CN107502603A - 一种大肠杆菌裂解酶及其制备方法与应用 - Google Patents

一种大肠杆菌裂解酶及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及属于生物工程领域，特别涉及一种大肠杆菌裂解酶及其制备方法及其作为抗感染药物的应用；一种大肠杆菌裂解酶，其特征在于其氨基酸序列为Seq ID NO.2。利用生物工程技术开发能够高效杀灭大肠杆菌的酶制剂，该制剂可以单独或复配使用，能够特异性的灭活多种大肠杆菌，为目前防控奶牛乳房炎中的大肠杆菌提供一种安全、无毒副作用的酶制剂来源。

Description

一种大肠杆菌裂解酶及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别是一种大肠杆菌裂解酶及其制备方法与应 用。
背景技术
大肠杆菌是一种重要的人畜共患病原菌。可以引起动物腹泻、出血性肠炎， 严重的可以导致死亡。而多年来抗生素的滥用导致产生的大肠杆菌超级细菌给人 类健康和畜禽养殖业带来了巨大危害，亟需研发新型安全的防控措施。
噬菌体裂解酶被认为是高效的生物酶抗生素，在当前微生物耐药性日益严重 的情况下，裂解酶在动物疫病防控领域的应用前景被全球科学家高度关注。虽然 裂解酶来源于噬菌体，但由于噬菌体裂解谱较窄，并且在应用过程中存在变异等 的问题，而限制其应用。细菌噬菌体裂解酶是一种新的细菌细胞壁裂解酶，由噬 菌体基因组编码，在噬菌体复制后期起释放病毒粒子作用。经典的裂解酶具备两 个独立的功能区，包括N端的裂解酶活性区(catalytic domain,CD)和C端的 细胞壁结合区(cell wall binding domain，CBD)，分别具有裂解酶活性和细胞 壁结合活性。一般来说，裂解酶的N端为裂解活性域，可以特异性的破坏肽聚 糖的化学键，根据裂解酶可以裂解的化学键可以将其分为几类：溶菌酶(lysozyme)、酰胺酶(amidase)和内肽酶(endopeptidase)。而相比之下，革 兰氏阴性菌裂解酶大多数情况下只有一个裂解活性区域，而没有结合区，大小也 只有15-20kDa。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种新型大肠杆菌裂解酶及其制备方法，该裂解 酶对大肠杆菌引起的奶牛乳房炎感染具有显著的防治效果，可以特异性的灭活金 葡菌，为工业化生产抗菌制剂提供原料来源，本发明是这样实现的：
一种大肠杆菌嵌合裂解酶LysBM1，其特征在于：其核苷酸序列如Seq ID NO.1 所示
(ATGCARATHTTYAAYATGMGNACNAAYGAYGARGGNGTNYTNGGNYTNMGNYTNACNYTNTAYAARGAYACNMGNGGNTTYTGGACNATHGGNGCNGGNATHTGGACNGTNTGYGCNAAYCCNGTNTGYGCNGGNGCNYTNGAYMGNATGATHGGNMGNAARTGYAAYCCNACNGTNTGYYTNYTNAARGCNMGNAARCARTTYAAYAARAARGTNAAYAARGCNGGNMGNGGNGCNATHGCNGGNAAYGCNWSNGTNAARCCNGTNTAYAARWSNYTNAARGCNGGNYTNGCNWSNGCNYTNGTNAAYATGGCNTTYMGNMGNGCNWSNTTYCCNTAYAAYGTNGCNTTYMGNWSNYTNMGNYTNYTNAARAARCARAARMGNTGGMGNAAYYTNAAYGCNGGNAARGCNTGYMGNAARTGGTAYMGNCARACNCCNAAYMGNGCNAARMGNGTNATHAARACNTGGGCNGGNGGNAARGTNWSNMGNMGNGAYATHGAR)，
氨基酸序列如Seq ID NO.2所示
(MQIFNMRTNDEGVLGLRLTLYKDTRGFWTIGAGIWTVCANPVCAGALDRMIGRKCNPTVCLLKARKQFNKKVNKAGRGAIAGNASVKPVYKSLKAGLASALVNMAFRRASFPYNVAFRSLRLLKKQKRWRNLNAGKACRKWYRQTPNRAKRVIKTWAGGKVSRRDIE)。
所述大肠杆菌裂解酶的制备方法，其特征在于，按如下步骤实现：
1)该裂解酶的重组毕赤酵母表达载体的构建：如所述的大肠杆菌嵌合裂解酶LysBM1的核酸序列和毕赤酵母表达载体pPIC9K通过双酶切方式构建裂解酶毕 赤酵母表达载体pPIC9K-BM1；
2)毕赤酵母的转化及筛选：用限制性内切酶酶切裂解酶毕赤酵母表达载体pPIC9K-BM1与酵母GS115感受态细胞通过电击法制备电转细胞，将细胞涂布于 含2.0mg/mlG418的MD D-山梨醇平板，所述的平板含有1.34％YNB，4×10-5％ 生物素，2％D-葡萄糖，1MD-山梨醇，然后倒置平板于28-30℃培养，2-4天 后出现转化子，筛选出高表达菌株；
随机挑取生长出的酵母菌落于YPD培养，按照Promega公司酵母基因组提 取试剂盒所述方法提取酵母基因组，并以其为模板进行PCR扩增LysBM1基因， 电泳显示与大肠杆菌嵌合裂解酶LysBM1序列大小一致，说明酵母高效表达菌株 建立成功；
3)诱导表达：挑取阳性克隆，分别接种于50mlBMGY培养基，所述的培养基为 酵母提取物1％，胰蛋白胨2％，磷酸钾缓冲液(pH6.0)100mmol/L，YNB 1.34％， 生物素4×10-5％，甘油1％，30℃，250rpm振荡培养至OD600在4-6之间时 取出，1500g离心5min，收集酵母细胞，然后重悬于装有1/5体积的BMMY培 养基中，其中所述的培养为酵母提取物1％、胰蛋白胨2％、磷酸钾缓冲液pH6.0 100mmol/L、YNB 1.34％、生物素4×10-5％、甲醇3％，三角瓶中继续培养，24 小时以后，每天补加甲醇至终浓度为2.5-3％，持续培养6-10天，离心取上清；电泳显示有目的蛋白表达，经测定蛋白量可达到200mg/L。
所述一种大肠杆菌嵌合裂解酶LysBM1在制备防治大肠杆菌感染和污染药物 中的应用。
所述的一种大肠杆菌嵌合裂解酶LysBM1的应用，其特征在于将纯化的裂解 酶产物制备防治奶牛养殖场中大肠杆菌引起的奶牛乳房炎药物中的应用。
所述的一种大肠杆菌嵌合裂解酶LysBM1的应用，其特征在于以重组表达抗 菌肽嵌合大肠杆菌嵌合裂解酶LysBM1裂解酶产物制成抗感染药物。
所述的一种大肠杆菌嵌合裂解酶LysBM1的应用，其特征在于：将纯化的裂 解酶产物与各种赋形剂复配后制备防治各种大肠杆菌的感染和污染药物中的应 用。
有益效果
1、我们前期在江苏某猪场污水分离到研究发现一株大肠杆菌的裂解性噬菌 体V_EcoM_BM1。通过全基因组测序获得其裂解酶基因LysBM1。LysBM1氨基酸 序列与已报道大肠杆菌O157噬菌体phiE142同源性最高，但只有61％。蛋白同 源建模分析发现，裂解酶LysBM1与phiE142高级结构很相似，具有典型的裂解 酶功能域特征(lysozyme-like structuraldomain superfamily)。裂解酶 LysBM1用毕赤酵母重组表达后具备体外抗菌活性且可以高效穿透EHEC外膜，而 裂解酶phiE142无体外抗菌活性。扫描电镜分析及流式细胞仪检测，可明显发现 LysBM1穿透细菌外膜，证实为高穿透性裂解酶。该裂解酶为当前首次发现。
2、本发明结合裂解酶及抗菌肽的优点，针对细菌细胞壁作为靶标进行杀菌， 用于防治多种大肠杆菌，该大肠杆菌裂解酶可以单独或复配使用，或制备成酶制 剂，用以防治由大肠杆菌引起的各种污染和感染，特别是奶牛养殖场中由大肠杆 菌引起的奶牛乳房炎感染，具有极高的防治效果，且安全无毒副作用。
附图说明
图1重组表达嵌合裂解酶LysBM1毕赤酵母GS115基因组PCR检测
M:DNA Marker 10000bp
1:未转化毕赤酵母GS115基因组；
2：转化后挑选单克隆1基因组；
3：转化后挑选单克隆2基因组；
4：转化后挑选单克隆3基因组；
图2嵌合裂解酶LysBM1及phiE142酵母表达上清SDS-PAGE
M:100kd protein marker
1:嵌合裂解酶LysBM1诱导表达上清；
2:嵌合裂解酶LysBM1诱导表达上清；
3：裂解酶phiE142诱导表达上清；
4：未转化毕赤酵母GS115诱导后上清。
图3.裂解酶LysBM1与phiE142重组表达及活性分析
图4裂解酶LysBM1与phiE142杀菌后扫描电镜观察
具体实施方式
实施例1重组嵌合裂解酶LysBM1基因的克隆、表达载体及表达菌株的构建
(a)根据大肠杆菌细胞壁结构特点以及本研究室分离大肠杆菌烈性噬菌体JS25裂解酶基因序列设计嵌合裂解酶LysBM1基因，其核苷酸序列如Seq ID NO.1所 示
(ATGCARATHTTYAAYATGMGNACNAAYGAYGARGGNGTNYTNGGNYTNMGNYTNACNYTNTAYAARGAYACNMGNGGNTTYTGGACNATHGGNGCNGGNATHTGGACNGTNTGYGCNAAYCCNGTNTGYGCNGGNGCNYTNGAYMGNATGATHGGNMGNAARTGYAAYCCNACNGTNTGYYTNYTNAARGCNMGNAARCARTTYAAYAARAARGTNAAYAARGCNGGNMGNGGNGCNATHGCNGGNAAYGCNWSNGTNAARCCNGTNTAYAARWSNYTNAARGCNGGNYTNGCNWSNGCNYTNGTNAAYATGGCNTTYMGNMGNGCNWSNTTYCCNTAYAAYGTNGCNTTYMGNWSNYTNMGNYTNYTNAARAARCARAARMGNTGGMGNAAYYTNAAYGCNGGNAARGCNTGYMGNAARTGGTAYMGNCARACNCCNAAYMGNGCNAARMGNGTNATHAARACNTGGGCNGGNGGNAARGTNWSNMGNMGNGAYATHGAR)。
(b)该裂解酶的重组毕赤酵母表达载体的构建：根据裂解酶LysBM1核酸序 列和毕赤酵母表达载体pPIC9K上的限制性内切酶位点特性，在裂解酶LysBM1 核酸序列上下游分别增加EcoRI和NotI位点，用EcoRI和NotI双酶切，再 与EcoRI和NotI双酶切过的pPIC9K相连，转化大肠杆菌DH5α，构建裂 解酶LysBM1的毕赤酵母表达载体pPIC9K-BM1。提取质粒，经EcoRI和NotI 双酶切、测序鉴定。证实该裂解酶毕赤酵母表达载体pPIC9K-BM1构建成功。
(c)毕赤酵母的转化及筛选：用限制性内切酶如SalI将重组质粒线性化， 取约5μl线性DNA 1μg与200μl甲醇酵母GS115感受态细胞混合，然后 注入预冷的0.2cm电击杯中，轻敲电击杯，使混合物落于电击杯底部，在电击 仪上设定电压为1500V，电容为50μF，电流25mA，电功率25W，电阻200 Ω，进行电穿孔操作。电穿孔后立即加入1ml预冷的1M D-山梨醇，混匀后从 中吸出200μl立即涂布于含2.0mg/ml G418的MD D-山梨醇平板(1.34％ YNB，4×10-5％生物素，2％D-葡萄糖，1M D-山梨醇)，然后倒置平板于 28-30℃培养，2-4天后出现转化子，筛选出高表达菌株。
随机挑取生长出的酵母菌落于YPD培养，按照Promega公司酵母基因组提 取试剂盒所述方法提取酵母基因组，并以其为模板进行PCR扩增LysBM1基 因，琼脂糖凝胶电泳，如图1所示，紫外光下可见约501bp大小的明显条带， 与LysBM1核酸序列大小一致，经测序鉴定与LysBM1核酸序列一致，说明酵母 高效表达菌株建立成功。
实施例2嵌合裂解酶LysBM1蛋白的诱导表达及纯化
诱导表达：挑取阳性克隆，分别接种于50mlBMGY培养基(酵母提取物 1％、胰蛋白胨2％、磷酸钾缓冲液(pH6.0)100mmol/L、YNB 1.34％、生物素(4× 10-5)％甘油1％)中，30℃，250rpm振荡培养至OD600在4-6之间时取出， 1500g离心5min，收集酵母细胞，然后重悬于装有1/5体积的BMMY培养基 (酵母提取物1％、胰蛋白胨2％、磷酸钾缓冲液(pH6.0)100mmol/L、YNB 1.34％、 生物素(4×10-5)％、甲醇3％)三角瓶中继续培养，24小时以后，每天补加甲 醇至终浓度为2.5-3％。持续培养6-10天，离心取上清。
直接取嵌合裂解酶LysBM1酵母表达上清作SDS-PAGE，电泳显示有目的 蛋白表达，经测定蛋白量可达到200mg/L左右。
实施例3嵌合裂解酶LysBM1的杀菌谱的分析
选取终浓度10μg/ml的裂解酶，分别作用于大肠杆菌ATCC25922及22株 在临床分离肠出血大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌ATCC25923、沙门氏菌 CMCC(B)50115、铜绿假单胞菌ATCC27853，用以检测平板上形成抑菌环的能力。 如表1所示，裂解酶LysBM1裂解谱远远大于噬菌体V_EcoM_BM1，可广谱裂 解大肠杆菌。
表1裂解酶LysBM1与噬菌体V_EcoM_BM1裂解谱对比
其中“-”表示不裂解；“+”表示裂解不完全，12小时后抑菌斑有菌落长出；“++”表示完全裂解。
实施例4：嵌合裂解酶LysBM1裂解大肠杆菌效果实验
设添加裂解酶和不添加裂解酶对照，向实施例2获得的嵌合裂解酶LysBM1 (终浓度10μg/ml)，在1min、2.0min、5.0min、10.0min、15.0min、20.0min 时分别取菌液1ml，测定细菌数目(CFU)及OD600。
结果如图3所示，LysBM1终浓度10μg/ml，在5min内可使大肠杆菌BP3 降低6个log，而phiE142及PBS对照无明显变化，说明LysBM1对生长状态的 大肠杆菌有明显抑菌作用(C)。
实施例5:裂解酶液细胞毒性实验
为评价该裂解酶的安全性，特别进行了将Caco-2细胞以每孔5×103的浓 度接种到96孔板中，培养24小时后，向孔板中加入一定浓度的嵌合裂解酶 LysBM1(0.1-1mg/mL)以及丝裂霉素C(15mg/mL)。继续培养24小时。培养结束 后，向孔板中加入染色剂WST-8，静置后在酶标仪上读取450nm吸光值。结果 显示即使高浓度的BM1也无细胞毒性。
实施例6：扫描电镜观察裂解酶LysBM1与phiE142杀菌机制
LysBM1终浓度10μg/ml，37℃，作用5min,固定制样后，扫描电镜分析 LysBM1裂解EHEC结果，如图4所示，细菌外膜破坏严重，推测裂解酶LysBM1 可以高效穿透大肠杆菌细胞壁的外膜而发挥作用而phiE142及PBS对照组未发 现细菌外膜明显变化。
实施例7:.裂解酶用于控制大肠杆菌引发的奶牛乳房炎实验
在南京卫岗奶业集团下属的高淳奶牛场，选取16头由金黄色葡萄球菌引发的患奶牛乳房炎奶牛的泌乳期荷斯坦奶牛进行治疗试验(经乳汁细菌分离鉴定主要致 病菌是金黄色葡萄球菌)。将牛随机分为两组，噬菌体实验组和对照组(不治疗 组)，每组9头奶牛。实验组牛用实施例2提供的纯化的裂解酶释液(终效价为 108pfu/m)，在每天傍晚挤奶后每头牛每个乳区用裂解酶溶液灌注10mL,，连续 一个疗程5天。，结果发现乳头肿胀度显著降低，乳汁颜色显著变浅，LMT检测 体细胞数显著变少。血液抗氧化指标显示：用药后血中SOD、GSH-Px的活性显著 增强，NO和MDA含量显著降低，显示，用药后队奶牛乳房炎有较好的治疗作用、 同时增强机体抗氧化能力，减少炎性因子的释放。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种大肠杆菌裂解酶及其制备方法与应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 501
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
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<223> n is a, c, g, t or u
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<222> (216)..(216)
<223> n is a, c, g, t or u
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<222> (225)..(225)
<223> n is a, c, g, t or u
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<222> (228)..(228)
<223> n is a, c, g, t or u
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<222> (231)..(231)
<223> n is a, c, g, t or u
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<222> (234)..(234)
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<222> (237)..(237)
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<222> (243)..(243)
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<222> (246)..(246)
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<222> (252)..(252)
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<222> (255)..(255)
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<222> (258)..(258)
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<222> (264)..(264)
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<222> (267)..(267)
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<222> (276)..(276)
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<222> (279)..(279)
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<222> (285)..(285)
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<222> (300)..(300)
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<222> (321)..(321)
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<222> (324)..(324)
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<222> (327)..(327)
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<222> (330)..(330)
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<222> (336)..(336)
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<222> (345)..(345)
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<222> (348)..(348)
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<222> (354)..(354)
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<222> (357)..(357)
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<222> (360)..(360)
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<222> (363)..(363)
<223> n is a, c, g, t or u
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<222> (366)..(366)
<223> n is a, c, g, t or u
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<222> (369)..(369)
<223> n is a, c, g, t or u
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<222> (384)..(384)
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<222> (390)..(390)
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<222> (396)..(396)
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<222> (402)..(402)
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<222> (405)..(405)
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<222> (411)..(411)
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<222> (417)..(417)
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<222> (429)..(429)
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<222> (435)..(435)
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<222> (438)..(438)
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<222> (444)..(444)
<223> n is a, c, g, t or u
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<222> (447)..(447)
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<222> (453)..(453)
<223> n is a, c, g, t or u
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<222> (456)..(456)
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<222> (465)..(465)
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<222> (471)..(471)
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<222> (474)..(474)
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<222> (477)..(477)
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<222> (483)..(483)
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<222> (486)..(486)
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<222> (489)..(489)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (492)..(492)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 1
atgcaratht tyaayatgmg nacnaaygay garggngtny tnggnytnmg nytnacnytn 60
tayaargaya cnmgnggntt ytggacnath ggngcnggna thtggacngt ntgygcnaay 120
ccngtntgyg cnggngcnyt ngaymgnatg athggnmgna artgyaaycc nacngtntgy 180
ytnytnaarg cnmgnaarca rttyaayaar aargtnaaya argcnggnmg nggngcnath 240
gcnggnaayg cnwsngtnaa rccngtntay aarwsnytna argcnggnyt ngcnwsngcn 300
ytngtnaaya tggcnttymg nmgngcnwsn ttyccntaya aygtngcntt ymgnwsnytn 360
mgnytnytna araarcaraa rmgntggmgn aayytnaayg cnggnaargc ntgymgnaar 420
tggtaymgnc aracnccnaa ymgngcnaar mgngtnatha aracntgggc nggnggnaar 480
gtnwsnmgnm gngayathga r 501
<210> 2
<211> 167
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
Met Gln Ile Phe Asn Met Arg Thr Asn Asp Glu Gly Val Leu Gly Leu
1 5 10 15
Arg Leu Thr Leu Tyr Lys Asp Thr Arg Gly Phe Trp Thr Ile Gly Ala
20 25 30
Gly Ile Trp Thr Val Cys Ala Asn Pro Val Cys Ala Gly Ala Leu Asp
35 40 45
Arg Met Ile Gly Arg Lys Cys Asn Pro Thr Val Cys Leu Leu Lys Ala
50 55 60
Arg Lys Gln Phe Asn Lys Lys Val Asn Lys Ala Gly Arg Gly Ala Ile
65 70 75 80
Ala Gly Asn Ala Ser Val Lys Pro Val Tyr Lys Ser Leu Lys Ala Gly
85 90 95
Leu Ala Ser Ala Leu Val Asn Met Ala Phe Arg Arg Ala Ser Phe Pro
100 105 110
Tyr Asn Val Ala Phe Arg Ser Leu Arg Leu Leu Lys Lys Gln Lys Arg
115 120 125
Trp Arg Asn Leu Asn Ala Gly Lys Ala Cys Arg Lys Trp Tyr Arg Gln
130 135 140
Thr Pro Asn Arg Ala Lys Arg Val Ile Lys Thr Trp Ala Gly Gly Lys
145 150 155 160
Val Ser Arg Arg Asp Ile Glu
165

Claims (6)

1.一种大肠杆菌嵌合裂解酶LysBM1，其特征在于：其核苷酸序列如Seq ID NO.1所示，氨基酸序列如Seq ID NO.2所示。
2.如权利要求1所述大肠杆菌裂解酶的制备方法，其特征在于，按如下步骤实现：
1）该裂解酶的重组毕赤酵母表达载体的构建 ：如权利要求1所述的大肠杆菌嵌合裂解酶LysBM1的核酸序列和毕赤酵母表达载体 pPIC9K通过双酶切方式构建裂解酶毕赤酵母表达载体 pPIC9K-BM1；
2）毕赤酵母的转化及筛选：用限制性内切酶酶切裂解酶毕赤酵母表达载体 pPIC9K-BM1与酵母 GS115 感受态细胞通过电击法制备电转细胞，将细胞涂布于含 2.0mg/ml G418的 MD D-山梨醇平板，所述的平板含有1.34％ YNB，4×10-5％生物素，2％ D-葡萄糖，1M D-山梨醇 ，然后倒置平板于 28-30℃培养，2-4 天后出现转化子，筛选出高表达菌株；
随机挑取生长出的酵母菌落于 YPD 培养，按照 Promega 公司酵母基因组提取试剂盒所述方法提取酵母基因组，并以其为模板进行 PCR 扩增LysBM1基因，电泳显示与大肠杆菌嵌合裂解酶LysBM1序列大小一致，说明酵母高效表达菌株建立成功；
3）诱导表达 ：挑取阳性克隆，分别接种于 50mlBMGY 培养基，所述的培养基为酵母提取物1%，胰蛋白胨 2%，磷酸钾缓冲液(pH6.0)100mmol/L，YNB 1.34%，生物素4×10 -5 %，甘油1%，30℃，250rpm 振荡培养至 OD600 在 4-6 之间时取出，1500g 离心 5min，收集酵母细胞，然后重悬于装有 1/5 体积的 BMMY 培养基中，其中所述的培养为酵母提取物1%、胰蛋白胨 2%、磷酸钾缓冲液pH6.0 100mmol/L、YNB 1.34%、生物素4×10 -5 %、甲醇 3%，三角瓶中继续培养，24 小时以后，每天补加甲醇至终浓度为 2.5-3％， 持续培养 6-10 天，离心取上清；电泳显示有目的蛋白表达，经测定蛋白量可达到 200mg/L 。
3.如权利要求1所述一种大肠杆菌嵌合裂解酶LysBM1在制备防治大肠杆菌感染和污染药物中的应用。
4.权利要求3所述的一种大肠杆菌嵌合裂解酶LysBM1的应用，其特征在于将纯化的裂解酶产物制备防治奶牛养殖场中大肠杆菌引起的奶牛乳房炎药物中的应用。
5.权利要求1所述的一种大肠杆菌嵌合裂解酶LysBM1的应用，其特征在于以重组表达抗菌肽嵌合大肠杆菌嵌合裂解酶LysBM1裂解酶产物制成抗感染药物。
6.权利要求1所述的一种大肠杆菌嵌合裂解酶LysBM1的应用，其特征在于：将纯化的裂解酶产物与各种赋形剂复配后制备防治各种大肠杆菌的感染和污染药物中的应用。
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