CN116042554A - 具有高酶活性与高热稳定性的葡聚糖单加氧酶及其制备方法与应用 - Google Patents
具有高酶活性与高热稳定性的葡聚糖单加氧酶及其制备方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116042554A CN116042554A CN202310083991.3A CN202310083991A CN116042554A CN 116042554 A CN116042554 A CN 116042554A CN 202310083991 A CN202310083991 A CN 202310083991A CN 116042554 A CN116042554 A CN 116042554A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- monooxygenase
- glucan
- amino acid
- nucleotide
- variant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 102000008109 Mixed Function Oxygenases Human genes 0.000 title claims abstract description 138
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 title claims abstract description 138
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 title claims abstract description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 title description 3
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 claims abstract description 135
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 41
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 41
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims abstract description 41
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 claims abstract description 34
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims abstract description 20
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims abstract description 20
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 claims abstract description 14
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims abstract description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 73
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 41
- 239000002773 nucleotide Chemical group 0.000 claims description 39
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 39
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 21
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 claims description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 16
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 4
- 102200115778 rs121918093 Human genes 0.000 claims description 4
- 239000010902 straw Substances 0.000 claims description 4
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 3
- 102220030567 rs188675457 Human genes 0.000 claims description 3
- 102220048321 rs77940364 Human genes 0.000 claims description 3
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 3
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 2
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 claims description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 2
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 claims description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 2
- 241000209140 Triticum Species 0.000 claims description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims description 2
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 claims description 2
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 claims description 2
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 claims description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 claims description 2
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 claims description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 claims 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 49
- NXXYKOUNUYWIHA-UHFFFAOYSA-N 2,6-Dimethylphenol Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1O NXXYKOUNUYWIHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 28
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 abstract description 27
- 239000000758 substrate Substances 0.000 abstract description 24
- KLIDCXVFHGNTTM-UHFFFAOYSA-N syringol Natural products COC1=CC=CC(OC)=C1O KLIDCXVFHGNTTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 16
- HJFZAYHYIWGLNL-UHFFFAOYSA-N 2,6-DiMepyz Natural products CC1=CN=CC(C)=N1 HJFZAYHYIWGLNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 14
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 abstract description 4
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 abstract description 2
- 101100373011 Drosophila melanogaster wapl gene Proteins 0.000 abstract 2
- 208000012396 long COVID-19 Diseases 0.000 abstract 2
- 210000004483 pasc Anatomy 0.000 abstract 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 18
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 10
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 10
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 8
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 7
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 7
- 102220125339 rs764468720 Human genes 0.000 description 7
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 7
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 6
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101710154526 Lytic chitin monooxygenase Proteins 0.000 description 5
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 5
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 description 4
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 4
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-M 4-hydroxybenzoate Chemical compound OC1=CC=C(C([O-])=O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 210000000723 mammalian artificial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000708016 Caenorhabditis elegans Sentrin-specific protease Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 241000702191 Escherichia virus P1 Species 0.000 description 1
- 102220466649 Histone H2A-Bbd type 2/3_V40A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 206010054949 Metaplasia Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012490 blank solution Substances 0.000 description 1
- 238000010504 bond cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012407 engineering method Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000015689 metaplastic ossification Effects 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/02—Monosaccharides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了具有高酶活性与高热稳定性的葡聚糖单加氧酶及其制备方法与应用，属于生物工程领域，本发明对葡聚糖单加氧酶BaLPMO10A的氨基酸序列进行定点突变，改变其氨基酸序列，显著提高葡聚糖单加氧酶的酶活性以及热稳定性。经验证，改造后的葡聚糖单加氧酶与野生型酶相比，单突变体对2,‑6‑DMP酶活性增加了40％‑90％，双突变体增加了30％‑95％；对PASC的催化水解活性增加了1倍；协同里氏木霉商业纤维素酶系降解底物PASC、FP和Avicel的还原糖产量分别增加了2.7倍、2.0倍和1.9倍；Tm升高了7.5℃，其为纤维素降解提供了更好的工具，因此更加适合产业化生产，具有良好的实际应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及具有高酶活性与高热稳定性的葡聚糖单加氧酶及其制备方法与应用。
背景技术
纤维素是地球上最丰富的自然资源，在生物炼制中起着举足轻重的作用，其在生物利用之前，需要通过纤维素酶系将其分解成易于降解的寡糖或单糖。然而，由于其顽固的结晶结构使其难以被高效水解。因此，提高酶的催化效率和降低水解酶的成本是酶工业应用的主要挑战。
葡聚糖单加氧酶(LPMOs)通过氧化断裂糖苷键的方式作用于纤维素表面顽固的结晶区，与传统的纤维素酶同时降解底物时，能够显著促进纤维素酶对底物的催化效率，是一类非常具有应用前景的生物质降解辅助酶。正因如此，LPMOs的发现对于纤维素的生物质降解具有重要意义。但大部分葡聚糖单加氧酶在高温长时间保温后极易失活，影响其实际应用效果。为了提高酶的热稳定性，科研工作者提出了许多非常重要的策略，如随机突变、直接进化筛选、构建嵌合体、化学修饰等方法，但其普遍存在构建繁琐、成功率低、工作量大、成本高、周期长等问题。此外，现有方法在提高酶热稳定性的同时，往往会降低酶的活性。因此，研究开发同时兼具高酶活性以及高热稳定性的葡聚糖单加氧酶对于扩展该酶在工业化生产中的应用尤为重要。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种具有高活性与高热稳定性的葡聚糖单加氧酶及其制备方法与应用。本发明通过定点突变改造了来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株产生的葡聚糖单加氧酶
BaLPMO10A(GenBank:AAP57758.1)的氨基酸序列，显著提高了酶活以及热稳定性，使其具有更好的实际应用价值。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
本发明的第一个方面，提供了具有高酶活性与高热稳定性的葡聚糖单加氧酶，本发明的葡聚糖单加氧酶是通过对解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株产生的葡聚糖单加氧酶BaLPMO10A(GenBank:AAP57758.1)进行改造获得的，所述改造具体为在葡聚糖单加氧酶BaLPMO10A氨基酸序列中的第3、4、5、36、40、55或124位中的一位或两位进行氨基酸替换获得；
一位氨基酸替换为N36E、R55Q、V40A、V40I、K5E、V40M、E124D、Y3F、I4V、V40L中的一种；
两位氨基酸替换为V40I-N36E、I4V-N36E、E124D-R55Q、Y3F-R55Q、V40L-R55Q、V40L-N36E、E124D-Y3F、V40L-I4V、V40L-Y3F、I4V-E124D、V40L-E124D中的一种。
优选的，所述葡聚糖单加氧酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.21的一种。本发明的葡聚糖单加氧酶通过对原有葡聚糖单加氧酶BaLPMO10A的氨基酸进行定点突变，有效地提高了酶的活性以及热稳定性。
本发明的第二个方面，提供一种葡聚糖单加氧酶类似物，其具有与所述葡聚糖单加氧酶相同的生物活性，所述葡聚糖单加氧酶类似物是指在用所述葡聚糖单加氧酶和另一种化合物融合或者用所述葡聚糖单加氧酶的氨基酸序列融合另外的多肽或者蛋白质而形成具有生物活性的多肽序列或蛋白质。
本发明的第三个方面，提供一种葡聚糖单加氧酶衍生物，其氨基酸序列具有与所述葡聚糖单加氧酶氨基酸主序列≥70％的一致性，≥90％的相似性，该衍生物是指把所述氨基酸的序列中的氨基酸的一个或者几个氨基酸的某个基团用另外的基团取代后与所述葡聚糖单加氧酶具有同样生物活性的葡聚糖单加氧酶。
本发明的第四个方面，提供一种葡聚糖单加氧酶变体，其氨基酸序列具有与权利要求1或2所述葡聚糖单加氧酶氨基酸主序列≥70％的一致性，≥90％的相似性，该变体是指一种具有一个或几个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列或编码它的核苷酸序列，所述改变包括在氨基酸序列或核苷酸序列中，在序列中间的任一位置缺失、插入或替换氨基酸或核苷酸，或在序列两端添加氨基酸或核苷酸，所述葡聚糖单加氧酶变体具有与上述葡聚糖单加氧酶相同的生物活性。
本发明的第五个方面，提供所述葡聚糖单加氧酶、葡聚糖单加氧酶类似物、葡聚糖单加氧酶衍生物或葡聚糖单加氧酶变体的核苷酸，其包含下组中的任一种：
(a)编码具有所述氨基酸序列的多肽或类似物、衍生物或其变体的核苷酸；
(b)与(a)所述核苷酸互补的核苷酸；
(c)与(a)或(b)中所述核苷酸有≥75％一致性的核苷酸。
本发明的第六个方面，提供上述葡聚糖单加氧酶、葡聚糖单加氧酶类似物、葡聚糖单加氧酶衍生物或葡聚糖单加氧酶变体的制备方法，所述制备方法包括通过基因由基因工程菌生产而得。
进一步的，所述制备方法包括：
合成编码所述葡聚糖单加氧酶、葡聚糖单加氧酶类似物、葡聚糖单加氧酶或葡聚糖单加氧酶变体的核苷酸；
将核苷酸导入表达载体构建表达载体，然后导入宿主进行培养，收集，纯化即得。
本发明的第七个方面，提供上述葡聚糖单加氧酶、葡聚糖单加氧酶类似物、葡聚糖单加氧酶衍生物或葡聚糖单加氧酶变体在食品、饲料、能源、生物转化领域中的应用。
本发明的有益效果为：
本发明通过对葡聚糖单加氧酶BaLPMO10A(GenBank:AAP57758.1)的基因序列进行定点突变，改变其氨基酸序列，从而显著提高了葡聚糖单加氧酶的酶活性以及热稳定性。经试验验证，本发明改造后的葡聚糖单加氧酶与野生型(WT)酶相比，单突变体对可溶底物2,6-DMP酶活性增加了40％-90％，双突变体酶对可溶底物2,6-DMP活性增加了30％-95％(图1)；突变体在不同温度下与来自里氏木霉纤维素酶的协同效应产生的还原糖都显著高于野生型(图10)；突变体表现出较高的表观熔化温度值(Tm)(图11和表1)，比WT更稳定。本发明改造后的葡聚糖单加氧酶更加适合产业化生产特别是高温环境下工业化生产的需求，有利于提高反应催化效率，缩短生产时间成本，因此具有良好的实际应用价值。
本发明通过多序列比对后进行定点突变在改善LPMOs方面是有效的，证明通过半理性设计的蛋白质工程方法来提高酶活性和稳定性将是蛋白质工程在各种工业应用不可或缺的途径之一。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例BaLPMO10A野生型及单突变体对可溶底物2,6-DMP的相对活性比较图；
图2为本发明实施例WT和双突变体对可溶性底物2,6-DMP的相对活性比较图；
图3为本发明实施例WT和突变体水解磷酸溶胀纤维素(PASC)的时间进程图；
图4为本发明实施例WT和突变体对降解可溶性底物2,6-DMP和不溶性底物PASC的活性之间的线性相关性数据图；
图5为本发明实施例WT和单突变体与里氏木霉纤维素酶协同水解PASC时间进程图；
图6为本发明实施例WT和双突变体与里氏木霉纤维素酶协同水解PASC时间进程图；
图7为本发明实施例WT和单突变体与里氏木霉纤维素酶协同水解滤纸(FP)时间进程图；
图8为本发明实施例WT和双突变体与里氏木霉纤维素酶协同水解FP时间进程图；
图9为本发明实施例WT和突变体与里氏木霉纤维素酶协同水解结晶纤维素(Avicel)的时间进程图；
图10为本发明实施例WT和突变体与里氏木霉纤维素酶协同水解PASC的最适温度曲线图；
图11为圆二色谱方法测试BaLPMO10A野生型及突变体的Tm值光谱曲线图。
图12为本发明实施例BaLPMO10A和其他LMPO多序列比对的同源性结果图
具体实施方式
如前所述，现有葡聚糖单加氧酶的酶活性和热稳定性仍然有待提高。
有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供具有高酶活性与高热稳定性的葡聚糖单加氧酶，本发明的葡聚糖单加氧酶是通过对BaLPMO10A酶氨基酸序列(即野生型WT,SEQ ID NO.22)中的第3、4、5、36、40、55或124位中的一位或两位进行氨基酸替换获得；
具体的，BaLPMO10A酶单突变体氨基酸替换为：
将第36位的氨基酸替换E(N36E)(SEQ ID NO.1)、
将第55位的氨基酸替换Q(R55Q)(SEQ ID NO.2)、
将第40位的氨基酸替换A(V40 A)(SEQ ID NO.3)、
将第40位的氨基酸替换I(V40I)(SEQ ID NO.4)、
将第5位的氨基酸替换E(K5E)(SEQ ID NO.5)、
将第40位的氨基酸替换M(V40M)(SEQ ID NO.6)、
将第124位的氨基酸替换D(E124D)(SEQ ID NO.7)、
将第3位的氨基酸替换F(Y3F)(SEQ ID NO.8)、
将第4位的氨基酸替换V(I4V)(SEQ ID NO.9)、
或将第40位的氨基酸替换L(V40L)(SEQ ID NO.10)；
BaLPMO10A酶双突变体氨基酸替换为：
将第40位的氨基酸替换I的同时将第36位的氨基酸替换E(V40I-N36E)(SEQ IDNO.11)、
将第4位的氨基酸替换V的同时将第36位的氨基酸替换E(I4V-N36E)(SEQ IDNO.12)、
将第124位的氨基酸替换D的同时将第55位的氨基酸替换Q(E124D-R55Q)(SEQ IDNO.13)、
将第3位的氨基酸替换F的同时将第55位的氨基酸替换Q(Y3F-R55Q)(SEQ IDNO.14)、
将第40位的氨基酸替换L的同时将第55位的氨基酸替换Q(V40L-R55Q)(SEQ IDNO.15)、
将第40位的氨基酸替换的同时将第36位的氨基酸替换E(V40L-N36E)(SEQ IDNO.16)、
将第124位的氨基酸替换D的同时将第3位的氨基酸替换F(E124D-Y3F)(SEQ IDNO.17)、
将第40位的氨基酸替换L的同时将第4位的氨基酸替换V(V40L-I4V)(SEQ IDNO.18)、
将第40位的氨基酸替换L的同时将第3位的氨基酸替换F(V40L-Y3F)(SEQ IDNO.19)、
将第4位的氨基酸替换V的同时将第124位的氨基酸替换D(I4V-E124D)(SEQ IDNO.20)、
或将第40位的氨基酸替换L的同时将第124位的氨基酸替换D(V40L-E124D)(SEQID NO.21)。
该实施方式的一些实施例中，葡聚糖单加氧酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1-SEQID NO.21中的一种。该葡聚糖单加氧酶通过对原有葡聚糖单加氧酶的氨基酸序列进行定点突变，有效地提高了酶的活性以及热稳定性。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种葡聚糖单加氧酶类似物，其具有与上述葡聚糖单加氧酶相同的生物活性，所述葡聚糖单加氧酶类似物是指在用所述葡聚糖单加氧酶和另一种化合物融合或者用所述葡聚糖单加氧酶的氨基酸序列融合另外的多肽或者蛋白质而形成具有生物活性的多肽序列或蛋白质。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种葡聚糖单加氧酶衍生物，其氨基酸序列具有与上述葡聚糖单加氧酶氨基酸主序列≥70％(例如70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(完全)序列)的一致性，≥90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或以上)的相似性，该衍生物是指把所述氨基酸的序列中的氨基酸的一个或者几个氨基酸的某个基团用另外的基团取代后与所述葡聚糖单加氧酶具有同样生物活性的葡聚糖单加氧酶。
本发明的又一具体具体实施方式中，提供一种葡聚糖单加氧酶变体，其氨基酸序列具有与上述葡聚糖单加氧酶氨基酸主序列≥70％(例如70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(完全)序列)的一致性，≥90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或以上)的相似性，该变体是指一种具有一个或几个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列或编码它的核苷酸序列，所述改变包括在氨基酸序列或核苷酸序列中，在序列中间的任一位置缺失、插入或替换氨基酸或核苷酸，或在序列两端添加氨基酸或核苷酸，所述葡聚糖单加氧酶变体具有与上述葡聚糖单加氧酶相同的生物活性。
本发明的又一具体实施方式中，提供编码上述葡聚糖单加氧酶、葡聚糖单加氧酶类似物、葡聚糖单加氧酶衍生物或葡聚糖单加氧酶变体的核苷酸，其包含下组中的任一种：
(a)编码具有所述氨基酸序列的多肽或类似物、衍生物或其变体的核苷酸；
(b)与(a)所述核苷酸互补的核苷酸；
(c)与(a)或(b)中所述核苷酸有≥75％(例如75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(完全)序列)一致性的核苷酸。
所述核苷酸采用人工合成方法制备。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述葡聚糖单加氧酶、葡聚糖单加氧酶类似物、葡聚糖单加氧酶衍生物或葡聚糖单加氧酶变体的制备方法，所述方法至少包括：
合成编码所述葡聚糖单加氧酶、葡聚糖单加氧酶类似物、葡聚糖单加氧酶或葡聚糖单加氧酶变体的核苷酸；
将核苷酸导入表达载体构建表达载体，然后导入宿主进行培养，收集，纯化即得。
该实施方式的一些实施例中，表达载体为病毒载体、质粒、噬菌体、噬菌粒、黏粒、F黏粒、噬菌体或人工染色体中的任意一种或多种；病毒载体可包括腺病毒载体、逆转录病毒载体或腺伴随病毒载体，人工染色体包括细菌人工染色体(BAC)、噬菌体P1衍生的载体(PAC)、酵母人工染色体(YAC)或哺乳动物人工染色体(MAC)；进一步优选为质粒；更进一步优选为pET-20b质粒。
该实施方式的一些实施例中，宿主包括但不限于细菌、真菌和真核细胞，进一步选自埃希氏大肠杆菌、芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、里氏木霉和草酸青霉；更进一步优选为大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述葡聚糖单加氧酶、葡聚糖单加氧酶类似物、葡聚糖单加氧酶衍生物或葡聚糖单加氧酶变体在食品、饲料、能源、生物转化领域中的应用；尤其是上述应用领域为高温环境；进一步优选的，所述高温环境为不低于30℃((例如30℃-35℃、35℃-40℃、40℃-50℃或50℃-65℃)；更进一步优选的，所述高温环境优选为45-55℃。
该实施方式的一些实施例中，上述葡聚糖单加氧酶、葡聚糖单加氧酶类似物、葡聚糖单加氧酶衍生物或葡聚糖单加氧酶变体在降解纤维素或木质纤维素中的应用；
优选的，所述纤维素包括：微晶纤维素、磷酸溶胀纤维素、羧甲基纤维素钠；
优选的，所述木质纤维素包括：玉米芯、滤纸、小麦秸秆、水稻秸秆。
该实施方式的一些实施例中，上述葡聚糖单加氧酶、葡聚糖单加氧酶类似物、葡聚糖单加氧酶衍生物或葡聚糖单加氧酶变体与纤维素酶协同降解纤维素或木质纤维素中的应用。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
除另有说明外，本发明中使用的所有材料和化学试剂均为最纯净等级，购自元业生物科技有限公司(中国上海)、国药化学试剂有限公司(中国北京)、Sigma-Aldrichchemicals Pvt.Ltd.(美国)和赛默飞世尔科技(美国)。
实施例
1、具有高酶活性与高热稳定性的葡聚糖单加氧酶
为了研究不同BaLPMO10A酶突变体等对酶活性和热稳定行动的影响，通过多序列比对的方法筛选目标位点，然后再进行定点突变。所有突变体均通过基于PCR的定点突变制备，并通过DNA测序进行验证。然后，所有PCR产物在大肠杆菌BL21(DE3)中重组表达。
编码BaLPMO10A的WT的PDB编号为(2YOX)，在N-末端加上SUMO标签，其DNA序列与含有限制性内切酶NdeI和XhoI的载体pET-20b连接。然后将构建的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，用于目的蛋白质的表达。所有突变体都是通过PCR的定点突变产生的，并通过DNA测序进行验证。WT和所有突变体以相同的方式进行重组表达和纯化，具体如下：
将新鲜菌落接种到含有100g/mL氨苄青霉素(Amp)的3L LB培养基中。细胞在37℃的摇床(～220rpm)中培养，直到OD600的光密度达到0.6-0.8。然后加入1mM浓度的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，在18℃诱导重组蛋白表达24小时。在50mM乙酸钠(pH＝5.0)中悬浮收集细胞，超声处理裂解并在9600g，4℃，离心30分钟。然后使用0.45微米孔径的滤膜过滤得上清液。在此之后，蛋白质通过预平衡的Ni-NTA色谱柱使用
纯层析系统(GE Healthcare，Chicago，USA)纯化。用缓冲液(50mM乙酸钠、20mM Na2HPO4、300mM NaCl和10mM咪唑)洗涤结合在柱上的非目的蛋白。最后，通过应用线性梯度咪唑(20-500mM)洗脱目的蛋白。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定蛋白质的纯度。使用截留分子量为10KDa的超滤管进行浓缩，然后将纯化的蛋白质透析，将缓冲液改变为pH 6.0的50mM乙酸钠，在-20℃储存。为了获得天然的N-末端，如前所述，用SUMO蛋白酶(Novagen，Billerica，MA，USA)裂解重组纯化的蛋白质(WT和所有突变体)。在酶切后，为了去除SUMO标签，将融合蛋白加到到镍-亲和层析柱(Novagen)中进行进一步纯化。通过使用UV-Vis光谱(Nanodrop 2000，Thermo Fisher)测量其在UV280的光密度来确定纯化蛋白质的浓度。纯化蛋白质的消光系数为44920M-1cm-1 280nm。
纯化的BaLPMO10A蛋白,在室温下孵育约30分钟，在20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中用过量的硫酸铜(II)(4倍摩尔过量)饱和纯化的BaLPMO10A蛋白(3mg/mL)。之后，使用PD10MidiTrap G-25(GE Healthcare)，用50mM乙酸钠缓冲液pH(6.0)平衡的脱盐柱除去过量的铜。
2、检测
2.1、酶活性测定
根据分光光度检测方法，使用显色分子2，6-二甲氧基苯酚(2,6-DMP)作为主要底物，H2O2作为共底物来测定纯化的BaLPMO10A的酶活性。
酶促反应在100mM乙酸钠缓冲液(pH＝6.0)、100μM H2O2、10mM 2,6-DMP、0.5μMBaLPMO10A(酶)中于30℃下进行反应5分钟。5分钟后。相对于在相同实验条件下孵育的含有相同酶促反应混合物组分(酶除外)的空白溶液，测量469nm处吸光度的增加。采用消光系数(ε469＝53200M-1cm-1)来确定反应时间内产生的有色产物的浓度。
2.2、催化水解PASC的研究
为了评估BaLPMO10A对PASC水解的活性，将含有0.5W/V PASC、1μM铜饱和的BaLPMO10A(WT和突变体)、2mM抗坏血酸的反应混合物在1.5mL eppendorf管中孵育，总反应体积为250μL，在pH 6.0的100mM乙酸钠缓冲液中培养，反应温度为50℃，反应时间分别为1、2、4、6、8、10和12小时。将反应混合物通过0.22m孔径的滤膜过滤后，通过PAHBAH分析法测定形成的还原糖产物的最终浓度。
2.3、BaLPMO10A与纤维素酶对纤维素底物解聚的协同作用
为了检测BaLPMO10A和纤维素酶(T.reesei)的协同作用，我们对其降解PASC、FP和Avicel进行了评估。在100mM乙酸钠缓冲液(pH 6.0)、2mM抗坏血酸、0.5W/V PASC、0.25mg/mL纤维素酶(T.reesei)、1μM铜饱和BaLPMO10A(WT和突变体)，在1.5mL eppendorf管中进行纯化酶(WT和突变体)与纤维素酶对PASC底物的协同作用的评估。在50℃下孵育1、2、4、6、8、10和12小时，将反应混合物通过0.22μm孔径的滤膜过滤后，通过PAHBAH分析法测定形成的产物的最终浓度。此外，除孵育时间为6、12、24、36和48h、酶浓度为2μM外，在相同的实验条件下研究纯化酶和纤维素酶对Avicel(10g/L)解聚的协同作用。
此外，为了评估纯化酶对滤纸降解的活性，将由10g/L滤纸((FP，Whatman 1号)、2μM铜饱和BaLPMO10A(WT和突变体)、0.25mg/mL纤维素酶、2mM抗坏血酸组成的反应混合物在2mL eppendorf管中孵育，总反应体积为400μL，在pH 6.0的100mM乙酸钠缓冲液中，50℃下反应6、12、24、36和48小时。将反应混合物通过0.22μm孔径的滤膜过滤后，通过PAHBAH分析法测定形成的产物的最终浓度。纯化酶在FP的酶解过程中形成的产物主要为还原糖。
2.4、温度对BaLPMO10A酶活性和热稳定性的影响
为了研究BaLPMO10A(野生型和突变体)及纤维素酶在协同水解PASC中的最佳温度，将反应混合物在不同温度范围(30、35、40、45、50、55、60、65、70、75和80℃)下孵育12小时，实验条件是100mM乙酸钠缓冲液(pH 6.0)、2mM抗坏血酸、0.5W/V PASC、0.5μM铜饱和BaLPMO10A(WT和突变体)和0.25mg/mL纤维素酶，总体积为250μL，置于1.5mL eppendorf管中反应。通过使用对羟基苯甲酸肼(PAHBAH)检测产生还原糖的量来评价酶的活性。
通过使用ChirascanTMCD光谱仪测量圆二色性(CD)光谱来研究BaLPMO10A(WT和突变体)的热稳定性，该光谱仪配备有温度调节的细胞保持器。在整个实验过程中，设备以10Lmin-1的流速填充氮气，反应的温度设定在20-95℃，反应混合物在50mM醋酸钠缓冲液(pH6.0)中进行。使用Origin 8软件绘制CD值，并用公式就行曲线拟合。
3、结果和讨论
3.1、定点突变筛选BaLPMO10A突变体
通过Blast搜索找到同源性不一的11个LMPO氨基酸序列，然后将野生型BaLPMO10A与这11个LMPO氨基酸序列进行比对，结果它们与BaLPMO10A的同源性为35.6％。在(图12)的比对结果中，如果野生型BaLPMO10A中的氨基酸类型不同于所有序列中的氨基酸类型，则选择该突变位点。总共选择15个突变体用于下一步可溶性底物的酶活性分析。
3.2、BaLPMO10A突变体的表达与筛选
编码野生型BaLPMO10A和单个突变体的基因序列已经成功克隆并在大肠杆菌中表达，并针对可溶性底物2,6-DMP进行了测试。总共获得了10个单个突变体对可溶底物2,6-DMP的活性提高了，其中与野生型(WT)酶相比，V40L具有最高的活性。单个突变体：V40L、I4V、Y3F和E124D分别显示出90％、82％、81％和80％的活性增强(图1)。此外，将活性良好的单突变体组合，设计出20个双突变体。与野生型相比，其中有10个双突变体的活性增加了，其中V40L-E124D的活性增加了93.7％(图2)。
似乎双突变体的活性仅略好于单突变体。不同的单突变体几乎没有协同效应。因此，没有制备三或四突变体。选择对可溶性底物2,6-DMP表现出较高活性的单突变体和双突变体，用于不溶性底物如PASC、Avicel和FP的进一步活性测定。这种对可溶性底物2,6-DMP活性的提高主要是由于各种氨基酸的定点取代。定点突变和半理性设计是提高相关酶特性的最有效方法之一，该方法可广泛用于提高各种LPMOs的活性和稳定性。
3.3、BaLPMO10A酶对水解PASC的作用
在不添加里氏木霉纤维素酶的情况下，针对不溶性底物PASC评估野生型BaLPMO10A酶以及突变体的纤维素解聚潜力。糖苷键可以被LPMO氧化断裂。使用对羟基苯甲酸肼(PAHBAH)的检测试验评估产生的还原糖量。使用PASC作为底物，在反应12小时后，单突变体产生0.19mM至0.26mM的还原糖，比WT高约19％至60％(图3)。单突变体V40L、E124D和I4V的还原糖产量各增加约60％。单突变体针对PASC的较高活性与针对2,6-DMP的活性测定一致。对于双突变体，观察到类似的活性增强。双突变体V40L-E124D、I4V-E124D和V40L-I4V产生的还原糖量最高，与野生型相比，还原糖产量分别增加了1.0、0.9和0.8倍(图4)。
3.4、BaLPMO10A与纤维素酶对不同底物的协同解聚能力
为了观察具有高活性的突变体是否有助于纤维素酶水解纤维素，使用市售纤维素酶(里氏木霉)与BaLPMO10A以及不同突变体一起水解PASC、FP和Avicel。如图5、6所示，在PASC的解聚中，WT BaLPMO10A和纤维素酶的组合在反应12小时后将还原糖的产量增加0.8倍。相比之下，向纤维素酶中添加突变体的还原糖产率提高了1.9倍。与单独的纤维素酶相比，高活性的单突变体V40L、E124D和I4V分别将还原糖的产量增加了1.9、1.8和1.7倍。双突变体V40L-E124D将还原糖的产量增加了2.7倍，其次是双突变体I4V-E124D、V40L-I4V和V40L-Y3F，与单独的纤维素酶相比，它们在还原糖产量方面分别增加了2.5、2.4和2.3倍。
除了PASC之外，我们还检测了BaLPMO10A以及不同的突变体和纤维素酶对FP的糖苷键切割的协同作用。与PACS相比，FP具有更多的结晶纤维素含量，因此更难解聚。反应48小时后，除V40I外，大多数单突变体产生的还原糖比单独的纤维素酶多90％至140％。此外，与单独通过纤维素酶产生还原糖相比，WT的添加增加了30％的还原糖的释放。2,6-DMP氧化最活跃的四个单突变体V40L、Y3F、I4V和E124D也显示出比其他单突变体更高的降解FP活性(图7)。相比之下，双突变体的活性更高一些。在反应48小时后，与纤维素酶相比，双突变体V40L-E124D将还原糖的产生量提高了2.0倍，其次是V40L-I4V和I4V-E124D，它们将还原糖的释放分别提高了约1.9倍。其他三个双突变体，V40L-Y3F，V40L-N36E和E124D-Y3F也显示出更高的还原糖生产效率，对应于单独的纤维素酶活性相比增加约1.8倍(图8)。
众所周知，纤维素糖苷键的切割是相当复杂的。酶需要结合到纤维素表面，寻找糖苷键，切割糖苷键，并从表面释放。将PASC中释放的还原糖量与对2,6-DMP的活性进行相关性比较。对可溶性和不溶性底物的活性之间的线性相关性表明糖苷键切割步骤限制了不溶性底物PASC的催化(图4)。
同时，我们还评估了检测了BaLPMO10A以及不同的突变体和纤维素酶降解Avicel纤维素的协同作用(图9)。与单独使用纤维素酶相比，WT与维素酶组合可将还原糖的产量提高了0.6倍。单突变体V40L、I4V和E124D分别将还原糖的产量增加了1.4、1.2和1.0倍。对于双突变体可以看到相同的效果。V40L-E124D显著提高了产量1.9倍，而其他双突变体I4V-E124D和E124D-Y3F与单独通过纤维素酶生产还原糖相比，还原糖的产量分别提高了1.8倍和1.7倍。
3.5、温度对酶活性和稳定性的影响
为了评估突变对BaLPMO10A酶与纤维素酶协同效应最佳温度的影响，使用PASC作为底物，在不同温度范围(30-80℃)下测量WT和一些高活性突变体的与纤维素酶协同效应的活性。如图10所示，WT和大多数突变体的协同效应产生的还原糖量都随着温度的升高而增加，直到大约50℃。只有单突变体E124D的最适协同效应温度为55℃。高于最佳温度时，随着温度的升高，WT和所有突变体和纤维素酶协同效应的活性逐渐降低(图10)。总的来说，由于更高的活性，所有突变体在不同温度下产生的还原糖都高于野生型。
WT和突变体的热稳定性通过使用圆二色性(CD)光谱测量折叠-展开平衡来研究(图11)。WT在57.3℃的熔融温度开始早期展开，而突变体在更高的温度下开始展开，并且与WT相比，熔融温度提高了7.5℃(表1)，表现出更高的热稳定性。
表1.在实验条件下测试的WT和所有突变体的表观Tm值
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.具有高酶活性与高热稳定性的葡聚糖单加氧酶，其特征在于，所述葡聚糖单加氧酶是通过对BaLPMO10A酶的氨基酸序列中的第3、4、5、36、40、55或124位中的一个或两个进行氨基酸替换获得；
一个氨基酸替换为N36E、R55Q、V40A、V40I、K5E、V40M、E124D、Y3F、I4V、V40L中的一种；
两个氨基酸替换为V40I-N36E、I4V-N36E、E124D-R55Q、Y3F-R55Q、V40L-R55Q、V40L-N36E、E124D-Y3F、V40L-I4V、V40L-Y3F、I4V-E124D、V40L-E124D中的一种。
2.如权利要求1所述葡聚糖单加氧酶，其特征在于，葡聚糖单加氧酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.21中的一种。
3.一种葡聚糖单加氧酶类似物，其特征在于，其具有与权利要求1或2所述葡聚糖单加氧酶相同的生物活性，所述葡聚糖单加氧酶类似物是指在用所述葡聚糖单加氧酶和另一种化合物融合或者用所述葡聚糖单加氧酶的氨基酸序列融合另外的多肽或者蛋白质而形成具有生物活性的多肽序列或蛋白质。
4.一种葡聚糖单加氧酶衍生物，其特征在于，其氨基酸序列具有与权利要求1或2所述葡聚糖单加氧酶氨基酸主序列≥70％的一致性，≥90％的相似性，该衍生物是指把所述氨基酸的序列中的氨基酸的一个或者几个氨基酸的某个基团用另外的基团取代后与所述葡聚糖单加氧酶具有同样生物活性的葡聚糖单加氧酶。
5.一种葡聚糖单加氧酶变体，其特征在于，其氨基酸序列具有与权利要求1或2所述葡聚糖单加氧酶氨基酸主序列≥70％的一致性，≥90％的相似性，该变体是指一种具有一个或几个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列或编码它的核苷酸序列，所述改变包括在氨基酸序列或核苷酸序列中，在序列中间的任一位置缺失、插入或替换氨基酸或核苷酸，或在序列两端添加氨基酸或核苷酸，所述葡聚糖单加氧酶变体具有与上述葡聚糖单加氧酶相同的生物活性。
6.编码权利要求1或2所述葡聚糖单加氧酶、权利要求3所述葡聚糖单加氧酶类似物、权利要求4所述葡聚糖单加氧酶衍生物或权利要求5所述葡聚糖单加氧酶变体的核苷酸；优选的，其包含下组中的任一种：
(a)编码具有所述氨基酸序列的多肽或类似物、衍生物或其变体的核苷酸；
(b)与(a)所述核苷酸互补的核苷酸；
(c)与(a)或(b)中所述核苷酸有≥75％一致性的核苷酸。
7.权利要求1或2所述葡聚糖单加氧酶、权利要求3所述葡聚糖单加氧酶类似物、权利要求4所述葡聚糖单加氧酶衍生物或权利要求5所述葡聚糖单加氧酶变体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括通过基因由基因工程菌生产而得。
8.如权利要求7所述制备方法，其特征在于，所述方法至少包括：
合成编码所述葡聚糖单加氧酶、葡聚糖单加氧酶类似物、葡聚糖单加氧酶或葡聚糖单加氧酶变体的核苷酸；
将核苷酸导入表达载体构建表达载体，然后导入宿主进行培养，收集，纯化即得；
优选的，所述表达载体为病毒载体、质粒、噬菌体、噬菌粒、黏粒、F黏粒、噬菌体或人工染色体中的任意一种或多种；所述表达载体进一步优选为质粒；更进一步优选为pET-20b质粒；
优选的，所述宿主包括细菌、真菌和真核细胞，进一步选自埃希氏大肠杆菌、芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、里氏木霉和草酸青霉；更进一步优选为大肠杆菌BL21(DE3)。
9.权利要求1或2所述葡聚糖单加氧酶、权利要求3所述葡聚糖单加氧酶类似物、权利要求4所述葡聚糖单加氧酶衍生物或权利要求5所述葡聚糖单加氧酶变体在食品、饲料、能源、生物转化领域中的应用；
优选的，所述应用领域为高温环境；进一步优选的，所述高温环境为不低于30℃；更进一步优选的，所述高温环境优选为45-55℃。
10.如权利要求9所述应用，其特征在于，权利要求1或2所述葡聚糖单加氧酶、权利要求3所述葡聚糖单加氧酶类似物、权利要求4所述葡聚糖单加氧酶衍生物或权利要求5所述葡聚糖单加氧酶变体在降解纤维素或木质纤维素中的应用；
优选的，所述纤维素包括：微晶纤维素、酸溶胀纤维素、羧甲基纤维素钠；
优选的，所述木质纤维素包括：玉米芯、滤纸、小麦秸秆、水稻秸秆；
优选的，权利要求1或2所述葡聚糖单加氧酶、权利要求3所述葡聚糖单加氧酶类似物、权利要求4所述葡聚糖单加氧酶衍生物或权利要求5所述葡聚糖单加氧酶变体与纤维素酶协同降解纤维素或木质纤维素中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310083991.3A CN116042554B (zh) | 2023-01-31 | 2023-01-31 | 具有高酶活性与高热稳定性的葡聚糖单加氧酶及其制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310083991.3A CN116042554B (zh) | 2023-01-31 | 2023-01-31 | 具有高酶活性与高热稳定性的葡聚糖单加氧酶及其制备方法与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116042554A true CN116042554A (zh) | 2023-05-02 |
| CN116042554B CN116042554B (zh) | 2024-06-14 |
Family
ID=86125373
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310083991.3A Active CN116042554B (zh) | 2023-01-31 | 2023-01-31 | 具有高酶活性与高热稳定性的葡聚糖单加氧酶及其制备方法与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116042554B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101906406A (zh) * | 2010-06-24 | 2010-12-08 | 复旦大学 | 具有内切葡聚糖酶/木聚糖酶活性的双功能酶及其制备方法与应用 |
| US20140178947A1 (en) * | 2011-09-05 | 2014-06-26 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Mutant endoglucanase |
| CN109957571A (zh) * | 2017-12-14 | 2019-07-02 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种多糖裂解单加氧酶编码基因及酶和制备与应用 |
| CN110551699A (zh) * | 2019-09-03 | 2019-12-10 | 天津科技大学 | 一种定点突变改造的裂解性多糖单加氧酶及其构建方法与应用 |
-
2023
- 2023-01-31 CN CN202310083991.3A patent/CN116042554B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101906406A (zh) * | 2010-06-24 | 2010-12-08 | 复旦大学 | 具有内切葡聚糖酶/木聚糖酶活性的双功能酶及其制备方法与应用 |
| US20140178947A1 (en) * | 2011-09-05 | 2014-06-26 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Mutant endoglucanase |
| CN109957571A (zh) * | 2017-12-14 | 2019-07-02 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种多糖裂解单加氧酶编码基因及酶和制备与应用 |
| CN110551699A (zh) * | 2019-09-03 | 2019-12-10 | 天津科技大学 | 一种定点突变改造的裂解性多糖单加氧酶及其构建方法与应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116042554B (zh) | 2024-06-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11530428B2 (en) | Nucleic acids encoding fungal cellobiohydrolases for expression in yeast | |
| JP4199422B2 (ja) | ポリペプチド | |
| WO2000070031A9 (en) | E1 endoglucanase variants y245g, y82r and w42r | |
| CN103687947B (zh) | 突变型β葡糖苷酶、生物质分解用酶组合物和糖液的制造方法 | |
| Zhu et al. | Characterization of a family 5 glycoside hydrolase isolated from the outer membrane of cellulolytic Cytophaga hutchinsonii | |
| Yin et al. | Expression and characterization of a cold-adapted, salt-and glucose-tolerant GH1 β-glucosidase obtained from Thermobifida halotolerans and its use in sugarcane bagasse hydrolysis | |
| JP6340647B2 (ja) | 超耐熱性セロビオハイドロラーゼ | |
| Ramachandran et al. | Cloning and characterization of a putative β-glucosidase (NfBGL595) from Neosartorya fischeri | |
| CN116042554B (zh) | 具有高酶活性与高热稳定性的葡聚糖单加氧酶及其制备方法与应用 | |
| Li et al. | Functional role of β domain in the Thermoanaerobacter tengcongensis glucoamylase | |
| JP4228073B2 (ja) | 高活性融合酵素 | |
| CN110358755B (zh) | 酸性耐高温重组纤维素酶及其应用 | |
| JPH11318441A (ja) | 超耐熱耐酸性アミロプルラナーゼ | |
| KR100367154B1 (ko) | 아카보오스분해능이있는아밀라제,그것을코딩하는유전자,그것을생산하는미생물및그아밀라제의용도 | |
| KR102312807B1 (ko) | 비피도박테리움 속의 저항전분 분해 활성을 가지는 아밀라아제들 및 이의 용도 | |
| US20160251642A1 (en) | Stable fungal cel6 enzyme variants | |
| JP5062730B2 (ja) | 改良耐熱性セルラーゼ | |
| KR101014802B1 (ko) | 복합 탈분지 효소를 이용하여 전분으로부터 포도당을 제조하는 방법 | |
| KR101834493B1 (ko) | 신규 베타-만노시다제 및 이의 생산방법 | |
| KR101646741B1 (ko) | 신규 재조합 셀룰레이즈 및 그의 용도 | |
| JPH0353883A (ja) | 耐熱性β‐１，３‐グルカナーゼ遺伝子ＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換え体プラスミド及び形質転換体と耐熱性β‐１，３‐グルカナーゼ及びその製法 | |
| KR20140048904A (ko) | 셀룰라제 융합 단백질 및 그를 이용한 셀룰로즈 물질의 분해 방법 | |
| CN114686500A (zh) | 一种1,4-α-葡聚糖分支酶、编码基因及工程菌株与应用 | |
| CN111172136A (zh) | 一种具有高比酶活性和高热稳定性的β-葡萄糖苷酶及其制备方法和应用 | |
| CN108546303A (zh) | 一种高表达高稳定性的多糖氢键破除酶融合蛋白及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant |