CN109897859A - 多糖裂解单加氧酶基因PsLMPO10A及其编码蛋白和功能 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种来源于假交替单胞菌的新菌株Pseudoalteromonas sp.DL‑6的多糖裂解单加氧酶基因PsLMPO10A及其克隆、表达、纯化与应用。以Pseudoalteromonas sp.DL‑6的基因组DNA为模板，以PCR方法获得PsLMPO10A的全长基因，其核苷酸序列全长2631bp，编码875个氨基酸，分子量约55.308kD。利用体外重组表达得到多糖裂解单加氧酶PsLMPO10A蛋白，纯化后的蛋白浓度为1.57mg/mL，蛋白总量15.7mg。通过PCR技术扩增目的基因，表达载体pET22b相连接，导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，得到分子量约为55KDa的重组蛋白，经Ni‑NTA亲和柱纯化得到目的蛋白。扫描电子显微镜(SEM)观察PsLMPO10A可破坏粉状几丁质。PsLMPO10A对胶体几丁质、α‑几丁质、β‑几丁质、微晶纤维素和β几丁质纳米须有结合能力。PsLMPO10A可抑制苹果腐烂病。

Description

多糖裂解单加氧酶基因PsLMPO10A及其编码蛋白和功能

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种多糖裂解单加氧酶(PsLMPO10A)基因，特别涉及一种来源于假交替单胞菌的新菌株Pseudoalteromonas sp.DL-6(CGMCCNo.8580)的单加氧酶基因PsLMPO10A及其克隆、表达与应用。

背景技术

多糖裂解单加氧酶(Lytic polysaccharide monooxygenase,LMPO)是一类氧化水解酶，在动植物及微生物中广泛存在，其活性中心由一个Cu²⁺和两个组氨酸构成，可裂解几丁质、淀粉、纤维素等不溶性多糖，产生寡聚糖醛酸。其属于氧化水解酶的AA10家族。CAZy数据库现(http://www.cazy.org)收录1148个成员，其中5个来源于真核生物，96个来源于病毒，1个来源于古生菌，5个未分类，剩余全部来源于细菌。目前，细菌中38个成员的特性被研究，其中9个溶解性多糖单加氧酶功能得到验证，3个特异降解粉状晶体几丁质，6个特异降解纤维素。8个LMPO晶体结构得到解析，分别为来源于菌株B.amyloliquefaciens(PDB:2yox)、E.faecalis(PDB:4A02)、S.marcescens(PDB:2BEM)、V.cholerae(PDB:2XWX)特异降解几丁质；来源于菌株Burkholderia Pseudomallei(PDB:3UAM)、S.coelicolor A3(2)(PDB:4OY7和4OY6)和Thermobifida fusca YX(PDB:4GBO)特异纤维素底物。为了高效、低成本的生产出在农业、医疗以及食品等行业有着广泛应用的寡糖物质，现在比较新兴的方法是将多糖裂解单加氧酶添加到几丁质酶降解体系中，辅助不溶性多糖的降解，大分子糖链在多糖裂解单加氧酶的作用下断裂，有利于几丁质酶进一步降解，有效的提高反应效率。

纤维素和几丁质是地球上最丰富的两类可再生资源,在开发并转化成生物燃料方面具有广泛的应用前景,同时这也对解决目前的资源、环境和能源问题有着重大意义。传统的酶法降解纤维素和几丁质主要是利用糖苷水解酶系来完成,其通过水解反应来断裂糖苷键。但是,糖苷水解酶对于底物结晶区域的催化效率很低,因而限制了生物质的高效降解。近年来,溶解性多糖单加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenases,LPMO)的发现使科学家对于酶法降解结晶多糖有了新的认识。溶解性多糖单加氧酶是一类作用于结晶多糖的氧化酶,其能够通过氧化作用来断裂几丁质(或纤维素)的糖苷键,生成氧化的糖链末端和新的非还原糖链端,使得结晶底物的结构趋于松散,为之后的糖苷水解酶进一步作用提供基础。LPMO主要分布于两大家族:AA9家族(旧称GH61家族)和AA10家族(旧称CBM33家族)。目前，对于LPMO的研究仍有许多问题尚待解决,尤其是AA10家族中LPMO的底物选择性和功能差异性更是值得探讨。因此,发掘并研究新来源的LPMO不仅对于深入探索LPMO具有深远影响而且对于结晶多糖的高效降解有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种假交替单胞菌Pseudoalteromonas sp.DL-6(CGMCCNo.8580)多糖裂解单加氧酶基因PsLMPO10A及其制备方法，另外提PsLMPO10A基因供体外表达方法及编码的蛋白产物与应用。

本发明提供的多糖裂解单加氧酶，命名为PsLMPO10A，来自假交替单胞菌(Psudoalteromonas sp.DL-6)(CGMCC No.8580)菌株。本发明所采用的技术方案是通过聚合酶链式反应(PCR)的方法获得了假交替单胞菌(Psudoalteromonas sp.DL-6)几丁质酶PsLMPO10A的保守序列。通过序列分析获得了2631bp完整的几丁质酶基因序列。具有如SEQID No.1所示的核苷酸序列。SEQ ID No.1的序列如下(Genbank登录号为：KF234016)：

所述的PsLMPO10A基因，以假交替单胞菌株DL-6基因组DNA为模板，以PsLMPO10AF引物和PsLMPO10AR引物对进行PCR扩增；

所述引物为：

引物PsLMPO10AF:

5’-GGAATTCCATATGCATGGTTATATGGATAGCCCTAAAG-3’

引物PsLMPO10AR:

5’-CCGCTCGAGCAGTGTGGTCCATACATCGGCTTG-3’

所述PCR的反应体系为：TaKaRa LA Taq聚合酶(5U/μL)0.5μL，10xLA TaqBuffer0.5μL，dNTP mixture(各2.5mM)2μL，基因组DNA 1μL，上(下)游引物(10μM)2μL，灭菌蒸馏水补足50μL。

所述PCR反应程序为：94℃2min，1个循环；94℃30s，55℃30s，68℃7min，30个循环；68℃15min，1个循环。本发明所述的PsLMPO10A编码500个氨基酸，分子量约55.308kD。

本发明所述的一种多糖裂解单加氧酶PsLMPO10A的表达与纯化方法，步骤如下：

(1)以PCR方法扩增SEQ ID No.1所示的碱基序列；

(2)构建大肠杆菌克隆载体pMD19-T-PsLMPO10A：将PCR扩增的DNA序列和pMD19-T载体用同样的限制性内切酶进行双酶切，用T₄DNA连接酶连接纯化的酶切产物，得到克隆载体pMD19-T-PsLMPO10A。

(3)构建大肠杆菌表达载体：将pMD19-T-PsLMPO10A质粒转化至E.coli Top10，得到阳性转化子。用限制性内切酶Nde Ⅰ和Xho Ⅰ将PsLMPO10A chiC基因片段从pMDl9-T-PsLMPO10A上切下，连接到pET-22b表达载体上，转化至E.coli BL21(DE3)，通过菌落PCR、酶切筛选鉴定阳性克隆子，命名为pET22b-PsLMPO10A。

(4)构建大肠杆菌重组表达菌株BL21(DE3)-pET22b-PsLMPO10A:将重组表达质粒pET22b-PsLMPO10A转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，挑选阳性克隆，得到重组表达菌株BL21(DE3)-pET22b-PsLMPO10A。

(5)所述体外诱导表达的方法为：将重组表达菌株BL21(DE3)-pET22b-PsLMPO10A接入含卡那的LB培养基中，37℃过夜培养14h。按1％的接种量接种到含卡那的LB培养基中。当OD_600nm达到0.6-0.8左右，加入终浓度为0.2mM的IPTG，30℃，100rpm低温诱导6h。

(6)单加氧酶PsLMPO10A的纯化：诱导表达结束后，4℃，5,000×g，离心5min，收集菌体，用10mL，PBS洗涤菌体三次。最后用10mL，PBS的缓冲液重悬菌体。离心管置于冰上超声(400w)破碎三次，每次30s，每次间隔1min。4℃，8,000×g离心20min，收集上清液，即为粗蛋白。粗蛋白用Ni²⁺-NTA柱(Novagen)进行亲和层析纯化，得到单加氧酶PsLMPO10A。

本发明提供一种重组单加氧酶PsLMPO10A的应用，其特征在于用作几丁质底物的降解。

本发明提供新的重组单加氧酶PsLMPO10A的应用，其特征在于，PsLMPO10A与粉状几丁质结合，经PsLMPO10A处理的几丁质，表面和边缘疏松多孔且粗糙不平，底物的结构遭到破坏，使几丁质酶与底物接触更容易。

本发明提供新的重组单加氧酶PsLMPO10A的应用，其特征在于，PsLMPO10A具有结合底物、协同几丁质酶降解或者氧化底物的功能，因而研究PsLMPO10A与不同底物之间的结合能力对于探索PsLMPO10A的底物选择性具有重要意义。PsLMPO10A对于几丁质的结合能力要远远高于纤维素，对微晶纤维素结合能力较弱。

本发明提供新的重组单加氧酶PsLMPO10A的应用，其特征在于，PsLMPO10A可显著抑制病原真菌的孢子萌发，且有一定的市场应用价值。尤其在抑制黑曲霉时0.125mg/mLPsLMPO10A蛋白抑制效果极其明显。

附图说明

图1 PsLMPO10A基因保守区片段的电泳检测结果；

图2 PsLMPO10A基因保守区片段和pET22b(+)的电泳检测结果；

图3菌落PCR验证PsLMPO10A基因的电泳检测结果；

图4重组质粒双酶切鉴定；

图5 pET22b-PsLMPO10A表达PsLMPO10A鉴定结果；泳道1为BL21(DE3)/pET22全液；泳道2为BL21(DE3)/pET22b上清；泳道3为BL21(DE3)/pET22b沉淀；泳道4为BL21(DE3)/pET22b-PsLMPO10A；泳道5为BL21(DE3)/pET22b-PsLMPO10A上清；泳道6为BL21(DE3)/pET22b-PsLMPO10A沉淀；

图6重组PsLMPO10A纯化结果；泳道1为BL21(DE3)/pET22b-PsLMPO10A上清；泳道2为Ni-NTA树脂；泳道3为缓冲液洗脱；泳道4为20mmol/L咪唑洗脱；泳道5为40mmol/L咪唑洗脱；泳道6为60mmol/L咪唑；泳道7为120mmol/L咪唑洗脱；泳道8为150mmol/L咪唑洗脱；泳道9为300mmol/L咪唑洗脱；

图7 PsLMPO10A抑菌活性研究结果；A图为PsLMPO10A孵育的α-几丁质(×1000)；B图为α-几丁质与PsLMPO10A孵育近似(×10000)；C图为缓冲液孵育的α-几丁质(×1000)；D图为缓冲液孵育的α-几丁质(×10000)；E图为-PsLMPO10A孵育的β-几丁质(×1000)；F图为-PsLMPO10A孵育β-几丁质(×10000)；G图为-缓冲液孵育的β-几丁质(×1000)；H图为缓冲液孵育的β-几丁质(×10000)；

图8 PsLMPO10A结合不同底物的SDS-PAGE结果；1.泳道为对照；2.泳道为-α-几丁质；3.泳道为-β-几丁质；4.泳道为-β几丁质纳米须；5.泳道为胶体几丁质；6.泳道为微晶纤维素；

图9 PsLMPO10A蛋白体外对苹果腐烂病和黑曲霉孢子萌发的抑制作用；A为苹果腐烂病；B为黑曲霉；“+”为阳性对照(噻霉酮)；“-”为阴性对照(无菌蒸水)；“3”为0.125mg/mLPsLMPO10A；“2”：0.25mg/mL PsLMPO10A；“1”：0.5mg/mL PsLMPO10A；

图10 PsLMPO10A作用α-几丁质质谱分析；

图11 PsLMPO10A作用β-几丁质质谱分析；

图12 PsLMPO10A作用胶体几丁质质谱分析；

图13 PsLMPO10A协同SmchiB降解α或β几丁质研究；A图为SmchiB降解α-几丁质、β-几丁质；B图为SmchiB降解β-几丁质；1-SmchiB+α-几丁质；2-SmchiB+0.3μmol/LPPsLMPO10A+α-几丁质；3-SmchiB+0.5μmol/L PsLMPO10A+α-几丁质；4-SmchiB+β-几丁质；5-SmchiB+0.3μmol/L PsLMPO10A+β-几丁质；6-SmchiB+0.5μmol/L PsLMPO10A+β-几丁质。

具体实施方式

实施例1 PsLMPO10A基因的扩增

利用PCR技术以假交替单胞菌(Psudoalteromonas sp.DL-6)菌株的基因组DNA为模板，

采用Primer5.0软件设计引物，分别为：上游引物PsLMPO10AF:5’-GGAATTCCATATGCATGGTTATATGGAT AGCCCTAAAG-3’设计有NdeI酶切位点，下游引物PsLMPO10AR:5’-CCGCTCGAGCAGTGTGGTCCATACATCGGCTTG-3’设计有XhoI酶切位点。

PCR反应体系：

PCR反应条件：94℃2min，1个循环；94℃30s，55℃30s，68℃7min，30个循环；68℃15min，1个循环。PCR反应结束以1％琼脂糖凝胶电泳检测，在1503bp处有明亮单一条带，即为目的基因PsLMPO10A，如图1所示。

实施例2大肠杆菌克隆载体pMDl9-T-PsLMPO10A的制备

1、PsLMPO10A基因与pMDl9-T的连接

对实例1得到的PCR产物进行纯化回收，使用TaKaRa DNA Ligation Kit<MightyMix>试剂盒，将回收的PsLMPO10A的PCR产物与pMD19-T simple克隆载体连接。

连接反应体系为：

PsLMPO10A的PCR产物 5μL

pMD19-T Simple(50ng/μL) 0.5μL

Solution I 4.5μL

连接反应的条件为：16℃过夜连接，构建克隆载体pMDl9-T-PsLMPO10A。

2、克隆载体(pMDl9-T-PsLMPO10A)的转化

(1)取冰上冻融的100μL大肠杆菌感受态细胞DH5α，于上述10μL的连接反应液中，轻柔混合均匀。

(2)冰中放置30分钟后，在42℃热激处理1min。然后立即转移冰中放置1min。

(3)加入900μL的SOC培养液，37℃振荡培养1h。

(4)取100μL涂平板(LA)，37℃过夜培养。筛选阳性转化子。

3、克隆载体(pMDl9-T-PsLMPO10A)的提取

从转化的平板上挑取新鲜的单菌落少许直接溶解到PCR反应混合物中，混匀后于PCR仪上进行反应。菌落PCR反应体系(20μL)：

PCR反应条件为：94℃5min，1个循环；94℃30s，52℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min，1个循环。PCR扩增产物经1％(w/v)琼脂糖电泳检测，将PCR产物大小正确的克隆送生工(上海)生物工程股份有限公司进行测序。

实施例3大肠杆菌表达载体pET22b-PsLMPO10A的制备

1、PsLMPO10A基因的制备

已构建的重组质粒pMDl9-T-PsLMPO10A用Nde Ⅰ/Xho Ⅰ两种限制性内切酶酶切鉴定，反应体系如下：

反应体系于37℃水浴中酶解2-3h，产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。酶解产物用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0，回收基因PsLMPO10A。

2、表达载体pET-22b的制备

将表达载体pET-28a利用同样的限制性内切酶Nde Ⅰ/Xho Ⅰ进行双酶切鉴定，反应体系如下：

反应体系于37℃水浴中酶解2-3h，产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。酶解产物用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0，回收表达载体pET-22b。

原核表达载体pET22b(+)和PsLMPO10A基因的PCR产物经过NdeI/XhoI双酶切，取1μL进行了1％琼脂糖凝胶电泳。结果如图2所示

3、原核重组表达载体pET22b-PsLMPO10A的构建

产物进行电泳分离并凝胶回收，然后用T4连接酶连接并转化到大肠杆菌Top10感受态细胞中，LA培养基37℃培养。通过菌落PCR和双酶切鉴定阳性重组体，并将正确大小的克隆扩增送至生工生物工程(上海)有限公司。

从转化的培养基上随机挑取了13个白斑作为模板进行PCR扩增，如图3。

以通用引物为模板将1号、4号、6号和9号的重组质粒进行PCR测序，如图4。

实施例4重组PsLMPO10A蛋白的诱导表达

1、重组PsLMPO10A蛋白表达检测

(1)测序正确的重组质粒命名为pET22b-PsLMPO10A。测序正确的质粒转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞，涂布在LA平板上，37℃培养过夜。

(2)从平板上挑取一个单克隆转化子接种至50mL LA培养基中，37℃，220r/min培养过夜。

(3)次日，取1mL过夜菌接种至100mL新LA培养基中，37℃，220r/min培养至菌液OD₆₀₀为0.6～0.8时加入IPTG至终浓度为lmmol/L，37℃继续培养4h。

(4)离心收集菌体，进行SDS-PAGE电泳，以E.coli BL21(DE3)/pET22b空载为对照，经染色脱色检测表达情况。

2、重组PsLMPO10A的SDS-PAGE检测

(1)、配制分离胶和浓缩胶。

(2)、装配好电泳装置：胶梳拔去并在电泳槽中固定。

将40μl样品与10μl 5×SDS-loading buffer于1.5mL EP管中混合，水浴煮沸5-10min；20μl点样，80v电泳。胶片考马斯亮蓝染色液中浸泡染色约6h，清水冲洗，脱色至获得清晰的蛋白质条带。

6号重组质粒测序鉴定与酶切鉴定正确，将其转化至E.coli BL21(DE3)中进行异源表达，SDS-PAGE分析目标蛋白表达情况，如图5所示。

实施例5 PsLMPO10A重组蛋白的纯化

1、Ni-NTA亲和层析柱纯化PsLMPO10A

(1)从培养基上挑取E.coli BL21(DE3)/pET22b-PsLMPO10A菌株至3mL LA培养基中37℃，220r/min培养12h。

(2)第二天，按1％接种量接种至1L新的LA培养基中，37℃，150r/min培养至菌液OD₆₀₀为0.6～0.8，加入终浓度0.2mmol/L的IPTG，30℃，100r/min诱导6h，5,000×g离心10min，收集菌体。

(3)加入30mL Bind Buffer重悬，超声破碎，取80μL裂解液加入20μL 5×蛋白上样缓冲液，沸水煮10min，留待SDS-PAGE电泳检测。

(4)将剩余的裂解液于4℃，12,000×g离心20min，取上清到另一管中，4℃保存。取80μL上清，加入20μL 5×蛋白电泳上样缓冲液，煮沸10min，留待SDS-PAGE电泳检测

2、Ni-NTA层析柱的处理

(1)用二次水清洗Ni²⁺-NTA树脂；

(2)用PBS清洗Ni²⁺-NTA树脂；

3、将大量诱导表达的融合蛋白粗提取物上柱；

如图6所示纯化后的蛋白浓度为1.57mg/mL，蛋白总量15.7mg。

实施例6 PsLMPO10A对照蛋白溶液的制备

用质粒pET22b代替pET22b-PsLMPO10A进行实施例1和实施例6步骤步骤制备对照蛋白溶液。

实施例7 PsLMPO10A重组蛋白的功能特性分析

1、扫描电子显微镜(SEM)观察PsLMPO10A结合粉状几丁质

反应体系(1mL)含有2mgα型几丁质或β型几丁质，0.5mg PsLMPO10A，室温下孵育1天，然后15,000×g离心10min，弃上清，37℃下自然烘干沉淀，未加入PsLMPO10A的作为对照，在扫描电子显微镜下观察底物结合情况。

如图7所示，为扫描电镜下观察到的PsLMPO10A与粉状几丁质结合情况。

2、SDS-PAGE几丁质结合活性分析

制备浓度为20mg/mL的α几丁质，β几丁质，β几丁质纳米须，微晶纤维素和胶体几丁质。在1mL反应体系，5mg/mL不同底物中加入1μg/mL PsLMPO10A，颠倒混合，并在室温下反应24小时；15,000×g离心5分钟；取80μL上清液并加入20μL5×SDS-PAGE蛋白质缓冲液。煮沸5分钟，14,000g离心5分钟，取10μl上清液进行SDS-PAGE；用50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)洗涤沉淀2-3次以除去非特异性结合并加入5x SDS-PAGE。将50μL蛋白质缓冲液煮沸5分钟，并以14,000xg离心5分钟。取上清液进行SDS-PAGE以检测PsLMPO10A与底物的结合。设置3个重复。

PsLMPO10A与不同底物的结合情况如图8所示。

3、PsLMPO10A抑菌活性研究

参照Muhammad Aamer Mehmood等和Yue Han等的方法，检测PsLMPO10A蛋白的抑菌活性，通过抑制孢子萌发的实验来验证ChiA抑菌性。以噻霉酮为阳性对照，无菌水为阴性对照，每一个样品设置3个重复。28℃恒温培养3天。结果如图9。

4、PsLMPO10A氧化作用产物分析

1000mL体系，底物4mg，PsLMPO10A 2μM，缓冲溶液Tris-HCl(pH 8.0)为20mM，Vc1mM。步骤如下：

(1)清洗：α-几丁质、β-几丁质以及1％的胶体几丁质各取4mg离心管中，用1mL、20mM醋酸，ddH₂O，20mM的Tris-HCl(pH 8.0)各洗涤两遍

(2)加入2μM的PsLMPO10A，1mM抗坏血酸，Tris-HCl(pH 8.0)定容到500μL；

(3)旋转混合仪中室温反应1d；

(4)12000rpm离心10min，得上清，质谱鉴定

结果如图10、11、12。

5、PsLMPO10A协同SmchiB降解α或β几丁质研究

预试验考察PsLMPO10A协同SmchiB水解α/β几丁质情况，500μL反应体系包含：1μmol/L SmchiB，0.3或0.5μmol/L PsLMPO10A，0.5mg/mLα几丁质或β几丁质，溶于50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.0)，1.0mmol/L抗坏血酸，37℃下温育24h，100℃沸水煮10min终止反应，15,000×g离心10min。取20μL上清样品用HPLC来检测PsLMPO10A协同SmchiB协同作用水解粉状几丁质的活力，活力以几丁二糖(GlcNAc)2的生成量来标定。谱柱为TSK-Gel Amide-80column(0.46×25cm；Tosoh)，粒径为5μM。采用70％乙腈等梯度洗脱，流速为0.7mL/min，柱温25℃。水解产物用紫外检测器检测，检测波长为190nm。1mL反应体系：1μmol/L SmchiB，0.5μmol/L PsLMPO10A，0.5mg/mLβ几丁质，溶于50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.0)，1.0mmol/L抗坏血酸，37℃下温育，分别于0、2、4、6、8、10、12、24、72h取样，加入等体积70％乙腈终止酶反应，取20μL样品通过HPLC来检测PsLMPO10A协同SmchiB协同作用水解粉状几丁质的活力，活力以几丁二糖(GlcNAc)₂的生成量来标定。结果如图13。

序列表

<110> 大连大学

<120> 多糖裂解单加氧酶基因PsLMPO10A 及其编码蛋白和功能

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2631

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaatatta aacaattaag cgcagctatg ggtgttgcac tatttgccgg ttctgtatcg 60

gcagcgcctt ctacaccaag cattaattgg gaaccgcagc aatattcgtt tgttgaggta 120

gatcttgagg gaaacggctc ttataagcag ctagttaccc gtgttgagca agttaatatc 180

aacattgagt ggagtgcatg gagtggtgat ggtggcgata gctacaaagt gtactttgat 240

gacatgctag tcaatgaagg cacgcttgct gctggttcta aaagtggcac tatcacattc 300

ccttatgata aagcgggccg ccatacaatg tatgttgagc tatgtgaagg tggcacaacg 360

tgtgctcgca gtgcaggcaa accaattgta attgctgaca ccgacggcgg acacctagca 420

ccattaccta tggatgttga cccaaataac cgtgacattg gtatcaaaca aggtttagtt 480

acaggcgctt actttgttga gtggggaatt tatggccgtg attatgatgt aacgaatatg 540

ccagcacaaa atctgagtca tattttgtat ggctttattc caatttgtgg tgaaaacgca 600

tcgttatcgg gtggtcctaa gcgtgcgctt gatactgcct gcgccggctc tgcagattac 660

gaagtggtta ttcacgaccc atgggcagca gtacaaaaag cactgccagg ggttgatgca 720

aaagatccta tccgtggtac ttactctcag ctaatggcgc ttaaacagcg ttacccagat 780

attaaaattt taccatctgt aggtggttgg acgttatcag acccattcgg tggctttacc 840

aataaagcta accgcgacac ctttgttgcc tcaatggaag aatttttaag aacatggaaa 900

ttctatgatg gtgtagatat tgactgggaa ttcccaggtg gtgacggccc caacccagac 960

attggcgatc caatcaacga tggcccagcc tatgtggcgc taatgcaaga gctacgcgct 1020

atgcttgata aacttgaagc agaaacgggc cgtacttacg agttaacctc agccattggt 1080

gcaggttacg ataaaattga agatgtagat taccaagccg caagccagta tatggattac 1140

atttttgcca tgacctatga cttttatggc gcatggagta acgtaaccgg acaccaaaca 1200

gcactttact gtggcgaaca tatgagtgtt ggtcaatgta atggtaccgg gcttgatgaa 1260

aatggcgaac ctcgtaaagg ccctgcttat accaccgata atgcagtgca gctgttactt 1320

gcgcaaaatg taccatcgaa aaaaatcgtc gtgggcacag ctatgtatgg ccgtggttgg 1380

gaaggtgttt acccgcaaaa tgcagcaatt gatggtaacc caatgaccgc ccctggtaat 1440

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ggcgttaaag caaatatgat tggtgcggcg ggcaccggta ttaatggttt tgaagtgggt 1560

tatgatgagc aagcgcaagc cgcttatgta tggaatcgtg caaccggtaa actaattact 1620

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aacgatccac ttagctttag ctggagtgct gataacgcac ttgtagtatc tggacaaaat 1920

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aacggcgttg aatataaagc aaagtggtgg actcaaggcg agcgtcctga tttaggtggt 2460

gcatgggaag caacaacaca acctacagat ggtacgggtg tcgcagtttg gcagccaacg 2520

gctatttata acagtggtga tgaagtttct tatcaaggta ataagtacca agctaaatgg 2580

tggactcaag ggaacgaacc tggttcaacc gatgtatggt tagcacttta a 2631

Claims (10)

1.本发明提供的单加氧酶基因PsLMPO10A，其特征在于，有如下的核苷酸序列：

2.根据权利要求1所述的单加氧酶PsLMPO10蛋白的制备方法，其特征在于，以假交替单胞菌株DL-6基因组DNA为模板，以PsLMPO10AF引物和PsLMPO10AR引物对进行PCR扩增；

所述引物为：

上游引物PsLMPO10AF:5’-GGAATTCCATATGCATGGTTATATGGAT AGCCCTAAAG-3’

下游引物PsLMPO10AR:5’-CCGCTCGAGCAGTGTGGTCCATACATCGGCTTG-3’

PCR的反应体系为：TaKaRa LATaq(5U/μl)0.5μl，10xLA PCR Buffer 0.5μl，dNTPMixture(各2.5mM)2μl，基因组DNA1μl，上(下)游引物(10μM)2μl，灭菌蒸馏水补足50μl。

PCR反应程序为：94℃ 2min，1个循环；94℃ 30s，55℃ 30s，68℃ 7min，30个循环；68℃15min，1个循环。

3.一种单加氧酶PsLMPO10A的表达与纯化方法，其特征在于，步骤如下：

(1)以权利要求2所述的PCR方法扩增权利要求1所示的核苷酸序列；

(2)构建大肠杆菌克隆载体pMD19-T-PsLMPO10A：将PCR扩增的DNA序列和pMD19-T载体用同样的限制性内切酶进行双酶切，用T₄DNA连接酶连接纯化的酶切产物，得到克隆载体pMD19-T-PsLMPO10A。

(3)构建大肠杆菌表达载体：将pMD19-T-PsLMPO10A质粒转化至E.coli Top10，得到阳性转化子。Nde Ⅰ和Xho Ⅰ将PsLMPO10AchiC基因片段从pMDl9-T-PsLMPO10A上切下，连接到pET-22b表达载体上，转化至E.coli BL21(DE3)，通过菌落PCR、酶切筛选鉴定阳性克隆子，命名为pET22b-PsLMPO10A。

(4)构建大肠杆菌重组表达菌株BL21(DE3)-pET22b-PsLMPO10A:将重组表达质粒pET22b-PsLMPO10A转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，挑选阳性克隆，得到重组表达菌株BL21(DE3)-pET22b-PsLMPO10A。

(5)所述体外诱导表达的方法为：将重组表达菌株BL21(DE3)-pET22b-PsLMPO10A接入含卡那的LB培养基中，37℃过夜培养14h。按1％的接种量接种到含卡那的LB培养基中。当OD_600nm达到0.6-0.8左右，加入0.2mM的IPTG，20℃，100rpm低温诱导6h。

(6)单加氧酶PsLMPO10A的纯化：诱导表达结束后，4℃，5,000×g,4℃离心5min，收集菌体，用10mL，PBS洗涤菌体三次。最后用10Ml，PBS的缓冲液重悬菌体。离心管置于冰上超声(400w)破碎三次，每次30s，每次间隔1min。4℃，8,000×g离心20min，收集上清液，即为粗蛋白。粗蛋白用Ni²⁺-NTA柱(Novagen)进行亲和层析纯化，得到单加氧酶PsLMPO10A。

4.一种重组单加氧酶PsLMPO10A的应用，其特征在于用作几丁质底物的降解。

5.一种具有几丁质降解的功能的产品，包括权利要求2所述的PsLMPO10A编码蛋白。

6.根据权利要求5所述的重组单加氧酶PsLMPO10A的应用，其特征在于，PsLMPO10A与粉状几丁质结合，经PsLMPO10A处理的几丁质，表面和边缘疏松多孔且粗糙不平，底物的结构遭到破坏，使几丁质酶与底物接触更容易。

7.根据权利要求5所述的重组单加氧酶PsLMPO10A的应用，其特征在于，PsLMPO10A具有结合底物、协同几丁质酶降解或者氧化底物的功能，因而研究PsLMPO10A与不同底物之间的结合能力对于探索PsLMPO10A的底物选择性具有重要意义。

8.根据权利要求5所述的重组单加氧酶PsLMPO10A的应用，其特征在于，PsLMPO10A可显著抑制病原真菌的孢子萌发，且有一定的市场应用价值。尤其在抑制黑曲霉时0.125mg/mLPsLMPO10A蛋白抑制效果极其明显。

9.根据权利要求5所述的重组单加氧酶PsLMPO10A的应用，其特征在于，PsLMPO10A不能协同SmchiB降解α几丁质，且加入PsLMPO10A和抗坏血酸后几丁二糖产物降低，可能是PsLMPO10A抑制了SmchiB降解α几丁质的酶活性。PsLMPO10A可协同SmchiB降解β几丁质，且外源电子供体可促进PsLMPO10A的协同降解功能。

10.根据权利要求5所述的重组单加氧酶PsLMPO10A的应用，其特征在于，PsLMPO10A可以降解α-几丁质产生糖醛酸和3糖醛酸，结果表明PsLMPO10A具有AA10家族溶解性多糖单加氧酶活性。