CN102010884B

CN102010884B - 抗菌活性物及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN102010884B
Application number: CN2010102023809A
Authority: CN
Inventors: 陈卫良; 林文凭; 许松伟
Original assignee: LANZHOU WEIRI BIO-ENGINEERING Co Ltd; Zhejiang University ZJU
Current assignee: LANZHOU WEIRI BIO-ENGINEERING Co Ltd; Zhejiang University ZJU
Priority date: 2010-06-13
Filing date: 2010-06-13
Publication date: 2012-09-19
Anticipated expiration: 2030-06-13
Also published as: CN102010884A

Abstract

本发明公开了一种抗菌活性物的制备方法，所用枯草芽孢杆菌保藏名称为：Bacillussubtilis ZJU15，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2010年4月8日，保藏号：CCTCC：M2010074；依次包括以下步骤：1)制备发酵液；2)将发酵液离心、加入固体硫酸铵等处理后，得抗菌粗提液；3)将上述抗菌粗提液经Sephadex G-75柱层析，收集具有抗菌活性的峰尖洗脱液，经Mill Q水透析后，冷冻真空干燥，得抗菌活性物。本发明方法制备而得的抗菌活性物用于抑制或消灭单增李斯特菌。

Description

抗菌活性物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一株枯草芽孢杆菌菌株ZJU15--Bacillus subtilis ZJU15，以及由其发酵产生的抗菌活性物及相应的制备方法和用途。

背景技术

食物是人类生存和社会发展的第一物质基础，而食品(农产品)安全是全世界共同关注的问题，其中，食品防腐保鲜则是食品安全的一个关键。目前普遍使用的化学食品防腐剂潜在的安全隐患不容忽视，但经长期的研究，发现一些合成防腐剂有诱癌性、致畸性和易引起食物中毒等问题。随着社会生活水平的不断提高和消费者对健康的日益关注，人们对防腐剂之类的食品添加剂在安全性能上提出了更高的要求，高效安全的天然食品防腐保鲜剂的开发与应用是食品科学研究的发展趋势。至今，国内外已从动物、植物和微生物等各种生物资源开发溶菌酶、乳酸链球菌素(Nisin)、纳他霉素(Natamycin)、ε-聚赖氨酸、茶多酚、香精油、大蒜素、鱼精蛋白、蜂胶、壳聚糖等一系列可作为天然食品防腐保鲜剂的产品，但由于原料来源、本身的产品性能、制备工艺和价格等多种因素的限制，目前仅乳酸链球菌(Lactococcus lactis)菌株产生的乳酸链球菌素等少数微生物源品种获得了市场的广泛认可，得到了较大规模的使用。乳酸链球菌素是由部分乳酸链球菌菌株产生的细菌素，由34个氨基酸组成，可抑制多种革兰氏阳性细菌的生长繁殖，并对人体安全无毒。但nisin在生产应用中存在其局限性，如它的最适活性pH值为3，在碱性条件下溶解度很少，稳定性也差；食品的化学组成和物理性质也可显著影响Nisin的活性，如新鲜肉中含有的谷胱甘肽能显著降低乳酸链球菌素的活性，而且肉本身较高pH和磷脂等成分也降低了它的抗菌效果，此外，国际上已发现李斯特菌等多种食品腐败革兰氏阳性细菌诱变后可对nisin具有较大的抗性。开发新的高效安全的天然食品防腐保鲜剂是保证食品(农产品)安全的一项重要的任务。

同时，自1941年弗莱明从青霉菌中发现第一个广谱抗生素--青霉素以来，链霉素、氯霉素、红霉素、利福霉素、万古霉素等不同化学结构类型和不同生物活性的抗生素相继问世，抗生素在临床上的应用成为治疗细菌感染的主要手段，从而挽救了无数人的生命。然而随着抗生素的广泛使用，细菌的耐药性问题也随之越来越突出，病原菌耐药性成为感染性疾病引起死亡的主要原因之一，这给临床治疗带来了严重的挑战。研究和开发新的抑制病原菌的药物变得非常紧迫。

在天然抗菌物质中，有一大类属于肽类抗菌剂，它们与抗生素在化学本质、产生机理、抑菌机理和免疫原性等方面显著不同，其高效安全，而受到人们广泛关注，其中微生物抗菌肽发酵周期短、生产成本低、抑菌效果好，因此成为研究热点领域。枯草芽孢杆菌在生长代谢过程中能够产生多种抗菌物质，其中以抗菌肽类为主：一类是核糖体合成的羊毛硫抗生素(bacteriocin)，已经鉴定的有：subtilosin、ericin、mersacidin、subtilin和sublancin等，它们都是由核糖体编码翻译成前导肽后，经过肽酶剪切、翻译后修饰形成成熟活性多肽。其中subtilin、ericin为一类具线性结构、碱性、长约34个氨基酸残基、具有相似的羊毛硫桥的短肽，mersacidin、sublancin、subtilosin呈略碱性或中性、长约19氨基酸残基、C-末端残基参与共价结合形成类似球形环状的短肽。另一类为非核糖体合成脂肽类(lipopeptides)，已经鉴定的有：surfactin、iturin和fengycin等三个家族。这些脂肽的分子结构由环状的7个氨基酸(surfactin和iturin)或10个氨基酸(fengycin)分别与一个脂肪酸链连接而成。Surfactin的脂肪酸链长度变化由C13到C16，iturin由C14到C17，fengycin由C14到C18，因此每一种脂肽类化合物都有多种同系物。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用枯草芽孢杆菌制备而得的抗菌活性物及其制备方法和用途。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种抗菌活性物的制备方法，该枯草芽孢杆菌保藏名称为：Bacillus subtilis ZJU15，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2010年4月2日，保藏号：CCTCC NO：M2010074；依次包括以下步骤：

1)、制备发酵液：

取保存于-70℃的Bacillus subtilis ZJU15 CCTCC NO：M2010074接种于LB培养液(LB液体培养基)中，30℃、200rpm/min振荡培养12小时，得种子培养液；

将上述种子培养液以5％的体积比浓度接种于LB培养液中，在30℃、200rpm/min振荡培养30小时，获得发酵液；

2)、将发酵液以6000～8000rpm/min离心20min，在所得上清液中按照10.5～11.5g硫酸铵/100ml上清液的投料比加入固体硫酸铵，0℃～4℃下放置10～14小时；然后再以11000～14000rpm/min离心10～20min，得沉淀；将所得沉淀用灭菌蒸馏水悬浮，灭菌蒸馏水的用量是上清液体积的1/20(v/v)；然后再以11000～14000rpm/min离心取上清，即得抗菌粗提液；

3)、将上述抗菌粗提液经Sephadex G-75柱层析，收集具有抗菌活性的峰尖洗脱液，经Mill Q水透析后，冷冻真空干燥，得抗菌活性物。

作为本发明的抗菌活性物的制备方法的改进：Superdex 75 prep grade柱层析方法为：将0.5ml枯草芽孢杆菌ZJU15的抗菌粗提液经冷冻真空干燥后，重新悬浮于0.3ml洗脱溶液A中，上样进行Superdex 75 prep grade柱层析，洗脱溶液A为含0.15M NaCl的20mM磷酸缓冲液(pH 7.0)，流速为1.0mL/min，按照1ml/管的格式分管收集洗脱液，以单增李斯特菌为指示菌测定抗菌活性，获得一个活性峰，收集具有抗菌活性的峰尖洗脱液3ml，经Mill Q水4℃透析6次，每次2h，然后冷冻真空干燥。

作为本发明的抗菌活性物的制备方法的进一步改进，LB培养液为：蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母提取物5g/L，其余为蒸馏水，于121℃灭菌20分钟，pH7.0。

蛋白胨可购自Oxoid公司，酵母提取物可购自Oxoid公司。

作为本发明的抗菌活性物的制备方法的进一步改进，抗菌活性测定方法为：采用琼脂扩散法(Agar Diffiution Assay)检测拮抗活性。

本发明还同时提供了利用上述方法制备而得的抗菌活性物。

本发明还同时提供了该抗菌活性物的用途：用于抑制或消灭单增李斯特菌。

在本发明中，含0.15M NaCl的20mM磷酸缓冲液(pH 7.0)的制备方法如下：按照标准方法配制0.2M磷酸缓冲液(PH7.0)，然后将其稀释10倍就形成了20mM磷酸缓冲液(pH7.0)，再添加NaCl，直至NaCl的摩尔浓度为0.15M。

在本发明的Superdex 75 prep grade柱层析方法中：收集具有抗菌活性的峰尖洗脱液3ml是指一个检测出具有活性的吸收峰(称为活性峰)，收集其中活性相对最大的3管(3ml)。

经过Superdex 75 prep grade层析柱层析所得的冷冻干燥活性产物(抗菌活性物)，经检测，以单增李斯特菌作为指示菌，其1.0ug/ml相对抗菌活性(the arbitrary unit，AU)达到25，而1.0ug/ml乳酸链球菌素(Nisin，有效成分)的AU为8。

本发明中所用到的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZJU15的保藏名称为：Bacillussubtilis ZJU15，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2010年4月2日，保藏号：CCTCC NO：M2010074。

本发明的抗菌活性物实际使用时，一般在每ml液体中添加4.0～12.0ug抗菌活性物，即可达到抑制或消灭液体中的单增李斯特菌的目的。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是枯草芽孢杆菌ZJU15菌株抗菌物的Hypersil ODS2色谱洗脱图；图中A，B，C表示三个具抗菌活性的洗脱峰。

具体实施方式

实施例1、抗菌活性物的制备方法，依次进行以下步骤：

1)、制备发酵液：

用接种环取一环保存于-70℃的Bacillus subtilis ZJU15 CCTCC NO：M2010074接种于50ml的LB液体培养基中，30℃、200rpm/min振荡培养12小时，得种子培养液；

LB液体培养基为：蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母提取物5g/L，其余为蒸馏水，于121℃灭菌20分钟，pH7.0。

将上述种子培养液以5％的体积比浓度接种于LB液体培养基中，在30℃、200rpm/min振荡培养30小时，获得发酵液；

2)、将发酵液以7000rpm/min离心20min，在所得上清液中按照11g硫酸铵/100ml上清液的投料比加入固体硫酸铵，4℃下放置10～12小时；然后再以12000rpm/min离心15min，得沉淀；将所得沉淀用灭菌蒸馏水悬浮，灭菌蒸馏水的用量是上清液体积的1/20(v/v)；然后再以12000rpm/min离心取上清，即得抗菌粗提液；

3)、将上述抗菌粗提液经Superdex 75 prep grade柱层析，具体如下：

Superdex 75 prep grade柱层析方法为：将0.5ml枯草芽孢杆菌ZJU15的抗菌粗提液经冷冻(-70℃)真空干燥后，重新悬浮于0.3ml的洗脱溶液A进行Superdex 75 prep grade柱层析，洗脱溶液A为含0.15M NaCl的20mM磷酸缓冲液(pH 7.0)，流速为1.0mL/min，分管收集洗脱液(1ml/管)，以单增李斯特菌为指示菌测定抗菌活性，获得一个活性峰，收集具有抗菌活性的峰尖洗脱液3ml，经Mill Q水4℃透析6次，每次2h，透析后冷冻真空干燥；得抗菌活性物。

实施例2、对实施例1所得的抗菌活性物进行RP-HPLC色谱纯化：

RP-HPLC色谱纯化方法为：将经Superdex 75 prep grade层析柱层析所得的冷冻干燥产物(即抗菌活性物，实施例1所得)，用150μL洗脱溶液B进行悬浮，洗脱溶液B为在体积浓度为90％的甲醇水溶液中添加乙酸，乙酸与甲醇水溶液的体积比为0.05％；然后取20μL悬浮液进行Hypersil ODS2色谱柱层析(购自大连依利特公司)，用洗脱溶液B进行洗脱，流速为1.0mL/min，收集各个洗脱峰，测定对李斯特菌的抗菌活性。具有抗菌活性的三个洗脱峰洗脱时间分别为11.762Min，12.767Min，14.340Min，分别命名为ZJU15A、ZJU15B和ZJU15C。如图1所示。

所得的抗菌肽ZJU15A、ZJU15B和ZJU15C提交中国人民解放军军事医学科学院生物医学分析中心进行质谱分析，首先进行MALDI-TOF-MS质谱扫描分析确定纯度(扫描范围50-5000Da)。再进行Q-TOF2一级质谱扫描，得到LC-ESI-MS图。从ESI-MS图中选出待测离子，然后进行ESI-MS/MS分析。该质谱图经Micromass的专用软件MaxEnt3转换后。借助Micromass的专用软件Peptide Sequencing直接推导出肽段序列。结果分析显示枯草芽孢杆菌ZJU15菌株产生的三个抗菌活性成分的氨基酸序列分别为：

ZJU15A(SEQ ID NO：1)：Leu¹-Leu²-Glu³-Leu⁴-Leu⁵-Pro⁶-Val⁷-Leu⁸-Leu⁹；

ZJU15B(SEQ ID NO：2)：Leu¹-Leu²-Glu³-Leu⁴-Leu⁵-Pro⁶-Val⁷-Leu⁸-Leu⁹；

ZJU15C(SEQ ID NO：3)：Leu¹-Thr²-His³-Met⁴-Leu⁵-Val⁶-Pro⁷-Leu⁸-Leu⁹。

实施例3、抗菌肽的抗菌活性测定：

采用琼脂扩散法(Agar Diffiution Assay)检测拮抗活性。在未凝固的TSBYE固体培养基中按1％接入指数生长期单增李斯特菌(OD600≈0.1)，终浓度≈107CFU ml^-1，倒平板。用孔径为5mm的打孔器打孔，每孔加10μl各洗脱峰液。37℃下培养过夜，观察抑菌作用，收集相对应的具抑菌作用的脱峰液。

实施例4、抑菌活性的计算方式

采用琼脂扩散法(Agar Diffiution Assay)检测拮抗活性。在未凝固的TSBYE固体培养基中按1％(体积比)接入指数生长期单增李斯特菌(OD₆₀₀≈0.1)，终浓度≈10⁷CFU ml^-1，倒平板。用孔径为5mm的打孔器打孔，每孔加10μL的抗菌活性物的悬浮液，经检测，其1.0ug/ml相对抗菌活性(the arbitrary unit，AU)达到25，而1.0ug/ml乳酸链球菌素(Nisin，有效成分)的AU为8。

实施例5、在巴氏灭菌牛奶(市购)中接种指数生长期的单增李斯特菌至终浓度≈10⁷CFU ml^-1后，添加冷冻真空干燥产物(抗菌活性物，实施例1所得)至5.0ug ml^-1，37℃下放置24小时后检测发现可完全抑制其微生物生长；添加冷冻真空干燥产物至10.0ug ml^-1，37℃下放置24小时后检测发现可杀死牛奶中的单增李斯特菌。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.一种抗菌活性物的制备方法，其特征是，所用枯草芽孢杆菌保藏名称为：

Bacillus subtilis ZJUl5，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2010年4月2日，保藏号：CCTCC NO：M2010074；依次包括以下步骤：

1)、制备发酵液：

取Bacillus subtilis ZJUl5 CCTCC NO：M2010074接种于LB培养液中，30℃、200rpm振荡培养12小时，得种子培养液；

将上述种子培养液以5％的体积比浓度接种于LB培养液中，在30℃、200rpm振荡培养30小时，获得发酵液；

2)、将发酵液以6000～8000rpm离心20min，在所得上清液中按照10.5～11.5g硫酸铵/100ml上清液的投料比加入固体硫酸铵，0℃～4℃下放置10～14小时；然后再以11000～14000rpm离心10～20min，得沉淀；将所得沉淀用灭菌蒸馏水悬浮，所述灭菌蒸馏水的用量是上清液体积的1/20；然后再以11000～14000rpm离心取上清，即得抗菌粗提液；

3)、将0.5ml的上述抗菌粗提液经冷冻真空干燥后，重新悬浮于0.3ml洗脱溶液A中，上样进行Superdex 75prep grade柱层析，洗脱溶液A为含0.15M NaCl的20mM磷酸缓冲液pH7.0，流速为1.0mL/min，按照lml/管的格式分管收集洗脱液，以单增李斯特菌为指示菌测定抗菌活性，获得一个活性峰，收集具有抗菌活性的峰尖洗脱液3ml，经Mill Q水4℃透析6次，每次2h，然后冷冻真空干燥，得抗菌活性物。

2.根据权利要求1所述的抗菌活性物的制备方法，其特征是所述LB培养液为：蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母提取物5g/L，其余为蒸馏水，于121℃灭菌20分钟，pH7.0。