养基震荡培养，培养温度为28℃，震荡速度200r·min^-1，至农杆菌长至对数生长期即OD₆₀₀为0.5时，将菌液倒入无菌离心管中，4000rpm离心10min，收集菌体沉淀，用等量30ml MS液体培养基重悬，备用；

3)遗传转化体系建立

在超净工作台上，25天苗龄的无菌苗顶端2-4片幼嫩叶片切成5mm²大小，在黑暗条件下进行下述培养：在MS+细胞分裂素6-BA 1.0mg·L^-1+生长素NAA 1.0mg·L^-1培养基上预培养3d，在上述制备的农杆菌悬浮液中侵染10min，用无菌滤纸吸干叶面菌液，放置于MS+细胞分裂素6-BA 1.0mg·L^-1+生长素NAA 1.0mg·L^-1上25℃共培养3d，转入脱菌培养基MS+细胞分裂素6-BA 1.0mg·L^-1+生长素NAA 1.0mg·L^-1+羧苄青霉素Carb 350mg·L^-1上脱菌培养3d，然后转入筛选培养基MS+细胞分裂素6-BA 1.0mg·L^-1+生长素NAA 1.0mg·L^-1+潮霉素Hyg 8mg·L^-1+羧苄青霉素Carb 250mg·L^-1上培养至诱导出愈伤组织，之后转入低选择压的筛选培养基MS+细胞分裂素6-BA 1.0mg·L^-1+生长素NAA 1.0mg·L^-1+潮霉素Hyg 6mg·L^-1+羧苄青霉素Carb 150mg·L^-1上继续培养至萌发不定芽点，以上黑暗培养时温度均为26±2℃，共培养时除外；

切取带有不定芽点的愈伤块转入不加抗生素的再生培养基MS+细胞分裂素6-BA 1.0mg·L^-1+生长素NAA 1.0mg·L^-1上，在温度为26±2℃，光照时间为16h·d^-1的条件下培养，待不定芽长至2.0cm左右时，切下不定芽转入生根筛选培养基1/2MS+生长素NAA 0.1mg·L^-1+潮霉素Hyg 7mg·L^-1，获得具有潮霉素抗性的生根苗，将生根苗转入1/2MS+生长素NAA 0.1mg·L^-1培养基中正常生根；

4)遗传转化植株的获得

待抗性植株长出8-10片叶时，取其嫩叶，采用CTAB法(邹喻萍，系统与进化学中的分子标记[M]，科学出版社，2001：3-9)提取基因组DNA。根据潮霉素磷酸转移酶基因HPT两端序列合成扩增反应引物(由上海英骏生物技术有限公司合成)Hyg-F(正向序列)和Hyg-R(反向序列)

Hyg-F：5′-CGTCTGTCGAGAAGTTTC-3′

Hyg-R：5′-TACTTCTACACAGCCATC-3′

分别以抗性植株和未转化的野生植株的DNA为模板，以Hyg-F和Hyg-R为引物，进行PCR扩增，PCR鉴定结果显示抗性植株在近1000bp下方扩增出一条清晰的条带，未转化植株则没有扩增出相应的条带，扩增产物经测序分析表明与潮霉素磷酸转移酶基因HPT核苷酸序列一致(950bp)，证实外源基因已转入地被菊基因组DNA中(图6)，初步获得了PCR检测单株60个，对单株进行扩繁获得60个转基因株系。

扩增体系为：1ul DNA模板，2ul dNTP Mixture(各2.5mM)，2.5ul 10 x PCR Buffer，1.5ulMgCl₂(2.5mM)，1U Taq酶，Hyg-F和Hyg-R(20uM)各1ul，去离子水补足25uL。

扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。

序列表

<110>南京农业大学

<120>一种匍匐型地被菊遗传转化的方法

<130>说明书

<140>00

<141>2008-08-08

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>Hyg-F

<222>(1)..(18)

<223>

<400>1

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>Hyg-R

<222>(1)..(18)

<223>

<400>2

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>DREBa基因扩增引物正向序列

<222>(1)..(30)

<223>

<400>3

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>DREBa基因扩增引物反向序列

<222>(1)..(30)

<223>

<400>4

<210>5

<211>872

<212>DNA

<213>菊花

<220>

<221>DREBa基因

<222>(1)..(872)

<223>

<400>5

Claims (1)

1、一种匍匐型地被菊遗传转化的方法，包括：

1)无菌苗的获得

于秋末取匍匐型地被菊脚芽，洗涤剂清洗15min，流水冲洗2h，滤纸吸干水分，无菌条件下依次用体积比为70％的乙醇浸泡30s，质量百分比为0.1％的升汞溶液消毒6min，无菌水冲洗4次，切取0.5cm带腋芽的茎段，接种于MS+细胞分裂素6-BA1.0mg·L^-1+生长素NAA0.1mg·L^-1培养基上诱导腋芽萌发，不定芽长至2cm左右时切下转入生根培养基1/2MS+生长素NAA0.1mg·L^-1获得无菌苗；

2)农杆菌悬浮液制备

菊花‘钟山红枫’DREBa基因的克隆、植物表达载体构建与农杆菌转化①DREBa基因克隆与连接

以菊花品种‘钟山红枫’RNA为模板进行RT-PCR扩增合成DREBa基因的cDNA开放阅读框ORF，扩增引物如下：

                 BamHI

正向引物：5’-CGCGGATCCATGGATATCGAATCACACTAC-3’

                  Kpn I

反向引物：5’-CGGGGTACCTCACTAAGAACACCACAACGA-3’

用琼脂糖凝胶电泳回收纯化以上RT-PCR目的产物片段872bp，与T-载体连接后转化大肠杆菌DH5α感受态，进行LB+50mg·L^-1氨苄青霉素平板培养，培养条件为37℃和16h，挑取白色克隆接种于LB培养基进行液体培养，培养条件为37℃和16h，提取含有DREBa基因片段的T-载体质粒，测序验证；

②pCAMBIA1301-DREBa植物表达载体构建与DH5α转化

用BamH I和Kpn I双酶切连接到T-载体的DREBa基因，电泳回收目的片段，与用BamH I和Kpn I双酶切过的植物表达载体pCAMBIA 1301连接，转化大肠杆菌DH5α感受态，挑取阳性克隆接种于LB培养基进行液体培养，培养条件为37℃和16h，提取质粒，BamHI和KpnI双酶切鉴定pCAMBIA1301-DREBa重组质粒；

③pCAMBIA1301-DREBa植物表达载体农杆菌转化与鉴定

pCAMBIA1301-DREBa重组质粒采用液氮冷冻法转化农杆菌LBA4404感受态菌株，于YEP+50mg·L^-1卡那霉素+50mg·L^-1利福平固体培养基划板培养，培养条件为28℃和48h，挑取单克隆于YEP+50mg·L^-1卡那霉素+50mg·L^-1利福平液体培养基震荡培养，培养条件为28℃和12h，震荡速度200r·min^-1，采用碱裂解法提取重组质粒并进行双酶切检测，经酶切验证含有pCAMBIA1301-DREBa重组质粒的农杆菌菌液则可用于下一步的叶盘侵染。添加终浓度体积比20％的甘油至农杆菌菌液，-80℃长期保存；

将-80℃保存的农杆菌菌液常温化冻后于YEP+50mg·L^-1卡那霉素+50mg·L^-1利福平固体培养基划板培养，培养条件为28℃和48h，挑取单克隆接种于30ml YEP+50mg·L^-1卡那霉素+50mg·L^-1利福平液体培养基震荡培养，培养温度为28℃，震荡速度200r·min^-1，至农杆菌长至对数生长期即OD₆₀₀为0.5时，将菌液倒入无菌离心管中，4000rpm离心10min，收集菌体沉淀，用等量30ml MS液体培养基重悬，备用；

3)遗传转化体系建立

在超净工作台上，25天苗龄的无菌苗顶端2-4片幼嫩叶片切成5mm²大小，在黑暗条件下进行下述培养：在MS+细胞分裂素6-BA1.0mg·L^-1+生长素NAA1.0mg·L^-1培养基上预培养3d，在上述制备的农杆菌悬浮液中侵染10min，用无菌滤纸吸干叶面菌液，放置于MS+细胞分裂素6-BA1.0mg·L^-1+生长素NAA1.0mg·L^-1上25℃共培养3d，转入脱菌培养基MS+细胞分裂素6-BA1.0mg·L^-1+生长素NAA1.0mg·L^-1+羧苄青霉素Carb350mg·L^-1上脱菌培养3d，然后转入筛选培养基MS+细胞分裂素6-BA1.0mg·L^-1+生长素NAA1.0mg·L^-1+潮霉素Hyg8mg·L^-1+羧苄青霉素Carb250mg·L^-1上培养至诱导出愈伤组织，之后转入低选择压的筛选培养基MS+细胞分裂素6-BA1.0mg·L^-1+生长素NAA1.0mg·L^-1+潮霉素Hyg6mg·L^-1+羧苄青霉素Carb150mg·L^-1上继续培养至萌发不定芽点，以上黑暗培养时温度均为26±2℃，共培养时除外；

切取带有不定芽点的愈伤块转入不加抗生素的再生培养基MS+细胞分裂素6-BA1.0mg·L^-1+生长素NAA1.0mg·L^-1上，在温度为26±2℃，光照时间为16h·d^-1的条件下培养，待不定芽长至2.0cm左右时，切下不定芽转入生根筛选培养基1/2MS+生长素NAA 0.1mg·L^-1+潮霉素Hyg7mg·L^-1，获得具有潮霉素抗性的生根苗，将生根苗转入1/2MS+生长素NAA0.1mg·L^-1培养基中正常生根；

4)转基因植株的获得

待抗性植株长出8-10片叶时，取其嫩叶，采用CTAB法提取基因组DNA，根据潮霉素磷酸转移酶基因HPT两端序列合成扩增反应引物Hyg-F正向序列和Hyg-R反向序列

Hyg-F：5′-CGTCTGTCGAGAAGTTTC-3′

Hyg-R：5′-TACTTCTACACAGCCATC-3′

以抗性植株的DNA为模板，以Hyg-F和Hyg-R为引物，进行PCR扩增，PCR鉴定结果显示抗性植株扩增出一条清晰的条带950bp，与潮霉素磷酸转移酶基因HPT核苷酸序列一致，证实外源基因已转入地被菊基因组DNA中，获得转基因植株。

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