CN107916273A - 一种双孢蘑菇遗传转化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种双孢蘑菇遗传转化的方法，涉及双孢蘑菇分子遗传转化技术领域。本发明公开的方法包括：将双孢蘑菇液体菌丝接种至米粒培养基中，置于20‑25℃条件下进行预培养，培养至米粒表面长出双孢蘑菇菌丝；其中，预培养期间每天摇匀米粒培养基。该方法以米粒作为双孢蘑菇菌丝生长的附着基质，在预培养期间和共培养期间每天摇匀培养基质，使菌丝在米粒上均匀生长，且通过摇动时产生的撞击力能使附着在米粒上的菌丝随机产生伤口，更利于农杆菌进行侵染，提高转化率。与现有的遗传转化方法相比，本发明的方法操作方便，转化效率高，转化子易分离，具有良好的应用前景。

Description

一种双孢蘑菇遗传转化的方法
技术领域
本发明涉及双孢蘑菇分子遗传转化技术领域，具体而言，涉及一种双孢蘑菇遗传转化的方法。
背景技术
遗传转化技术是进行双孢蘑菇分子育种和基因功能研究的重要手段之一。但食用菌基因工程研究起步较晚，没有一个稳定、高效的外源基因转化系统是制约利用分子生物学方法进行双孢蘑菇遗传改造的主要障碍。现有报道中，食用菌例如双胞蘑菇转化用的培养基大多是马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)，其转化效率低，后期阳性转化子难于分离。
发明内容
本发明的目的在于提供一种双孢蘑菇遗传转化的方法，其操作方便，转化效率高，转化子易分离，具有良好的应用前景。
本发明是这样实现的：
一种双孢蘑菇遗传转化的方法，其包括：
步骤(a)：将双孢蘑菇液体菌丝接种至米粒培养基中，置于20-25℃条件下进行预培养，培养至米粒表面长出双孢蘑菇菌丝；
预培养期间每天摇匀米粒培养基；
步骤(b)：将长有双孢蘑菇菌丝的米粒与诱导培养基混合，经超声处理和浸泡处理后，弃上清液，取沉淀下的米粒；
步骤(c)：将步骤(b)得到的米粒与含有目的基因的农杆菌侵染液混合，经超声处理和静置侵染后，吸掉多余的农杆菌菌液，置于20～25℃条件下进行共培养；
共培养期间每天摇匀米粒；
步骤(d)：共培养结束后，挑取单颗米粒转入筛选培养基，置于20～25℃条件下进行筛选培养。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，按每100ml计，所述诱导培养基含有：K-buffer 0.8-1.2ml、M-N solution 1.8-2.2ml、1％ CaCl2 0.08-0.12ml、0.01％ FeSO40.8-1.2ml、20％ NH4NO3 0.23-0.27ml、Spore elements 0.48-0.52ml、50％甘油0.8-1.2ml、1mol/L pH5.3MES 3.8-4.2ml以及2mol/L葡萄糖0.48-0.52ml。
优选地，在本发明的一些实施方案中，按每100ml计，所述诱导培养基含有：K-buffer 1ml、M-N solution 2ml、1％ CaCl2 0.01ml、0.01％ FeSO4 1ml、20％ NH4NO30.25ml、Spore elements 0.5ml、50％甘油1ml、1mol/L pH5.3的MES 4ml、2mol/L葡萄糖0.5ml。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，按每100ml计，K-buffer含有：K2HPO4 18-22g、KH2PO4 14-15g；pH 6.8-7.2。
优选地，在本发明的一些实施方案中，按每100ml计，K-buffer含有：K2HPO4 20g、KH2PO4 14.5g；pH 7.0。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，按每100ml计，M-N solution含有：MgSO4·7H2O 2.8-3.2g和NaCl 1.3-1.7g。
优选地，在本发明的一些实施方案中，按每100ml计，M-N solution含有：MgSO4·7H2O 3g和NaCl 1.5g。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，Spore elements由500mg/L的ZnSO4·7H2O、500mg/L的CuSO4·5H2O、500mg/L的H3BO3、500mg/L的MnSO4·H2O以及500mg/L的NaMoO4·2H2O以等体积混合得到。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在步骤(b)中，米粒与诱导培养基的质量体积比(g：ml)为1:1.3-1.7；在步骤(c)中，农杆菌侵染液的用量与步骤(b)中的诱导培养基的用量一致。
优选地，在本发明的一些实施方案中，在步骤(b)中，米粒与诱导培养基的质量体积比(g：ml)为1:1.5。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在步骤(b)中，超声处理的频率为40～60KHz，功率为140～160W，时间为1min～2min；浸泡处理的时间为：10～15min。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在步骤(c)中，超声处理的频率为40～60KHz，功率为140～160W，时间为10s～30s；静置侵染的时间为：20-30min。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，按每L计，所述筛选培养基含有：马铃薯190-210g、葡萄糖18-22g以及琼脂粉18-22g。
需要说明的是：
步骤(a)中的米粒培养基可通过如下方法但不限于由以下方法制备得到：将米粒清洗干净，用蒸馏水浸泡至米粒微软，散开到纱布上，吸干水分，再装入三角瓶中，高温高压灭菌即得。
步骤(a)中的双孢蘑菇液体菌丝可通过如下方法但不限于由以下方法制备得到：将在固体培养基上培养的双孢蘑菇菌丝，与培养基一起挑入均质仪中，加入液体培养基，间歇打碎，得到双孢蘑菇液体菌丝。
步骤(c)中的农杆菌侵染液可通过如下方法但不限于由以下方法制备得到：将含有双元表达载体的农杆菌在含有相应抗生素的固体培养基上划线接种，28℃培养2～3天；再挑取单菌落接种于液体培养基中，28℃、180～220r/min培养至OD600＝0.5～0.6；然后取农杆菌菌液重悬于诱导培养基中，28℃、180～220r/min培养至OD600＝0.5～0.6，即可作为侵染使用的农杆菌侵染液。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的双孢蘑菇遗传转化的方法，其以米粒作为双孢蘑菇菌丝生长的附着基质，在预培养期间和共培养期间每天摇匀培养基质，使菌丝在米粒上均匀生长，且通过摇动时产生的撞击力能随机使附着在米粒上的菌丝产生伤口，更利于农杆菌侵染反应，提高转化率；
通过超声处理可以明显促进农杆菌侵染菌丝，提高转化率；且每一粒米粒都可作为一个单独的转化个体，操作以及统计更加快捷方便，也易于分离。
与现有的遗传转化方法相比，本发明提供的双孢蘑菇遗传转化的方法操作方便，转化效率高，转化子易分离，具有良好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例中的转化子在复筛培养基上的生长情况；
图2为本发明实施例中的转化子的绿色荧光蛋白(EGFP)的表达结果；图中：A:绿色激发光视野；B:白光视野；C:白光视野和激发光视野的叠加图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例
本实施例提供的双孢蘑菇遗传转化的方法，步骤如下。
1制备米粒培养基
1.1将小米清洗干净，用蒸馏水浸泡20分钟至小米微软，散开到干净的纱布上，吸干水分；
1.2称取小米粒30g，装入250ml的三角瓶中，高温高压灭菌(120℃，30min)，制得小米粒培养基。
2制备含双孢蘑菇液体菌丝
将在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上培养20天的双孢蘑菇单核体s73菌丝，带培养基(50mm×50mm)一起挑入均质仪中，加入100ml马铃薯葡萄糖培养基(PDB)，间歇打碎30s，得到含双孢蘑菇液体菌丝。
3制备农杆菌侵染液
3.1将含有双元表达载体pYN6981(含目的基因EGFP)的农杆菌在含有相应抗生素(利福平rif 20mg/L，卡那霉素Kan 50mg/L)的LB固体平板上划线接种，28℃培养2天；
其中，按1L计，LB固体培养基含有：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15g。
3.2挑取单菌落接种于5mL LB液体培养基中(含利福平rif 20mg/L，卡那霉素Kan50mg/L)，28℃、200r/min培养至OD600＝0.5～0.6；
其中，按1L计，LB液体培养基配方：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g。
3.3取200ul步骤3.2得到的农杆菌菌液，重悬于5mL诱导培养基中(添加乙酰丁香酮AS 200μmol/L)，28℃、200r/min培养至OD600＝0.5～0.6，得到农杆菌侵染液。
其中，100ml诱导培养基通过如下方法制备：取K-buffer 1ml、M-N solution 2ml、1％ CaCl2 0.01ml、0.01％ FeSO4 1ml、20％ NH4NO3 0.25ml、Spore elements 0.5ml、50％甘油1ml、1mol/L pH5.3的MES 4ml、2mol/L葡萄糖0.5ml；用无菌ddH2O定容至100ml。
其中：
100ml的K-buffe通过如下方法制得：取K2HPO4 20g、KH2PO414.5g；用KOH调pH值至7.0，无菌ddH2O定容至100ml；
100ml的M-N solution通过如下方法制得：取MgSO4·7H2O 3g和NaCl 1.5g，无菌ddH2O定容至100ml；
Spore elements通过如下方法制得：500mg/L的ZnSO4·7H2O、500mg/L的CuSO4·5H2O、500mg/L的H3BO3、500mg/L的MnSO4·H2O以及500mg/L的NaMoO4·2H2O以等体积混合，过滤除菌，4℃保存。
4取10ml步骤2得到的含双孢蘑菇菌丝的菌液，将其接入小米粒培养基，置于25℃预培养，培养期间每天摇匀(或摇动)小米粒培养基培养至米粒表面长出双孢蘑菇菌丝，得到小米粒-双孢蘑菇菌丝复合体。
5取培养好的小米粒-双孢蘑菇菌丝复合体1g左右加入玻璃小试管中，加入诱导培养基1.5ml，用上海科导超声仪器有限公司的双频超声波清洗器超声1min，频率40KHz、功率160W，然后静置浸泡10min，吸掉上清液，保留沉淀下的米粒。
6往步骤5中的米粒中加入农杆菌侵染液1.5ml，用上海科导超声仪器有限公司的双频超声波清洗器超声10s(频率40KHz、功率160W)，静置侵染20min，吸掉多余菌液，25℃静置共培养72小时以上，共培养期间每天摇匀2次。
7共培养结束后，挑取单粒小米粒转入初筛培养基平板，每个平板接20粒，25℃培养10天；
8把小米粒周围的菌丝重新挑到复筛培养基，平板中间设置没有被农杆菌侵染的菌丝作为对照，25℃培养，观察菌丝的生长情况。
9转化子的筛选验证
选取在复筛培养基上长出菌丝的转化子(如图1所示)，挑取其菌丝进行菌落PCR，选取经PCR验证正确的菌丝保存或进行后续实验。
每一粒米粒都可作为一个单独的转化个体，操作以及统计更加快捷方便，也易于分离(如图1所示)。
其中，初筛培养基和复筛培养基成分基本一致，通过如下方法制得：取马铃薯200g；葡萄糖20g；琼脂粉20g；用ddH2O定容至1L，高温高压灭菌后添加潮霉素，初筛培养基添加5mg/L，复筛培养基添加10mg/L，头孢噻肟钠400mg/L。
PCR鉴定的方法如下：
(1)用灭菌牙签在平板表面刮取幼嫩气生菌丝2～3次，至牙签头部有肉眼可见的菌丝团(菌丝重量＜0.001g)，将带有菌丝团的牙签置于预先加入100ul TE buffer的小离心管(200μL)中搅动数次，使菌丝全部分散在离心管中(牙签置于离心管中的时间不要过长，否则会影响裂解液的体积，并会影响PCR扩增效)；
(2)将离心管置于微波炉中加热1min45s，取出离心管立即置于冰上并用移液器反复吹打，使其混匀，取上清液进行PCR扩增。
(3)PCR扩增体系为：总体积20μL，包括：10×PCR buffer 2μL，25mmol/L MgCl2 2μL，10mmol/L dNTP 0.4μL，5U/μL Taq DNA酶0.2μL，10μmol/L正向引物Hyg-F和反向引物Hyg-R各1μL，上清液2μL，ddH2O 11.4μL；
PCR反应条件：94℃5min；94℃30second，56℃40second，72℃30second，30个循环；72℃8min。
所用潮霉素引物为：
Hyg-F：GATGTTGGCGACCTCGTATT；
Hyg-R：TCGTTATGTTTATCGGCACTTT；
(4)PCR产物送上海杰李生物技术公司测序验证；
10统计阳性转化率，结果显示阳性转化率为42.3％。阳性转化率＝阳性转化子数/总转化子数。
11取在复筛培养基上长出的菌丝，于激光共聚焦显微镜下观察目的基因EGFP表达情况，结果如图2所示。
图2显示，菌丝有绿色荧光，表明目的基因EGFP转化成功并在宿主菌丝体内成功表达。
综上，本发明提供的双孢蘑菇遗传转化的方法，其以米粒作为双孢蘑菇菌丝生长的附着载体，在预培养期间和共培养期间每天摇匀培养基质，使菌丝在米粒上均匀生长，且通过摇动时产生的撞击力能随机使附着在米粒上的菌丝产生伤口，更利于与农杆菌进行侵染反应，大大地提高了转化率。且通过超声处理可以明显促进农杆菌侵染菌丝，提高转化率；且每一粒米粒都可作为一个单独的转化个体，操作以及统计更加快捷方便，也易于分离。
总之，与现有的遗传转化方法相比，本发明提供的双孢蘑菇遗传转化的方法操作方便，转化效率高，转化子易分离，具有良好的应用前景。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种双孢蘑菇遗传转化的方法，其特征在于，其包括：
步骤(a)：将双孢蘑菇液体菌丝接种至米粒培养基中，置于20-25℃条件下进行预培养，培养至米粒表面长出双孢蘑菇菌丝；
预培养期间每天摇匀米粒培养基；
步骤(b)：将长有双孢蘑菇菌丝的米粒与诱导培养基混合，经超声处理和浸泡处理后，弃上清液，取沉淀下的米粒；
步骤(c)：将步骤(b)得到的米粒与含有目的基因的农杆菌侵染液混合，经超声处理和静置侵染后，吸掉多余的农杆菌菌液，置于20～25℃条件下进行共培养；
共培养期间每天摇匀米粒；
步骤(d)：共培养结束后，挑取单颗米粒转入筛选培养基，置于20～25℃条件下进行筛选培养。
2.根据权利要求1所述的双孢蘑菇遗传转化的方法，其特征在于，按每100ml计，所述诱导培养基含有：K-buffer 0.8-1.2ml、M-N solution 1.8-2.2ml、1％CaCl2 0.08-0.12ml、0.01％FeSO4 0.8-1.2ml、20％NH4NO3 0.23-0.27ml、Spore elements 0.48-0.52ml、50％甘油0.8-1.2ml、1mol/L pH5.3 MES 3.8-4.2ml、2mol/L葡萄糖0.48-0.52ml。
3.根据权利要求2所述的双孢蘑菇遗传转化的方法，其特征在于，按每100ml计，K-buffer含有：K2HPO4 18-22g、KH2PO4 14-15g；pH 6.8-7.2。
4.根据权利要求2所述的双孢蘑菇遗传转化的方法，其特征在于，按每100ml计，M-Nsolution含有：MgSO4.7H2O 2.8-3.2g和NaCl 1.3-1.7g。
5.根据权利要求2所述的双孢蘑菇遗传转化的方法，其特征在于，Spore elements由500mg/L的ZnSO4·7H2O、500mg/L的CuSO4·5H2O、500mg/L的H3BO3、500mg/L的MnSO4·H2O以及500mg/L的NaMoO4·2H2O以等体积混合得到。
6.根据权利要求1所述的双孢蘑菇遗传转化的方法，其特征在于，在步骤(b)中，米粒与诱导培养基的质量体积比(g：ml)为1:1.3-1.7；在步骤(c)中，农杆菌侵染液的用量与步骤(b)中的诱导培养基的用量一致。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的双孢蘑菇遗传转化的方法，其特征在于，在步骤(b)中，超声处理的频率为40～60KHz，功率为140～160W，时间为1min～2min；浸泡处理的时间为：10～15min。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的双孢蘑菇遗传转化的方法，其特征在于，在步骤(c)中，超声处理的频率为40～60KHz，功率为140～160W，时间为10s～30s；静置侵染的时间为：20-30min。
9.根据权利要求1-6中任一项所述的双孢蘑菇遗传转化的方法，其特征在于，按每L计，所述筛选培养基含有：马铃薯190-210g、葡萄糖18-22g以及琼脂粉18-22g。
10.根据权利要求1-6中任一项所述的双孢蘑菇遗传转化的方法，步骤(a)中的米粒培养基可通过如下方法制备得到：将米粒清洗干净，用蒸馏水浸泡至米粒微软，散开到纱布上，吸干水分，再装入三角瓶中，高温高压灭菌即得。
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