BR102016025442A2 - levedura industrial geneticamente modificada lvy142 com a via oxi-redutiva de conversão de xilose, cassete de expressão gênica, processo de obtenção de etanol 2g e uso da levedura lvy142 - Google Patents

Abstract

levedura industrial geneticamente modificada lvy142 com a via oxi-redutiva de conversão de xilose, cassete de expressão genica, processo de obtenção de etanol 2g e uso da levedura lvy142. a presente invenção refere-se a levedura industrial geneticamente modificada lvy142 com a via oxi-redutiva de conversão de xilose, cassete de expressão gênica, processo de obtenção de etanol 2g e uso da levedura lvyl42.

Description

(54) Título: LEVEDURA INDUSTRIAL GENETICAMENTE MODIFICADA LVY142 COM A VIA OXI-REDUTIVA DE CONVERSÃO DE XILOSE, CASSETE DE EXPRESSÃO GÊNICA, PROCESSO DE OBTENÇÃO DE ETANOL 2G E USO DA LEVEDURA LVY142 (51) Int. Cl.: C12N 15/81; C12N 15/53; C12N 15/54; C12R 1/865; C12P 7/08; (...) (73) Titular(es): UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS - UNICAMP (57) Resumo: LEVEDURA INDUSTRIAL GENETICAMENTE MODIFICADA LVY142 COM A VIA OXI-REDUTIVA DE CONVERSÃO DE XILOSE, CASSETE DE EXPRESSÃO GENICA, PROCESSO DE OBTENÇÃO DE ETANOL 2G E USO DA LEVEDURA LVY142. A presente invenção refere-se a levedura industrial geneticamente modificada LVY142 com avia oxi-redutiva de conversão de xilose, cassete de expressão gênica, processo de obtenção de etanol 2G e uso da levedura LVYI42.

(72) Inventor(es): LEANDRO VIEIRA DOS SANTOS; GONÇALO AMARANTE GUIMARÃES PEREIRA (85) Data do Início da Fase Nacional:

31/10/2016

XR (^GRÈ3)

I (ilulosé b- *

T^P

ÁGRE3 | LVY127 | [LVY142

Xilose Xilose

l <ilulose-5-P

PPP

1/20

LEVEDURA INDUSTRIAL GENETICAMENTE MODIFICADA LVY142 COM A VIA OXI-REDUTIVA DE CONVERSÃO DE XILOSE, CASSETE DE EXPRESSÃO GÊNICA, PROCESSO DE OBTENÇÃO DE ETANOL 2G E USO DA LEVEDURA LVY142 são os dois principais etanol, responsáveis,

CAMPO DA INVENÇÃO [1] A presente invenção refere-se a levedura industrial geneticamente modificada LVY142 com a via oxi-redutiva de conversão de xilose, cassete de expressão gênica, processo de obtenção de etanol 2G e uso da leveduraLVY142.

[2] A invenção tem aplicação no setor de produção de etanol 2G.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [3] Estados Unidos e Brasil produtores mundiais de respectivamente, por 56 e 26,85 bilhões de litros de etanol produzidos em 2009 (RFA, 2016). O etanol pode ser produzido a partir de diferentes fontes de matérias-primas, como milho, beterraba, trigo, cana-de-açúcar, entre outros. O processo de produção de etanol no Brasil utiliza essencialmente a cana-de-açúcar como matéria-prima. A alta capacidade produtiva dessa cultura e as condições climáticas apropriadas para o seu plantio no país permitiram a obtenção de um modelo de produção de baixo custo, tornando o Brasil uma referência mundial na produção de etanol.

[4] A obtenção de etanol se dá pela via fermentativa no interior de dornas onde são adicionados o mosto (caldo e melaço de cana-de-açúcar) e uma alta concentração de células de levedura (10-17% m/v) . O caldo e melaço são usados como substratos e concentrações de etanol de 8-11% (v/v) são alcançadas em um período de 6-llhs a 32-35°C. Após a fermentação, todo o conteúdo é centrifugado e o mosto fermentado (vinho) segue para as torres de destilação. As células coletadas por centrifugação são tratadas com ácido

2/20 sulfúrico e reutilizadas repetidamente em novos ciclos fermentativos, com pelo menos 2 fermentações por dia, em um período de 200-250 dias. O reciclo celular característico do processo brasileiro de produção de etanol utiliza uma alta concentração de células no início da fermentação contribuindo para um reduzido crescimento e alto rendimento em etanol (90-92% do rendimento teórico de conversão) (Basso et al., 2008).

[5] As condições estressantes do processo de produção, como alta concentração de etanol, altas temperaturas, estresse osmótico, acidez e contaminação bacteriana, resultaram no isolamento de leveduras selvagens mais adaptadas e que substituíam as linhagens iniciadoras da fermentação em curtos períodos de 20-30 dias de reciclo celular (SilvaFilho et al., 2005). Basso (2008) analisou 350 isolados quanto a características de interesse industrial desejáveis como floculação, rendimento, velocidade de fermentação, taxa de crescimento, capacidade de reciclo, produção de espuma e capacidade de implantação nas destilarias. Dentre as linhagens selecionadas, destacaram-se PE-2, CAT-1 e BG-1 por apresentarem um desempenho eficiente e a habilidade de competir com as leveduras nativas, sobrevivendo e dominando o processo de fermentação industrial. Em 2008, PE-2 e CAT-1 foram usadas em aproximadamente 150 destilarias, representando 60% do etanol produzido no Brasil (Basso et al., 2008). Tendo em vista seu alto desempenho fermentativo, as linhagens PE-2 e CAT-1 estão sendo estudadas mais profundamente a fim de se compreender as características que as diferenciam em relação às demais em escala industrial. Argueso et al. (2009), ao observarem que os estoques comercialmente disponíveis da PE-2 apresentavam grande variedade de cariótipos, selecionaram e caracterizaram uma colônia única, denominada JAY270. Análises moleculares mostraram que o genoma de PE-2 é altamente heterozigoto (2

3/20

SNPs/kb), tanto estruturalmente quanto a nível de nucleotídeos, apresentando polimorfismos estruturais entre cromossomos homólogos. A alta capacidade de adaptação de PE2 às condições estressantes impostas em uma dorna de fermentação está diretamente ligada a sua arquitetura genômica heterogênea, tornando tais cepas ideais para a criação de uma nova geração de organismos industriais, idealizados para as novas tecnologias de produção de etanol e outros processos biotecnológicos (Argueso & Pereira, 2010).

[6] Cofatores desempenham um papel essencial em um grande número de reações bioquímicas e na produção de diferentes compostos (Liu et al., 2006) . Eles participam de uma série de funções fisiológicas, incluindo a regulação de metabolismo energético, ajuste do estado redox intracelular, controle do fluxo de carbono, atividade mitocondrial, regulação do ciclo celular e modulação da virulência. Em microrganismos, os cofatores NADH/NAD+ e NADPH/NADP+ estão envolvidos em 740 e 887 reações bioquímicas e interagem com 433 e 462 enzimas, respectivamente (Chen et al., 2014). O NAD+ atua em oxidações, geralmente associadas a processos catabólicos, enquanto o NADPH é utilizado em reduções, geralmente associadas a processos anabólicos. As reações onde ocorre a incorporação de um íon hidreto pelo NAD+ (ou NADP+) a partir de um substrato reduzido, ou NADPH (ou NADH) doa um íon hidreto para um substrato oxidado são conhecidas como oxirredutases, também denominadas desidrogenases (Nelson & Cox, 2011).

[7] A nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD+ em sua forma oxidada) e o seu análogo, nicotinamida adenina nucleotídeo fosfato (NADP+), são formados por dois nucleotídeos ligados por seus grupos fosfato por meio de uma ligação fosfoanidrido. Ambas as coenzimas sofrem redução reversível do anel nicotinamida. À medida que uma molécula de substrato

4/20 sofre oxidaçâo (desidrogenaçâo), liberando dois átomos de hidrogênio, a forma oxidada do nucleotídeo (NAD+ ou NADP+) recebe um íon hidreto (:H-, o equivalente a um próton e dois elétrons), sendo transformada na sua forma reduzida (NADH ou NADPH). O segundo próton removido do substrato é liberado no solvente aquoso (Nelson & Cox, 2011).

[8] Em S. cerevisiae há um aumento de complexidade em termos de balanço entre a formação e consumo de cofatores, já que não há atividade de uma transidrogenase que possa converter NADH diretamente em NADPH. Além disso, como o metabolismo é compartimentalizado, não havendo fluxo de cofatores entre mitocôndria e citosol, a formação e consumo dos cofatores NADH e NADPH deve ser balanceada em cada compartimento, o que impõe restrições no fluxo de carbono. Assim sendo, devem existir mecanismos distintos para re-oxidar os cofatores no citosol e mitocôndria (Santos et al., 2004; Vemuri et al,, 2006).

[9] NADH é gerado primariamente no citosol pela glicólise e na mitocôndria pelo ciclo do ácido cítrico (TCA) (Vemuri et al., 2006). No citosol, a glicose é oxidada usando NAD+ como cofator, o qual é simultaneamente convertido na sua forma reduzida, NADH, em quantidade equivalente. Sendo o NADH um cofator altamente utilizado em diversas reações metabólicas, qualquer alteração na taxa NADH/NAD+ leva a grandes alterações no metabolismo. O balanço NADH/NAD+ é um fator importante na manutenção do fluxo glicolítico. Assim sendo, a depleção de NAD+ pode forçar o fluxo a cessar. A fim de aumentar a atividade glicolítica, o NADH produzido na glicólise, oxidaçâo de ácidos graxos e o ciclo de ácido cítrico deve ser oxidado a NAD⁺ para alcançar um equilíbrio redox (Liu et al., 2006).

[10] Existem, pelo menos, cinco mecanismos para reoxidação do NADH em S. cerevisiae: fermentação alcoólica; produção de glicerol; oxidaçâo de NADH intramitocondrial via NADH

5/20 desidrogenase mitocondrial interna; e regeneração citosólica através de NADH desidrogenases mitocondriais externas ou via glicerol-3-fosfato, durante a respiração (Bakker et al., 2001).

[11] A regeneração de NAD⁺ a partir de NADH pela levedura pode ocorrer em aerobiose, na cadeia de transporte de elétrons, com oxigênio como aceptor final de elétrons e com a produção de grande quantidade de ATP. O NADH mitocondrial é oxidado por uma NADH desidrogenase mitocondrial interna ligada a membrana e codificada pelo gene NDIl. Ou pode acontecer sob condições anaeróbicas, na fermentação alcoólica, primariamente com o acetaldeído como aceptor de elétrons, em uma reação onde a álcool desidrogenase catalisa a oxidação da NADH a NAD⁺, com a produção de etanol e dióxido de carbono a partir de piruvato. O NADH citosólico é oxidado por duas NADH desidrogenases mitocondriais externas (citosólicas) ligadas a membrana, codificadas pelos genes NDE1 e NDE2 com sítios catalíticos em contato com o citosol. Adicionalmente, glicerol-3-fosfato desidrogenases (codificadas por GPD1 e GPD2) oxidam o NADH citosólico com concomitante formação de glicerol. Sob condições anaeróbicas, o NADH originado da produção de ácidos orgânicos, biomassa, entre outros, é re-oxidado a NAD⁺ pela formação de glicerol, já que a respiração não é possível e a formação de etanol é um processo redox-neutro (Bro et al., 2006; Liu et al., 2006; Vemuri et al., 2006), [12] Em S. cerevisiae, NADPH pode ser gerado, principalmente, nas reações catalisadas por duas desidrogenases na fase oxidativa das pentoses fosfato (ZWF1, glicose-6-Ρ desidrogenase e GND1, 6-fosfogluconato desidrogenase), na reação catalisada pela isocitrato desidrogenase NADP+ dependente (IDP2), na reação catalisada pela acetaldeído desidrogenase NADP⁺ dependente (ALD6) e na reação catalisada pela enzima málica (MAE1). De todas citadas

6/20 acima, a via das pentoses fosfato representa a principal via de produção de NADPH na levedura (Santos et al., 2004; Wang et al., 2013) .

[13] A via das pentoses fosfato é controlada principalmente em nível enzimático, com NADPH e ATP inibindo competitivamente a glicose-6-Ρ desidrogenase {ZííFl} e 6fosfogluconato desidrogenase (GND2). A regulação coordenada dos genes envolvidos com o metabolismo de NADPH, incluindo a maioria dos genes da PPP, foi reportado sob condições de stress oxidativo. A ativação de genes dependentes de NADPH envolve STB5, responsável também por reprimir a expressão de PGI, que çodifica a fosfoglicose isomerase na junção entre a via glicolítica e a da pentose fosfato. Esse fator de transcrição desempenha um papel fundamental no redirecionamento do fluxo de carbono para fornecer NADPH adicional em resposta a estresse oxidativo, por exemplo, além de ser responsável por manter o fluxo basal da PPP sob condições anaeróbicas (Celton et al., 2012b).

[14] Celton (2012) demonstrou que células de levedura respondem ao aumento da demanda de NADPH com o aumento do fluxo através das vias da pentose fosfato e de formação de acetato, o que corresponde a 80 e 20% da demanda de NADPH, respectivamente. Alguns genes da pentose fosfato são regulados positivamente com o aumento da demanda por NADPH. GND1 e SOL3 são induzidos quando uma concentração moderada de NADPH é necessária pela adição de acetoína. Quando essa demanda aumenta, dois genes da fase não oxidativa da pentose fosfato, TAL1 e TKL1 também são regulados positivamente (Celton et al., 2012a).

[15] O balanço redox ocorre quando a produção e o consumo de cofatores são aproximadamente iguais. Desbalancear o potencial oxi-redutivo pode causar prejuízos a célula, gasto de energia e carbono e prejudicar todo o metabolismo celular. A quantidade e disponibilidade de cofatores na célula pode

7/20 se tornar um passo limitante, sendo essenciais em diversas reações metabólicas e na produção de diferentes compostos. Assim sendo, manipulações no balanço redox e na quantidade de cofatores produzidos pela célula pode ser uma poderosa ferramenta no melhoramento da performance fermentativa da levedura (Liu et al., 2006; Chen et al. , 2014). O balanço redox pode ser regulado por diferentes abordagens, como regulação da via metabólica pelo ajuste da expressão dos genes, engenharia de proteínas envolvendo sítio de ligação aos cofatores, restruturação do genoma pela remoção de genes redundantes que utilizam cofatores, regeneração de coenzimas pela restruturação das rotas metabólicas, entre outros (Chen et al., 2014) .

[16] Além das alternativas descritas acima, um método passível de gerar avanços na produção de etanol por S. cerevísiae e que não envolve manipulação genética direta é a aplicação de uma corrente elétrica para estimular o metabolismo da levedura em fermentadores modificados com eletrodos, denominados reatores bioelétricos (Thrash & Coates, 2008). Nesse reator modificado, microrganismos são cultivados em uma câmara contendo um eletrodo que recebe a corrente elétrica de um circuito acoplado a uma fonte, transferindo elétrons às células. Os elétrons recebidos pelas células podem, então, ser utilizados em reações do metabolismo envolvendo redução de substratos, fornecendo poder redutor às células, diminuindo a geração de subprodutos e consequentemente aumentando a produção de etanol.

[17] O etanol de segunda geração ou etanol celulósico consiste na conversão de polímeros que formam a parede celular vegetal em etanol. Estes polímeros constituem a celulose, hemicelulose e lignina, e sua hidrólise disponibiliza açúcares fermentescíveis, representados por hexoses e pentoses, que podem ser convertidos a etanol por S. cerevísiae. Hexoses são normalmente utilizadas por S.

8/20 cerevisiae. Porém, linhagens selvagens dessas leveduras não conseguem metabolizar as pentoses xilose e arabinose presentes na biomassa. Tendo em vista sua significativa parcela na constituição da biomassa, a completa utilização desses compostos aumentaria o rendimento e a viabilização do processo de produção de etanol de segunda geração.

[18] A engenharia metabólica de leveduras para introdução das vias metabólicas de consumo de xilose tem como foco duas vias principais: a via Xilose Redutase - Xilitol Desidrogenase (XR-XDH) e a via Xilose Isomerase (XI) . A via XR-XDH, presente em micro-organismos eucariotos, consiste em duas reações de oxi-reduçâo, onde a xilose é reduzida a xilitol pela ação da enzima xilose redutase (XR), em uma reação mediada por NADPH/NADH e em seguida, o xilitol é oxidado a xilulose por meio da enzima xilitol desidrogenase (XDH), mediada exclusivamente por NAD⁺. A diferença de especificidade pelos cofatores gera o desbalanço redox. Para gerar NADPH para a reação da xilose redutase, parte do carbono da xilose deve ser direcionado através da fase oxidativa das pentoses fosfato, envolvendo as reações de glicose-6-fosfato desidrogenase e 6-fosfogluconato. Apesar de permitir uma eficiente regeneração de NADPH, ocorre perda de carbono na forma de CO2 o que impacta o rendimento de etanol a partir de xilose (van Maris et al., 2007).

[19] Em aerobiose, o NAD⁺ é regenerado na cadeia respiratória, com o oxigênio como aceptor final de elétrons. Sob limitadas concentrações de oxigênio, a reoxidação do excesso de NADH, gerado através da reação da xilitol desidrogenase, é realizada através de compostos mais reduzidos que a xilose, como xilitol e glicerol, subprodutos da fermentação. A produção do xilitol ocorre via xilose redutase, que devido a dupla especificidade pela coenzima, pode usar também NADH. Como esse mecanismo envolve o consumo de uma xilose para cada NADH gerado, tem um alto impacto

9/20 negativo no rendimento de etanol obtido a partir de xilose (Hahn-Hágerdal et al·., 2001; Aguiar et al., 2002; Kuyper et al., 2004; van Maris et al., 2007).

[20] Apesar de S. cerevisiae possuir os genes que codificam uma aidose redutase dependente da NADH (GRE3) e uma xilitol desidrogenase (Xyl2), eles não permitem seu crescimento eficiente em xilose. A superexpressâo desses genes usando promotores endógenos permitiu o crescimento em shakers, com taxa de crescimento de 0.01 kr¹ em D-xilose e rendimento de xilitol de 55%. Sob condições anaeróbicas, essas linhagens foram incapazes de crescer (van Maris et al., 2007).

[21-] A XR e XDH mais comumente usada em estudos envolvendo a via oxi-redutiva de conversão de xilose pertence a levedura Scheffersomyces stipitis. Devido a preferência da XR de S. stipítis por NADPH, enquanto que a XDH produz apenas NADH, o acúmulo de xilitol resultante e o baixo rendimento de etanol tem sido atribuído a esse desbalanço de cofatores. Diversos estudos focaram em estratégias para resolver esse problema. Sítios de ligação aos cofatores em xiloses redutases são alvo de técnicas de engenharia de proteínas, visando aumentar a afinidade por NADH em relação a NADPH. Porém, o aumento da taxa de NADH/NADPH nesses estudos se deve a uma diminuição na eficiência catalítica de ligação ao NADPH pela XR, enquanto que o real aumento na afinidade de ligação ao NADH é bem baixo (Liang et al·., 2007; Watanabe et al., 2007; Bengtsson et al. , 2009; Runquist et al. , 2010; Cai et al., 2012).

[22] Em uma abordagem similar, Watanabe (2005) alterou completamente a afinidade da enzima xilitol desidrogenase de S. stipitis de NAD⁺ para NADP⁺ através de mutagênese sítio dirigida. As enzimas com duplas mutações (D207A/I208R e D207A/F209S) tiveram aumento na afinidade por NADP⁺, mas a preferência por NAD⁺ ainda se mantinha superior. As enzimas com mutações triplas (D207A/I208R/F209S) e quádruplas

10/20 (D207A/I208R/F209S/N211R) mostraram valores maiores que 4500 vezes em kcat/Km com NADP+ em relação a enzima selvagem, atingindo valores comparáveis ao kcat/Km com NAD+ em relação a enzima selvagem. Em estudo posterior, a enzima com a tripla mutação foi introduzida em uma linhagem de S. cerevisiae, substituindo a XDH selvagem de S. stipitis. A linhagem YARSdR produziu 86% menos xilitol e consequentemente 41% mais etanol em relação a linhagem parental (Watanabe et al., 2007). A linhagem MA-N5 com a XDH mutante NADP + dependente apresentou alto rendimento de 0.49 g/g a partir dos açúcares totais presentes hidrolisado lignocelulósico (Matsushika et al., 2009). Com a finalidade de melhorar o balanço de cofatores nessas linhagens, Khattab (2013) utilizou estratégias de mutagênese sítio dirigida para produzir uma série de XR que utilizam unicamente NADPH, que ao ser oxidado, fornece NADP+ para a XDH NADP+ dependente. As linhagens resultantes apresentaram redução de xilitol de 34.4 a 54.7% em relação a linhagem controle, além de aumentos de 10 e 20% na produção de etanol em duas das linhagens construídas com as novas xiloses redutases.

[23] Diferente das abordagens descritas acima, que modificam racional ou aleatoriamente as enzimas da via de conversão de xilose, outras estratégias foram descritas na literatura onde ocorre alteração nas vias centrais de consumo de açúcares visando alteração e ajuste no balanço de cofatores. A diminuição da produção de NADPH pela inativação dos genes da fase oxidativa da via das pentoses fosfato, GNDl, que codifica a 6-fosfogluconato desidrogenase ou ZWF1, que codifica a glicose 6-fosfato desidrogenase, resultou em linhagens com redução na produção de xilitol e aumento do rendimento de etanol obtido a partir de xilose. Porém, tais linhagens tiveram uma diminuição significativa na velocidade de consumo de xilose, explicado pela redução desse açúcar estar acontecendo mediada principalmente através de NADH,

11/20 pela ação da enzima xilose redutase {XR), com especificidade por ambos os cofatores. Outro fato observado foi o aumento da quantidade de acetato produzido, o que sugere que a produção de acetato a partir de acetaldeido se tornou a nova fonte de fornecimento de NADPH para a XR (Jeppsson et al., 2002; Cai et al., 2012).

[24] Para facilitar a regeneração de NADPH, a expressão de uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Kluyveromyces lactis NADP⁺ dependente (GDP) , associada com a deleção de ZWF1 resultou em uma linhagem com maior rendimento de etanol a partir de xilose. A regeneração de NADPH através desse gene não está associada a produção de CO2, como acontece na via das pentoses fosfato, justificando a melhor performance em relação a linhagem que não possui o GDP expresso. Tal abordagem permite a criação de um sistema de regeneração de cofatores não ligado a perda de carbono através da produção de CO2, o que resulta em maior quantidade de etanol produzido (Verho et al., 2003).

[25] Outra estratégia visando a introdução de uma via alternativa de re-oxidação de NADH foi através da introdução da rota alternativa da fosfocetolase, comumente encontrada em procariotos. A expressão heteróloga da fosfotransacetilase de Bacillus subtilis e da acetaldeido desidrogenase de Entamoeba histolytica visa um desvio na via das pentoses fosfato, pela conversão de xilulose-5-Ρ em gliceraldeído-3-Ρ, que entra na via glicolítica, e acetilP, que pode ser convertido pela fosf ot ransacetilase em acetil-CoA, o que é reduzido a acetaldeido pela acetaldeido desidrogenase, com a utilização de NADH como cofator. A introdução desses genes em S. cerevísiae resultou em uma linhagem com aumento de 25% na produção de etanol, devido a uma menor formação do subproduto xilitol (Sonderegger et al., 2004).

12/20 [25] Apesar dos esforços em estratégias para regular e ajustar o balanço redox em linhagens contendo a via oxiredutiva de conversão de xilose, outras razões desconhecidas, além do desbalanço redox, são responsáveis pela alta quantidade de xilitol produzindo e baixa produtividade de etanol em condições anaeróbicas de consumo de xilose. Outros esforços como o desenvolvimento de uma rede metabólica e regulatória, levando em conta todo o metabolismo redox da célula deve ser considerado para resolver esse problema (Cai et al., 2012).

[27] 0 documento Xiong, M. et al. refere-se à alteração da xylose reductase para aumentar â produção de etanol em Saceharomyces cerevisiae, mais especificamente na alteração da XR para ter maior afinidade por NADH ao invés de NADPH.

[28] 0 documento Khathaab, S.M.R. et al. refere-se à produção de bioetanol usando combinações de Saceharomyces cerevisiae, Xilose redutase e Xilitol desidrogenase, mais especificamente na alteração sítio específica da XR para ter afinidade apenas por NADPH.

[29] O documento US20130040353 refere-se à produção de etanol no meio de Saceharomyces cerevisiae e a alteração da XR para ter maior afinidade por NADH ao invés de NADPH.

[30] A presente invenção difere dos documentos apresentados acima, pois não faz alteração da sequência de XR. Foi utilizado uma XR que naturalmente já tem maior afinidade por NADH ao invés de NADPH, diminuindo o desbalanço redox e aumentando a produção de etanol.

[31] 0 documento americano US20120329104 refere-se à combinação de microorganismos para a produção de etanol e descreve a criação de uma linhagem utilizando a via oxiredutiva de S. stipitis. Não foi utilizado nenhuma estratégia para regular o balanço redox da linhagem. Na presente invenção foi utilizada em uma linhagem industrial, mais tolerante a inibidores presentes no processo 2G e com

13/20 características de interesse industrial. Além disso, foram empregadas diversas estratégias para regular o balanço redox da linhagem e melhorar a produção de etanol. Os cassetes utilizados também apresentam diferenças em promotor e terminador, região de inserção utilizado.

[32] Diante do exposto, seria útil se a técnica dispusesse de cassete de expressão e leveduras capazes de regular o balanço redox de uma linhagem industrial de S. cerevisiae, amplamente utilizada no setor de etanol 2G, contendo a via oxi-redutiva de consumo de xilose.

relação ao e marcador

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO [33] A presente invenção refere-se a levedura industrial geneticamente modificada LVY142 com a via oxi-redutiva de conversão de xilose, cassete de expressão gênica, processo de obtenção de etanol 2G e uso da levedura LVY142.

[34] 0 cassete de expressão gênica 1 compreende:

- a xilose redutase (XR) de Spathaspora passa lida rum sob a ação do promotor e terminador do gene que codifica 3fosfoglicerato Quinase (PGK1) em S. cerevisiae;

- o gene URA3 de S. cerevisiae, juntamente com seu promotor e terminador, flanqueado por dois sítios loxP em cada extremidade e na mesma orientação;

- gene xilitol desidrogenase (XDH) de S. stipitís sob a ação do promotor e terminador do gene que codifica a Gliceraldeído 3-Fosfato Desidrogenase, isoenzima 1 (TDH1) em S. cerevisiae, clonados no vetor pRS304; e

- sequência de nucleotídeos é representada pela SEQ ID NO:1.

[35] A levedura geneticamente modificada é a Saccharomyces cerevisiae DSM32122.

[36] O processo de obtenção de etanol 2G é realizado com a levedura geneticamente modificada Saccharomyces cerevisiae

DSM32122.

14/20 [37] A levedura LVY142 (DSM32122) possui aplicação em qualquer processo que envolva o consumo de xilose.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [38] A Figura 1 representa o fluxograma do desenvolvimento da linhagem LVY142, com a substituição da XR de S. stipitis pela XR de S. passa lida rum, que apresenta maior afinidade pelo cofator NADH (DSM32122).

[39] A Figura 2 representa o gráfico que demonstra o consumo de xilose pela linhagem LVY142 (DSM32122) comparada com a linhagem predecessora LVY127. O meio continha 10 g/L de glicose (não apresentado na figura).

[40] A Figura 3 representa o gráfico de desempenho da produção de etanol da linhagem LVY142 (DSM32122) em comparação com a linhagem LVY127, em meio contendo uma mistura dos açúcares glicose (10 g/L) e xilose (30 g/L).

[41] A Figura 4 representa o gráfico que demonstra a redução do subproduto xilitol pela linhagem LVY142 (DSM32122) em comparação com a linhagem LVY127.

[42] A Figura 5 representa o gráfico que demonstra a redução do subproduto glicerol pela linhagem LVY142 (DSM32122) em comparação com a linhagem LVY127.

[43] A Figura 6 representa o gráfico que demonstra a via metabólica representando o consumo de açúcares pela linhagem LVY142 (DSM32122), contendo a XR de S. passalidarum e a XDH de S. stipitis.

[44] A Figura 7 representa o plasmídeo pSpXyll.2_SsXDH, contendo as XR de S. passalidarum e a XDH de S. stipitis. O esquema foi construído utilizando o software SnapGene Viewer. 0 fragmento contendo os genes XR de S. passalidarum e a XDH de S. stipitis foi amplificado do vetor pSpXyll.2_SsXDH e utilizado para a transformação de S. cerevisiae.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

15/20 [45] A presente invenção refere-se a levedura industrial geneticamente modificada LVY142 com a via oxi-redutiva de conversão de xilose, cassete de expressão gênica, processo de obtenção de etanol 2G e uso da levedura LVY142.

[46] O cassete de expressão gênica 1 compreende:

- a xilose redutase (XR) de S. passalidarum sob a ação do promotor e terminador do gene que codifica 3-fosfoglícerato Quinase (PGK1} em S. cerevisiae;

- o gene URA3 de S. cerevisiae, juntamente com seu promotor e terminador, flanqueado por dois sítios loxP em cada extremidade e na mesma orientação;

- gene xilitol desidrogenase (XDH) de S. stipitis sob a ação do promotor e terminador do gene que codifica a Gliceraldeído 3-Fosfato Desidrogenase, isoenzima 1 (TDHl) em S. cerevisiae, clonados no vetor pRS304; e

- sequência de nucleotídeos é representada pela SEQ ID NO:1.

[47] O cassete 1 é flanqueado por regiões que apresentam homologia a 516pb do centrômero cinco de S. cerevisiae.

[48] O cassete de expressão gênica 2 compreende:

- promotor (ADH1) e terminador (ADH1) do gene que codifica a enzima xiluloquinase de S. cerevisiae;

- gene URA3 de S. cerevisiae, juntamente com seu promotor e terminador, flanqueado por dois sítios loxP em cada extremidade e na mesma orientação; e

-sequência de nucleotideos.

[49] Para a construção do micro-organismo DSM32122 a primeira inserção do cassete 2 ocorreu a 288 pb do centrômero dois e a segunda cópia está a 228 pb do centrômero oito.

[50] O cassete de expressão gênica 3 compreende:

- gene xilitol desidrogenase (XDH) de S. stipitis sob a ação do promotor e terminador do gene que codifica a Gliceraldeído 3-Fosfato Desidrogenase, isoenzima 1 (TDHl) em S. cerevisiae;

16/20

- gene URA3 de S. cerevisiae, juntamente com seu promotor e terminador, flanqueado por dois sítios loxP em cada extremidade e na mesma orientação; e

- sequência de nucleotídeos.

[51] 0 cassete 3 refere-se à segunda cópia do gene que codifica a xilitol desidrogenase inserido a 454 pb do centrômero três.

[52] Os cassetes 2 e 3 são objetos do pedido de patente BR 10 2016 017560 7.

[53] A levedura geneticamente modificada é a Saccharomyces cerevisiae DSM32122.

[54] As etapas da construção da LVY142 (DSM32122) envolveram a inserção de 1 cópia do gene que codifica a xilose redutase (XR) de S, passalidarum, 2 cópias do gene que codifica a xilitol desidrogenase (XDH) de S. stipitis, deleção da aldose redutase GRE3 e inserção de 2 cópias de XKS1 (Figura 1).

[55] Para construção da linhagem LVY142 (DSM32122) fermentadora de xilose, foi utilizado um esporo da linhagem industrial PE-2, amplamente utilizada na indústria de etanol de primeira geração. A linhagem PE-2 apresenta alta performance fermentativa e é altamente tolerante a diversos estresses do processo industrial, se tornando uma plataforma robusta para a introdução da via de conversão de xilose.

[56] Os genes que expressam as enzimas XR e XDH de S. stipitis foram clonados, respectivamente, sob a ação dos promotores PGK1 e TDH1, e inseridos a 516 pb do centrômero cinco, resultando na linhagem LVY103. A linhagem era capaz de consumir toda a xilose presente em meio de cultivo, produzindo etanol. Porém, utilizando apenas essas modificações, a maior parte da xilose foi convertida em xilitol. A superexpressão do gene XKS1 sob ação do promotor ADHl deu origem a linhagem LVY123 e permitiu uma melhora significativa de desempenho, alcançando rendimento de etanol de 34% a partir dos açúcares totais (sendo 51% o rendimento

17/20 teórico), e rendimento de xilitol de 19% e glicerol de 5,51%. O cassete contendo o gene XKS1 foi inserido próximo ao centrômero dois.

[57] Por apresentar um rendimento ainda distante do teórico, o próximo passo desenvolvido foi o aumento do fluxo xilose à xilulose-5-Ρ, com a duplicação do número de cópias integradas dos genes XDH e XKS1 (inseridos próximo aos centrômeros três e oito, respectivamente) , além da deleção do gene que codifica uma aldose redutase, GRE3. Esse gene tem a mesma função que a xilose redutase (XR), realizando a redução da xilose a xilitol, utilizando exclusívamente NADPH como cofator. O gene XR de S. stípitis utilizado na transformação utiliza tanto NADPH como NADH, embora tenha uma maior afinidade pelo primeiro. A deleção do GRE3 é uma estratégia descrita que visa a diminuição de xilitol, visto que sua produção seria exclusivamente via XR de S. stípitis, o qual realiza a oxidação de NADH a NAD⁺ permitindo o aumento do fluxo pela XDH NAD⁺ dependente, próximo gene da via. A deleção do gene GRE3 (LVY124) e o aumento do número de cópias do XDH (LVY125) e XKS1 resultou na linhagem LVY127, que apresentou rendimento de etanol de 36% e diminuição nos rendimentos dos subprodutos xilitol e glicerol, com 8% e 8%, respectivamente.

[58] A linhagem LVY142, objeto da presente invenção, foi derivada a partir da linhagem LVY127, pela substituição da XR de S. stípitis pela XR de S, passalidarum. O promotor e terminador foram mantidos. O rendimento de etanol foi de 0,42 g etanol/g açúcares totais.

Exemplo de concretização

Linhagens utilizadas [59] Para os experimentos de clonagem e multiplicação dos plasmídeos foi utilizada a linhagem bacteriana de Escherichia colí DH5a (Stratagene®). Quando necessário, a linhagem foi ativada à 37 °C por esgotamento em meio de

18/20 cultura LB (Luria-Bertaini). Para a construção das linhagens foi utilizada a cepa industrial de S. cerevisiae PE-2, mantida em meio YEPD.

Construção do cassete de expressão [60] Para a construção dos cassetes foi utilizada a técnica descrita por Gibson et al. (2009), que consiste na fusão de fragmentos de DNA com um mix das enzimas T5 exonuclease, Taq ligase e DNA polimerase em uma única reação. Para o processo de seleção, foi utilizado o sistema Cre/loxP (Gueldener et al., 2002). 0 gene URA3 foi amplificado por PCR, juntamente ao seu promotor e terminador, e foram adicionadas sequências loxP na mesma orientação, nas duas extremidades, permitindo que esse marcador seja utilizado em os cassetes de transformação. Sequências de homologia ao local de inserção foram adicionadas nas extremidades dos cassetes.

Transformação de levedura e processo de seleção [61] A transformação de levedura for feita utilizando o método de acetato de lítio descrito por Gietz e Schíestl (2007) . A linhagem utilizada para a transformação é um esporo haplóide mat α derivado do diplóide S. cerevisiae PE-2. Para iniciar as introduções dos cassetes, a linhagem teve o gene URA3 removido para ser utilizado como marca auxotrófica. Os transformantes foram selecionados em meio YNB (sem uracila). A retirada do marcador pode então ser realizada com o plasmídeo pSH65 (Gueldener et al., 2002}, que contém o gene que codifica a recombinase Cre sob a ação do promotor induzível por galactose.

Ensaio fermentativo

Cultivo em semi-anaerobiose [62] O ensaio fermentativo foi realizado em meio YPDX (10 g/L de glicose e 30 g/L de xilose) em garrafas vedadas de 100 ml e volume de trabalho de 80 ml, iniciando a cultura com OD de aproximadamente 1,0. A temperatura e velocidade de agitação foram mantidas constantes, respectivamente, em 30

19/20 °C e 150 rpm. Amostras foram retiradas para medir OD e para posterior análise por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).

Quantificação dos produtos da fermentação [63] A quantificação de glicose, xilose, xilitol, glicerol, ácido acético e etanol foi realizada por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) utilizando o cromatógrafo Allíance HT (Waters) com detector de índice de refração (Waters 2414). As amostras foram analisadas por HPLC-RI utilizando a coluna de exclusão iônica HPX-87H (300mm x 7,8mm, BioRad®), aquecida em forno a 35 °C, H2SO4 5 mM como fase móvel a uma vazão de 0,6 mL/min. Uma curva padrão com as concentrações conhecidas com compostos de interesse também foram analisadas pelo mesmo procedimento.

[64] As concentrações dos compostos nas amostras foram determinadas por comparação das áreas dos picos cromatográficos obtidos com as curvas de calibração. 0 crescimento da linhagem LVY142, modificada com as vias de conversão de xilose, objeto da presente invenção, foi comparado com a linhagem predecessora LVY127, que possui a XR de S. stipitis, identificada na figura 2. O ensaio fermentativo foi conduzido em meio contendo uma mistura de glicose e xilose nas concentrações de 10 e 30 g/L, respectivamente. A figura 2 demonstra que a linhagem LVY142 agora é capaz de consumir toda a xilose presente no meio, com uma velocidade superior em relação a linhagem predecessora. O experimento foi conduzido em triplicata. A levedura LVY142 (DSM32122) possui aplicação em qualquer processo que envolva o consumo de xilose.

[65] A performance fermentativa da linhagem LVY142 (DSM32122) foi avaliada em condições semi-anaeróbicas em meio contendo xilose e glicose como fontes de carbono, iniciando com baixo volume de células com ODeoonm de aproximadamente 1.0 (0.25 g DW/L). A linhagem apresentou um

20/20 rendimento de etanol de 42%, além de uma diminuição nos rendimentos dos subprodutos xilitol e glicerol em relação as linhagens predecessoras, com 5,8% e 2%, respectivamente.

Claims (5)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Cassete de expressão gênica 1 caracterizado por compreender:

   - xilose redutase (XR) de S. passalidarum sob a ação do promotor e terminador do gene que codifica 3-fosfoglicerato Quinase (PGK1) em S. cerevisíae;

   - gene URA3 de S. cerevisíae, juntamente com seu promotor e terminador, flanqueado por dois sítios loxP em cada extremidade e na mesma orientação;

   - gene xilitol desidrogenase de S. stipitis sob a ação do promotor e terminador do gene que codifica a Gliceraldeído 3-Fosfato Desidrogenase, isoenzima 1 (TDH1) em S. cerevisíae, clonados no vetor pRS304; e

   - sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO:1.
2. 2. Levedura geneticamente modificada caracterizada por ser Saccharomyces cerevisíae DSM32122.
3. 3. Levedura, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por ser construída com a inserção de 1 cópia do gene que codifica a xilose redutase (XR) de S. passalidarum, 2 cópias do gene que codifica a xilitol desidrogenase (XDH) de S. stipitis, deleção da aldose redutase GRE3 e inserção de 2 cópias de XKS1.
4. 4. Processo de obtenção de etanol 2G caracterizado por ser realizado com a levedura Saccharomyces cerevisíae DSM32122.
5. 5. Uso da levedura conforme descrita nas reivindicações 2 e 3 caracterizado por ser para aplicação em qualquer processo que envolva o consumo de xilose.

   1/4

   LVY124

   LVY125

   LVY126

   LVY127

   Xilose NADPH\|

   J, XR «AOP’“

   Xilitol

   NAD* \| ^4 ^xdh

   Xilulose I XKS1

   Xilulose-5-Ρ

   Xilose

   NADPHJ

   NADp4 XR Xilitol

   NADXDh(x2}

   NAOH»f V-S/ t NADH

   Xilulose r- —

   I XKS1 Xilulose-5-Ρ

   PPP

   PPP

   LVY127

   Xilose

   NAD(P)H

   NAD(P)

   XR S. stípitis

   Xilitol

   NAD',

   XDH S. stipitís

   NADH >

   Xilulose

   XKS1

   Xilulose-5-Ρ +

   PPP

   Xilose

   NAOPHVl hadp4 XRAGRE3 Xilitol

   NAD* _ “ XDH(

   Xilulose I XKS1 Xilulose-5-Ρ

   PPP

   LVY142

   NADH~

   ΝΔΙΥ *

   Xilose

   Xilose

   NADPKKl haop4^X« ^âGRE3

   XiHtol ναοη4 ^XDH*^?

   Xilulose

   I XKSl(x 2 Xilulose-S-P

   PPP

   XR S. passatidarum

   Xilitol NAD\

   XDH S. stípitis

   NADH I

   Xilulose

   XKS1

   Xilulose-5-Ρ

   PPP