KR20150044188A - 새송이버섯 형질전환용 재조합 벡터 및 이를 이용한 목적 단백질 제조방법 - Google Patents
새송이버섯 형질전환용 재조합 벡터 및 이를 이용한 목적 단백질 제조방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20150044188A KR20150044188A KR20130123254A KR20130123254A KR20150044188A KR 20150044188 A KR20150044188 A KR 20150044188A KR 20130123254 A KR20130123254 A KR 20130123254A KR 20130123254 A KR20130123254 A KR 20130123254A KR 20150044188 A KR20150044188 A KR 20150044188A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- mushroom
- transformation
- vector
- mushrooms
- protein
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 70
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 46
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 37
- 230000009466 transformation Effects 0.000 title claims abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 244000252132 Pleurotus eryngii Species 0.000 title abstract description 8
- 235000001681 Pleurotus eryngii Nutrition 0.000 title abstract description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 4
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 claims abstract description 48
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 claims description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 4
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 claims description 2
- 241000589159 Agrobacterium sp. Species 0.000 claims 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 claims 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 abstract description 6
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 abstract description 6
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 abstract description 6
- 230000006798 recombination Effects 0.000 abstract description 5
- 238000005215 recombination Methods 0.000 abstract description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000003257 protein preparation method Methods 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 32
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 13
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 10
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 8
- OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N acetosyringone Chemical compound COC1=CC(C(C)=O)=CC(OC)=C1O OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000001965 potato dextrose agar Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- VLEIUWBSEKKKFX-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O VLEIUWBSEKKKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 description 2
- 102000038461 Growth Hormone-Releasing Hormone Human genes 0.000 description 2
- 239000000095 Growth Hormone-Releasing Hormone Substances 0.000 description 2
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 2
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 2
- 101710142969 Somatoliberin Proteins 0.000 description 2
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 2
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000221198 Basidiomycota Species 0.000 description 1
- 241000222455 Boletus Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 206010013883 Dwarfism Diseases 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N N-[2-oxo-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 240000001462 Pleurotus ostreatus Species 0.000 description 1
- 235000001603 Pleurotus ostreatus Nutrition 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 244000184734 Pyrus japonica Species 0.000 description 1
- 208000007660 Residual Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 1
- -1 acetosyringone Chemical class 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004198 anterior pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- CRZXNIPRLGELRX-UHFFFAOYSA-L calcium sulfate hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.S(=O)(=O)([O-])[O-].[Ca+2] CRZXNIPRLGELRX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 244000000004 fungal plant pathogen Species 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 1
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 230000031068 symbiosis, encompassing mutualism through parasitism Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 버섯 형질전환용 재조합 벡터 및 이를 이용한 목적 단백질 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 버섯 형질전환에 적합한 발현 컨스트럭트를 포함하는 벡터 및 이를 이용한 형질전환 버섯으로부터 성장 호르몬 단백질 등의 다양한 목적 단백질을 성공적으로 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 재조합 발현 벡터는 버섯을 형질전환 하는 데에 매우 적합하며, 다양한 단백질을 버섯, 특히 새송이 버섯에서 발현 및 수득할 수 있도록 한다.
Description
본 발명은 새송이버섯 형질전환용 재조합 벡터 및 이를 이용한 목적 단백질 제조방법에 관한 것이다.
유용 단백질 소재는 인체 치료용뿐만 아니라 산업용으로도 사용함으로써 그 활용 폭이 점점 확대되고 있어, 전 세계적으로 그 중요성이 부각되고 있다. 그러나 이러한 유용 단백질들은, 특히 동물 유래의 단백질의 경우 생체에서 미량으로 만들어지기 때문에 치료 목적으로 단백질을 사용하기 위해서는 대량 생산이 필요할 뿐만 아니라, 혈액에서 분리하는 단백질의 경우에는 바이러스 등의 감염 위험성, 잠재적인 암 유발인자의 잔류 가능성 등과 같은 심각한 문제점을 가지고 있다. 상기의 여러 가지 문제점을 해결하기 위하여 유용 단백질의 유전자를 미생물 등의 단백질 발현 숙주 세포에서 대량으로 생산하는 유전자 재조합 기술을 이용함으로써 해결할 수가 있다. 유전자 재조합 기술은 산업적, 의학적으로 중요한 기능을 갖는 단백질(효소, 호르몬, 성장인자 등)을 미생물, 효모 등의 세포에 해당 유전자를 도입하여 목적하는 단백질을 합성하도록 하는 기술로서 생체 유래 생리 활성 단백질의 대량생산이 가능하게 하는 기술이다. 재조합 단백질 제품으로 1982년 Genentech 사가 대장균에서 생산한 사람 인슐린이 FDA의 승인받아 최초로 판매된 이래로, 산업자원부의 산업기술개발 사업보고서에 의하면 단백질 제품은 2005년 기준 약 130여 종의 단백질 제품이 판매되고 있으며, 세계 시장 규모는 약 500억 달러에서, 2011년에는 1,100억 달러에 이를 것으로 예측되고 있는 고부가가치의 산업으로 전 세계적으로 100개 이상의 다국적기업이 참여하고 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 유전자 재조합 기술을 이용한 단백질 생산은 단백질 시장에 매우 빠른 속도로 확장되고 있다. 재조합 단백질은 사용 목적, 단백질의 종류 및 생산 규모에 따라 여러 종류의 발현시스템을 사용하여 생산되고 있으며 대표적으로 많이 쓰이는 세포는 대장균이나 효모와 같은 미생물을 이용하거나 곤충세포, 동물세포, 식물세포를 이용하고 있다. 특히, 대장균을 이용한 단백질 발현은 유전자 조작이 쉽고, 균체의 성장 속도가 빠르며, 배양이 용이하고, 비교적 많은 양으로 생산하여 경제적인 방법으로 단백질 합성이 가능하다. 그러나 당화 단백질(glycoprotein)과 같은 진핵세포 유래의 단백질을 생산하고자 할 경우에는 대장균이 당화 단백질을 합성하지 못하고 많은 단백질의 경우 접힘(folding)이 제대로 이루어지지 않는 봉입체(inclusion body) 형태의 불용성 단백질로 생산되어 생물학적 활성을 갖게 하기 위해서는 재접힘(refolding) 공정이 필요하고, 분비 단백질의 생산이 어려움 등의 여러 가지 문제점을 가지고 있다. 초기의 재조합 단백질 의약품은 주로 대장균에서 생산하였으나 기술이 발전함에 따라 2000년대에는 대장균에서 생산한 재조합 단백질의 비율이 감소한 반면, 효모나 곤충, 식물 및 동물세포에서의 생산이 증가하고 있다. 동물세포나 곤충세포의 경우에는 인체 유래 단백질을 대부분 완전한 활성형의 단백질로 생산이 가능하다는 장점을 가지고 있으나 배양 시간이 길며, 배양 조건이 까다롭고, 배지의 가격이 비싸다는 문제점을 가지고 있다. 식물을 이용하여 생산한 재조합 단백질은 인체 유래 유용 단백질들의 생물학적 활성에 필수적인 당화, 인산화 등과 같은 화학적 수식 작용을 가지고 있다. 또한 생물학적 안전성을 갖는 단백질을 생산할 수 있다는 장점을 가지고 있으며, 당(sugar)과 염(salt)을 주 배지 성분으로 사용하여 경제적인 면에서도 저렴하게 생산이 가능하나 느린 성장속도, 낮은 수율 등의 단점들을 지니고 있다(Biotechnol. Bioeng. 1997, 56, 473-484). 상기의 재조합 단백질의 생산 시스템이 가지고 있는 여러 가지 문제점들로 인하여 현재 새로운 재조합 단백질의 생산 시스템의 필요성이 대두 되고 있다.
버섯은 분류학상으로 고등균류 중 진균류(Eumycetes)에 속하며, 대부분은 담자균류에 속한다. 새송이버섯은 남유럽 일대, 북아프리카, 동아시아, 남러시아 등지에 분포하고 있으며 식용으로 널리 사용되어 왔고, 학명은 Pleurotus eryngii이며, 분류학적으로 진정담자균강, 동담자균아강(모균아강), 주름버섯목, 느타리과에 속하는 담자균류(Basidiomycetes)의 일종이다. 일반명은 왕굴버섯(King Oyster Mushroom) 또는 초원버섯(Boletus of the Steppes)이며, 우리나라에서는 큰느타리버섯 또는 왕느타리버섯으로 알려져 왔다. 이 버섯은 죽은 나무의 그루터기 또는 줄기에 부착하여 자생하는 기생균으로서 몇몇 식물의 조직에서도 생장이 가능하며, 산형과, 분과, 부처꽃과 등 초본식물의 뿌리에 질병을 유발시키는 병원균으로 보고되어 있다.
한편, 그람 음성 박테리아인 아그로박테리움 투메파시언스(Agrobacterium tumefaciens)은 식물에 뿌리혹병(crown gall)을 일으키는 식물 병원성 균으로 알려져 있다. 아그로박테리움 투메파시언스는 식물 세포 염색체 DNA에 끼어들어갈 수 있는 Ti 플라스미드 DNA를 가지고 있어 목적하고자 하는 유전자를 식물로 도입하는데 많이 이용되고 있다. Ti 플라스미드에는 Ti DNA 운송, 식물세포 염색체 DNA에 삽입되는 과정에 필요한 여려 가지 vir gene 들을 가지고 있으며, 아세토시린곤(acetosyringone)과 같은 방향족 화합물(phenolic compounds)에 의하여 유도되어 Ti 플라스미드 DNA가 식물세포로 운송되어 단일사슬 DNA 형태로 숙주세포의 염색체 DNA에 삽입되는 과정을 거친다 (Plant Physiol, 2000, 124, 13631371). 아그로박테리움으로 매개하여 식물의 형질전환은 식물에 유전자를 도입하기 위하여 오래 동안 사용되어 왔으며, 식물에 돌연변이 도입에도 사용되어 왔으며, 백색부후균의 형질전환 방법으로도 이용되고 있다. 또한 아스퍼질러스(Aspergillus; 누룩곰팡이), 푸사리움(Fusarium; 곰팡이)와 트리코더마(Trichoderma; 곰팡이) 등과 같은 여러 가지 곰팡이 에도 성공적인 형질전환 방법으로 사용되어 왔다(Nature Biotechn., 1998, 16, 839-842; J. Appl. Microbiol, 2002, 92, 189-195; Symbiosis. J, 2006, 41, 71-79). 그러나 현재까지 버섯류에서 유용한 단백질을 생산하는 유전자를 도입하는 형질전환시스템은 시도된 연구가 매우 제한적이어서, 유용 재조합 단백질 생산에 관한 산업화 연구는 아직까지 많이 이루어지지 않고 있다.
유용 단백질 중 하나인 성장 호르몬(growth hormone)은 뇌하수체전엽에서 217개의 아미노산으로 구성된 단백질로 합성된 후, N-말단 부분의 리더서열(leader peptide)이 제거되어 191개(N-말단 알라닌) 또는 190개(N-말단 페닐알라닌) 길이의 분자량이 약 22,000 달톤에 달하는 단백질로 전환되어 생물학적 활성을 갖는다(Pro. Natl. Acad. Sci. 1977, 74, 2432-2436). 성장호르몬의 분비조절은 시상하부(hypothalamus)에서 분비되는 성장호르몬 방출 호르몬(growth hormone releasing hormone, GHRH)에 의해 자극받고, 소마토스타틴(somatostatin)에 의해 분비가 억제된다. 분비된 성장호르몬은 간에서 인슐린유사 성장인자-1(insulin-like growth factor-1, IGF-1)의 생산을 유도하여 단백질, 탄수화물, 지방 및 무기물 대사 조절에 관여하여 성장을 촉진시키는 기능을 하는 단백질로서(Nature, 1982, 300, 611-615), 성장호르몬이 결여된 왜소증 환자의 치료 및 축산업에서 동물의 성장을 촉진하는데 이용이 되고 있다.
본 발명은 유용한 재조합 단백질을 생산할 수 있는 형질전환 백색부후균을 얻기 위하여 아그로박테리움을 이용하여 새송이버섯의 형질전환 방법 및 이러한 방법에 의해 얻은 새송이버섯 형질전환체를 제공하며, 짧은 시간 내에 활성을 갖는 유용 재조합 단백질을 대량생산할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 새송이 버섯 형질전환용 재조합 벡터 및 이를 이용한 목적 단백질 제조방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 새송이버섯 형질전환에 적합한 발현 컨스트럭트를 포함하는 벡터를 구축하였고, 이를 이용하여 새송이버섯을 형질전환시켜 성공적으로 목적 단백질을 생산함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 특징은, 새송이버섯 형질전환용 재조합 벡터를 제공하는데 있다.
그 결과, 새송이버섯 형질전환에 적합한 발현 컨스트럭트를 포함하는 벡터를 구축하였고, 이를 이용하여 버섯을 형질전환시켜 성공적으로 목적 단백질을 생산하였다.
본 발명의 버섯 형질전환용 재조합 벡터에서 프로모터로서 CaMV 35S 프로모터(cauliflower mosaic virus 35S promoter)가 이용된다.
그리고 본 발명의 다른 특징은, 본 발명에서 사용한 비해석 부위는 CaMV 35S 유래의 비해석 부위이다.
본 발명은 버섯 형질전환에 적합한 발현 컨스트럭트를 포함하는 벡터 및 이를 이용한 형질전환 버섯으로부터 성장 호르몬 단백질 등의 목적 단백질을 성공적으로 제조하는 방법을 제공한다.
이러한 결과를 바탕으로 재조합 발현 벡터는 새송이 버섯을 형질전환 하는 데에 매우 적합하며, 다양한 단백질을 버섯, 특히 새송이 버섯에서 발현 및 수득할 수 있도록 한다.
또한, 대량생산이 가능한 단백질 발현시스템 확립으로 산업적으로 활용이 가능하게 한다.
도 1은 본 발명에 따른 재조합 소성장 호르몬을 포함하는 벡터의 제작과정을 나타내는 도면,
도 2는 본 발명에 따라 재조합 소성장 호르몬을 포함하는 벡터의 DNA를 주형으로 하여 PCR로 분석한 bGH 유전자를 확인한 전기영동 사진,
도 3는 본 발명에 따른 재조합 소성장 호르몬을 포함하는 벡터로 형질전환 방법을 나타내는 도면,
도 4는 본 발명에 따라 재조합 소성장 호르몬을 포함하는 벡터로 형질전환된 새송이버섯 형질전환체의 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR로 분석한 bGH 유전자를 확인한 전기영동 사진.
도 5은 본 발명에 따라 재조합 소성장 호르몬을 포함하는 벡터로 형질전환된 새송이버섯 균사체를 배양하였을 때 발현된 bGH 단백질을 웨스턴블럿 방법으로 분석한 사진이다.
도 2는 본 발명에 따라 재조합 소성장 호르몬을 포함하는 벡터의 DNA를 주형으로 하여 PCR로 분석한 bGH 유전자를 확인한 전기영동 사진,
도 3는 본 발명에 따른 재조합 소성장 호르몬을 포함하는 벡터로 형질전환 방법을 나타내는 도면,
도 4는 본 발명에 따라 재조합 소성장 호르몬을 포함하는 벡터로 형질전환된 새송이버섯 형질전환체의 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR로 분석한 bGH 유전자를 확인한 전기영동 사진.
도 5은 본 발명에 따라 재조합 소성장 호르몬을 포함하는 벡터로 형질전환된 새송이버섯 균사체를 배양하였을 때 발현된 bGH 단백질을 웨스턴블럿 방법으로 분석한 사진이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
<실시예 1> 재조합 단백질을 생산하는 벡터 제조
<1-1> 벡터의 제조
대장균 배양액으로부터 알칼리 분리 방법(alkaline lysis method) 에 따라 분리한 pPEV 벡터를 BamHI으로 37에서 2시간 동안 반응시키고 아가로스 겔 전기영동으로 약 10.6 kb 크기의 DNA 단편을 아가로스 겔로부터 추출하였다. 직선화한 pPEV 벡터를 클레노브효소(Klenow enzyme)로 처리하여 벡터의 양쪽 끝을 평할 말단(blunt end)으로 만든 후 다시 아가로스 겔로부터 추출하였다.
<1-2> bGH 유전자의 제조
소 성장호르몬 유전자의 경우 bGH가 클로닝 되어있는 pGEMT-bGH 플라스미드로부터 EcoRI 및 HindIII로 37에서 2시간 동안 반응시키고 아가로스 겔 전기영동으로 약 0.57 kb 크기의 DNA 단편을 아가로스 겔로부터 추출하였다. 분리한 bGH 유전자 단편을 클레노브효소로 처리하여 양쪽 끝을 평할 말단으로 만든 후 다시 아가로스 겔로부터 추출하여 pPEV 벡터에 클로닝할 bGH 유전자 DNA로 사용하였다.
<1-3> 재조합 유전자 벡터의 제조
상기 실시예 <1-1>에서 제조한 평할 말단(blunt end)을 갖는 pPEV 벡터와 상기 실시예 <1-2>에서 제조한 bGH 유전자를 Sam Brook 등의 방법에 따라 pPEV 벡터와 bGH 유전자 단편을 라이게이션(ligation)하고 라이게이션 반응액을 대장균(E. coli XL-1 Blue MRF')에 형질전환 하였다(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1972, 69, 2110-2114). LB 배지에 접종한 E. coli XL-1 Blue MRF'를 600 nm에서 흡광도가 약 0.5가 될 때까지 37에서 200 rpm으로 교반하면서 배양하고, 3500 rpm으로 10분간 원심분리하여 대장균을 회수하고 차가운 0.1 M CaCl2 용액으로 간단하게 세척하여 준 후, 얻어진 대장균을 1/10 부피의 차가운 0.1 M CaCl2 용액에 잘 현탁하여 얼음에서 30분 동안 방치하였다. 원심분리하여 CaCl2로 처리된 대장균을 회수하여 1/2 부피의 차가운 0.1 M CaCl2 용액에 잘 현탁하였다. 대장균 현탁액 200 에 상기의 방법으로 각각 제조한 라이게이션 반응액을 잘 혼합하여 주고, 얼음에서 30분 동안 방치하고 42에서 1분 동안 열 충격을 가한 후 얼음에서 2분 동안 방치하였다. 이 반응액에 0.5 의 LB 배지를 가하고 37에서 1시간 동안 방치하고, 이 용액으로부터 0.1 을 50 /의 카나마이신(kanamycin)을 포함하는 LB 한천 배지에 도말하고 37에서 하루 동안 배양하여 콜로니(colony)가 생성되도록 하였다. 선별된 콜로니로부터 알카리 분해법으로 재조합 벡터를 분리하고, bGH 유전자가 클로닝되어 있는 클론은 PCR을 이용하여 약 0.57 kb 크기의 DNA 밴드를 을 확인하였으며 제조된 재조합 벡터를 pPEV-bGH로 명명하였다(도 1 및 도 2 참조).
<실시예 2> 형질전환
<2-1> 아그로박테리움의 형질전환
새송이버섯(Pleurotus eryngii)에 상기 실시예 1에서 제조한 pPEV-bGH를 도입시키기 위하여 아그로박테리움에 의한 형질전환 방법을 사용하였다(Plasmid, 1978, 1, 456-467). YEP 배지(1% Bacto tryptone, 1% yeast extract, 0.5% NaCl)에 접종한 아그로박테리움 투메파시언스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404를 600 nm에서 흡광도가 약 0.5 가 될 때까지 37에서 200 rpm으로 교반하면서 배양하고, 배양액을 얼음에서 10분간 방치하여 냉각시켰다. 3500 rpm으로 10분간 원심분리하여 균을 회수하고 1 의 차가운 20 mM CaCl2 용액에 잘 현탁하고, 아그로박테리움 현탁액 200 에 상기의 방법으로 각각 제조한 재조합 벡터 pPEV-bGH 용액을 잘 혼합하여 주고, 혼합액을 액체 질소에 방치하여 급속 냉동시킨 후, 얼려진 각 혼합액을 37에서 5분 동안 방치하여 녹여 주었다. 그런 후, 혼합액의 10배 부피의 YEP 배지를 가하여 28에서 2시간 동안 잘 저어 주면서 균을 배양하였다. 3500 rpm으로 10분간 원심분리하여 균을 회수하고, 균을 0.3 의 YEP 배지에 잘 현탁시키고, 이 중 0.1 을 취하여 50 /의 카나마이신을 포함하는 YEP 한천 배지에 도말하고 37에서 하루 동안 배양하여 콜로니(colony)가 생성되도록 하였다. 선별된 콜로니로부터 알카리 분해법으로 각 재조합 벡터를 분리하고, 실시예 1-3에 기재한 방법으로 bGH 유전자가 클로닝되어 있는 클론을 확인하였으며(도 2 참조), DNA 시퀀싱에 의하여 재조합 벡터에 삽입된 유전자의 서열을 최종적으로 확인되었다.
<2-2> 아그로박테리움 투메파시언스에 의한 새송송버섯의 형질전환
아그로박테리움 투메파시언스에 의한 새송이버섯의 형질전환은 Michielse 등의 방법을 약간 수정하여 사용하였다(Nat. Protoc, 2008, 3, 16711678). 간단하게, 상기 실시예 1에서 제조한 pPEV-bGH로 형질전환된 아그로박테리움 LBA4404를 50 /의 카나마이신을 포함하는 5 의 최소배지(0.2% 글루코오스(glucose), 0.205% 다이포타슘 포스페이트(dipotassium phosphate; K2HPO4), 0.145% 모노포타슘 포스페이트(monopotassium phosphate; KH2PO4), 0.015% 소듐클로라이드(sodium choloride; NaCl), 0.05% 마그네슘 설페이트(magnesium sulfate; MgSO47H2O), 0.01% 칼슘클로라이드 헥사하이드레이트(calcium chloride hexahydrate; CaCl26H2O), 0.00025% 페러스 설페이트(ferrous sulfate; FeSO47H2O), 0.05% 암모늄 설페이트(ammonium sulfate; (NH4)2SO4))접종하고 28에서 2일 동안 잘 저어주면서 배양하였다. 아그로박테리움 배양액을 600 nm에서 흡광도가 약 0.5가 되게 유도배지(induction medium) (10 mM 글루코오스, 0.205% 다이포타슘 포스페이트, 0.145% 모노포타슘 포스페이트, 0.015% 소듐클로라이드, 0.05% 마그네슘 설페이트, 0.01% 칼슘클로라이드 헥사하이드레이트, 0.00025% 페러스 설페이트, 0.05% 암모늄 설페이트, 0.5% 글라이세롤(glycerol), 200 M 아세토시린곤(acetosyringone), 40 mM 모르폴리노에탄설폰산(2-morpholinoethanesulfonic acid; MES)으로 희석하고 같은 조건에서 3시간 동안 더 배양하여 준 후, 동일한 부피의 새송이버섯 분생자 현탁액(conidial suspension, 106 conidia/)과 혼합하여 주었다(Eur. Mol. Biol. Organ, 1995, 14, 3206-3214). 이 혼합액 200 를 3 MM filter paper(왓트만사, 미국)에 가하고, 200 M의 아세토시린곤을 포함하는 유도배지 및 아세토시린곤을 포함하지 않는 유도배지에 각각 상기의 이 필터페이퍼를 담가두고 28에서 2일 동안 공동배양(co-cultivation)하였다. 각 공동배양 후에, 3 MM 필터페이퍼에서 자란 버섯균(새송이버섯; Pleurotus eryngii) 및 미생물균(아그로박테리움 투메파시언스)을 200 M 세포탁심을 포함하는 PDA(potato dextrose agar) 배지로 옮겨 아그로박테리움을 죽게 하였다. PDA 배지 상에서 자란 각 형질전환된 새송이버섯의 분생자(conidia)를 멸균수에 현탁하고 200 M 세포탁심을 포함하는 PDB 배지(0.4% 감자전분(Potato Starch), 2% 덱스트로즈(Dextrose))에 접종하고 28에서 100 rpm으로 진탕배양하였다. PDB 배지에서 자란 새송이버섯 형질전환체를 원심분리하여 회수하고, 여러 가지 분석을 위하여 사용하였다.
<실시예 3> 형질전환된 새송이버섯의 염색체 DNA 분석
상기 실시예 2에 의하여 얻어진 새송이버섯 형질전환체를 200 M 세포탁심을 포함하는 PDB 배지에서 배양하고, 회수한 균사체로부터 염색체 DNA를 변형한 헥사데실트리메틸 암모늄 브로마이드(hexadecyltrimethylammonium bromide; CTAB) 방법(FOCUS, 1990, 12, 13-15)으로 분리하였다. 간단하게, 상기 실시예 2에서 얻어진 새송이버섯 균사체 0.1g 을 0.5 의 DNA 추출 완충액(0.1 M Tris-Cl (pH 9), 20 mM 에틸렌다이아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA), 1.4 M 염화나트륨(NaCl), 2% 헥사데실트리메틸 암모늄 브로마이드, 1% 폴리에텔렌 글리콜(polyethylene glycol), 0.2% 베타-머캡토에탄올(β-mercaptoethanol)를 가하여 조직을 파쇄하고, 74에서 70분간 열처리 하였다. 상기의 용액을 200 의 클로로포름/이소아밀알콜(chloroform/isoamyl alcohol) (24:1)로 추출하고, 0에서 30분간 방치한 후, 15,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 상층액을 회수하였으며, 용출 추출과정을 한 번 더 반복하였다. 상층액을 회수하고 0.55배 부피의 이소프로판올(isopropanol)을 가하고 상온에서 5분간 방치한 후, 15,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 침전물을 회수하여, 염색체 DNA를 얻었다. DNA 침전물을 50 의 40 /의 리보핵산가수분해효소 A(RNase A)를 포함하는 TE(Tris-EDTA) 용액에 녹여, 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR)의 주형 DNA로 사용하였다. 이 염색체 DNA를 주형으로 하여 bGH 유전자 분석은 PCR 하여 bGH 유전자의 도입을 확인하였으며, 약 0.57 kb 크기의 DNA 밴드를 확인하여(도 4), bGH 유전자로 형질전환 여부를 확인하였으며 최종적으로 각 중합효소 연쇄 반응 산물을 클로닝하여 DNA 서열을 분석하여 최종적으로 정확한 서열의 유전자로 형질전환 되었음을 확인하였다.
<실시예 4> 형질전환된 새송이버섯 균사체에서 bGH gene 의 발현 확인
pPEV-bGH 벡터로 형질전환된 새송이버섯 균사체를 PDB 배지에서 접종하고 25에서 5일 동안 100 rpm으로 진탕배양으로 배양하였다. 이 균 배양액 1 을 50 의 Mushroom Complete 배지(0.2% 트립톤(Bacto tryptone), 0.2% 효모추출물(yeast extract), 2% 글루코오스, 0.05% 마그네슘 설페이트)를 포함하는 250 의 삼각플라스크에 접종하고 25에서 7일 동안 100 rpm으로 진탕배양 하였다. 각 시간대별로 균사체를 회수하고, 회수한 균사체를 균사체 1 g 당 3 의 초음파 파쇄 버퍼(buffer)(10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.2 M NaCl, 5 mM 베타-머캡토에탄올)에 현탁하고, 균질기(homogenizer) 및 초음파 파쇄기로 새송이버섯 균사체를 파쇄하였다. 균사체를 파쇄 후, 15,000 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 상층액을 회수하여 단백질 발현 분석 시료로 사용하였다. 세포 추출액 0.5 에 동일한 부피의 99% 에탄올을 가하여 잘 섞어준 후, -20에서 30분간 방치하고 12,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 단백질 침전물을 회수하고, 이 침전물은 공기 중에 약 30분 간 방치하여 건조시켰다. 건조한 단백질 추출물은 20 의 증류수에 잘 현탁시키고 20 의 2X SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 샘플 버퍼(0.1 M Tris-HCl (pH 6.8), 0.2 M 디티오트레이톨(Dithiothreitol; DTT), 4% SDS, 20% 글리세롤, 0.2% 브로모페놀블루(bromophenolblue))를 가하고, 100에서 5분간 가열하여 단백질 전기영동(SDS-PAGE)방법으로 확인하였다(Nature, 1970, 227, 680-685). 일정한 전기장에서 분리가 끝난 젤은 쿠마시 브릴리언트 블루 용액(Coomassie brilliant blue)에 넣어 1시간 정도 염색한 후 탈색용액(30% 메탄올, 10% 아세트산)에 옮겨 탈색하여 생산된 단백질을 확인하였다. 또한 SDS-PAGE를 전개한 단백질을 PVDF(Polyvinylidene fluoride) 막(membrane)으로 이동시킨 후 토끼에서 제조한 anti-bGH 항체를 이용하여 형질전환된 새송이버섯 균사체 배양액에서 발현된 bGH 단백질을 공지의 항체 블럿 방법으로 확인하였다. 그 결과, 본 발명의 pPEV-bGH로 형질전환된 새송이버섯 균사체 배양액은 배양 시간이 지남에 따라 분자량 약 21 kDa의 bGH 단백질의 발현됨을 확인하였다(도 5 참조).
Claims (5)
- 다음을 포함하는 버섯 형질전환용 재조합 벡터:
(a) CaMV 35S 프로모터(cauliflower mosaic virus 35S promoter);
(b) CaMV 35S 5-비해석부위(untranslated sequence, UTS);
(c) CaMV 35S 3-비해석부위;
(d) NOS 터미네이터(nopaline synthase terminator); 및
(e) 상기 (b)와 (c) 사이에 위치한 목적 단백질 코딩 뉴클레오타이드 서열. - 상기 제 1 항의 재조합 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 속 미생물.
- 상기 제 1 항의 재조합 벡터로 형질전환된 버섯.
- 제 1 항에 있어서, 상기 목적 단백질은 소 성장 호르몬(bovine growth hormone)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 3 항에 있어서, 상기 버섯은 새송이버섯인 것을 특징으로 하는 형질전환된 버섯.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20130123254A KR20150044188A (ko) | 2013-10-16 | 2013-10-16 | 새송이버섯 형질전환용 재조합 벡터 및 이를 이용한 목적 단백질 제조방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20130123254A KR20150044188A (ko) | 2013-10-16 | 2013-10-16 | 새송이버섯 형질전환용 재조합 벡터 및 이를 이용한 목적 단백질 제조방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20150044188A true KR20150044188A (ko) | 2015-04-24 |
Family
ID=53036534
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR20130123254A KR20150044188A (ko) | 2013-10-16 | 2013-10-16 | 새송이버섯 형질전환용 재조합 벡터 및 이를 이용한 목적 단백질 제조방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20150044188A (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| USD885411S1 (en) | 2018-07-31 | 2020-05-26 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Display screen or portion thereof with transitional graphical user interface |
-
2013
- 2013-10-16 KR KR20130123254A patent/KR20150044188A/ko not_active Application Discontinuation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| USD885411S1 (en) | 2018-07-31 | 2020-05-26 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Display screen or portion thereof with transitional graphical user interface |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Cui et al. | Direct conversion of inulin into single cell protein by the engineered Yarrowia lipolytica carrying inulinase gene | |
| CN101914603B (zh) | 利用乳糖诱导pMFH载体生产重组蛋白的发酵方法 | |
| CN108315288A (zh) | 一种表达甲酰胺酶与亚磷酸脱氢酶融合蛋白的重组大肠杆菌及其构建方法与应用 | |
| JPH05184352A (ja) | ピヒア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母中での異種遺伝子の発現方法、発現ベクターおよび形質転換微生物 | |
| Liu et al. | Fusion expression of pedA gene to obtain biologically active pediocin PA-1 in Escherichia coli | |
| CN102181469A (zh) | 枯草芽孢杆菌表面展示人血清白蛋白重组芽孢及其制备方法 | |
| CN114958897B (zh) | 可高效表达饲用低温角蛋白酶的枯草芽孢杆菌构建方法 | |
| CN112210519A (zh) | 一种以食用菌分泌乙醛脱氢酶的基因工程菌 | |
| JP5662363B2 (ja) | 難発現性タンパク質の分泌のためのタンパク質融合因子（ｔｆｐ）を明らかにする方法、タンパク質融合因子（ｔｆｐ）ライブラリーを製造する方法、及び難発現性タンパク質の組み換え的生産方法 | |
| CN102020712B (zh) | 一种可用于疫苗稳定剂的类人胶原蛋白及其生产方法 | |
| CN106939315A (zh) | 一种草酸脱羧酶的制备方法及应用 | |
| KR20150044188A (ko) | 새송이버섯 형질전환용 재조합 벡터 및 이를 이용한 목적 단백질 제조방법 | |
| CN106366201A (zh) | 融合蛋白damp4‑igf‑1的基因序列、载体、重组菌株、重组蛋白及其制备方法 | |
| CN112662700B (zh) | 用于谷胱甘肽生物合成的重组质粒的构建方法 | |
| KR20160072451A (ko) | 새송이버섯 형질전환용 재조합 벡터를 이용한 인간 성장 호르몬 단백질 제조방법 | |
| KR20150044195A (ko) | 새송이버섯 분비 벡터를 이용한 목적 단백질 생산 방법 | |
| CN105087725B (zh) | 一种提高大肠杆菌中可溶性重组原动蛋白2β表达水平的方法 | |
| CN114058606A (zh) | 缺失xpt基因的地衣芽孢杆菌在异源蛋白生产中的应用 | |
| Kim et al. | Expression of human growth hormone gene in Pleurotus eryngii | |
| KR20160072458A (ko) | 새송이버섯 분비 벡터를 이용한 인간 성장 호르몬 단백질 생산 방법 | |
| KR20160072448A (ko) | 새송이버섯의 라카아제 프로모터를 함유하는 형질전환용 분비벡터를 이용한 인간 성장 호르몬 단백질 제조방법 | |
| KR20160072450A (ko) | 새송이버섯 형질전환용 재조합 벡터를 이용한 표피성장인자 단백질 제조방법 | |
| KR20160072454A (ko) | 새송이버섯 분비 벡터를 이용한 표피성장인자 단백질 생산 방법 | |
| KR101077783B1 (ko) | 재조합 인간성장호르몬 단백질, 이의 발현 벡터, 및 이를 이용한 인간성장호르몬 단백질의 제조방법 | |
| KR20160072444A (ko) | 새송이버섯의 라카아제 프로모터를 함유하는 형질전환용 분비벡터를 이용한 표피성장인자 단백질 제조방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E601 | Decision to refuse application |