WO2017164388A1 - 変異型キシロース代謝酵素とその利用 - Google Patents

変異型キシロース代謝酵素とその利用 Download PDF

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WO2017164388A1
WO2017164388A1 PCT/JP2017/012104 JP2017012104W WO2017164388A1 WO 2017164388 A1 WO2017164388 A1 WO 2017164388A1 JP 2017012104 W JP2017012104 W JP 2017012104W WO 2017164388 A1 WO2017164388 A1 WO 2017164388A1
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cpxi
gene
xylose
mutant
yeast
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泰介 清家
一浩 藤森
小林　洋介
健彦 佐原
扇谷　悟
鎌形　洋一
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国立研究開発法人産業技術総合研究所
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    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a technique for producing ethanol by fermentation using yeast. More specifically, the present invention relates to a mutant xylose isomerase with improved xylose metabolic capacity and ethanol from a biomass saccharified solution by yeast introduced with the enzyme gene. It relates to the production method.
  • the budding yeast Saccharomyces cerevisiae has high fermentative ability and high ethanol tolerance, and has been used for ethanol production for a long time mainly for the production of alcoholic beverages.
  • Ethanol is also positioned as a renewable energy as an alternative fuel to gasoline, and is produced from plant-derived biomass by fermentation.
  • First-generation bioethanol is ethanol for fuel produced by fermentation using budding yeast or the like using glucose derived from sugarcane or the like, or glucose obtained by enzymatic decomposition of starch derived from corn or the like as a raw material. is there. However, it is regarded as a problem that these raw materials compete with food and livestock feed.
  • second generation bioethanol is ethanol produced from cellulosic biomass that does not compete with food or livestock feed.
  • various problems are known depending on the type of raw material, pretreatment method, saccharification process, and fermentation process, and their solutions are expected.
  • various resources are assumed for cellulosic biomass.
  • wood has high expectations for its use because it contains the largest amount of cellulose, which is the raw material for glucose.
  • cellulose has hemicellulose and lignin as main components, but the use of hemicellulose, which has the second highest content after cellulose, is also an important issue in ethanol production from cellulosic biomass.
  • budding yeast Although hemicellulose is converted to xylose by decomposition with a saccharifying enzyme, budding yeast has a problem that ethanol production efficiency from xylose is remarkably low because genes for assimilating xylose are hardly functioning. For this reason, extensive research has been conducted to impart xylose assimilability to budding yeast by introducing xylose-metabolizing enzymes derived from xylose-assimilating organisms into budding yeast or by forced expression of genes involved in endogenous xylose metabolism. Has been made.
  • xylose reductase xylitol dehydrogenase
  • xylulose phosphorylase xylose isomerase
  • enzymes involved in the pentose phosphate pathway and the like.
  • Non-patent Document 1 NADPH-dependent xylose reductase (XR) and NAD + -dependent xylitol dehydrogenase (XDH).
  • XR NADPH-dependent xylose reductase
  • XDH NAD + -dependent xylitol dehydrogenase
  • xylose isomerase XI
  • yeast cells in which the xylose isomerase gene is expressed, there is a problem that the ethanol production rate from xylose is slow.
  • xylose isomerase genes have been cloned from many bacteria and fungi so far and have been tried to be expressed in yeast cells. So far, Piromyces sp. E2 (Non-patent document 2), Orpinomyces sp.
  • Non-patent document 3 Clostridium phytofermentans ISDg (Non-patent document 4), Ruminococcus flavefaciens 17 (Non-patent document 5), Prevotella ruminicola TC2- 24 (Non-patent document 6), Burkholderia cenocepacia J2315 (Non-patent document 7), Clostridium cellulolyticum H10 (Non-patent document 8), Streptomyces rubiginosus (Non-patent document 9) functions in yeast cells. However, it has been shown that the host budding yeast can impart xylose metabolism ability with low efficiency.
  • Non-patent Document 10 xylose isomerase derived from mutant Piromyces sp. E2 introduced with mutations at 6 sites (E15D, E114G, E129D, T142S, A177T, V433I) is aerobic using xylose as a carbon source in budding yeast. It has been shown to improve ethanol production by increasing the growth rate and consumption rate of xylose. This mutant type Piromyces sp.
  • E2-derived xylose isomerase showed an improvement of 77% Vmax in comparison with the wild type, but it was also shown that the Km value was about twice as high. It has also been shown that among six mutations, amino acid mutations important for high activation are E15D and T142S. Moreover, in the xylose isomerase derived from Ruminococcus flavefaciens 17, 15% of the activity was improved by amino acid substitution (G179A) in the vicinity of the xylose binding site, and the N-terminal 10 amino acid sequence was changed to N of the xylose isomerase from Piromyces sp. E2. -It has been reported that the activity is improved by 26.8% by substitution with the terminal 12 amino acid sequence (Non-patent Document 5).
  • Non-patent Document 9 Regarding the xylose isomerase derived from Streptomyces rubiginosus, it has been reported that several mutant xylose isomerase genes that have acquired high affinity with xylose have been obtained under reaction conditions of pH 6 or less (Non-patent Document 9). .
  • xylose isomerase As described above, studies on xylose isomerase for high-efficiency bioethanol production from xylose in yeast have been extensively performed. However, the evaluation of xylose metabolizing ability in yeast into which each xylose isomerase gene has been introduced has been conducted.
  • the fermentation conditions that can produce ethanol most efficiently in Saccharomyces cerevisiae are anaerobic or microaerobic conditions. In many cases, no comparative evaluation has been made under fermentation conditions that enable ethanol production with high efficiency.
  • xylose isomerase genes with different origins, for each xylose isomerase gene, codon optimization under the same conditions and cloning into the same expression vector were performed.
  • Information on the optimal xylose isomerase gene is provided by preparing a practical yeast strain for ethanol production into which xylose isomerase gene expression plasmid is introduced, and evaluating the xylose utilization efficiency under the same culture conditions.
  • artificial mutations are introduced into the optimal xylose isomerase gene, and the xylose-assimilating ability of yeast strains having these mutant-type xylose isomerase genes is evaluated, thereby imparting high xylose metabolism to budding yeast.
  • a yeast strain having the mutant xylose isomerase gene is provided.
  • the efficient production method of the useful substance using the said yeast strain is provided.
  • the present inventors selected a xylose isomerase gene that can confer the most excellent xylose metabolic ability from eight types of xylose isomerase genes that have been successfully expressed in a functional manner in budding yeast.
  • a screening method at that time the high-concentration xylose medium and microaerobic conditions under aerobic conditions used by the present inventors when obtaining yeast mutant strains with improved xylose metabolism ability were used.
  • each xylose isomerase gene expression plasmid using the same promoter and terminator was constructed.
  • a yeast strain expressing each xylose isomerase gene was constructed by introducing it into the same ethanol-producing practical yeast strain. Using the thus obtained yeast strains, the growth in a medium using xylose as a carbon source was evaluated, and the xylose utilization of each yeast strain was examined. In addition, ethanol productivity was also evaluated by a batch fermentation test using a simulated saccharified solution (YPD 85 X 35 ) under microaerobic conditions.
  • CpXI gene a gene derived from Clostridium phytofermentans (CpXI gene) was selected as a xylose isomerase gene capable of imparting the best ability to metabolize xylose.
  • CpXI gene a mutant xylose isomerase gene library in which the selected xylose isomerase gene (CpXI gene) was artificially introduced with molecular evolution engineering techniques. Evaluation was performed by growth under aerobic conditions in a medium using xylose as a carbon source and by a batch fermentation test under microaerobic conditions using a pseudo saccharified solution (YPD 85 X 35 ) (Non-patent Document 11). ).
  • mutant xylose isomerase genes in which mutations at the amino acid sequence level were introduced at different locations were isolated. Furthermore, we constructed a double mutant xylose isomerase gene that aggregates mutations in two of the mutations of these mutant xylose isomerase genes and used a pseudo-saccharified solution (YPD 85 X 35 ). Evaluation was performed by a batch fermentation test under microaerobic conditions. As a result, two mutant xylose isomerase genes, especially the double mutant xylose isomerase gene, can confer xylose metabolizing ability to host yeast strains better than previously reported xylose isomerase genes. We found something and came to complete the present invention.
  • the present invention includes the following inventions.
  • CpXI Clostridium phytofermentans-derived xylose isomerase
  • at least one amino acid corresponding to the 63rd threonine and the 162nd valine in SEQ ID NO: 11 is substituted with another amino acid.
  • a mutant xylose isomerase (mutant CpXI), which has a higher xylose metabolic activity than wild type xylose isomerase (CpXI).
  • substitution of the 63rd threonine with another amino acid in SEQ ID NO: 11 is a substitution with isoleucine, lysine, glycine or histidine, and the substitution of the 162nd valine with another amino acid is alanine.
  • a mutant CpXI comprising an amino acid sequence in which the 63rd threonine in SEQ ID NO: 11 is substituted with isoleucine and the 162nd valine is substituted with alanine.
  • CpXI Clostridium phytofermentans-derived xylose isomerase
  • at least one codon corresponding to the 63rd threonine and the 162nd valine in SEQ ID NO: 11 in the encoded amino acid sequence is Mutant xylose isomerase gene (mutant CpXI gene) containing a base sequence substituted with a codon corresponding to another amino acid, and higher xylose metabolism compared to the wild-type CpXI gene for Saccharomyces cerevisiae hosts A mutant CpXI gene that confers high ability and high ethanol production ability.
  • a mutant comprising a base sequence having a codon mutation corresponding to a mutation in which the 63rd threonine in the encoded amino acid sequence is substituted with isoleucine and the 162nd valine is substituted with alanine
  • the CpXI gene is preferred.
  • a transformed yeast that is transformed with the mutant CpXI gene according to [4] or [5] and has a higher xylose metabolizing ability than a parent yeast.
  • the yeast comprises Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, Schizosaccharomyces, and Hansenula.
  • the transformed yeast according to [6] above which is a yeast selected from the group.
  • the transformed yeast according to [6] wherein the yeast is a Saccharomyces yeast.
  • the present invention provides a microorganism having an excellent ability to metabolize xylose.
  • a mutant gene or mutant protein encoding the mutant xylose isomerase found by the present invention it is possible to produce a microorganism having excellent xylose metabolism ability by a gene recombination technique or the like. It becomes.
  • the microorganism of the present invention or the microorganism having the mutated gene found by the present invention it becomes possible to efficiently produce useful substances such as ethanol using a medium containing xylose.
  • pUG6zeo is a plasmid in which a Zeocin TM resistance gene (bleMX6) in which loxP sites are arranged at both ends is introduced into a pUC vector backbone.
  • pUG6hyg is a plasmid in which a hygromycin resistance gene (hphMX6) in which loxP sites are arranged at both ends is introduced into a pUC vector backbone.
  • pUG35-kan-TDH3p has a pUC vector backbone, replication origin for yeast (CEN6 / ARSH4), Geneticin (R) resistance gene (kanMX6), and expression unit for yeast (TDH3 promoter, multicloning site (MCS), CYC1 (Terminator) introduced plasmid.
  • pAUR101r2-XKS1-06_CpXIopt is a plasmid obtained by introducing an XKS1 expression unit (PGK1 promoter, XKS1 gene, CYC1 terminator) and CpXI gene into pAUR101 (Takara Bio).
  • yeast strains (SS37 to SS44) introduced with 8 types of xylose isomerase genes and yeast strains (SS36) introduced with only expression vectors
  • the growth curve under aerobic conditions using YPX 50 medium using xylose as a single carbon source is shown. Data is the average of 3 experiments.
  • mutant CpXI gene expression strains in xylose medium under aerobic conditions 11 strains (M6-2, M6) obtained by introducing mutation into CpXI gene and screening mutant CpXI gene library by molecular evolution engineering technique -6, M6-7, M6-10, M6-11, M6-13, M6-15, M6-19, M6-20, M6-21, and M6-22), and wild type CpXI expression strain (SS42)
  • M6-2, M6 11 strains obtained by introducing mutation into CpXI gene and screening mutant CpXI gene library by molecular evolution engineering technique -6, M6-7, M6-10, M6-11, M6-13, M6-15, M6-19, M6-20, M6-21, and M6-22
  • wild type CpXI expression strain SS42
  • the growth curve under an aerobic condition using YPX 80 medium is shown. Data is the average of 3 experiments.
  • Fermentation test of mutant CpXI gene expression strain using pseudo saccharified solution under microaerobic condition 11 strains obtained by introducing mutation into CpXI gene by molecular evolution engineering technique and screening of mutant CpXI gene library ( M6-2, M6-6, M6-7, M6-10, M6-11, M6-13, M6-15, M6-19, M6-20, M6-21, and M6-22) The results of fermentation tests using YPD 85 X 35 ) under microaerobic conditions are shown.
  • the culture supernatant was sampled over time, and the glucose, xylose, xylitol, glycerol, acetic acid, and ethanol contents were measured by HPLC. Data is the average of 3 experiments.
  • pAUR101r2-XKS1-HSP12p2 is a plasmid in which an XKS1 expression unit (PGK1 promoter, XKS1 gene, CYC1 terminator), HSP12 promoter, and multiple cloning site (MCS) are introduced into pAUR101 (Takara Bio).
  • the present invention relates to a microorganism having a mutated xylose isomerase gene (mutant CpXI gene) or a use thereof.
  • Information on the base sequence of the xylose isomerase gene can be analyzed by BLAST, etc. using the database such as National Center for Biotechnology Information (NCBI) as the gene name, or the base sequence of the gene or the amino acid sequence encoded thereby as a key. Can be found.
  • the target xylose isomerase gene into which a mutation is introduced is a gene derived from Clostridium phytofermentans (also referred to as a CpXI gene), and the CpXI gene may be derived from a genome or cDNA.
  • the codon of CpXI (SEQ ID NO: 11) derived from Clostridium phytofermentans ISDg strain described in Non-Patent Document 4 was optimized for the Saccharomyces cerevisiae host (optimum codon information described in Non-Patent Document 12).
  • the artificially synthesized CpXI gene (SEQ ID NO: 12) was used.
  • a host other than Saccharomyces cerevisiae is used as the host to be used, it is preferable to optimize with the optimal codon information according to the host.
  • a molecular evolution engineering technique is applied to the CpXI gene of SEQ ID NO: 12, to obtain a plurality of mutant CpXI genes having superior xylose metabolic capacity compared to the original CpXI, and Among them, the mutant CpXI gene having mutations at positions corresponding to threonine at position 63 and valine at position 162 of SEQ ID NO: 11 was found to be superior, and a double mutant CpXI gene that aggregated the mutations at the two positions was found. It has been confirmed that particularly excellent xylose metabolism ability and ethanol production ability can be imparted to Saccharomyces cerevisiae hosts.
  • the mutated protein of the xylose isomerase (CpXI) derived from Clostridium phytofermentans of the present invention and the gene encoding the same as long as they are functionally equivalent, in addition to any of the two mutation sites disclosed above, Furthermore, one or several amino acids or bases may be deleted, substituted or added. References to deletions, substitutions, additions of several amino acids include, but are not limited to, for example, deletions, substitutions, additions of 2-20, 22, 44, 66, 88, 132 amino acids.
  • mutant proteins and the genes encoding them if at least one of the disclosed mutation sites is conserved, at least 70% identity to the entire amino acid sequence, at least 80% Identity, at least 85% identity, at least 90% identity, at least 95% identity, at least 96% identity, at least 97% identity, at least 98% identity, or at least 99% Genes having amino acid sequences with identity and exhibiting growth and ethanol production from xylose are also included in the present invention. Furthermore, for genes encoding these mutant proteins, if a codon mutation corresponding to at least one of the disclosed amino acid mutation positions is conserved, DNA comprising a complementary nucleotide sequence to the disclosed nucleotide sequence and Genes that hybridize under stringent conditions are also included in the present invention.
  • Stringent conditions are well known in the art and differ in various situations because they are sequence-dependent, for example, 2 ⁇ SSC and 0.5% SDS for 5 minutes, 2 ⁇ SSC and 0.1% for 15 minutes Calculate the hybrid Tm from 12 to 12 in SDS in 0.1 ⁇ SSC and 0.5% SDS at 37 ° C. for 30-60 minutes and then in 0.1 ⁇ SSC and 0.5% SDS at 68 ° C. for 30-60 minutes. Includes cleaning conditions for cleaning at temperatures below 20 ° C.
  • the mutation can be incorporated using any mutation introduction method other than the Error-prone PCR method.
  • Promoters that control the expression of these mutant CpXI genes are not limited to those derived from the HSP12 gene. That is, other gene-derived promoters such as glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (TDH3) can be used. Also, the terminator is not limited to being derived from the CYC1 gene, and other gene-derived terminators can be used. Furthermore, the promoter, mutant CpXI gene and terminator may be introduced into yeast in the form of a plasmid, or may be incorporated into genomic DNA. Further, the copy number is not limited in both cases of insertion into a plasmid or genome. When incorporating into genomic DNA, it may be introduced site-specifically into the genome or randomly.
  • TDH3 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • the gene present in the genome may or may not be modified, but xylose to xylulose may be used.
  • xylose isomerase (CpXI) activity by xylitol produced by the reverse reaction of endogenous xylose reductase (XR) or xylitol dehydrogenase (XDH) It is desirable that the enzyme gene is deficient. Further, in order to enhance the metabolism of xylulose to xylulose 5-phosphate, it is desirable that endogenous xylulose kinase (XK) is overexpressed.
  • the promoter controlling the expression of the xylulose kinase gene is not limited to that derived from the PGK1 gene, and other gene-derived promoters can be used.
  • the terminator is not limited to being derived from the CYC1 gene, and other gene-derived terminators can be used.
  • the promoter, xylulose kinase gene and terminator may be introduced into yeast in the form of a plasmid, or may be integrated into genomic DNA, regardless of the copy number. Absent.
  • any xylulose kinase gene may be used from any organism. In addition, any other gene derived from any organism may be introduced.
  • the type of the recombinant vector and the transformation method are not limited. As long as the culture solution contains xylose, it is not limited to the constituent components as long as the yeast grows, including the presence of other carbon sources.
  • the yeast of the present invention When producing a useful substance, it can be produced using the yeast of the present invention using a culture solution containing at least xylose.
  • the yeast in addition to the mutant CpXI gene shown in the present invention, the yeast may be introduced with a gene suitable for producing the useful substance or may have a mutant gene.
  • Useful substances include, but are not limited to, ethanol, xylulose, lactic acid, acetic acid, propanol, isobutanol, butanol, succinic acid, and glycerol. In particular, it is desirable to obtain ethanol as a useful substance.
  • These substances can be produced by introducing substances that are produced in yeast by the reaction of metabolic enzymes originally possessed by yeast, or by introducing the enzyme genes necessary to produce them into yeast.
  • yeast hosts transformed with the mutant CpXI gene of the present invention include Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, Schizosaccharomyces. ), Hansenula and the like.
  • the genus Saccharomyces is preferable, and examples thereof include Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces ⁇ ⁇ boraldii and the like.
  • the culture method is not limited as long as the yeast grows in a culture solution containing xylose.
  • the culture solution may be a pretreatment solution or saccharified solution containing xylose obtained by processing a natural product such as wood, or an artificially prepared xylose or other substance.
  • a liquid obtained by adding a chemical substance to a liquid obtained by processing a natural product may be used.
  • the culture conditions are not limited to temperature, pH, aeration conditions, stirring speed, culture time, and the like.
  • the method for controlling these conditions is not limited. Further, there is no limitation on the presence or absence of pretreatment or saccharification treatment, or the process of proceeding fermentation simultaneously with saccharification treatment.
  • the purification process of useful substances after fermentation is not limited. An appropriate method can be used depending on the type of useful substance.
  • the YPD medium used as the yeast growth medium is 10 g of Bacto TM yeast extract (BD Bioscience, USA), 20 g of Bacto TM peptone (BD bioscience), 20 g of D-glucose (hereinafter glucose, Sigma Aldrich, USA) In 1 L of purified water.
  • YPX 50 medium contains 10 g of Bacto TM yeast extract, 20 g of Bacto TM peptone, and 50 g of D-xylose (hereinafter, xylose, Sigma-Aldrich) in 1 L of purified water.
  • YPX 80 medium contains 10 g of Bacto TM yeast extract, 20 g of Bacto TM peptone, and 80 g of xylose in 1 L of purified water.
  • YPD 85 X 35 medium contains 10 g of Bacto TM yeast extract, 20 g of Bacto TM peptone, 85 g of glucose, and 35 g of xylose in 1 L of purified water.
  • 20 g of Bacto TM agar (BD Bioscience) was added per 1 L medium to the medium having the above composition.
  • the antibiotics described below were appropriately added to the medium having the above composition so as to have various concentrations.
  • coli DH5 ⁇ strain as a host, a selective medium in which ampicillin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 ⁇ g / mL was added to Difco TM LB, Miller medium or Difco TM LB Agar, Miller medium was used.
  • ampicillin Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • Plasmid extraction from E. coli was performed using QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Germany) according to the attached protocol. Genomic DNA extraction from yeast was performed using Gen Toru-kun (for yeast) High Recovery (Takara Bio Inc.) according to the attached protocol. The PCR reaction was performed using KOD-Plus-Neo (Toyobo Co., Ltd.).
  • PCR buffer for KOD-Plus-Neo, 0.2 mM dNTPs, 1.5 mM MgSO 4 , 0.3 Prepare with the composition of ⁇ M primer, Template DNA (1 ng), KOD-Plus-Neo DNA polymerase (1 U / ⁇ L) (50 ⁇ L reaction solution), 3 step cycle (pre-denaturation 94 °C 2 minutes, denaturation 98 °C 10) Second, annealing Tm temperature 30 seconds, extension reaction 68 ° C. 30 seconds / kb), 30 cycles. The annealing temperature was in accordance with the Tm temperature of the primer used. The extension reaction time was adjusted according to the length of the base sequence intended for amplification.
  • Example 1 Artificially synthesized xylose isomerase gene Amino acid sequence information of eight types of xylose isomerase genes reported to be capable of imparting xylose metabolic ability to budding yeast (Burkholderia cenocepacia J2315 (BcXI, Table 1: Sequences) No. 1, Non-Patent Document 7), Prevotella ruminicola TC2-24 (PrXI, Table 1: SEQ ID NO: 3, Non-Patent Document 6), Ruminococcus flavefaciens 17 (RfXI, Table 1: SEQ ID NO: 5, Non-Patent Document 5), Orpinomyces sp.
  • Non-patent Document 12 Included in each xylose isomerase gene using an optimized codon table (Non-patent Document 12) created based on a gene group having a high gene expression level in budding yeast for the amino acid sequence of each xylose isomerase Codon optimization was performed.
  • the obtained base sequences are BcXI gene (SEQ ID NO: 2), PrXI gene (SEQ ID NO: 4), RfXI gene (SEQ ID NO: 6), OspXI gene (SEQ ID NO: 8), PspXI gene (SEQ ID NO: 10), CpXI gene, respectively.
  • SEQ ID NO: 12 CcXI gene (SEQ ID NO: 14), and SrXI gene (SEQ ID NO: 16).
  • Example 2 Production of host yeast strain As a host for evaluating the xylose metabolic performance of each xylose isomerase, diploid ethanol-producing practical yeast strain IR-2 (Table 4, Non-Patent Document 13) A diploid IR-2 strain was constructed. Specifically, the following procedure was used. First, the HO gene was disrupted to suppress mating-type conversion in the isolated haploid strain. Using a primer set (Table 2: SEQ ID NOs: 17 and 18) having a sequence homologous to the promoter region or terminator region of the HO gene at the 5′-end using pUG6zeo (FIG.
  • a zeocin resistance gene A DNA fragment in which a sequence homologous to the promoter region or terminator region of the HO gene was added to both ends was prepared.
  • a HO-bleMX6 fragment was prepared by PCR reaction using a primer set (Table 2: SEQ ID NOs: 19 and 20). Using this fragment, the IR-2 strain was transformed by homologous recombination and cultured in a YPD plate medium supplemented with zeocin for 3 days.
  • the obtained transformant was cultured overnight in a YPD medium supplemented with zeocin, and then genomic DNA was extracted from yeast cells.
  • genomic DNA was extracted from yeast cells.
  • a PCR reaction was carried out using genomic DNA obtained from the transformant as a template using a primer set for confirmation (Table 2: SEQ ID NOs: 21 and 22), and a DNA fragment of about 1.6 kb Got.
  • Transformants in which the HO gene was disrupted were identified by base sequence analysis of the obtained fragments.
  • the resulting transformant was sporulated by culturing in a spore-forming plate medium (potassium acetate 10 g, Bacto TM agar 20 g contained in 1 L of purified water), and a micromanipulator (MSM System series 400, Singer Instruments, UK) ) To perform tetramolecular spore separation.
  • the obtained spore was cultured in a YPD plate medium to obtain a haploid 2a-3-34A strain (Table 4) showing properties equivalent to those of the parent strain IR-2.
  • the GRE3 gene which is a xylose reductase gene, was disrupted.
  • pUG6hyg FOG. 1
  • a primer set having a sequence homologous to the promoter region or terminator region of the GRE3 gene at the 5′-end SEQ ID NOs: 23 and 24 was subjected to PCR reaction to produce a hygromycin resistance gene.
  • a primer set (Table 2: SEQ ID NO: 25 And 26) were used to prepare a GRE3-hphMX6 fragment by PCR reaction.
  • the 2a-3-34A strain was transformed by homologous recombination, and cultured for 3 days in a YPD plate medium supplemented with hygromycin B.
  • the obtained transformant was cultured overnight in a YPD medium supplemented with hygromycin B, and then genomic DNA was extracted from the transformant cells.
  • genomic DNA was extracted from the transformant cells.
  • a PCR reaction was carried out using the genomic DNA obtained from the transformant as a template using the GRE3 disruption confirmation primer set (SEQ ID NOs: 27 and 28), and a DNA fragment of about 2 kb Got.
  • the transformant in which the GRE3 gene was disrupted was identified by analyzing the nucleotide sequence of the obtained fragment, and the obtained transformant was designated as the host yeast strain SS29 (Table 4) used in the following Examples. Below, (Table 2) shows the base sequences of the primers used in this study.
  • Example 3 Construction of xylose isomerase gene expression system and introduction into yeast strains Using the budding yeast host (SS29 strain) prepared in Example 2, yeast expression vectors were used to try to express each xylose isomerase.
  • PLTex321sV5H (Table 3: Plasmid No. 3, Patent Document 2) was subcloned. Specifically, subcloning was performed according to the following procedure.
  • Each xylose isomerase gene prepared in Example 1 was amplified by PCR using a primer set (Table 2: SEQ ID NOs: 29 to 44) corresponding to each gene.
  • the reverse primer used for amplification had an XhoI site introduced therein, and the amplified DNA fragment was cleaved with XhoI at about 1.3 kb.
  • the yeast expression vector pLTex321sV5H fragment (about 7.4 kb) cleaved with SmaI and XhoI and the amplified DNA fragment encoding each xylose isomerase were attached using TaKaRa Ligation Kit Mighty Mix (Takara Bio Inc.) Ligation reaction was performed according to the protocol. After completion of the reaction, each ligation reaction solution was used to transform Escherichia coli DH5 ⁇ and cultured overnight in an ampicillin-added LB plate medium.
  • the obtained transformant was cultured overnight in ampicillin-added LB medium, and then the plasmid was extracted.
  • the transformant carrying the target plasmid was identified by restriction enzyme cleavage pattern and nucleotide sequence analysis.
  • the obtained plasmid containing each xylose isomerase gene was cleaved with SpeI and KpnI to obtain an approximately 2.2 kb fragment consisting of HSP12 promoter, each xylose isomerase gene, and CYC1 terminator.
  • SpeI and KpnI A ligation reaction was carried out with the yeast expression vector pUG35-kan-PTDH3 (FIG. 1, Table 3: Plasmid No. 4) fragment (about 4.6 kb) cleaved by.
  • each ligation reaction solution was used to transform Escherichia coli DH5 ⁇ and cultured overnight in an ampicillin-added LB plate medium.
  • the obtained transformant was cultured overnight in ampicillin-added LB medium, and then the plasmid was extracted.
  • the transformant carrying the target plasmid was identified by restriction enzyme cleavage pattern and nucleotide sequence analysis. Plasmid extraction was performed from the obtained transformant to obtain expression plasmids containing each xylose isomerase gene expression unit.
  • an XKS1 gene expression unit was introduced into each of the above expression plasmids.
  • the introduction method at that time is as follows.
  • a DNA fragment containing an XKS1 overexpression unit consisting of a PGK1 promoter, an XKS1 gene, and a CYC1 terminator using pAUR-XRXDHXK (Table 3: plasmid number 5), which is a plasmid containing an XKS1 gene expression unit, as a template.
  • Amplification was performed by PCR using primer sets for overexpression units (Table 2: SEQ ID NOs: 45 and 46). About 2.9 kb of the amplified DNA fragment and the above expression plasmid fragment cleaved with KpnI, using In-Fusion ( HD ) HD Cloning Kit (Takara Bio Inc.), In-Fusion reaction according to the attached protocol Went. After completion of the reaction, Escherichia coli DH5 ⁇ strain was transformed with the In-Fusion reaction solution, and cultured overnight on an LB plate medium supplemented with ampicillin.
  • HD In-Fusion
  • the obtained transformant was cultured overnight in an ampicillin-added LB medium, the plasmid was extracted, and a transformant carrying the target plasmid was obtained by restriction enzyme cleavage pattern and nucleotide sequence analysis. Plasmid extraction was performed from the obtained transformants to obtain plasmids (Table 3: Plasmid Nos. 7 to 14) containing each xylose isomerase gene expression unit and xylulokinase gene expression unit. In the same manner, a plasmid having only an expression unit not containing any XI was prepared (Table 3: Plasmid No. 6).
  • the SS29 strain was transformed.
  • the SS29 strain is transformed by the lithium acetate method and cultured for 3 days on Geneticin (R) -supplemented YPD plate medium, and possesses a plasmid containing each xylose isomerase gene expression unit and xylulokinase gene expression unit.
  • SS29 strain transformant was obtained.
  • the obtained transformants were named SS36 to SS44 strains (Table 4: strain numbers 4 to 12), respectively.
  • (Table 3) shows the plasmids used in this study
  • (Table 4) shows the genotypes of the yeast strains used in this study.
  • R Geneticin
  • Collect the yeast cells by centrifugation (3,000 rpm, 5 minutes, 4 ° C) using the total amount of the preculture, and use 10 mL of pseudo-saccharified solution (YPD 85 X 35 medium: glucose 85 g / L, xylose 35 g / L, yeast extract 10 g / L, peptone 20 g / L), and the cells were collected again by centrifugation. After washing the cells with the simulated saccharified solution, the yeast cells were suspended again in the simulated saccharified solution so that the total volume became 10 mL. 60 mL of pseudo saccharified solution was added to a 100 mL flask, and 10 mL of the cell suspension was inoculated (total volume of 70 mL).
  • pseudo-saccharified solution YPD 85 X 35 medium: glucose 85 g / L, xylose 35 g / L, yeast extract 10 g / L, peptone 20 g / L
  • the flask was closed with a silicon stopper inserted with an injection needle for exhausting carbon dioxide generated during fermentation and an injection needle for sampling the culture solution.
  • a three-way stopcock was connected to the sampling needle, and it was closed except during sampling.
  • the flask was subjected to shaking culture at 30 ° C. and 135 rpm for 72 hours.
  • 500 ⁇ L of the culture solution was sampled over time from a sampling needle using a 2.5 mL syringe.
  • the collected culture was centrifuged at 15,000 rpm for 5 minutes at 4 ° C., and 400 ⁇ L of the supernatant was stored frozen at ⁇ 80 ° C.
  • Example 6 Quantification by HPLC of sugar and alcohol in the culture solution of each transformed yeast strain Determination of glucose, xylose, xylitol, glycerol, acetic acid and ethanol in the sampled culture solution by high performance liquid chromatography (HPLC) Therefore, the measurement was performed by the following method. For the measurement, using HPLC LC-2000Plus series (JASCO Corporation) equipped with Aminex HPX-87C column (Bio-Rad Co., Ltd.) and Cation H Refill Guard column (Bio-Rad Co., Ltd.), 5 mM H 2 SO Separation was performed under conditions of a flow rate of 0.6 mL / min and 65 ° C. using 4 as a mobile phase.
  • HPLC LC-2000Plus series JASCO Corporation
  • Aminex HPX-87C column Bio-Rad Co., Ltd.
  • Cation H Refill Guard column Bio-Rad Co., Ltd.
  • a differential refractometer (JASCO Corporation) was used to detect the substance separated by the column. 25 ⁇ L of a sample obtained by diluting the sampled culture broth 5 times with distilled water was analyzed with the present HPLC apparatus under the above conditions.
  • a standard curve for quantification a standard substance solution in which glucose, xylose, xylitol, glycerol, acetic acid and ethanol are mixed at a concentration of 2% (w / v), and this solution are mixed with 1%, A standard curve for quantification is created by measuring with this HPLC system using solutions diluted in stages to 0.1% and 0.01%, and the concentration of each substance contained in the culture solution sample is quantified. did.
  • Non-Patent Documents 5 and 10 show A strain into which a mutant xylose isomerase gene with improved xylose metabolism was introduced and its fermentation performance was evaluated.
  • the mutant RfXI (G179A) gene expression plasmid was a primer set (Table 2: RfXI) using the wild-type RfXI expression plasmid pUG35-kan-HSP12p-RfXI-CYC1t-PGK1p-XKS1-CYC1t (Table 3: plasmid number 9) as a template.
  • the composition of the reaction solution was prepared as follows according to the attached protocol. PCR grade deionized water 13.4 ⁇ L, 10 ⁇ PCR Buffer for KOD -Plus- Neo 2 ⁇ L, 2 mM dNTP Mix 2 ⁇ L, 25 mM MgSO 4 1.2 ⁇ L, 10 ⁇ M Primer set 0.6 ⁇ L, 1 ng / ⁇ L Template DNA 0.4 ⁇ L , And 1 U / ⁇ L KOD -Plus-Neo DNA Polymerase 0.4 ⁇ L, pre-denaturation 94 ° C for 2 minutes, denaturation 98 ° C for 10 seconds, annealing 58 ° C for 30 seconds, extension reaction 68 ° C for 5 minutes For 10 cycles and a final extension reaction at 68 ° C.
  • PCR product 1.2 ⁇ L of DpnI was added and treated at 37 ° C. for 2 hours.
  • the resulting linear vector fragment was subjected to blunt end ligation.
  • the ligation reaction was performed using T4 DNA Ligase (Takara Bio Inc.), and the composition of the reaction solution was prepared as follows according to the attached protocol. Distilled water 14 ⁇ L, 10 ⁇ Ligation Buffer 2 ⁇ L, T4 DNA ligase 1 ⁇ L, T4 Polynucleotide Kinase 1 ⁇ L, and linear DNA 2 ⁇ L were reacted at room temperature for 1 hour.
  • Escherichia coli DH5 ⁇ was transformed and cultured overnight on an LB plate medium supplemented with ampicillin. Multiple selection from the obtained transformants, each after overnight culture in LB medium supplemented with ampicillin, the plasmid was extracted, plasmid pUG35-kan-HSP12p-RfXI (G179A) -CYC1t having the desired mutation by nucleotide sequence analysis -PGK1p-XKS1-CYC1t (Table 3: Plasmid No. 15) was obtained.
  • the mutant PspXI (E15D) gene expression plasmid is a primer set (PspXI (Opt)) using the wild-type PspXI expression plasmid pUG35-kan-HSP12p-PspXI-CYC1t-PGK1p-XKS1-CYC1t (Table 3: plasmid number 11) as a template.
  • PspXI (Opt) [SEQ ID NO: 59]
  • PspXI (Opt) (E15D) as [SEQ ID NO: 60] were similarly constructed and plasmid pUG35-kan-HSP12p-PspXI (E15D) having the desired mutation.
  • the mutant PspXI (T142S) gene expression plasmid is a primer set (PspXI (Opt)) using the wild-type PspXI expression plasmid pUG35-kan-HSP12p-PspXI-CYC1t-PGK1p-XKS1-CYC1t (Table 3: plasmid number 11) as a template.
  • T142S [SEQ ID NO: 61]
  • PspXI (Opt) (T142S) as [SEQ ID NO: 62]).
  • the mutant PspXI (E15D, T142S) gene expression plasmid is a primer set (PspXI (Opt)) using pUG35-kan-HSP12p-PspXI (E15D) -CYC1t-PGK1p-XKS1-CYC1t (Table 3: plasmid number 16) as a template.
  • T142S [SEQ ID NO: 61] and PspXI (Opt) (T142S) as [SEQ ID NO: 62]
  • plasmid pUG35-kan-HSP12p-PspXI E15D, E15D, T142S
  • CYC1t-PGK1p-XKS1-CYC1t Table 3: Plasmid No. 18
  • Example 8 Production of mutant CpXI library by mutagenesis PCR (Example 6) From the results of fermentation test (Example 6), the CpXI gene was shown to be capable of imparting the highest xylose metabolic capacity to host yeast strains. In order to further improve the molecular evolution engineering technique, a mutant CpXI library was prepared by random mutagenesis PCR. The specific procedure is as follows.
  • an expression plasmid introduced with the CpXI gene (pUG35-kan-HSP12p-CpXI-CYC1t-PGK1p-XKS1-CYCt, Table 3: plasmid number 12) was used, and about 1 kb from the 5′-end of the CpXI gene.
  • Diversify PCR Random Mutagenesis Kit (Takara Bio) using a primer set having homology at both ends of the mutagenesis site in the range (Table 2: oSS62 XI-F_HSP12s [SEQ ID NO: 47] and oSS74 XI-Rc [SEQ ID NO: 48]) Random mutagenesis PCR was carried out.
  • Random mutagenesis PCR conditions were set such that 2.7 mutations were introduced per kb according to the attached protocol.
  • the composition of the random mutagenesis PCR reaction solution was 38 ⁇ L of PCR grade deionized water, 5 ⁇ L of 10 ⁇ TITANIUM Taq buffer, 2 ⁇ L of 8 mM MnSO 4 , 1 ⁇ L of 2 mM dGTP, 1 ⁇ L of 50 ⁇ Diversify dNTP Mix, 0.02 mM primer set Consists of 1 ⁇ L, 1 ng / ⁇ L template DNA, and 1 ⁇ L of TITANIUM Taq Polymerase. Pre-denaturation 94 ° C for 30 seconds, denaturation 94 ° C for 30 seconds, extension reaction 68 ° C for 1 minute 25 cycles, final Extension reaction was performed at 68 ° C. for 1 minute.
  • the linear vector fragment was obtained by the following method.
  • primer sets Table 2: oSS63 XI-R_HSP12as [SEQ ID NO: 49] and oSS83 06_CpXI-Fc [SEQ ID NO: 50]
  • KOD -Plus- It was prepared by Inverse PCR method using Neo (Toyobo Co., Ltd.).
  • the composition of the reaction solution was prepared as follows according to the attached protocol.
  • PCR grade deionized water 33.5 ⁇ L, 10 ⁇ PCR Buffer for KOD -Plus- Neo 5 ⁇ L, 2 mM dNTP Mix 5 ⁇ L, 25 mM MgSO 4 3 ⁇ L, 10 ⁇ M Primer set 1.5 ⁇ L, 1 ng / ⁇ L Template DNA 1 ⁇ L , And 1 U / ⁇ L KOD -Plus-Neo DNA Polymerase 1 ⁇ L, pre-denaturation 94 ° C for 2 minutes, denaturation 98 ° C for 10 seconds, annealing 58 ° C for 30 seconds, extension reaction 68 ° C for 4 minutes For 25 cycles and a final extension reaction at 68 ° C. for 5 minutes.
  • E. coli DH5 ⁇ strain Giga Competent Cell (DH5 ⁇ ), Biodynamics Laboratories, Inc.
  • DH5 ⁇ Giga Competent Cell
  • plasmids were prepared from several DH5 ⁇ transformants, and CpXI gene base sequence analysis was performed. As a result, at least 90% of mutations were introduced into the CpXI gene of the plasmid on average. Confirmed that it was. In addition, they were judged to be extremely high-quality libraries because mutations were introduced independently and entirely.
  • Example 9 Screening for mutant CpXI gene with improved xylose metabolism ability From screening of mutant CpXI gene with improved xylose metabolism ability (Example 8) Study was carried out.
  • yeast strain SS42 into which a wild-type CpXI gene expression plasmid (pUG35-kan-HSP12p-CpXI-CYC1t-PGK1p-XKS1-CYC1t, Table 3: plasmid number 12) was introduced, the xylose concentration was changed from 50 g / L to 90 g.
  • the growth test of the SS42 strain was performed using YPX plate medium (added with Geneticin (R) to maintain the expression plasmid ) changed to / L.
  • YPX plate media containing xylose concentrations at concentrations of 50 g / L, 60 g / L, 70 g / L, 80 g / L, 90 g / L (YPX 50 , YPX 60 , YPX 70 , YPX 80 , YPX 90 ) was inoculated with 50 ⁇ L of the bacterial cell solution and cultured at 30 ° C. for 4 days.
  • colony formation was observed in the SS42 strain on YPX 50 , YPX 60 and YPX 70 plate media, but no colony formation was observed on YPX 80 and YPX 90 plate media containing 80 g / L or more of xylose. It was.
  • Example 10 Twenty-four colonies obtained by screening on a high-concentration xylose medium (YPX 80 plate medium) in the second screening of the mutant CpXI gene with improved xylose metabolism ability (Example 9) Not only SS29 transformants whose xylose metabolism ability has been improved by mutations, but also false positive strains that can grow in high-concentration xylose media due to mutations in their genomic DNA caused by natural mutations. Was considered. Therefore, the mutant CpXI expression plasmid was extracted from the obtained SS29 strain transformants derived from the 24 colonies using the Easy Yeast Plasmid Isolation Kit (Takara Bio Inc.) according to the attached protocol. . Using each of the obtained expression plasmids, E.
  • Example 11 For the 11 SS29 transformants obtained by the second screening of the SS29 transformant in which the mutant CpXI gene was expressed (Example 10), the xylose metabolic capacity was improved. It was confirmed to be derived from the mutated CpXI gene. Furthermore, in order to confirm the effectiveness, a growth test on a YPX 80 liquid medium under aerobic conditions was performed by the method using the 96-well microplate described above. As a result, all 11 isolated transformants were observed to grow faster than the SS42 strain expressing wild type CpXI. The results are shown in FIG.
  • Table 7 “Growth rate of mutant CpXI enzyme gene-introduced strain in a xylose medium under aerobic conditions” is used to identify 11 strains of xylose obtained by screening mutant CpXI gene library. Growth rate under aerobic conditions in the exponential growth phase using YPX 80 medium used as carbon source (Specific growth rate) and relative growth rate (Relative growth rate) relative to the strain (SS42) introduced with wild type CpXI gene Indicates. The data is an average of three experiments. Moreover, the standard deviation was shown about the growth rate.
  • Example 12 In the screening of the introduction of the mutant CpXI gene into the genome (Example 9), an expression vector retained in a low copy in yeast cells was used, but the mutant CpXI expression plasmid in yeast cells was used. It was considered that the influence of the copy number may contribute to the improvement of the xylose metabolic capacity of the host yeast cells. Therefore, we constructed strains that introduced 11 selected mutant CpXI gene expression units into the host yeast strain genome and evaluated their fermentation performance. Eleven mutant CpXI gene expression plasmids were cleaved with SpeI and SphI to obtain a fragment (about 2 kb) containing HSP12p-CpXI.
  • pAUR101r2-XKS1-06_CpXIopt (Fig. 1), which is a vector in which an XKS1 gene expression unit and a wild-type CpXI gene are introduced into pAUR101 (Takara Bio Inc.), a yeast genome introduction type vector, is similarly cleaved by SpeI and SphI.
  • a vector fragment of about 8.3 kb was obtained.
  • Both DNA fragments were subjected to a ligation reaction using TaKaRa DNA Ligation Kit Mighty Mix (Takara Bio Inc.) according to the attached protocol.
  • E. coli DH5 ⁇ strain (ECOS TM Competent E.
  • coli DH5 ⁇ Nippon Gene Co., Ltd.
  • ampicillin-added LB plate medium and cultured at 37 ° C overnight. Got the stock.
  • the obtained transformant was cultured overnight in ampicillin-added LB medium, the plasmid was extracted, and a transformant carrying the target plasmid was identified by restriction enzyme cleavage pattern and nucleotide sequence analysis.
  • the resulting 11 types of mutant CpXI gene expression plasmids (Table 3: plasmid numbers 20 to 30) were cleaved with BsiWI, and this DNA fragment was used to transform the SS29 strain.
  • each mutant CpXI expression unit is introduced into the yeast strain (SS82, SS84, SS85, SS86, SS87, SS88, SS89, SS91, SS92, SS93, and SS94 [Table 82]. 4: strain number 18-28]).
  • a wild-type CpXI expression plasmid (pAUR-kanMX6-HSP12p-CpXI-CYC1t-PGK1p-XKS1-CYC1t [Table 3: Plasmid No. 19]) was prepared in the same manner, and the SS29 strain was transformed. The obtained control strain was designated as SS81 strain (Table 4: strain number 17).
  • Example 13 Twelve types of SS29 transformants (SS81, SS82, SS84, SS85, SS86, SS87, SS88, SS89, SS91) produced in a fermentation test (Example 12) under simulated aerobic conditions in a simulated saccharified solution , SS92, SS93, and SS94) were evaluated for fermentation under microaerobic conditions using YPD 85 X 35 simulated saccharified solution similar to that used in (Example 5). .
  • the culture solution was sampled over time, and glucose, xylose, xylitol, glycerol, acetic acid, and ethanol in the culture solution were quantified by HPLC. The result is shown in FIG.
  • two strains (SS82 strain and SS92 strain) were selected which showed significantly better xylose metabolic capacity than the SS81 strain expressing wild type CpXI.
  • Example 14 Xylose isomerization expressed in yeast cells under fermentation conditions under microaerobic conditions for two mutant CpXI expression strains selected by measuring the activity of xylose isomerase (Example 13) The enzyme activity was measured by the following method. After the start of the fermentation test in the YPD 85 X 35 medium under microaerobic conditions, the culture solution 24 hours later was sampled and the yeast cells were collected by centrifugation. Yeast cells are suspended in CelLytic TM Y Cell Lysis Reagent (Sigma Aldrich Japan Co., Ltd.) and Protease Inhibitor Cocktail for use with fungal and yeast extracts (Sigma Aldrich Japan Co., Ltd.), and 0.5 mm zirconia beads are used.
  • the cells were disrupted. After cell disruption, a supernatant from which zirconia beads and cell insolubles were removed by centrifugation was obtained. In order to measure the protein concentration of this cell disruption solution, the protein concentration was quantified using Pierce TM 660 nm Protein Assay Reagent (Thermo Fisher Scientific) according to the attached protocol. The xylose isomerase activity in the cell disruption solution was measured by the following method.
  • the composition in a 100 ⁇ L reaction solution is as follows.
  • Example 15 CpXI modification by site-directed mutagenesis (Example 14) Contribution to improvement of xylose metabolism in each mutation of two mutations in CpXI-V162A and N303T in the mutant CpXI gene examined in Example 14 Therefore, CpXI-V162A and CpXI-N303T were isolated by site-directed mutagenesis.
  • a specific site-directed mutagenesis method was performed as follows. Using wild-type CpXI expression plasmid pAUR-kanMX6-HSP12p-CpXI-CYC1t-PGK1p-XKS1-CYC1t (Table 3: Plasmid No.
  • primer sets (Table 2: oSS106 06_CpXI_V162A [SEQ ID No. 53] and oSS107 06_CpXI_V162Aas [Sequence] No. 54]).
  • the composition of the reaction solution was prepared as follows according to the attached protocol.
  • PCR product 1.2 ⁇ L of DpnI was added and treated at 37 ° C. for 2 hours.
  • the resulting linear vector fragment was subjected to blunt end ligation.
  • the ligation reaction was performed using T4 DNA Ligase (Takara Bio Inc.), and the composition of the reaction solution was prepared as follows according to the attached protocol. Distilled water 14 ⁇ L, 10 ⁇ Ligation Buffer 2 ⁇ L, T4 DNA ligase 1 ⁇ L, T4 Polynucleotide Kinase 1 ⁇ L, and linear DNA 2 ⁇ L were reacted at room temperature for 1 hour.
  • Escherichia coli DH5 ⁇ was transformed and cultured overnight on an LB plate medium supplemented with ampicillin. A plurality of transformants were selected from the obtained transformants, and each was cultured overnight in an LB medium supplemented with ampicillin, and then the plasmid was extracted. A plasmid (Table 3: Plasmid No. 31) having the desired mutation was obtained by nucleotide sequence analysis.
  • the CpXI-N303T expression plasmid was also constructed in the same manner using the primer sets (oSS108 06_CpXI_N303T [SEQ ID NO: 55] and oSS109 06_CpXI_N303Tas [SEQ ID NO: 56]), and plasmids having the desired mutations (Table 3: Plasmid numbers). 32) was obtained.
  • the prepared mutant CpXI-V162A gene expression plasmid (Table 3: plasmid number 31) and CpXI-N303T gene expression plasmid (Table 3: plasmid number 32) were cleaved with BsiWI, and the SS29 strain was transformed.
  • the obtained strains were designated as SS104 strain (Table 4: strain number 29) and SS105 strain (Table 4: strain number 30), respectively.
  • a fermentation test was carried out under a microaerobic condition using a simulated saccharified solution (YPD 85 X 35 medium). After the start of culture, xylose isomerase activity in the cells of both strains 24 hours later Activity measurement was performed.
  • both mutant CpXI showed 29.5 mM and 19.1 mM and lower Km values than wild-type CpXI, respectively.
  • the Vmax value of CpXI (N303T) was 0.03 ⁇ mol / mg protein / min and wild-type CpXI ( The value was lower than 0.66 ⁇ mol / mg protein / min) (Table 8).
  • the SS104 strain expressing CpXI-V162A showed higher xylose metabolic capacity than the SS81 strain expressing wild type CpXI, but the SS105 strain expressing CpXI-N303T. Xylose metabolism ability was lower than SS81 strain (FIG. 5 and Table 9). From the above results, it was confirmed that the V162A mutation is effective in improving the ability of CpXI to metabolize xylose.
  • This table shows the contents of glucose, xylose, xylitol, glycerol, acetic acid and ethanol in the culture supernatant 72 hours after the start of the fermentation test. Moreover, the yield (% theoretical yield) of produced ethanol with respect to the amount of ethanol obtained from the input sugars (glucose and xylose) was shown. Data are the average of three experiments and its standard deviation. Moreover, nd indicates that it is below the detection limit in the quantification by HPLC.
  • Example 16 Preparation and evaluation of CpXI double mutant (16-1) Preparation of CpXI double mutant Two types of mutations that were shown to be effective in improving the ability of CpXI to metabolize xylose Mutant CpXI (T63I, V162A) into which mutation was introduced was prepared by a site-specific mutagenesis method. A specific manufacturing method is as follows. Using the mutant CpXIpAUR-kanMX6-HSP12p-CpXI (T63I) -CYC1t-PGK1p-XKS1-CYC1t (Table 3: Plasmid No.
  • primer sets (Table 2: oSS106 06_CpXI_V162A [SEQ ID No. 53] and oSS107 06_CpXI_V162Aas [Sequence] No. 54]).
  • the composition of the reaction solution was prepared as follows according to the attached protocol.
  • the obtained linear vector fragment was subjected to blunt-end ligation reaction using T4 DNA Ligase (Takara Bio Inc.).
  • T4 DNA Ligase Takara Bio Inc.
  • the composition of the reaction solution was prepared as follows according to the attached protocol. Distilled water 14 ⁇ L, 10 ⁇ Ligation Buffer 2 ⁇ L, T4 DNA ligase 1 ⁇ L, T4 Polynucleotide Kinase 1 ⁇ L, and linear DNA 2 ⁇ L were reacted at room temperature for 1 hour. Using this reaction solution, Escherichia coli DH5 ⁇ was transformed and cultured overnight on an LB plate medium supplemented with ampicillin.
  • a plurality of transformants were selected from the obtained transformants, and each was cultured overnight in an LB medium supplemented with ampicillin, and then a plasmid was extracted.
  • a plasmid (Table 3: Plasmid No. 33) having the desired mutation was obtained by nucleotide sequence analysis.
  • the prepared CpXI (T63I, V162A) gene expression plasmid (Table 3: Plasmid No. 33) was cut with BsiWI to transform the SS29 strain.
  • the resulting double mutant CpXI gene-introduced strain was designated as SS120 strain (Table 4: strain number 31).
  • the mutations contributing to the improvement of xylose metabolism in CpXI are T63I and V162A amino acid substitutions, especially the double mutant CpXI to which the two mutations (T63I and V162A) were simultaneously added. It has been demonstrated that the gene can confer high xylose metabolic capacity and ethanol production capacity to the host yeast strain.
  • the nucleotide sequence of the mutation site of the obtained plasmid is determined by nucleotide sequence analysis. In the 63rd threonine or 162nd valine, other amino acid residues (except cysteine) including wild type amino acid residues are determined. 19 types of substituted expression plasmids were obtained. The obtained expression plasmid is cleaved with BsiWI (New England Biolabs), and each DNA fragment is used to transform the SS29 strain, followed by culturing at 30 ° C. for 3 days in an aureobasidin A-added YPD plate medium. Thus, a transformant was obtained.
  • BsiWI New England Biolabs
  • mutant CpXI having T63I mutation is to lysine (T63L), glycine (T63G), and histidine (T63H) (FIG. 9: The nucleotide sequences of mutant CpXI having amino acid substitutions to T63L, T63G, and T63H correspond to SEQ ID NOs: 63 to 65, respectively).
  • the present invention makes it possible to construct a yeast strain capable of producing ethanol with high efficiency from xylose, and is expected to contribute to higher efficiency in the production of second-generation bioethanol using biomass as a raw material.

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Abstract

本発明は、出芽酵母に高いキシロース代謝能を付与可能な変異型キシロース異性化酵素遺伝子及び変異タンパク質の情報を提供する。さらにその変異型キシロース異性化酵素遺伝子を有する酵母株を提供する。また、当該酵母株を利用した有用物質の効率的な生産方法を提供する。　本発明により、Clostridium phytofermentans 由来キシロース異性化酵素（CpXI）の配列番号１１における第63番目のスレオニンがイソロイシン、リジン、グリシン、または、ヒスチジンに置換され、及び／又は第162番目のバリンがアラニンに置換されるアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含み、高いキシロース代謝活性を有する変異型CpXIを提供した。また、出芽酵母の優先コドンに最適化されたCpXI遺伝子において、配列番号１１中の第63番目のスレオニンがイソロイシン、リジン、グリシン、または、ヒスチジンに置換され、及び／又は第162番目のバリンがアラニンに置換されるコドン変異に対応するコドン変異を含む変異型CpXI遺伝子を用いて形質転換された、エタノール生産能が高い形質転換酵母、並びに当該形質転換酵母を用いたエタノール生産方法が提供できた。

Description

変異型キシロース代謝酵素とその利用
　本発明は、酵母を用いて発酵法によりエタノールを生産する技術に関し、より詳しくは、キシロースの代謝能力が向上した変異型キシロース異性化酵素ならびに当該酵素遺伝子を導入した酵母によるバイオマス糖化液からのエタノール生産方法に関する。
　出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeは、高い発酵能と高いエタノール耐性を有しており、主に酒類の製造のために古くからエタノール生産に利用されている微生物であり、近年は、燃料用エタノール生産においても利用されている。また、エタノールは、ガソリンの代替燃料として再生可能エネルギーとしても位置づけられており、植物由来バイオマスより発酵法によって生産されている。
　第一世代バイオエタノールは、サトウキビなどに由来するグルコース、あるいはトウモロコシなどに由来するデンプンを酵素分解などにより得られたグルコースを原料として、出芽酵母などを用いることにより発酵によって生産される燃料用エタノールである。しかしながら、これらの原料が食糧や家畜飼料と競合することが問題視されている。
　一方、第二世代バイオエタノールは、食糧や家畜飼料と競合しないセルロース系バイオマスから生産されるエタノールである。セルロース系バイオマスからのエタノール生産においては、原料の種類、前処理方法、糖化プロセス、発酵プロセスの組み合わせによってさまざまな問題が知られており、それらの解決が期待されている。
　また、セルロース系バイオマスにはさまざまな資源が想定されているが、特に木質は、グルコースの原料となるセルロースが最も多量に含まれていることから、その利用について期待も高い。また、木質には、セルロースのほかに、ヘミセルロース、リグニンを主成分として有しているが、セルロースの次に含量が多いヘミセルロースの利用も、セルロース系バイオマスからのエタノール生産において重要な課題である。ヘミセルロースは、糖化酵素による分解によってキシロースに変換されるが、出芽酵母はキシロースを資化するための遺伝子がほとんど機能していないため、キシロースからのエタノール生産効率が著しく低いことが問題であった。このため、キシロース資化性生物由来のキシロース代謝酵素を出芽酵母に導入したり、内在性のキシロース代謝に関わる遺伝子の強制発現などによって、出芽酵母にキシロースの資化性を付与するという研究が広くなされている。これらのキシロース代謝に関わる酵素は、キシロース還元酵素、キシリトール脱水素酵素、キシルロースリン酸化酵素、キシロース異性化酵素、ペントースリン酸経路に関わる酵素などである。
　キシロースからキシルロースへの変換には二種類の経路があり、一つは、還元型経路であり、本経路は、NADPH依存型キシロース還元酵素（XR）およびNAD+依存型キシリトール脱水素酵素（XDH）が触媒するが、両酵素における補酵素が異なるため、そのインバランスから副産物としてキシリトールが蓄積する（非特許文献１）。特に、商業スケールでのキシロースからのエタノール生産においては、このキシリトール蓄積の問題は、エタノール生産効率の低下につながるため、本問題点の解決は重要である。
　もう一方の経路は、キシロース異性化酵素（XI）が触媒し、本経路では副産物としてのキシリトールの蓄積の問題を生じない利点がある。一方で、キシロース異性化酵素遺伝子を発現させた酵母細胞において、キシロースからのエタノール生産速度が遅いといった問題点が知られている。これらの問題点の解決のため、これまでに多くの細菌や真菌等からキシロース異性化酵素遺伝子がクローニングされ、酵母細胞内での発現が試みられてきた。これまでに、Piromyces sp. E2（非特許文献２）、Orpinomyces sp. ukk1（非特許文献３）、Clostridium phytofermentans ISDg（非特許文献４）、Ruminococcus flavefaciens 17（非特許文献５）、Prevotella ruminicola TC2-24（非特許文献６）、Burkholderia cenocepacia J2315（非特許文献７）、Clostridium cellulolyticum H10（非特許文献８）、Streptomyces rubiginosus（非特許文献９）に由来するキシロース異性化酵素遺伝子が酵母細胞内で機能し、宿主出芽酵母に効率は悪いながらもキシロース代謝能を付与可能であることが示されている。
　近年、Piromyces sp. E2由来キシロース異性化酵素の分子進化工学的手法による高活性化についての報告がなされた（非特許文献１０）。本報告では、6カ所（E15D, E114G, E129D, T142S, A177T, V433I）の変異が導入された変異型Piromyces sp. E2由来キシロース異性化酵素が、出芽酵母におけるキシロースを炭素源とした好気条件での生育速度、およびキシロースの消費速度の向上によるエタノール生産を改善することが示された。本変異型Piromyces sp. E2由来キシロース異性化酵素は、野生型と比較して77% Vmax値が向上していたが、Km値は約2倍高いことも示されている。また、6カ所の変異のうち、高活性化に重要なアミノ酸変異は、E15DおよびT142Sであることも示されている。
　また、Ruminococcus flavefaciens 17由来キシロース異性化酵素においても、キシロース結合部位付近のアミノ酸置換（G179A）による15%の活性の改善、およびN-末端10アミノ酸配列をPiromyces sp. E2由来キシロース異性化酵素のN-末端12アミノ酸配列に置換することによる26.8%の活性の改善が報告されている（非特許文献５）。
　Streptomyces rubiginosus由来キシロース異性化酵素については、pH6以下の反応条件においてキシロースと高い親和性を獲得した幾つかの変異型キシロース異性化酵素遺伝子が得られたことが報告されている（非特許文献９）。
　このように、酵母におけるキシロースからの高効率なバイオエタノール生産のためのキシロース異性化酵素に関わる研究は広くなされているが、それぞれのキシロース異性化酵素遺伝子を導入した酵母におけるキシロース代謝能の評価は、それぞれ異なる条件においてなされたものであり、キシロースからのバイオエタノール生産を最も効率的に行える能力を付与可能なキシロース異性化酵素は、どの生物由来のキシロース異性化酵素遺伝子であるのか、多種類のキシロース異性化酵素を同一の宿主株・発現条件・培養条件で比較検討された報告例はない。また、出芽酵母において最も効率的にエタノール生産を行える発酵条件は、嫌気もしくは微好気条件であるが、これまでの多くの報告では好気条件下での培養におけるキシロース異性化酵素の機能評価が多く、エタノール生産を高効率に行える発酵条件下での比較評価はなされていない。さらに変異導入によって高機能化された変異型キシロース異性化酵素であっても、嫌気もしくは微好気条件において、高効率なバイオエタノール生産に資するものであるかは不明である。
特開２０１５－３３３４２号公報 特許第４３３２６３０号公報
Matsushika A,et al., Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75, p.3818-3822. Kuyper M, et al., FEMS Yeast Research, 2003, 4, p.69-78. Tanino T, et al., Applied Microbiology and Biotechnology, 2010, 88, p.1215-1221. Demeke MM,et al., Biotechnology for Biofuels, 2013, 6, p.89. Aeling KA,et al., Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2012, 39, p. 1597-1604. Hector RE,et al., Biotechnology for Biofuels, 2013, 6, p.84. de Figueiredo Vilela L,et al., Bioresource Technology, 2013, 128, p.792-796. Harcus D,et al., PloS One, 2013, 8, e80733. Waltman MJ ,et al., Protein Engineering, Design and Selection, 2014, 27, p.59-64. Lee SM,et al., Applied and Environmental Microbiology, 2012, 78, p.5708-5716. 日本農芸化学会2016年度大会（2016年3月27日～30日開催）要旨集、発表番号：2A022, 2A023 Akashi H.,Genetics, 2003, 164, p.1291-1303. Kuriyama H,et al., Journal of Fermentation Technology, 1985, 63, p.59-165.
　本発明では、由来が異なる8種類のキシロース異性化酵素遺伝子を用いて、各キシロース異性化酵素遺伝子について、同一条件下でのコドンの最適化と同一発現ベクターへのクローニングを行い、得られた各キシロース異性化酵素遺伝子発現プラスミドを導入したエタノール生産実用酵母株を作製し、それらのキシロース資化性の評価を同一培養条件下で行うことで、最適なキシロース異性化酵素遺伝子の情報を提供する。さらに最適なキシロース異性化酵素遺伝子に人工的な変異導入を行い、それら変異型キシロース異性化酵素遺伝子を有する酵母株のキシロース資化性の評価を行うことで、高いキシロース代謝能を出芽酵母に付与可能な変異型キシロース異性化酵素遺伝子及び変異型タンパク質の情報を提供する。さらにその変異型キシロース異性化酵素遺伝子を有する酵母株を提供する。また、当該酵母株を利用した有用物質の効率的な生産方法を提供する。
　背景技術に示したとおり、酵母においてキシロースからエタノールを生産させる効率を向上させるためには、優れたキシロース代謝能を有する外来性のキシロース代謝酵素遺伝子を機能する形で、酵母細胞内に導入する必要がある。これまで、多くのキシロース異性化酵素遺伝子が単離され、酵母における発現が試みられてきたが、酵母細胞内において機能を有する形で発現に成功しているキシロース異性化酵素遺伝子の報告は僅かである。また、各キシロース異性化酵素の酵母細胞内でのキシロース代謝能力の評価は、異なる発酵条件下で行われたものであり、どのキシロース異性化酵素遺伝子が酵母細胞での発現に適しており、優れたキシロース代謝能を宿主酵母細胞に付与可能かどうかは明らかにされていない。また、エタノール生産を高効率に行える嫌気条件もしくは微好気条件での発酵において、これらのキシロース異性化酵素遺伝子が有効に機能するのかなど不明な点が多く、キシロースからエタノールを生産させる効率を向上させるためには、最適なキシロース異性化酵素遺伝子を選抜することが重要である。
　本発明者らは、これまで出芽酵母において、機能を有する形で発現に成功している8種類のキシロース異性化酵素遺伝子から、最も優れたキシロース代謝能を付与可能なキシロース異性化酵素遺伝子を選抜することとし、その際のスクリーニング方法として、本発明者らが以前にキシロース代謝能が向上した酵母変異株を取得する際に用いた、好気性条件下での高濃度キシロース培地および微好気性条件下での疑似糖化液（YPDX）培地を用いた発酵試験を組み合わせたスクリーニング方法（特許文献１）を改良して用いることとした。
　すなわち、上記8種類のキシロース異性化酵素遺伝子について、翻訳効率の影響を最小限に抑えるためコドンの最適化を行い、同一のプロモーターおよびターミネーターを用いた各キシロース異性化酵素遺伝子発現プラスミドを構築し、同一のエタノール生産実用酵母株に導入することで、各キシロース異性化酵素遺伝子を発現する酵母株を構築した。こうして得られた酵母株を用いて、キシロースを炭素源として用いた培地における生育を評価することで、各酵母株のキシロース資化性について検討した。また、疑似糖化液（YPD85X35）を用いた微好気条件下での回分発酵試験によって、エタノール生産性についても評価を行った。これらの評価によって、最も優れたキシロース代謝能を付与可能なキシロース異性化酵素遺伝子としてClostridium phytofermentans由来遺伝子（CpXI遺伝子）を選抜した。次いで、キシロース代謝能の向上のため、選抜されたキシロース異性化酵素遺伝子（CpXI遺伝子）に分子進化工学的手法によって人工的に変異導入を行った変異型キシロース異性化酵素遺伝子ライブラリーを作製し、キシロースを炭素源として用いた培地における好気条件での生育、および疑似糖化液（YPD85X35）を用いた微好気条件下での回分発酵試験によって、評価を行った（非特許文献１１）。
　その結果、異なる箇所にアミノ酸配列レベルでの変異が導入された複数の種類の変異型キシロース異性化酵素遺伝子を単離した。さらに、これらの変異型キシロース異性化酵素遺伝子が有する変異のうちの2か所の変異を集約した二重変異型キシロース異性化酵素遺伝子を構築し、疑似糖化液（YPD85X35）を用いた微好気条件での回分発酵試験によって評価を行った。その結果、2種類の変異型キシロース異性化酵素遺伝子、特に二重変異型キシロース異性化酵素遺伝子が、従来報告されていたキシロース異性化酵素よりも優れたキシロース代謝能を宿主酵母株に付与可能であることを見いだし、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
［１］　Clostridium phytofermentans 由来キシロース異性化酵素（CpXI）のアミノ酸配列において、配列番号１１における第６３番目のスレオニン及び第１６２番目のバリンに対応する少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含む変異型キシロース異性化酵素（変異型CpXI）であって、野生型キシロース異性化酵素（CpXI）と比較して高いキシロース代謝活性を有する変異型CpXI。
［２］　前記配列番号１１における第６３番目のスレオニンの他のアミノ酸への置換がイソロイシン、リジン、グリシン、または、ヒスチジンへの置換であり、第１６２番目のバリンの他のアミノ酸への置換がアラニンへの置換である、前記［１］に記載の変異型CpXI。
［３］　配列番号１１に示されるキシロース異性化酵素のアミノ酸配列において、第６３番目のスレオニンがイソロイシン、リジン、グリシン、または、ヒスチジンに置換され、及び／又は第１６２番目のバリンがアラニンに置換されている、前記［２］に記載の変異型CpXI。
　特に、配列番号１１中の第６３番目のスレオニンがイソロイシンに置換され、かつ第１６２番目のバリンがアラニンに置換されているアミノ酸配列を含む変異型CpXIが好ましい。
［４］　Clostridium phytofermentans 由来キシロース異性化酵素（CpXI）遺伝子の塩基配列において、コードするアミノ酸配列における配列番号１１中の第６３番目のスレオニン及び第１６２番目のバリンに対応するコドンの少なくとも１つのコドンが他のアミノ酸に対応するコドンに置換された塩基配列を含む変異型キシロース異性化酵素遺伝子（変異型CpXI遺伝子）であって、Saccharomyces cerevisiae 宿主に対して、野生型CpXI遺伝子と比較して高いキシロース代謝能及び高いエタノール生産能を付与する変異型CpXI遺伝子。
［５］　配列番号１２に示されるキシロース異性化酵素遺伝子（CpXI遺伝子）の塩基配列において、コードするアミノ酸配列中の第６３番目のスレオニンがイソロイシン、リジン、グリシン、または、ヒスチジンに置換され、及び／又は第１６２番目のバリンがアラニンに置換される変異に対応するコドン変異を有する塩基配列を含む、前記［４］に記載の変異型CpXI遺伝子。
　特に、配列番号１２において、コードするアミノ酸配列中の第６３番目のスレオニンがイソロイシンに置換され、かつ第１６２番目のバリンがアラニンに置換される変異に対応するコドン変異を有する塩基配列を含む変異型CpXI遺伝子が好ましい。
［６］
　前記［４］又は［５］に記載の変異型CpXI遺伝子により形質転換された酵母であって、親酵母と比較して高いキシロース代謝能を有する形質転換酵母。
［７］　前記酵母が、サッカロマイセス属（Saccharomyces）、クルイベロマイセス属（Kluyveromyces）、カンジダ属（Candida）、ピキア属（Pichia）、シゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces）、及びハンセヌラ属（Hansenula）からなる群から選択される酵母である、前記［６］に記載の形質転換酵母。
［８］　前記酵母がサッカロマイセス属（Saccharomyces）酵母である、前記［６］に記載の形質転換酵母。
［９］　キシロース存在下において、前記［６］～［８］のいずれかに記載の形質転換酵母を用いたエタノール生産方法。
　本発明により、優れたキシロース代謝能を有する微生物が提供される。また、本発明によって見いだされた変異型キシロース異性化酵素をコードする変異型遺伝子あるいは変異型タンパク質を利用することにより、優れたキシロース代謝能を有する微生物を遺伝子組換え技術などにより作出することが可能となる。さらには、本発明の微生物あるいは本発明によって見いだされた変異遺伝子を有する微生物を用いることにより、キシロースを含有する培地を利用して効率的にエタノールなどの有用物質を生産することが可能となる。
プラスミドの物理マップ：図中、pUG6zeoは、pUC系ベクター骨格に、loxPサイトを両端に配置したZeocinTM耐性遺伝子（bleMX6）を導入したプラスミドである。pUG6hygは、pUC系ベクター骨格に、loxPサイトを両端に配置したハイグロマイシン耐性遺伝子（hphMX6）を導入したプラスミドである。pUG35-kan-TDH3pは、pUC系ベクター骨格に、酵母用複製起点（CEN6/ARSH4）、Geneticin（R）耐性遺伝子（kanMX6）、および酵母用発現ユニット（TDH3プロモーター、マルチクローニングサイト（MCS）、CYC1ターミネーター）を導入したプラスミドである。pAUR101r2-XKS1-06_CpXIoptは、pAUR101（タカラバイオ）に、XKS1発現ユニット（PGK1プロモーター、XKS1遺伝子、CYC1ターミネーター）、及びCpXI遺伝子を導入したプラスミドである。 キシロース異性化酵素遺伝子導入株の好気条件下でのキシロース培地における生育：8種類のキシロース異性化酵素遺伝子を導入した酵母株（SS37～SS44）および発現ベクターのみを導入した酵母株（SS36）のキシロースを単一の炭素源として用いたYPX50培地を用いた好気条件下での生育曲線を示す。データは3回の実験の平均値である。 キシロース異性化酵素遺伝子導入株の微好気条件下での疑似糖化液を用いた発酵試験：8種類のキシロース異性化酵素遺伝子を導入した酵母株（SS37～SS44）および発現ベクターのみを導入した酵母株（SS36）のグルコースとキシロースを炭素源として含む疑似糖化液（YPD85X35）を用いた微好気条件下での発酵試験結果を示す。本発酵試験中、経時的に培養上清のサンプリングを行い、培養上清中のグルコース、キシロース、キシリトール、グリセロール、酢酸、エタノール含量をHPLCによって測定した。データは3回の実験の平均値である。 変異型CpXI遺伝子発現株の好気条件下におけるキシロース培地における生育：分子進化工学的手法によるCpXI遺伝子への変異導入と変異型CpXI遺伝子ライブラリーのスクリーニングによって得られた11株（M6-2、M6-6、M6-7、M6-10、M6-11、M6-13、M6-15、M6-19、M6-20、M6-21、およびM6-22）、および野生型CpXI発現株（SS42）のYPX80培地を用いた好気条件下での生育曲線を示す。データは3回の実験の平均値である。 変異型CpXI遺伝子発現株の微好気条件下における疑似糖化液を用いた発酵試験：分子進化工学的手法によるCpXI遺伝子への変異導入と変異型CpXI遺伝子ライブラリーのスクリーニングによって得られた11株（M6-2、M6-6、M6-7、M6-10、M6-11、M6-13、M6-15、M6-19、M6-20、M6-21、およびM6-22）の疑似糖化液（YPD85X35）を用いた微好気条件下での発酵試験結果を示す。本発酵試験中、経時的に培養上清のサンプリングを行い、グルコース、キシロース、キシリトール、グリセロール、酢酸、エタノール含量をHPLCによって測定した。データは3回の実験の平均値である。 変異型CpXI遺伝子ゲノム導入株の微好気条件下における疑似糖化液を用いた発酵試験：変異型CpXI遺伝子発現ユニットを宿主酵母株（SS29株）に導入した株のうちの8種類の株（SS82 [CpXI-T63I]、SS84 [CpXI-K136T, A176T]、 SS85 [CpXI-Y13H, D228V]、SS86 [CpXI-T273A]、SS87 [CpXI-D207G]、SS88 [CpXI-N223I]、SS89 [CpXI-L78S]、およびSS91 [CpXI-E114G]）並びに、野生型CpXI遺伝子発現ユニットをSS29株に導入した株（SS81）の疑似糖化液（YPD85X35）を用いた微好気条件下での発酵試験結果を示す。（図６Ａ，Ｂ）における発酵試験中、経時的に培養上清のサンプリングを行い、グルコース、キシロース、キシリトール、グリセロール、酢酸、エタノール含量をHPLCによって測定した。データは3回の実験の平均値である。 変異型CpXI遺伝子ゲノム導入株の微好気条件下における疑似糖化液を用いた発酵試験：変異型CpXI遺伝子発現ユニットを宿主酵母株（SS29株）に導入した株のうちの3種類の株（SS92 [V162A, N303T]、SS93 [CpXI-R191K, E192K] および SS94 [CpXI-L304S] ）、SS92株が有する変異型CpXI遺伝子に存在する２箇所の変異（V162AおよびN303T）をそれぞれ分離した変異型CpXI遺伝子を導入した株（SS104 [CpXI-V162A]およびSS105 [CpXI-N303T]）、並びにSS82 [CpXI-T63I]とSS104 [CpXI-V162A] がそれぞれ有する変異型CpXI遺伝子に存在する変異（T63IおよびV162A）を集約した変異型CpXI遺伝子を導入した株（SS120 [CpXI-T63I, V162A]）の疑似糖化液（YPD85X35）を用いた微好気条件下での発酵試験結果を示す。 既知の変異型キシロース異性化酵素遺伝子導入株の微好気条件下における疑似糖化液を用いた発酵試験：非特許文献５および１０に示されているRfXIおよびPspXIにおいて、キシロース代謝向上に関わる変異を導入した変異型RfXI遺伝子（RfXI-G179A）の遺伝子発現プラスミドをSS29株に導入した株（SS45）、および変異型PspXI遺伝子（PspXI-E15D、PspXI-T142S、およびPspXI-E15D, T142S）の発現プラスミドを導入した株（それぞれ、SS46、SS48、およびSS51）を作製した。得られたこれらの株の疑似糖化液（YPD85X35）を用いた微好気条件下での発酵試験結果を示す。本発酵試験中、経時的に培養上清のサンプリングを行い、グルコース、キシロース、キシリトール、グリセロール、酢酸、エタノール含量をHPLCによって測定した。データは３回の実験の平均値である。 プラスミドの物理マップ：pAUR101r2-XKS1-HSP12p2は、pAUR101（タカラバイオ）に、XKS1発現ユニット（PGK1プロモーター、XKS1遺伝子、CYC1ターミネーター）、及びHSP12プロモーター、マルチクローニングサイト（MCS）を導入したプラスミドである。 変異型CpXI遺伝子発現株の好気条件下でのキシロース培地における生育：野生型CpXI発現株（T63T）、および変異型CpXI発現株（T63I, T63L, T63G, T63H）のキシロースを炭素源として用いたYPX50培地を用いた好気条件下での生育曲線を示す。データは3回の実験の平均値である。
　本発明は、変異を有するキシロース異性化酵素遺伝子（変異型CpXI遺伝子）を有する微生物あるいはその利用に関する。
　キシロース異性化酵素遺伝子の塩基配列の情報は、National Center for Biotechnology Information（NCBI）などのデータベースを遺伝子名、あるいは、当該遺伝子の塩基配列あるいはそれにコードされるアミノ酸配列をキーとしたBLASTなどによる配列解析によって見いだすことが可能である。本発明において変異を導入する対象のキシロース異性化酵素遺伝子は、Clostridium phytofermentans 由来の遺伝子（CpXI遺伝子ともいう。）であり、当該CpXI遺伝子としては、ゲノム由来であっても、cDNAでもよい。本発明の実施例では、非特許文献４に記載のClostridium phytofermentans ISDg株由来のCpXI（配列番号１１）のコドンを、サッカロマイセス・セレビシエ宿主に最適化（非特許文献１２に記載の最適コドン情報）して人工合成したCpXI遺伝子（配列番号１２）を用いた。使用する宿主としてサッカロマイセス・セレビシエ以外の宿主を用いる場合は、宿主に応じた最適コドン情報により最適化することが好ましい。
　本発明においては、配列番号１２のCpXI遺伝子に分子進化工学の手法を適用して、もとのCpXIと比較してキシロース代謝能が優れた複数の変異型CpXI遺伝子を取得し、その変異箇所のうち、配列番号１１の63位のスレオニン及び162位のバリンに対応する位置に変異を有する変異型CpXI遺伝子が優れていることを見いだし、当該2箇所の変異を集約した二重変異型CpXI遺伝子が特に優れたキシロース代謝能及びエタノール生産能をサッカロマイセス・セレビシエ宿主に対して付与できることを確認している。
　したがって、本発明のClostridium phytofermentans 由来キシロース異性化酵素（CpXI）の変異したタンパク質およびそれをコードする遺伝子は、機能的に同等である限り、開示された上記2箇所のいずれかの変異箇所以外に、さらに1又は数個のアミノ酸あるいは塩基の欠失、置換、付加があってもかまわない。数個のアミノ酸の欠失、置換、付加があるというとき、以下に限定されないが、例えば、２～２０、２２、４４、６６、８８、１３２個のアミノ酸の欠失、置換、付加を含む。また、これらの変異型タンパク質およびそれをコードする遺伝子について、開示される上記変異箇所の少なくとも1箇所が保存されていれば、全体のアミノ酸配列に対して少なくとも70%の同一性、少なくとも80%の同一性、少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%の同一性、少なくとも97%の同一性、少なくとも98%の同一性、又は少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ開示されたキシロースを含む培地における増殖およびキシロースからのエタノール生産を示す遺伝子も本発明に含まれる。さらに、これらの変異タンパク質をコードする遺伝子について、開示される上記アミノ酸変異箇所の少なくとも1箇所に対応するコドン変異が保存されていれば、開示された塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子も本発明に含まれる。ストリンジェントな条件は、当分野で周知であり、配列依存性であるため様々な状況において相違するが、例えば5分間にわたって2×SSCおよび0.5% SDS中で、15分間にわたって2×SSCおよび0.1% SDS中で、30-60分間にわたって37℃で0.1×SSCおよび0.5% SDS中で、次いで30～60分間にわたって68℃で0.1×SSCおよび0.5% SDS中で、ハイブリッドの計算上のTmを12～20℃下回る温度で洗浄する洗浄条件を含む。また、変異については、Error-prone PCR法の他、あらゆる変異導入法を用いて組み込むことが可能である。
　これらの変異型CpXI遺伝子の発現を制御するプロモーターは、HSP12遺伝子由来に限定されない。すなわち、グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(TDH3)など他の遺伝子由来プロモーターを用いることができる。また、ターミネーターもCYC1遺伝子由来に限定されず、他の遺伝子由来ターミネーターを用いることができる。さらに、プロモーター、変異型CpXI遺伝子およびターミネーターは、プラスミドの形態で酵母に導入されても良いし、ゲノムDNAに組み込まれても良い。また、プラスミド、ゲノムへの挿入いずれの場合にもコピー数は問わない。ゲノムDNAに組み込む際には、ゲノム中に部位特異的に導入されても良いし、ランダムに導入されても良い。
　本発明に関わる変異型CpXI遺伝子を導入するための宿主酵母は機能的に同等である限り、ゲノム中に存在する遺伝子が改変されていても、改変されていなくてもかまわないが、キシロースからキシルロースへの代謝において、内在性のキシロース還元酵素（XR）もしくは、キシリトール脱水素酵素（XDH）の逆反応によって生成されるキシリトールによるキシロース異性化酵素（CpXI）の活性阻害の抑制のため、一方もしくは両酵素遺伝子が欠損していることが望ましい。また、キシルロースからキシルロース5リン酸への代謝を強化するため、内在性のキシルロースリン酸化酵素（XK）が過剰発現されていることが望ましい。キシルロースリン酸化酵素遺伝子の発現を制御するプロモーターはPGK1遺伝子由来に限定されず、他の遺伝子由来プロモーターを用いることができる。またターミネーターもCYC1遺伝子由来に限定されず、他の遺伝子由来ターミネーターを用いることができる。キシルロースリン酸化酵素遺伝子の過剰発現には、プロモーター、キシルロースリン酸化酵素遺伝子およびターミネーターがプラスミドの形態で酵母に導入されても良いし、ゲノムDNAに組み込まれても良く、そのコピー数も問わない。さらに、キシルロースリン酸化酵素遺伝子はいかなる生物由来の遺伝子を用いても良い。また、いかなる生物由来の上記以外の他の遺伝子が導入されていてもかまわない。変異型CpXI遺伝子を導入するための宿主酵母の作製、及び変異型CpXI遺伝子の導入においては、組換えベクターの種類、形質転換法を問わない。培養液については、キシロースを含んでいれば、他の炭素源の存在を含め、酵母が生育する限り構成成分に限定されない。
　有用物質を生産する場合、少なくともキシロースを含む培養液を用い、本発明の酵母を用いて生産することができる。この場合、当該酵母は本発明に示した変異型CpXI遺伝子を有する他に、当該有用物質を生産するために適した遺伝子が導入されたり、変異型遺伝子を有していても可能である。有用物質としては特に限定しないが、エタノール、キシルロース、乳酸、酢酸、プロパノール、イソブタノール、ブタノール、コハク酸、グリセロールが含まれる。特にエタノールが有用物質として得られることが望ましい。これらの物質は酵母が元来有している代謝酵素の反応によって酵母内で生産される物質、あるいはこれらを生産するために必要な酵素遺伝子を遺伝子組換え技術によって酵母に導入することによって生産可能となる物質であり、さらには代謝マップを参考に酵素の発現量などを適切に調節することによってより効率的な生産が可能となる。これらの物質を生産するための研究においては、多くは通常のグルコースを炭素源とした培地を用いて当該物質を生産しているが、これら従来の技術に本発明の成果を適用することにより、キシロースを含む炭素源をこれらの有用物質を生産するために用いることが可能となる。すなわち、本発明の成果はバイオエタノールの生産のみならず、さまざまな化成品の原料の生産にも用いることが可能となる。
　本発明の変異型CpXI遺伝子を用いて形質転換する酵母宿主としてはサッカロマイセス属（Saccharomyces）、クルイベロマイセス属（Kluyveromyces）、カンジダ属（Candida）、ピキア属（Pichia）、シゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces）、ハンセヌラ属（Hansenula）などが挙げられる。特にサッカロマイセス属（Saccharomyces）が好ましく、例えばサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス・バヤヌス（Saccharomyces bayanus）、サッカロマイセス・ボウラルディ（Saccharomyces boulardii）などが挙げられる。
　培養方法については、当該酵母がキシロースを含む培養液で生育する限り、形態を問わない。培養液は、木質などの天然物を処理することによって得たキシロースを含む前処理液や糖化液であってもよいし、人工的にキシロース他の物質を調合したものでもよい。天然物を処理して得られた液に化学物質を添加した液でもよい。培養条件は当該酵母が生育し、キシロースを代謝し有用物質を生産する限り、温度、pH、通気条件、攪拌速度、培養時間など限定されない。これらの条件を制御する方法にも限定されない。また、前処理や糖化処理の有無や、糖化処理と同時に発酵をすすめるかという工程についても限定されない。発酵後の有用物質の精製処理も制限されない。有用物質の種類などに応じて適切な方法を用いることができる。
　以下に本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
　本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を準用して行った。
　なお、本明細書中に引用した技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。
（本実施例で用いる培地）
　酵母の増殖培地として用いたYPD培地は、BactoTM 酵母エキス （BD バイオサイエンス、米国）10 g、BactoTM ペプトン（BD バイオサイエンス） 20 g、D-グルコース（以下グルコース、シグマ アルドリッチ、米国）20 gを精製水 1 Lに含む。YPX50培地は、BactoTM 酵母エキス 10 g、BactoTM ペプトン 20 g、D-キシロース（以下キシロース、シグマ アルドリッチ） 50 gを精製水 1 Lに含む。YPX80培地は、BactoTM 酵母エキス 10 g、BactoTM ペプトン 20 g、キシロース 80 gを精製水 1 Lに含む。YPD85X35培地は、BactoTM 酵母エキス 10 g、BactoTM ペプトン 20 g、グルコース 85 g、キシロース 35 gを精製水 1 L に含む。また、平板培地は、上記の組成の培地に、BactoTM アガー（BD バイオサイエンス） 20 gを1 L培地当たりに添加した。
　酵母の遺伝子操作による株の構築には、以下に記載の抗生物質を各濃度になるように上記組成の培地に適宜添加した。Geneticin(R)（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社、米国） 200μg/mL、ZeocinTM（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社） 200μg/mL、ハイグロマイシンB （サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）200μg/mL、オーレオバシジンA（タカラバイオ株式会社） 0.5μg/mL。
　また、大腸菌 DH5α株の液体培養には、DifcoTM LB, Miller 培地（BD バイオサイエンス）、平板培地での培養には DifcoTM LB Agar, Miller 培地（BD バイオサイエンス）を用いた。
　大腸菌 DH5α株を宿主として用いた遺伝子操作では、DifcoTM LB, Miller 培地もしくはDifcoTM LB Agar, Miller 培地にアンピシリン（和光純薬工業株式会社） 100μg/mLを添加した選択培地を用いた。
（本実施例におけるDNA抽出法、PCR法、及び形質転換方法）
　大腸菌からのプラスミド抽出は、QIAprep Spin Miniprep Kit（キアゲン社、ドイツ）を用いて、添付のプロトコルに従い抽出、精製を行った。酵母からのゲノムDNA抽出は、Genとるくん（酵母用）High Recovery （タカラバイオ株式会社）を用いて、添付のプロトコルに従い抽出、精製を行った。
　PCR反応は、KOD -Plus- Neo（東洋紡株式会社）を用いて行い、反応液中には添付のプロトコルに従って、1×PCR buffer for KOD -Plus- Neo、0.2 mM dNTPs、1.5 mM MgSO4、0.3μM primer、Template DNA（1 ng）、KOD -Plus- Neo DNA polymerase （1 U/μL）の組成で調製し （50 μL反応液）、3ステップサイクル（プレ変性 94℃ 2分、変性 98℃ 10秒、アニーリング Tm温度 30秒、伸長反応 68℃ 30秒/kb）で、30サイクルで行った。アニーリング温度は、使用するプライマーのTm温度に従った。また、伸長反応時間は、増幅を目的とする塩基配列の長さに従って調整した。大腸菌を宿主として用いたキシロース異性化酵素遺伝子発現プラスミドの構築は、ECOSTM Competent E. coli DH5α（株式会社ニッポンジーン）を用いて行い、形質転換方法は添付のプロトコルに従って行った。出芽酵母の形質転換は酢酸リチウム法にて行った。
（実施例１）キシロース異性化酵素遺伝子の人工合成
　出芽酵母にキシロース代謝能を付与可能と報告されている8種類のキシロース異性化酵素遺伝子のアミノ酸配列情報（Burkholderia cenocepacia J2315 （BcXI、表１：配列番号１、非特許文献７）、Prevotella ruminicola TC2-24 （PrXI、表１：配列番号３、非特許文献６）、Ruminococcus flavefaciens 17 （RfXI、表１：配列番号：５、非特許文献５）、Orpinomyces sp. ukk1 （OspXI、表１：配列番号７、非特許文献３）、Piromyces sp. strain E2 （PspXI、表１：配列番号９、非特許文献２）、Clostridium phytofermentans ISDg （CpXI、表１：配列番号１１、非特許文献４）、Clostridium cellulolyticum H10 （CcXI、表１：配列番号１３、非特許文献８）、Streptomyces rubiginosus （SrXI、表１：配列番号１５、非特許文献９）を、National Center for Biotechnology Information （NCBI）のデータベースより入手した。
　各キシロース異性化酵素のアミノ酸配列に対し、出芽酵母において高い遺伝子発現量を有する遺伝子群に基づき作成された最適化コドンテーブル （非特許文献１２）を用いて、各キシロース異性化酵素遺伝子に含まれるコドンの最適化を行った。得られた塩基配列はそれぞれ、BcXI遺伝子（配列番号２）、PrXI遺伝子（配列番号４）、RfXI遺伝子（配列番号６）、OspXI遺伝子（配列番号８）、PspXI遺伝子（配列番号１０）、CpXI遺伝子（配列番号１２）、CcXI遺伝子（配列番号１４）、およびSrXI遺伝子（配列番号１６）である。これらの塩基配列に基づき、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社に委託して人工合成を行い、各キシロース異性化酵素遺伝子を得た。
　以下、（表１）「本研究で使用したキシロース異性化酵素遺伝子のアミノ酸配列および塩基配列」として、本研究で使用したキシロース異性化酵素遺伝子について、由来生物名、本研究で付与した遺伝子名、アミノ酸配列、GenBank Accession No.、およびコドン最適化後の塩基配列を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（実施例２）宿主酵母株の作製
　各キシロース異性化酵素のキシロース代謝性能の評価のための宿主として、二倍体エタノール生産実用酵母株IR-2（表４、非特許文献１３）より、一倍体IR-2株を構築した。
　具体的には、以下の手順で行った。まず、単離される一倍体株におけるmating-typeの転換を抑制するため、HO 遺伝子の破壊を行った。pUG6zeo（図１）を鋳型とし、5’-末端にHO遺伝子のプロモーター領域もしくはターミネーター領域と相同な配列を有するプライマーセット（表２：配列番号１７および１８）を用いてPCR反応によって、ゼオシン耐性遺伝子の両端にHO遺伝子のプロモーター領域もしくはターミネーター領域と相同な配列を付加したDNA断片を作製した。次いで、本DNA断片を鋳型として、両端の相同配列をさらに延伸するため、プライマーセット（表２：配列番号１９および２０）を用いてPCR反応によってHO-bleMX6 断片を作製した。本断片を用いて、相同組換えによるIR-2株の形質転換を行い、ゼオシン添加YPD平板培地にて3日間培養を行った。
　得られた形質転換体を、ゼオシン添加YPD培地によって一晩培養後、酵母細胞よりゲノムDNAの抽出を行った。HO遺伝子破壊の確認のため、確認用プライマーセット（表２：配列番号２１および２２）を用いて、形質転換体より得られたゲノムDNAを鋳型としたPCR反応を行い、約1.6 kbのDNA断片を得た。得られた断片の塩基配列解析によって、HO遺伝子が破壊された形質転換体を判別した。得られた形質転換体を胞子形成平板培地（酢酸カリウム 10 g、BactoTM アガー 20 gを精製水1Lに含む）における培養によって胞子形成をさせ、マイクロマニピュレーター（MSM System series 400、シンガー インスツルメンツ社、英国）によって、四分子胞子分離を行った。得られた胞子をYPD平板培地で培養を行い、親株IR-2と同等の性質を示す一倍体2a-3-34A株（表４）を取得した。
　さらに、宿主酵母が有するキシロース還元酵素遺伝子によるキシロースからキシリトールへの触媒反応を抑制するため、キシロース還元酵素遺伝子であるGRE3遺伝子の破壊を行った。pUG6hyg（図１）を鋳型として、5’-末端にGRE3遺伝子のプロモーター領域もしくはターミネーター領域と相同な配列を有するプライマーセット（配列番号：２３および２４）を用いてPCR反応によって、ハイグロマイシン耐性遺伝子の両端にGRE3遺伝子のプロモーター領域もしくはターミネーター領域と相同な配列を付加したDNA断片を作製した後、本DNA断片を鋳型として、両端の相同配列をさらに延伸するため、プライマーセット（表２：配列番号２５および２６）を用いてPCR反応によってGRE3-hphMX6断片を作製した。
　本DNA断片を用いて、相同組換えによる2a-3-34A株の形質転換を行い、ハイグロマイシンB添加YPD平板培地にて3日間の培養を行った。得られた形質転換体を、ハイグロマイシンB添加YPD培地によって一晩培養後、形質転換体細胞よりゲノムDNAの抽出を行った。GRE3遺伝子破壊の確認のため、GRE3破壊確認用プライマーセット（配列番号：２７および２８）を用いて、形質転換体より得られたゲノムDNAを鋳型としたPCR反応を行い、約2 kbのDNA断片を得た。得られた断片の塩基配列解析によって、GRE3遺伝子が破壊された形質転換体を判別し、得られた本形質転換体を以下の実施例で用いる宿主酵母のSS29株（表４）とした。
　以下には、（表２）として、本研究で使用したプライマーの塩基配列を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（実施例３）キシロース異性化酵素遺伝子発現系の構築と酵母株への導入
　実施例２で作製した出芽酵母宿主（SS29株）を用い、各キシロース異性化酵素の発現を試みるため、酵母発現ベクターであるpLTex321sV5H（表３：プラスミド番号３、特許文献２）にサブクローニングを行った。具体的には、以下の手順でサブクローニングを行った。
　実施例１で作製した各キシロース異性化酵素遺伝子をそれぞれに対応するプライマーセット（表２：配列番号２９～４４）を用いてPCRによって増幅を行った。増幅の際に用いたリバースプライマーには、XhoIサイトが導入されており、増幅されたDNA断片約1.3 kbをXhoIにて切断処理を行った。同時に、SmaI および XhoI によって切断した酵母発現ベクターpLTex321sV5H断片（約7.4 kb）と、各キシロース異性化酵素をコードする増幅DNA断片を、TaKaRa Ligation Kit Mighty Mix（タカラバイオ株式会社）を用いて、添付のプロトコルに従ってライゲーション反応を行った。反応終了後、各ライゲーション反応液を用いて、大腸菌DH5αの形質転換を行い、アンピシリン添加LB平板培地にて一晩培養を行った。得られた形質転換体を、アンピシリン添加LB培地によって一晩培養後、プラスミドを抽出し、制限酵素切断パターンおよび塩基配列解析によって目的のプラスミドを保有した形質転換体を判別した。
　得られた各キシロース異性化酵素遺伝子を含むプラスミドを、SpeI および KpnI によって切断し、HSP12 プロモーター、各キシロース異性化酵素遺伝子、CYC1 ターミネーターからなる約 2.2 kbの断片を得て、同様に、SpeI および KpnI によって切断した酵母発現ベクター pUG35-kan-PTDH3（図１、表３：プラスミド番号４）断片（約4.6 kb）とライゲーション反応を行った。ライゲーション反応終了後、各ライゲーション反応液を用いて、大腸菌DH5αの形質転換を行い、アンピシリン添加LB平板培地にて一晩培養を行った。得られた形質転換体を、アンピシリン添加LB培地によって一晩培養後、プラスミドを抽出し、制限酵素切断パターンおよび塩基配列解析によって目的のプラスミドを保有した形質転換体を判別した。得られた形質転換体よりプラスミド抽出を行い、各キシロース異性化酵素遺伝子発現ユニットを含む発現プラスミドをそれぞれ得た。
　さらに、キシルロースからキシルロース 5-リン酸への反応を触媒するキシルロースリン酸化酵素遺伝子（XKS1）の過剰発現のため、上記の各発現プラスミドへのXKS1遺伝子発現ユニットの導入を行った。その際の導入方法については、以下のとおり。XKS1遺伝子発現ユニットを含むプラスミドである pAUR-XRXDHXK（表３：プラスミド番号５）を鋳型として用いて、PGK1プロモーター、XKS1遺伝子、CYC1ターミネーターからなるXKS1過剰発現ユニットを含むDNA断片を増幅するため、XKS1過剰発現ユニット用プライマーセット（表２：配列番号４５および４６）を用いてPCRによって増幅を行った。増幅されたDNA断片約2.9 kbと、KpnIによって切断した上記の発現プラスミド断片を、In-Fusion（R） HD Cloning Kit（タカラバイオ株式会社）を用いて、添付のプロトコルに則ってIn-Fusion反応を行った。反応終了後、In-Fusion反応液を用いて、大腸菌DH5α株の形質転換を行い、アンピシリン添加LB平板培地にて一晩培養を行った。得られた形質転換体を、アンピシリン添加LB培地によって一晩培養後、プラスミドを抽出し、制限酵素切断パターンおよび塩基配列解析によって目的のプラスミドを保有した形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミド抽出を行い、各キシロース異性化酵素遺伝子発現ユニットおよびキシルロキナーゼ遺伝子発現ユニットを含むプラスミド（表３：プラスミド番号７～１４）を得た。同様の方法で、いずれのXIも含まない発現ユニットだけのプラスミドを作製した（表３：プラスミド番号６）。
　得られたプラスミドを用いて、SS29株の形質転換を行った。SS29株の形質転換は、酢酸リチウム法によって行い、Geneticin（R）添加YPD平板培地によって3日間培養を行うことで、各キシロース異性化酵素遺伝子発現ユニットおよびキシルロキナーゼ遺伝子発現ユニットを含むプラスミドを保有するSS29株形質転換体を得た。得られた形質転換体は、それぞれ、SS36～SS44株（表４：株番号４～１２）と命名した。
　以下に、（表３）として、本研究で使用したプラスミドを、（表４）として、本研究で使用した酵母株の遺伝子型を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（実施例４）好気条件下での生育試験
　酵母株に導入されたキシロース異性化酵素によるキシロース代謝能の評価のため、YPX50培地における生育試験を行った。各形質転換体SS36～SS44株をGeneticin（R）添加YPD培地にて定常期まで前培養を行い、本培養液を遠心分離によって各形質転換体細胞を集菌し、滅菌水によって細胞を洗浄した。96穴透明プレートの各ウェルに100 μLのYPX50培地を分注し、OD600 ＝0.1となるように洗浄した形質転換体細胞を植菌した。各形質転換体のYPX50培地における生育は、マイクロプレートリーダー（Infinite（R） 200 PRO 、テカン社、スイス）を用いて、30℃で振盪培養を行うとともに、経時的に吸光度測定（OD600）を４日間行った。得られたOD値を1 cm光路での吸光度に変換し、各形質転換体の生育曲線を得た。本結果を図２と表５に示す。本結果から、OspXI遺伝子を含むSS40株が最も速い生育速度を示し、次いで、CpXI遺伝子を含むSS42株が同程度の生育速度を示した。一方、BcXI遺伝子、CcXI遺伝子およびSrXI遺伝子を含むそれぞれの株は高濃度キシロース培地では生育しなかった。
　以下に、（表５）「好気条件下での各種キシロース異性化酵素発現株の生育速度」として、8種類のキシロース異性化酵素遺伝子を導入した株（SS37～SS44）および発現ベクターのみを導入した酵母株（SS36）のキシロースを単一の炭素源として用いたYPX50培地を用いた好気条件下での指数増殖期における生育速度を示す。なお、データは3回の実験の平均値および標準偏差である。また、n.d.は、生育できなかったことを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
（実施例５）微好気条件下での発酵試験
　各形質転換酵母株（SS36～SS44株）を、5 mLのYPD培地（14 mL 試験管）に植菌し、30℃、150 rpm で1日間振盪培養を行った（前々培養）。前々培養液全量を50 mLのYPD培地（100 mLバッフル付きフラスコ）に植菌し、2日間振盪培養（30℃、 135 rpm）行った（前培養）。前培養液の濁度は、何れの株も約OD600 ＝20であった。前培養液全量を用いて、遠心分離（3,000 rpm、 5分、4℃）によって酵母細胞を集菌し、10 mLの疑似糖化液（YPD85X35培地：glucose 85 g/L, xylose 35 g/L, yeast extract 10 g/L, peptone 20 g/L）に再懸濁後、再度、遠心分離によって集菌した。疑似糖化液での細胞洗浄後、全量が10 mLとなるように、再度、疑似糖化液に酵母細胞を懸濁した。100 mL フラスコに 60 mLの疑似糖化液を加え、10 mLの細胞懸濁液を植菌した（全量 70 mL）。発酵時における微好気条件を維持するため、発酵中に発生する二酸化炭素の排気のための注射針と培養液のサンプリング用の注射針を刺したシリコン栓にてフラスコを閉栓した。サンプリング用注射針には、三方活栓を連結し、サンプリング時以外は閉栓するようにした。本フラスコを、30℃、135 rpmで72時間の振盪培養を行った。培養開始後、0、1、3、6、12、24、36、48、60、72時間に、2.5 mLシリンジを用いて、サンプリング用注射針より500 μLの培養液を経時的にサンプリングした。
　採取した培養液は、15,000 rpm、 5分、4℃にて遠心分離を行い、その上澄み 400 μLを-80℃にて凍結保存した。
（実施例６）各形質転換酵母株の培養液中の糖、アルコールのHPLCによる定量
　サンプリングした培養液中のグルコース、キシロース、キシリトール、グリセロール、酢酸およびエタノールの高速液体クロマトグラフィー（HPLC）による定量のため、以下の方法で測定を行った。測定には、Aminex HPX-87Cカラム（バイオラッド株式会社）および Cation H Refill Guard カラム（バイオラッド株式会社）を装備したHPLC LC-2000Plusシリーズ（日本分光株式会社）を用いて、5 mM H2SO4を移動相として、流速 0.6 mL/分、65℃の条件で分離を行った。なお、カラムによって分離された物質の検出には、示差屈折計（日本分光株式会社）を用いた。サンプリングした培養液を蒸留水にて5倍希釈したサンプル 25 μLを、本HPLC装置にて上記の条件で分析を行った。また、定量のための標準曲線作成のため、グルコース、キシロース、キシリトール、グリセロール、酢酸およびエタノールを、それぞれ2%（w/v）の濃度で混合した標準物質溶液と、本溶液を、1%、0.1%、0.01%となるように段階希釈した溶液を用いて、本HPLC装置で測定を行うことで、定量のための標準曲線を作成し、培養液サンプル中に含まれる各物質の濃度を定量した。各形質転換酵母株（SS36～SS44）に対する上記の条件での発酵試験の結果、SS42株（表４：株番号１０）が、最も高いキシロース代謝能を有していることが明らかとなった（図３）。
　このことは、CpXI遺伝子が宿主酵母株に最も高いキシロース代謝能を付与可能であることを示している。
（実施例７）既知の変異型キシロース異性化酵素遺伝子導入株の構築と発酵性能評価
（７－１）既知の変異型キシロース異性化酵素遺伝子導入株の構築
　非特許文献５及び１０に示される、キシロース代謝能が向上した変異型キシロース異性化酵素遺伝子を導入した株を作製し、その発酵性能の評価を行った。
　変異型RfXI（G179A）遺伝子発現プラスミドは、野生型RfXI発現プラスミドpUG35-kan-HSP12p-RfXI-CYC1t-PGK1p-XKS1-CYC1t（表３：プラスミド番号９）を鋳型として、プライマーセット（表２：RfXI(Opt)(G179A)［配列番号５７］およびRfXI(Opt)(G179A)as［配列番号５８］）を用いたInverse PCR法によって作製した。反応液の組成は、添付のプロトコルに則って以下のとおり調製した。PCRグレード脱イオン水 13.4 μL、10×PCR Buffer for KOD -Plus- Neo 2 μL、2 mM dNTP Mix 2 μL、25 mM MgSO4 1.2 μL、10 μM プライマーセット 0.6 μL、1 ng/μL 鋳型DNA 0.4 μL、および 1 U/μL KOD -Plus- Neo DNA Polymerase 0.4 μLで構成され、反応サイクルを、プレ変性 94℃2分の後、変性 98℃ 10秒、アニーリング 58℃ 30秒、伸長反応 68℃ 5分を10サイクル、最終伸長反応 68℃5分で行った。得られたPCR産物にDpnI 1.2 μLを加え、37℃で2時間処理した。得られた直鎖状ベクター断片の平滑末端ライゲーションを行った。ライゲーション反応は、T4 DNA Ligase（タカラバイオ株式会社）を用いて行い、反応液の組成は、添付のプロトコルに則って以下のとおり調製した。Distilled water 14 μL、10 ×Ligation Buffer 2 μL、T4 DNA ligase 1 μL、T4 Polynucleotide Kinase 1 μL、直鎖状DNA 2 μLで構成され、室温で1時間反応させた。本反応液を用いて、大腸菌DH5αの形質転換を行い、アンピシリン添加LB平板培地にて一晩培養を行った。得られた形質転換体から複数選別し、それぞれアンピシリン添加LB培地によって一晩培養後、プラスミドを抽出し、塩基配列解析によって目的の変異を有したプラスミドpUG35-kan-HSP12p-RfXI(G179A)-CYC1t-PGK1p-XKS1-CYC1t（表３：プラスミド番号１５）を得た。
　変異型PspXI（E15D）遺伝子発現プラスミドは、野生型PspXI発現プラスミドpUG35-kan-HSP12p-PspXI-CYC1t-PGK1p-XKS1-CYC1t（表３：プラスミド番号１１）を鋳型として、プライマーセット（PspXI(Opt)(E15D) ［配列番号５９］およびPspXI(Opt)(E15D)as ［配列番号６０］）を用いて、同様に構築を行い、目的の変異を有したプラスミドpUG35-kan-HSP12p-PspXI(E15D)-CYC1t-PGK1p-XKS1-CYC1t（表３：プラスミド番号１６）を得た。
変異型PspXI（T142S）遺伝子発現プラスミドは、野生型PspXI発現プラスミドpUG35-kan-HSP12p-PspXI-CYC1t-PGK1p-XKS1-CYC1t（表３：プラスミド番号１１）を鋳型として、プライマーセット（PspXI(Opt)(T142S)［配列番号６１］およびPspXI(Opt)(T142S)as［配列番号６２］）を用いて、同様に構築を行い、目的の変異を有したプラスミドpUG35-kan-HSP12p-PspXI(T142S)-CYC1t-PGK1p-XKS1-CYC1t（表３：プラスミド番号１７）を得た。
変異型PspXI（E15D, T142S）遺伝子発現プラスミドは、pUG35-kan-HSP12p-PspXI(E15D)-CYC1t-PGK1p-XKS1-CYC1t（表３：プラスミド番号１６）を鋳型として、プライマーセット（PspXI(Opt)(T142S)［配列番号６１］およびPspXI(Opt)(T142S)as［配列番号６２］）を用いて、同様に構築を行い、目的の変異を有したプラスミドpUG35-kan-HSP12p-PspXI(E15D, T142S)-CYC1t-PGK1p-XKS1-CYC1t（表３：プラスミド番号１８）を得た。
（７－２）キシロース代謝能の評価
　構築したRfXI（G179A）遺伝子発現プラスミド（表３：プラスミド番号１５）、PspXI（E15D）遺伝子発現プラスミド（表３：プラスミド番号１６）、PspXI（T142S）遺伝子発現プラスミド（表３：プラスミド番号１７）、およびPspXI（E15D, T142S）遺伝子発現プラスミド（表３：プラスミド番号１８）をそれぞれ用いて、SS29株を形質転換し、SS45（表４：株番号１３）、SS46（表４：株番号１４）、SS48（表４：株番号１５）、およびSS51（表４：株番号１６）株を得た。これらの株のキシロース代謝能の評価のため、（実施例５）で用いたのと同様のYPD85X35擬似糖化液を用いた微好気条件での発酵試験を行った。（実施例５）と同様に経時的に培養液のサンプリングを行い、HPLCによる培養液中のグルコース、キシロース、キシリトール、グリセロール、酢酸、エタノールの定量を行った。その結果を図７に示す。変異型RfXI遺伝子発現株SS45株と野生型RfXI遺伝子発現株SS39株（図３）との発酵試験結果の比較、および変異型PspXI遺伝子発現株SS46, SS48, SS51株と野生型PspXI遺伝子発現株SS41株（図３）との発酵試験結果の比較において、変異導入による顕著なキシロース代謝能の向上は観察されなかった。本結果からも、CpXI遺伝子が宿主酵母株に最も高いキシロース代謝能を付与可能であることを示している。
（実施例８）変異導入PCRによる変異型CpXIライブラリーの作製
　（実施例６）の発酵試験結果から宿主酵母株に最も高いキシロース代謝能を付与可能であることが示されたCpXI遺伝子に対して、分子進化工学的手法によりさらなる改良を加えるため、変異型CpXIライブラリーをランダム変異導入PCR法によって作製した。
　具体的な手順は以下のとおりである。
　鋳型としては、CpXI遺伝子が導入された発現プラスミド（pUG35-kan-HSP12p-CpXI-CYC1t-PGK1p-XKS1-CYCt、表３：プラスミド番号１２）を用い、CpXI遺伝子の5’-末端から約1 kbの範囲の変異導入部位の両端に相同性を有するプライマーセット（表２：oSS62 XI-F_HSP12s［配列番号４７］およびoSS74 XI-Rc［配列番号４８］）を用いてDiversify PCR Random Mutagenesis Kit（タカラバイオ株式会社）によりランダム変異導入PCRを行った。ランダム変異導入PCRの条件は、添付のプロトコルに則って、1 kbあたり2.7カ所の変異が導入される条件を設定した。ランダム変異導入PCR反応液の組成は、PCRグレード脱イオン水 38μL、10×TITANIUM Taq バッファー 5 μL、8 mM MnSO4 2 μL、2 mM dGTP 1 μL、50× Diversify dNTP Mix 1 μL、0.02 mM プライマーセット 1 μL、1 ng/μL 鋳型DNA 1μL、および TITANIUM Taq Polymerase 1μLで構成され、反応サイクルを、プレ変性 94℃ 30秒の後、変性 94℃ 30秒、伸長反応 68℃ 1分を25サイクル、最終伸長反応 68℃ 1分で行った。
　一方、直鎖状ベクター断片については以下の方法で行った。pUG35-kan-HSP12p-CpXI-CYC1t-PGK1p-XKS1-CYC1tを鋳型として、プライマーセット（表２：oSS63 XI-R_HSP12as［配列番号４９］およびoSS83 06_CpXI-Fc［配列番号５０］）およびKOD -Plus- Neo（東洋紡株式会社）を用いた Inverse PCR法によって作製した。
　反応液の組成は、添付のプロトコルに則って以下のとおり調製した。PCRグレード脱イオン水 33.5 μL、10×PCR Buffer for KOD -Plus- Neo 5 μL、2 mM dNTP Mix 5 μL、25 mM MgSO4 3 μL、10 μM プライマーセット 1.5 μL、1 ng/μL 鋳型DNA 1 μL、および 1 U/μL KOD -Plus- Neo DNA Polymerase 1 μLで構成され、反応サイクルを、プレ変性 94℃ 2分の後、変性 98℃ 10秒、アニーリング 58℃ 30秒、伸長反応 68℃ 4分を25サイクル、最終伸長反応 68℃ 5分で行った。得られた変異CpXI遺伝子断片および直鎖状ベクター断片を、In-Fusion（R） HD Cloning Kitを用いて、添付のプロトコルに則って In-Fusion反応を行った。本反応液を用いて、大腸菌DH5α株（Giga Competent Cell (DH5α)、株式会社バイオダイナミクス研究所）の形質転換を行い、1×104以上のDH5α形質転換体からなる変異型CpXIライブラリーを構築した。変異導入頻度の確認のため、幾つかのDH5α形質転換体からプラスミドを調製し、CpXI遺伝子の塩基配列解析を行った結果、少なくとも90%以上のプラスミドのCpXI遺伝子に、平均2カ所の変異が導入されたことを確認した。またそれらは独立的に、かつ全体に変異が導入されていたことから、極めて質の高いライブラリーであると判断した。
（実施例９）キシロース代謝能が向上した変異型CpXI遺伝子のスクリーニング
　（実施例８）で構築した変異型CpXIライブラリーより、キシロース代謝能が向上した変異型CpXI遺伝子のスクリーニングを行うため、その条件検討を行った。野生型CpXI遺伝子発現プラスミド（pUG35-kan-HSP12p-CpXI-CYC1t-PGK1p-XKS1-CYC1t、表３：プラスミド番号１２）を導入した酵母株SS42を用いて、キシロース濃度を 50 g/L から 90 g/L まで変更したYPX平板培地（発現プラスミドの保持のため、Geneticin（R）を添加）を用いて、SS42株の生育試験を行った。5 mL YPD培地にSS42株を植菌し、30℃で振盪培養（150 rpm）を行った。培養液より集菌し、滅菌水で細胞を洗浄した後、OD600 ＝ 1.0×10-4になるように、滅菌水に再度懸濁した。キシロース濃度を、50 g/L、60 g/L、70 g/L、80 g/L、90 g/Lの濃度で含むYPX平板培地（それぞれ、YPX50、YPX60、YPX70、YPX80、YPX90）に、本菌体液 50 μLを植菌し、30℃で4日間培養を行った。その結果、YPX50、YPX60およびYPX70平板培地では、SS42株はコロニー形成が観察されたが、80 g/L以上のキシロースを含むYPX80およびYPX90平板培地上ではコロニー形成が観察されなかった。
　本結果を踏まえ、SS29株を宿主とした変異型CpXI遺伝子ライブラリーから、キシロース代謝能が向上した変異型CpXI遺伝子をスクリーニングするためには、80 g/L以上の高濃度キシロースを含む培地で選抜を行うこととした。
　大腸菌DH5αにおいて構築した変異型CpXIライブラリーより、変異型CpXI遺伝子を含む発現プラスミドの抽出を行い、得られたプラスミドを用いて、SS29株の形質転換を行った。得られたSS29株形質転換体（約2.4 ×105 コロニー）をGeneticin（R）添加YPX80平板培地に植菌し、30℃、4日間培養を行った。YPX80平板培地を用いたスクリーニングの結果、YPX80平板培地においてもコロニーを形成でき、生育が可能となった24株が得られた。
（実施例１０）キシロース代謝能が向上した変異型CpXI遺伝子のセカンドスクリーニング　（実施例９）の高濃度キシロース培地（YPX80平板培地）でのスクリーニングで得られた24個のコロニーには、CpXIにおける変異によってキシロース代謝能が向上したSS29形質転換株だけでなく、自然突然変異によってそのゲノムDNAに変異が生じることで、高濃度キシロース培地においても生育が可能となった擬陽性株も含まれていることが考えられた。そのため、得られた24個のコロニーに由来するSS29株形質転換体から、Easy Yeast Plasmid Isolation Kit（タカラバイオ株式会社）を用いて、添付のプロトコルに則り、変異型CpXI発現プラスミドの抽出を行った。得られた各発現プラスミドを用いて、大腸菌DH5α（ECOSTM Competent E. coli DH5α）を形質転換し、各発現プラスミドの増幅を行った。複数の大腸菌コロニーから得られたプラスミドから、プライマー（表２：06_CpXIopt_F1［配列番号３９］、06_CpXIopt_R1［配列番号４０］、06_CpXIopt_Seq_F1［配列番号５１］、および06_CpXIopt_Seq_R1［配列番号５２］）を用いて、それぞれCpXI遺伝子領域の塩基配列解析を行った結果、18株の変異型CpXI遺伝子にはアミノ酸置換を伴う変異を有していた。
　次に、得られた各変異型CpXI発現プラスミドを用いて、再度、SS29株の形質転換を行った。得られたSS29形質転換体を、再度、YPX80平板培地に植菌しその生育を確認した結果、11株のSS29形質転換体においてYPX80平板培地における生育を確認した。これらの11株が有する変異型CpXI酵素におけるアミノ酸変異について、下記（表６）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
（実施例１１）変異型CpXI遺伝子を発現させたSS29形質転換株のサードスクリーニング
　（実施例１０）のセカンドスクリーニングによって得られた11個のSS29形質転換株については、そのキシロース代謝能の向上が、変異導入されたCpXI遺伝子に由来することが確認された。
　さらに、その有効性を確認するため、前述の96穴マイクロプレートを用いた方法で好気条件下でのYPX80液体培地での生育試験を行った。その結果、11株全ての単離した形質転換体において野生型CpXIを発現させたSS42株よりも速い生育が観察された。その結果を図４および表７に示す。また、疑似糖化液（YPD85X35培地）を用いた発酵試験を、前述の方法で行った結果、得られた11株は、何れも本発酵試験条件下において、野生型CpXIを発現させたSS42株よりも高いキシロース代謝能を有していることが明らかとなった（図５）。
　以下に、（表７）「変異型CpXI酵素遺伝子導入株の好気条件下でのキシロース培地における生育速度」として、変異型CpXI遺伝子ライブラリーのスクリーニングによって得られた11株のキシロースを単一の炭素源として用いたYPX80培地を用いた指数増殖期における好気条件下での生育速度（Specific growth rate）および、野生型CpXI遺伝子を導入した株（SS42）に対する相対生育速度（Relative growth rate）を示す。なお、データは3回の実験の平均値である。また、生育速度についてはその標準偏差を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
（実施例１２）変異型CpXI遺伝子のゲノムへの導入
　（実施例９）のスクリーニングでは、酵母細胞内において低コピーで保持される発現ベクターを利用したが、酵母細胞内での変異型CpXI発現プラスミドのコピー数の影響が、宿主酵母細胞のキシロース代謝能の向上に寄与している可能性が考えられた。そのため、選抜した11種類の変異型CpXI遺伝子発現ユニットを宿主酵母株ゲノムへ導入した株の構築と発酵性能の評価を行った。11種類の変異型CpXI遺伝子発現プラスミドを、SpeIおよびSphIによって切断し、HSP12p-CpXI含む断片（約2 kb）を得た。一方、酵母ゲノム導入型ベクターであるpAUR101（タカラバイオ株式会社）にXKS1遺伝子発現ユニットおよび野生型CpXI遺伝子を導入したベクターであるpAUR101r2-XKS1-06_CpXIopt（図１）を、同様にSpeIおよびSphIによって切断し、約8.3 kbのベクター断片を得た。両DNA断片を、TaKaRa DNA Ligation Kit Mighty Mix（タカラバイオ株式会社）を用いて、添付のプロトコルに則って、ライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液を用いて、大腸菌DH5α株（ECOSTM Competent E. coli DH5α、ニッポンジーン株式会社）の形質転換を行い、アンピシリン添加LB平板培地に植菌し、37℃で一晩培養することで形質転換株を得た。得られた形質転換株を、アンピシリン添加LB培地によって一晩培養後、プラスミドを抽出し、制限酵素切断パターンおよび塩基配列解析によって目的のプラスミドを保有した形質転換体を判別した。得られた11種類の変異型CpXI遺伝子発現プラスミド（表３：プラスミド番号２０～３０）をBsiWIによって切断し、本DNA断片を用いて、SS29株の形質転換を行った。形質転換反応液をオーレオバシジンA添加YPD平板培地に塗布し、30℃、3日間静置培養した。本操作によって、各変異型CpXI発現ユニットが、宿主SS29株のAUR1遺伝子座に導入された酵母株（SS82、SS84、SS85、SS86、SS87、SS88、SS89、SS91、SS92、SS93、およびSS94［表４：株番号１８～２８］）を得た。また、コントロールとして、野生型CpXI発現プラスミド（pAUR-kanMX6-HSP12p-CpXI-CYC1t-PGK1p-XKS1-CYC1t［表３：プラスミド番号１９］）を同様に作製し、SS29株の形質転換を行った。得られたコントロール株をSS81株（表４：株番号１７）とした。
（実施例１３）疑似糖化液における微好気条件での発酵試験
　（実施例１２）で作製した12種類のSS29形質転換株（SS81、SS82、SS84、SS85、SS86、SS87、SS88、SS89、SS91、SS92、SS93、およびSS94）のキシロース代謝能の評価のため、（実施例５）で用いたのと同様のYPD85X35疑似糖化液を用いた微好気条件での発酵試験を行った。（実施例５）と同様に、経時的に培養液のサンプリングを行い、HPLCによる培養液中のグルコース、キシロース、キシリトール、グリセロール、酢酸、エタノールの定量を行った。その結果を図６に示す。本発酵試験の結果、野生型CpXIを発現させたSS81株よりも、有意に優れたキシロース代謝能を示した2株（SS82株およびSS92株）を選抜した。
（実施例１４）キシロース異性化酵素の活性測定
　（実施例１３）で選抜された2株の変異型CpXI発現株について、微好気条件での発酵条件における酵母細胞内で発現されたキシロース異性化酵素の活性を以下の方法で測定した。YPD85X35培地での微好気条件における発酵試験開始後、24時間後の培養液をサンプリングし、遠心分離によって、酵母細胞を集菌した。酵母細胞は、酵母破砕溶液である CelLyticTM Y Cell Lysis Reagent（シグマアルドリッチジャパン株式会社）およびProtease Inhibitor Cocktail for use with fungal and yeast extracts（シグマアルドリッチジャパン株式会社）に懸濁し、0.5 mm ジルコニアビーズを用いて、細胞破砕を行った。細胞破砕操作後、遠心分離によってジルコニアビーズおよび細胞不溶物を除去した上清を得た。本細胞破砕溶液のタンパク質濃度測定のため、PierceTM 660 nm Protein Assay Reagent（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を用いて、添付のプロトコルに従って、タンパク質濃度の定量を行った。細胞破砕溶液中のキシロース異性化酵素活性は、以下の方法で測定した。100 μLの反応液中の組成は、以下のとおりである。100 mM Tris-HCL buffer （pH8.0）、 10 mM MgCl2、 0.3 mM β-NADH（オリエンタル酵母工業株式会社）、2 U Sorbitol dehydrogenase（シグマアルドリッチジャパン株式会社）、1 mg/ml 各細胞破砕液、各種濃度のキシロース（10、50、100、もしくは 500 mM）を含むように調製した。反応は、前述のキシロース溶液の添加によって開始し、Infinite（Ｒ） 200 PROマイクロプレートリーダーを用いて、30℃にて340 nmの吸光度の変化を経時的に測定した。NADHの340 nmの分子吸光係数を6.25 mM-1 cm-1として、比活性を計算した。活性測定の結果を、下記（表８）に示す。その結果、野生型CpXI発現株と比較して、変異型CpXI発現株では高いキシロース異性化酵素活性が観察された。これらの結果は、各変異型CpXI発現株の微好気条件での発酵試験結果と一致した。特に、CpXI-T63Iは、野生型と比較して38%高い代謝活性（Vmax）を示し、そのKm値は 29.2 mMだった。また、CpXI-V162A, N303Tは、Vmax値は野生型と同等であったが、Km値は 28.4 mMと変異型CpXIのうち、最も低い値を示した。
　以下に、（表８）「変異型CpXI酵素の反応速度論的パラメーター」を示す。なお、表中、野生型CpXI遺伝子ゲノム導入株（SS81）、および変異型CpXI遺伝子ゲノム導入株（SS82、SS92、SS104、SS105、およびSS120）の微好気条件下での発酵試験において、培養開始後24時間の細胞破砕溶液中のキシロース異性化酵素活性における、Vmax値およびKm値を示した。データは3回の実験の平均値である。また、Vmax値については、その標準偏差を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
（実施例１５）部位特異的変異導入によるCpXIの改変
　（実施例１４）で検討した変異CpXI遺伝子中のCpXI-V162A, N303Tにおける2箇所の変異のそれぞれの変異におけるキシロース代謝能の向上への寄与について検討するため、両変異を分離したCpXI-V162AおよびCpXI-N303Tを部位特異的変異導入法によって作製した。具体的な部位特異的変異導入方法については、以下のとおり行った。
　野生型CpXI発現プラスミドpAUR-kanMX6-HSP12p-CpXI-CYC1t-PGK1p-XKS1-CYC1t（表３：プラスミド番号１９）を鋳型として、プライマーセット（表２：oSS106 06_CpXI_V162A［配列番号５３］およびoSS107 06_CpXI_V162Aas［配列番号５４］）を用いたInverse PCR法によって作製した。反応液の組成は、添付のプロトコルに則って以下のとおり調製した。PCRグレード脱イオン水 13.4 μL、10×PCR Buffer for KOD -Plus- Neo 2 μL、2 mM dNTP Mix 2 μL、25 mM MgSO4 1.2 μL、10 μM プライマーセット 0.6 μL、1 ng/μL 鋳型DNA 0.4 μL、および 1 U/μL KOD -Plus- Neo DNA Polymerase 0.4 μLで構成され、反応サイクルを、プレ変性 94℃2分の後、変性 98℃ 10秒、アニーリング 58℃ 30秒、伸長反応 68℃ 5分を10サイクル、最終伸長反応 68℃5分で行った。得られたPCR産物にDpnI 1.2 μLを加え、37℃で2時間処理した。得られた直鎖状ベクター断片の平滑末端ライゲーションを行った。ライゲーション反応は、T4 DNA Ligase（タカラバイオ株式会社）を用いて行い、反応液の組成は、添付のプロトコルに則って以下のとおり調製した。Distilled water 14 μL、10 ×Ligation Buffer 2 μL、T4 DNA ligase 1 μL、T4 Polynucleotide Kinase 1 μL、直鎖状DNA 2 μLで構成され、室温で1時間反応させた。本反応液を用いて、大腸菌DH5αの形質転換を行い、アンピシリン添加LB平板培地にて一晩培養を行った。得られた形質転換体から複数選別し、それぞれアンピシリン添加LB培地によって一晩培養後、プラスミドを抽出し、塩基配列解析によって目的の変異を有したプラスミド（表３：プラスミド番号３１）を得た。CpXI-N303T発現プラスミドについても、プライマーセット（oSS108 06_CpXI_N303T［配列番号５５］およびoSS109 06_CpXI_N303Tas［配列番号５６］）を用いて、同様に構築を行い、目的の変異を有したプラスミド（表３：プラスミド番号３２）を得た。
　作製した変異型CpXI-V162A遺伝子発現プラスミド（表３：プラスミド番号３１）およびCpXI-N303T遺伝子発現プラスミド（表３：プラスミド番号３２）を、BsiWIによって切断し、SS29株を形質転換した。得られた株をそれぞれ、SS104株（表４：株番号２９）およびSS105株（表４：株番号３０）とした。前述と同一条件にて、疑似糖化液（YPD85X35培地）を用いた微好気条件での発酵試験を行い、培養開始後、24時間後の両株の細胞内におけるキシロース異性化酵素の活性測定を行った。
　その結果、両変異型CpXIはそれぞれ、29.5 mMおよび19.1 mMと野生型CpXIよりも低いKm値を示したが、CpXI（N303T）のVmax値は、0.03 μmol/mg protein/minと野生型CpXI（0.66 μmol/mg protein/min）よりも低い値であった（表８）。
　さらに、本発酵試験の結果、CpXI-V162Aを発現させたSS104株は、野生型CpXIを発現させたSS81株と比較して高いキシロース代謝能を示したが、CpXI-N303Tを発現させたSS105株はSS81株よりもキシロース代謝能が低下した（図５および表９）。以上の結果から、V162A変異は、CpXIのキシロース代謝能の向上に有効であることが確認された。
　以下に、（表９）として、「CpXI遺伝子導入株の微好気条件下での擬似糖化液を用いた発酵試験結果」を示す。
　なお、表中、発現ベクターのみ導入した株（SS36）、野生型CpXI遺伝子ゲノム導入株（SS81）、および変異型CpXI遺伝子ゲノム導入株（SS82、SS92、SS120）の疑似糖化液（YPD85X35）を用いた微好気条件下での発酵試験結果である。本表では、発酵試験開始後、72時間後の培養上清中のグルコース、キシロース、キシリトール、グリセロール、酢酸、エタノール含量を示した。また、投入した糖（グルコースおよびキシロース）から得られるエタノール量に対する、生成エタノールの収率（%理論収率）を示した。データは３回の実験の平均値およびその標準偏差である。また、n.d.は、HPLCによる定量において検出限界以下であることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
（実施例１６）CpXI二重変異体の作製とその評価
（１６－１）CpXI二重変異体の作製
　CpXIのキシロース代謝能の向上に有効であることが示された2種類の変異について、両変異を導入した変異型CpXI（T63I, V162A）を部位特異的変異導入方法によって作製した。具体的な作製方法は以下のとおりである。
　変異型CpXIpAUR-kanMX6-HSP12p-CpXI(T63I)-CYC1t-PGK1p-XKS1-CYC1t（表３：プラスミド番号２０）を鋳型として、プライマーセット（表２：oSS106 06_CpXI_V162A［配列番号５３］およびoSS107 06_CpXI_V162Aas［配列番号５４］）を用いたInverse PCR法によって作製した。反応液の組成は、添付のプロトコルに則って以下のとおり調製した。PCRグレード脱イオン水 13.4 μL、10×PCR Buffer for KOD -Plus- Neo 2 μL、2 mM dNTP Mix 2 μL、25 mM MgSO4 1.2μL、10 μM プライマーセット 0.6μL、1 ng/μL 鋳型DNA 0.4 μL、および 1 U/μL KOD -Plus- Neo DNA Polymerase 0.4 μLで構成され、反応サイクルを、プレ変性 94℃ 2分の後、変性 98℃ 10秒、アニーリング 58℃ 30秒、伸長反応 68℃ 5分を10サイクル、最終伸長反応 68℃ 5分で行った。得られたPCR産物にDpnI 1.2 μLを加え、37℃で2時間処理した。得られた直鎖状ベクター断片は、T4 DNA Ligase（タカラバイオ株式会社）を用いて、平滑末端ライゲーション反応を行った。反応液の組成は、添付のプロトコルに則って以下のとおり調製した。Distilled water 14 μL、10 × Ligation Buffer 2 μL、T4 DNA ligase 1 μL、T4 Polynucleotide Kinase 1 μL、直鎖状DNA 2 μLで構成され、室温で1時間反応させた。本反応液を用いて、大腸菌DH5αの形質転換を行い、アンピシリン添加LB平板培地にて一晩培養を行った。得られた形質転換体から複数選別し、それぞれアンピシリン添加LB培地によって一晩培養後、プラスミドを抽出し、塩基配列解析によって目的の変異を有したプラスミド（表３：プラスミド番号３３）を得た。
　作製したCpXI（T63I, V162A）遺伝子発現プラスミド（表３：プラスミド番号３３）をBsiWIによって切断し、SS29株を形質転換した。得られた二重変異型CpXI遺伝子導入株をSS120株とした（表４：株番号３１）。
（１６－２）CpXI二重変異株の評価
　当該SS120株に対して前述と同一条件における微好気条件での発酵試験を行い、同様に発酵試験開始後、24時間後のSS120株細胞中のキシロース異性化酵素の活性測定を行った。その結果、本変異型CpXI（T63I, V162A）遺伝子を含むSS120株は、SS82株およびSS92株と比較して、Km値については34.4 mMと僅かに高くなったが、Vmax値が0.104μmol/mg protein/minと大きく改善された（表８）。また、微好気条件での発酵試験の結果も、他の構築株と比較して、SS120株は最も高いキシロース代謝能、エタノール生産量およびエタノール収率を示した（図６および表９）。さらに、SS120株を用いて、前述の擬似糖化液（YPD85X35培地）を用いた微好気条件での発酵試験において、より低濃度の初期植菌量OD600=3、より高温条件の培養温度38℃に変更した発酵試験を行った結果、120時間以内に、疑似糖化液（YPD85X35）中のグルコースおよびキシロースの大部分を消費し、約53.3g/Lのエタノールを産生した。エタノール変換効率は、投入糖に対しては約87％、消費糖に対して約92％であり、低植菌量かつ高温条件下での発酵においても、SS120株は高いキシロース代謝能、エタノール生産量を示した。
　以上の結果から、CpXIにおいてキシロース代謝能の向上に寄与している変異は、T63IおよびV162Aのアミノ酸置換であり、特にその2か所の変異（T63IおよびV162A）を同時に付与した二重変異型CpXI遺伝子は、宿主酵母株に対して高いキシロース代謝能およびエタノール生産能を付与できることが実証された。
（１６－３）ラボスケールでの評価
　さらに、（１６－１）で得られた二重変異型CpXI遺伝子導入株のSS120株に対して、ラボスケールでの評価を行うため、NaOH処理バガスを用いて同時糖化発酵実験（SSF）を行った。
　その結果、ラボスケールでのSSF実験においても、推定糖化率約85％、120g/L 糖生産条件において、72h以内に約53g/Lのエタノールを生産することができ、推定変換効率は約91％という高いエタノール生産能を示した。
（実施例１７）飽和変異ライブラリーの作製とその評価
　前述において同定した2種類の変異（T63IおよびV162A）において、他のアミノ酸残基へ置換した変異型CpXIにおけるキシロース代謝能を評価するため、両変異部位における飽和変異ライブラリーを作製した。作製方法は以下のとおり。XKS1発現ユニットを含み、HSP12プロモーター、マルチクローニングサイト、CYC1ターミネーターからなる発現ユニットを含む発現ベクター pAUR101r2-XKS1-HSP12p2（図８）をSmaIおよびXhoIで切断したベクター断片および、CpXIにおける63番目のアミノ酸残基（スレオニン）、もしくは162番目のアミノ酸残基（バリン）において、野生型アミノ酸残基とは異なる18種類のアミノ酸残基（システインを除く）に置換した変異型CpXI遺伝子断片をライゲーション反応によって、ベクター断片に導入した飽和変異ライブラリーを、それぞれの変異箇所について作製した（ジェンスクリプトジャパン株式会社）。
　両飽和変異ライブラリーを用いて、大腸菌DH5αの形質転換を行い、アンピシリン添加LB平板培地にて一晩培養を行った。得られた形質転換体から複数コロニーを選別し、アンピシリン添加LB培地にて一晩培養後、プラスミドを抽出した。塩基配列解析によって、得られたプラスミドの変異箇所の塩基配列を決定し、63番目のスレオニン、もしくは162番目のバリンにおいて、野生型のアミノ酸残基を含み他のアミノ酸残基（システインを除く）に置換された19種類の発現プラスミドをそれぞれ取得した。
　得られた発現プラスミドをBsiWI（ニューイングランドバイオラボ社）によって切断し、各DNA断片を用いて、SS29株を形質転換し、オーレオバシジンA添加YPD平板培地にて、30℃、3日間培養を行うことで形質転換体を取得した。
　得られた形質転換体のキシロース代謝能の評価のため、キシロースを炭素源としたYPX50培地における好気条件下での生育試験を行った。オーレオバシジンA添加YPD培地において、各形質転換体を30℃, 定常期まで前培養を行った後、YPX50培地を100 uLずつ分注したマイクロプレート（透明、平底、コーニング社）に、各ウェルにOD600 = 0.1となるように前培養液を植菌した。マイクロプレートリーダー（Infinite（R） 200 PRO、テカン社）を用いて、本マイクロプレートの30℃、96時間の培養および経時的な吸光度測定（OD600）を行い、各形質転換体の生育曲線を得た。本生育試験の結果、T63I変異を有する変異型CpXIと同等もしくはそれ以上のxylose資化能を宿主酵母株に付与可能なアミノ酸置換は、リジン(T63L)、グリシン（T63G）、ヒスチジン（T63H）へのアミノ酸置換であった（図９：T63L、T63G、T63Hへのアミノ酸置換を有する変異型CpXIの塩基配列は、それぞれ配列番号６３－６５に相当する）。
　本発明により、キシロースからの高効率なエタノール生産が可能な酵母株を構築することが可能となり、バイオマスを原料とした第二世代バイオエタノール生産の高効率化に寄与できることが見込まれる。

Claims (9)

  1. 　Clostridium phytofermentans 由来キシロース異性化酵素（CpXI）のアミノ酸配列において、配列番号１１における第６３番目のスレオニン及び第１６２番目のバリンに対応する少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含む変異型キシロース異性化酵素（変異型CpXI）であって、野生型キシロース異性化酵素（CpXI）と比較して高いキシロース代謝活性を有する変異型CpXI。
  2. 　前記配列番号１１における第６３番目のスレオニンの他のアミノ酸への置換がイソロイシン、リジン、グリシン、または、ヒスチジンへの置換であり、第１６２番目のバリンの他のアミノ酸への置換がアラニンへの置換である、請求項１に記載の変異型CpXI。
  3. 　配列番号１１に示されるキシロース異性化酵素のアミノ酸配列において、第６３番目のスレオニンがイソロイシン、リジン、グリシン、または、ヒスチジンに置換され、及び／又は第１６２番目のバリンがアラニンに置換されている、請求項２に記載の変異型CpXI。
  4. 　Clostridium phytofermentans 由来キシロース異性化酵素（CpXI）遺伝子の塩基配列において、コードするアミノ酸配列における配列番号１１中の第６３番目のスレオニン及び第１６２番目のバリンに対応するコドンの少なくとも１つのコドンが他のアミノ酸に対応するコドンに置換された塩基配列を含む変異型キシロース異性化酵素遺伝子（変異型CpXI遺伝子）であって、Saccharomyces cerevisiae 宿主に対して、野生型CpXI遺伝子と比較して高いキシロース代謝能及び高いエタノール生産能を付与する変異型CpXI遺伝子。
  5. 　配列番号１２に示されるキシロース異性化酵素遺伝子（CpXI遺伝子）の塩基配列において、コードするアミノ酸配列中の第６３番目のスレオニンがイソロイシン、リジン、グリシン、または、ヒスチジンに置換され、及び／又は第１６２番目のバリンがアラニンに置換される変異に対応するコドン変異を有する塩基配列を含む、請求項４に記載の変異型CpXI遺伝子。
  6. 　請求項４又は５に記載の変異型CpXI遺伝子により形質転換された酵母であって、親酵母と比較して高いキシロース代謝能を有する形質転換酵母。
  7. 　前記酵母が、サッカロマイセス属（Saccharomyces）、クルイベロマイセス属（Kluyveromyces）、カンジダ属（Candida）、ピキア属（Pichia）、シゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces）、及びハンセヌラ属（Hansenula）からなる群から選択される酵母である、請求項６に記載の形質転換酵母。
  8. 　前記酵母がサッカロマイセス属（Saccharomyces）酵母である、請求項６に記載の形質転換酵母。
  9. 　キシロース存在下において、請求項６～８のいずれかに記載の形質転換酵母を用いたエタノール生産方法。

     
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