JP2020054339A - アレルゲン検出のための組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
アレルギーは、世界中の何百万もの人々が罹患している重大な病状であり、米国では、多くの子供を含む約1500万人の人々が罹患している。アレルギー反応の間、免疫系はアレルゲンを誤って脅威として標的とし、攻撃する。アレルギー反応は、皮膚、消化器系、消化管、呼吸器系、循環器系及び心血管系に影響を与え、一部のアレルギー反応では、複数の臓器系が影響を受ける。アレルギー反応は、軽度から重度の範囲にわたり、あるいは生命を脅かす。重度の症状は、呼吸困難、低血圧、胸痛、意識喪失、及びアナフィラキシーを含みうる。食物アレルギーは、全ての工業先進国において大きな健康問題である。食物アレルギーを有する人々は、現状では、特異的アレルゲンを含有する可能性のあるあらゆる食品を避けることによって、アレルギーを制御している。これらの制限は患者の生活の質に大きな影響を与え、食品の実際のアレルゲン含量を評価する方法はないままである。米国では、食物アレルギーの症状により、3分ごとに1人が緊急治療室に送られる。
一部の実施形態では、本発明の組成物は、高親和性でアレルゲンに特異的に結合することができる核酸アプタマーに基づくシグナル生成ポリヌクレオチド(SPN)を含む。他の実施形態では、前記SPNは、核酸配列の一端にフルオロフォア、反対の端にクエンチャーをさらに含む。本発明のSPNは、ポリヌクレオチド配列を含んでもよく、ここでポリヌクレオチド配列の5’端の5〜20核酸塩基残基は、ヘアピン構造を形成することができる配列の3’端の5〜20核酸塩基残基と少なくとも80%相補性であり、それによりクエンチャーを、フルオロフォアの蛍光をクエンチするためにフルオロフォアに対して十分近接させている。
一部の実施形態では、試験試料中の1つ又は複数のアレルゲンを検出するためのアッセイ及び方法が本発明で提供される。一部の実施形態では、方法は、(a)アレルゲンを含む疑いがある試験試料を得る工程と、(b)試験試料を処理し、処理された試料から抽出バッファーを使用してタンパク質を抽出する工程と、(c)工程(b)のタンパク質抽出物を、アレルゲンに特異的に結合するSPNと混合する工程と、(d)エネルギー励起によりSPNを活性化する工程と、(e)SPNとアレルゲンタンパク質との間の相互作用を視覚化し、試験試料中のアレルゲンの不在又は存在を検出する工程を備えてもよい。一部の実施形態では、試験試料から抽出された総タンパク質が決定され、抽出バッファーは、タンパク質抽出を最大とするために最適化される。他の実施形態では、試験試料中に存在するアレルゲンの量が決定される。
本発明の組成物
本明細書において、組成物、組成物の設計、調製、使用及び製造のための方法、ならびに試料中の標的タンパク質、特にアレルゲンタンパク質を検出するための方法及びアッセイを説明する。
アプタマー
本発明によれば、本発明の組成物は、限定されないが、1つ又は複数のアレルゲンに対して会合又は結合することができる任意の1つ又は複数の分子を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物は、1つ又は複数のアプタマーを含む。
ligands by exponential enrichment、指数関数的濃縮によるリガンドの組織的進化)を通じて工学的に作製される核酸種である。核酸アプタマーは、古典的ワトソン−クリック(Watson−Crick)塩基対合以外の相互作用を介して分子に対して特別な結合親和性を有する。ファージディスプレイによって生成されたペプチド又はモノクローナル抗体のような核酸アプタマーは、選択された標的に特異的に結合することができ、結合を介して、それらの標的が機能する能力を遮断する。一部の場合では、アプタマーは、ペプチドアプタマーであってもよい。本明細書で使用されるとき、「アプタマー」は、核酸アプタマーをとりわけ指す。
本明細書で使用されるとき、用語「多量体アプタマー」又は「多価アプタマー」は、複数の単量体単位を含むアプタマーを指し、単量体単位のそれぞれは、それ自体アプタマーでありうる。多価アプタマーは、多価結合特性を有する。多量体アプタマーは、ホモ多量体又はヘテロ多量体でありうる。用語「ホモ多量体」は、同じ種類の複数の結合単位を含む多量体アプタマーを指し、つまりそれぞれの単位は、同じ標的分子の同じ結合部位に結合する。用語「ヘテロ多量体」は、様々な種類の複数の結合単位を含む多量体アプタマーを指し、つまり、それぞれの結合単位は同じ標的分子の様々な結合部位に結合するか、又はそれぞれの結合単位は様々な標的分子の結合部位に結合する。したがって、ヘテロ多量体は、様々な結合部位(sties)で1つの標的分子へ結合する多量体アプタマー、又は様々な標的分子へ結合する多量体アプタマーを指しうる。様々な標的分子に結合するヘテロ多量体は、多特異的多量体としても参照されうる。
一部の実施形態では、核酸アプタマーは、P(O)O基がP(O)S(「チオエート」)、P(S)S(「ジチオエート」)、P(O)NR2(「アミデート」)、P(O)R、P(O)OR’、COもしくはCH2(「ホルムアセタール」)又は3’−アミン(−NH−CH2−CH2−)で置き換えられて提供され、ここで各R又はR’は独立してH又は置換されたもしくは置換されていないアルキルである。連結基は、−O−、−N−又は−S−連結を通じて隣接するヌクレオチドに付加させることができる。核酸アプタマーにおける全ての連結が同一である必要はない。
アプタマーコンジュゲート及び標識
一部の実施形態では、本発明のアプタマーは、コンジュゲートを含みうる。本発明のそのようなコンジュゲートは、天然物質又はリガンド、タンパク質など;炭水化物(例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンもしくはヒアルロン酸)又は脂質ならびに組換えもしくは合成分子、合成ポリマーなどを含みうる。
protocols.)、335巻、シュプリンガー(Springer)、2006に記載されており、これらの文献は全体として本願明細書に援用する。
シグナル生成ポリヌクレオチド(SPN)
ある特定の実施形態によれば、アレルゲン標的に対して高親和性及び特異性で結合するときに検出可能なポリヌクレオチド配列が提供される。そのようなポリヌクレオチド配列は、本明細書において上述されるSELEXプロセスを使用して製造されてもよい。
ある特定の実施形態では、5’端のフルオロフォア分子は、Gヌクレオチド残基により生じるクエンチを防ぐために、Tヌクレオチド残基に結合される。
実施例で記載されたSELEXプロセスから選択された核酸アプタマーに加えて、シグナル生成ポリヌクレオチドは、他の研究から選択されたアプタマーを使用して設計されてもよい。5’端及び3’端ヌクレオチド、フルオロフォア/クエンチャー対及びステム−ループ構造を、上記基準にしたがってさらに設計し、標的に対するそれらの結合親和性及び特異性について試験してもよい。
of diverse analytes with an aptazyme ligase array)、Analytical Biochemistry、2003、312:106−1 12、これらの文献はそれぞれ全体として本願明細書に援用する)に特異的なアプタマーが含まれうる。それぞれの開示からのアプタマーの核酸配列は、表2に列挙されている。
cedar pollen for biosensing applications)、Biosens Bioelectron.、2015、63、159−165)、ルーピン粉中に存在するlup an 1(β−コングルチン)サブユニット(スボボドバら(Svobodova et al.)、β−コングルチン食物アレルゲンの超高感度アプタマーに基づく検出(Ultrasensitive aptamer based detection of β−conglutin food allergen)、Food Chem.、2014、165、419−423;ならびにマイライら(Mairal et al.)、選択的及び高感度Lup an 1アレルゲン検出のためのFRETに基づく二量体アプタマープローブ(FRET−based dimeric aptamer probe for selective and sensitive Lup an 1 allergen detection)、Biosens Bioelectron.、2014、54:207−210)、ならびにグリアジン(グルテン)(ピント エイら(Pinto A eta l.)、リアルタイムアプタPCRによって媒介されるグリアジン食物アレルゲンの標識フリー検出(Label−free detection of gliadin food allergen mediated by real−time apta−PCR)、Anal Bioanal Chem.、2014、406(2):515−524)に結合するアプタマーを使用して開発されてもよく、これらの文献はそれぞれ全体として本願明細書に援用する。
一部の実施形態では、シグナル生成ポリヌクレオチドは、病原体に対する検出分子として選択されるアプタマーを使用して開発されてもよい。非限定的な例として、サルモネラ菌、リステリア菌、大腸菌(E.coli)、コウジカビ(aspergillus fumigatus)を特異的に認識することができるアプタマーを使用して、本明細書に記載されるシグナル生成ポリヌクレオチド(SPN)を設計してもよい。そのようなアプタマーは、例えば、ハン及びリー(Han and Lee)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella Typhimurium)に特異的なRNAアプタマーのin Vitro選択(In Vitro Selection of RNA Aptamer Specific to Salmonella Typhimurium)、Journal of Microbiology and Biotechnology,2013、23:878−884;ヒョン、ジェイら(Hyeon,J. et al.)、サルモネラ・エンテリティディス(Salmonellas Enteritidiss)の検出のためのRNAアプタマーの開発(Development of RNA Aptamers for Detection of Salmonellas Enteritidiss)、Journal of Microbiological Methods、2012、89:79−82;オークら(Ohk et al.)、食品からのリステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)の特異的検出のための抗体−アプタマー機能化光ファイバーバイオセンサー(Antibody−aptamer functionalized fibre−optic biosensor for specific detection of Listeria monocytogenes from food)、J. Appl. Microbiol.、2010、109:808−817;リ、エイチら(Li,H. et al.)、大腸菌(Escherichia coli)K88の検出のためのアプタマー選択(Aptamer selection for the detection of Escherichia coli K88)、Canadian
Journal of Microbiology、2011、57:453−459;リーら(Lee at al.)、大腸菌O157のin vitro選択:H7特異的RNAアプタマー(In vitro selection of Escherichia coli O157:H7−specific RNA aptamer)、Biochemical and Biophysical Research Communications、2012、417:214−220;アリら(Ali et al.)、細菌指標としての蛍光発生DNAザイム オベス(Fluorogenic DNAzyme obes as Bacterial Indicators)、Angewandte Chemie International Edition、2011、50:3751−3754;ならびにデグラッセ ジェイエー(DeGrasse JA)、黄色ブドウ球菌エンテロトキシンBに選択的に結合する一本鎖DNAアプタマー(A Single−Stranded DNA Aptamer That Selectively Binds to Staphylococcus aureus Enter otoxin B)、Plos One、2012、7:e33410で論じられており、これらの文献はそれぞれ全体として本願明細書に援用する。表3は、これらの開示からのそのようなアプタマーの配列を列挙する。
他の実施形態では、当業者であれば想像しうるように、非タンパク質標的、例えば小分子に対して特異的に結合するアプタマーも、本明細書に記載されるシグナル生成ポリヌクレオチドを設計するために使用されうる。表4は、非限定的な例としての一部のアプタマーの配列を列挙する(ファーガソンら(Ferguson et al.)、アロステリックリボザイムの選択のための新規戦略により、カフェイン及びアスパルテームに対するリボレポーターTMセンサを得る(A novel strategy for selection of allosteric ribozymes yields RiboReporter TM sensors for caffeine and aspartame)、Nucleic Acids Research、2004、32:1756−1766;ならびにオノ及びトガシ(Ono and Togashi)、水溶液中の水銀(II)に対するオリゴヌクレオチドに基づく高選択性センサ(Highly selective oligonucleotide−based sensor for mercury(II) in aqueous solutions)、Angew. Chem. Int. Ed.,2004、43:4300−4302)。
シグナル生成ポリヌクレオチドの標的
本発明は、標的分子に結合する、アプタマーに基づくシグナル生成ポリヌクレオチド(SPN)を提供する。後述するように、標的分子は、アレルゲンタンパク質又はそのバリアントでありうる。一部の実施形態では、SPNは、それ自体アレルゲンと会合するタンパク質又は他の生体分子と結合又は会合するように設計されうる。
アレルゲン
一部の実施形態では、アレルゲンは、食物アレルゲンである。食物に関連するアレルゲン性タンパク質の例としては、限定されないが、ブラインシュリンプ(Art fir 5)、カニ(Cha f 1)、北海エビ(Cra c 1、Cra c 2、Cra c 4、Cra c 5、Cra c 6、Cra c 8)、アメリカンロブスター(Hom a 1、Hom a 3、Hom a 6)、ホワイトシュリンプ(Lit v
1、Lit v 2、Lit v 3、Lit v4)、ジャイアント淡水エビ(Mac r 1)、エビ(Met e 1、Pen a 1、Pen i 1)、北部エビ(Pan b 1)、イセエビ(Pan s 1)、ブラックタイガーエビ(Pen m 1、Pen m 2、Pen m 3、Pen m 4、Pen m 6)、狭ツメガエルザリガニ(Pon i 4、Pon i 7)、青スイマーカニ(Por p 1)、畜牛(Bos d 4、Bos d 5、Bos d 6、Bos d 7、Bos d
8、Bos d 9、Bos d 10、Bos d 11、Bos d 12)、大西洋ニシン(Clu h 1)、コイ(Cyp c 1)、バルトタラ(Gad c 1)、大西洋タラ(Gad m 1、Gad m 2、Gad m 3)、タラ(Gad c 1)、ニワトリ(Gal d 1、Gal d 2、Gal d 3、Gal d 4、Gal d 5)、バラマンディ(Barramunda)(Lat c 1)、メグリム(Lepidorhombus whiffiagonis)(Lep w 1)、シロザケ(Onc k 5)、大西洋サケ(Sal s 1、Sal s 2、Sal
s 3)、ニジマス(Onc m 1)、モザンビークティラピア(Ore m 4)、食用カエル(Ran e 1、Ran e 2)、パシフィックピルチャード(Sar
sa 1)、海洋パーチ(Seb m 1)、キハダ(Thu a 1、Thu a 2、Thu a 3)、メカジキ(Xip g 1)、アワビ(Hal m 1)、ヒメリンゴマイマイ(Hel as 1)、イカ(Tod p 1)、パイナップル(Ana
c 1、Ana c 2)、アスパラガス(Aspa o 1)、オオムギ(Hor v 12、Hor v 15、Hor v 16、Hor v 17、Hor v 20、Hor v 21)、バナナ(Mus a 1、Mus a 2、Mus a 3、Mus a 4、Mus a 5)、バナナ(Musxp1)、イネ(Ory s 12)、ライ麦(Sec c 20)、小麦(Tri a 12、Tri a 14、Tri a 18、Tri a 19、Tri a 25、Tri a 26、Tri a 36、Tri a 37)、トウモロコシ(コーン)(Zea m 14、Zea m 25)、キウイフルーツ(Act c1、Act c 2、Act c 5、Act c 8、Act c 10、Act d 1、Act d 2、Act d 3、Act d 4、Act d 5、Act d 6、Act d 7、Act d 8、Act d 9、Act d 10、Act d 11)、カシューナッツ(Ana o 1、Ana
o 2、Ana o 3)、セロリ(Api g 1、Api g 2、Api g 3、Api g 4、Api g 5、Api g 6)、落花生(Ara h 1、Ara h 2、Ara h 3、Ara h 4、Ara h 5、Ara h 6、Ara h 7、Ara h 8、Ara h 9、Ara h 10、Ara h 11、Ara h 12、Ara h 13)、ブラジルナッツ(Ber e 1、Ber e 2)、オリエンタルマスタード(Bra j 1)、ナタネ(Bra n 1)、キャベツ(Bra o 3)、カブ(Bra r 1、Bra r 2)、ピーマン(Cap a lw、Cap a 2)、ペカン(Car i 1、Car i 4)、クリ(Cas s 1、Cas s 5、Cas s 8、Cas s 9)、レモン(Cit
I 3)、タンジェリン(Cit r 3)、スイートオレンジ(Cit s 1、Cit s 2、Cit s 3)、ハシバミ(Cor a 1、Cor a 2、Cor
a 8、Cor a 9、Cor a 11、Cor a 12、Cor a 13、Cor a 14)、マスクメロン(Cuc m 1、Cuc m 2、Cuc m 3)、ニンジン(Dau c 1、Dau c 4、Dau c 5)、普通ソバ(Fag
e 2、Fag e 3)、韃靼ソバ(Fag t 2)、イチゴ(Fra a 1、Fra a 3、Fra a 4)、大豆(Gly m 1、Gly m 2、Gly m 3、Gly m 4、Gly m 5、Gly m 6、Gly m 7、Gly m 8)、ヒマワリ(Hel a1、Hel a 2、Hel a 3)、黒クルミ(Jug n 1、Jug n 2)、セイヨウグルミ(Jug r 1、Jug r 2、Jug r 3、Jug r 4)、栽培レタス(Lac s 1)、レンズマメ(Len c 1、Len c 2、Len c 3)、ライチ(Lit c 1)、ホソバアオバナルーピン(narrow−leaved blue lupin)(Lup an
1)、リンゴ(Mal d 1、Mal d 2、Mal d 3、Mal d 4)、キャッサバ(Man e 5)、クワ(Mor n 3)、アボカド(Pers a 1)、サヤインゲン(Pha v 3)、ピスタチオ(Pis v 1、Pis v 2、Pis v 3、Pis v 4、Pis v 5)、エンドウ(Pis s 1、Pis s 2)、アプリコット(Pru ar 1、Pru ar 3)、オウトウ(Pru av 1、Pru av 2、Pru av 3、Pru av 4)、セイヨウスモモ(Pru d 3)、アーモンド(Pru du 3、Pru du 4、Pru
du 5、Pru du 6)、モモ(Pru p 1、Pru p 2、Pru p
3、Pru p 4、Pru p 7)、ザクロ(Pun g 1)、ナシ(Pyr c 1、Pyr c 3、Pyr c 4、Pyr c 5)、トウゴマ(Ric c 1)、赤ラズベリー(Rub i 1、Rub i 3)、ゴマ(Ses i 1、Ses i 2、Ses i 3、Ses i 4、Ses i 5、Ses i 6、Ses i 7)、イエローマスタード(Sin a 1、Sin a 2、Sin a 3、Sin a 4)、トマト(Sola I 1、Sola I 2、Sola I 3、Sola I 4)、ジャガイモ(Sola t 1、Sola t 2、Sola t 3、Sola t 4)、緑豆(Vig r 1、Vig r 2、Vig r 3、Vig r 4、Vig r 5、Vig r 6)、ブドウ(Vit v 1)、ナツメ(Ziz m 1)、アナカルディウム・オクシデンタル(Anacardium occidentale)(Ana o 1.0101、Ana o 1.0102)、アピウム・グラヴェオレンス(Apium graveolens)(Api g 1.0101、Api g 1.0201)、ダウカス・カロタ(Daucus carota)(Dau c1.0101、Dau c1.0102、Dau c1.0103、Dau c1.0104、Dau c1.0105、Dau c1.0201)、シトラス・シネンシス(Citrus sinensis)(Cit s3.0101、Cit s3.0102)、グリシン・マックス(Glycine max)(Gly m1.0101、Gly m1.0102、Gly m3.0101、Gly m3.0102)、レンズ・クリナリス(Lens culinaris)(Len c1.0101、Len c1.0102、Len c1.0103)、ピサム・サティバム(Pisum sativum)(Pis s1.0101、Pis s1.0102)、リコペルシコン・サティバム(Lycopersicon sativum)(Lyc e2.0101、Lyc e2.0102)、フラグリア・アナナッサ(Fragaria ananassa)(Fra a3.0101、Fra a3.0102、Fra a3.0201、Fra a3.0202、Fra a3.0203、Fra a3.0204、Fra a3.0301)、マルス・ドメスティカ(Malus domestica)(Mal d1.0101、Mal d1.0102、Mal d1.0103、Mal d1.0104、Mal d1.0105、Mal d1.0106、Mal d1.0107、Mal d1.0108、Mal d1.0109、Mal d1.0201、Mal d1.0202、Mal d1.0203、Mal d1.0204、Mal d1.0205、Mal d1.0206、Mal d1.0207、Mal d1.0208、Mal d1.0301、Mal d1.0302、Mal d1.0303、Mal d1.0304、Mal d1.0401、Mal d1.0402、Mal d1.0403、Mal d3.0101w、Mal d3.0102w、Mal d3.0201w、Mal d3.0202w、Mal d3.0203w、Mal d4.0101、Mal d4.0102、Mal d4.0201、Mal d4.0202、Mal d4.0301、Mal d4.0302)、プリムス・アビウム(Primus avium)(Pru av1.0101、Pru av1.0201、Pru av1.0202、Pru av1.0203)、及びプルヌス・ペルシカ(Prunus
persica)(Pru p4.0101、Pru p4.0201);ならびにそれらの任意のバリアントが含まれる。食品に関連するアレルゲンの名前は、組織的に命名され、IUISアレルゲン命名分科委員会(allergen nomenclature subcommittee)によってリスト化されている(国際免疫学会連合(International Union of Immunological Societies)アレルゲン命名分科委員会、イソアレルゲン及びバリアントのリスト参照)。
3、Dac g 4、Dac g 5)、ヒロハノウシノケグサ(meadow fescue)(Fes p 4)、シラゲガヤ(velvet grass)(Hol I
1、Hol I 5)、大麦(Hor v 1、Hor v 5)、ドクムギ(rye
grass)(Lol p 1、Lol p 2、Lol p 3、Lol p 4、Lol p 11)、バヒアグラス(bahia grass)(Pas n 1)、カナリークサヨシ(canary grass)(Pha a 1、Pha a 5)、オオアワガエリ(timothy)(Phl p 1、Phl p 2、Phl p 4、Phl p 5、Phl p 6、Phl p 7、Phl p 11、Phl p 12、Phl p 13)、ナツメヤシ(date palm)(Pho d 2)、ナガハグサ(Kentucky blue grass)(Poa p 1、Poa p 5)、ライ麦(Sec c 1、Sec c 5、Sec c 38)、セイバンモロコシ(Johnson grass)(Sor h 1)、小麦(Tri a 15、Tri
a 21、Tri a 27、Tri a 28、Tri a 29、Tri a 30、Tri a 31、Tri a 32、Tri a 33、Tri a 34、Tri a 35、Tri a 39)、トウモロコシ(Zea m 1、Zea m 12)、ハンノキ(Aln g 1、Aln g 4)、アオゲイトウ(redroot pigweed)(Ama r 2)、ブタクサ(short ragweed)(Amb
a 1、Amb a 2、Amb a 3、Amb a 4、Amb a 5、Amb
a 6、Amb a 7、Amb a 8、Amb a 9、Amb a 10、Amb a 11)、ブタクサモドキ(western ragweed)(Amb p 5)、オオブタクサ(giant ragweed)(Amb t 5)、ヨモギ(Art
v 1、Art v 2、Art v 3、Art v 4、Art v 5、Art
v 6)、テンサイ(Beta v 1、beta v 2)、ヨーロッパシラカバ(Bet v 1、Bet v 2、Bet v 3、Bet v 4、Bet v 6、Bet v 7)、カブ(Bra r 5)、シデ(Car b 1)、クリ(Cas s 1)、ツルニチニチソウ(rosy periwinkle)(Cat r 1)、アカザ(lamb’s−quarters、pigweed)(Che a 1、Che
a 2、Che a 3)、アラビアコーヒー(Cof a 1、Cof a 2、Cof a 3)、ハシバミ(Cor a 6、Cor a 10)、ヘーゼルナッツ(Cor a1.04、Cor a2、Cor a8)、ヨーロッパブナ(Fag s 1)、灰(Fra e 1)、ヒマワリ(Hel a 1、Hel a 2)、パラゴムノキ(Hev b 1、Hev b 2、Hev b 3、Hev b 4、Hev b 5、Hev b 6、Hev b 7、Hev b 8、Hev b 9、Hev b 10、Hev b 11、Hev b 12、Hev b 13、Hev b 14)、金葎(Hum j 1)、イボタ(Lig v 1)、メルクリアリス・アヌア(Mercurialis annua)(Mer a 1)、オリーブ(Ole e 1、Ole
e 2、Ole e 3、Ole e 4、Ole e 5、Ole e 6、Ole
e 7、Ole e 8、Ole e 9、Ole e 10、Ole e 11)、ヨーロッパホップホーンビーン(Ost c 1)、パリエタリア・ジュダイカ(Parietaria judaica)(Par j 1、Par j 2、Par j 3、Par j 4)、パリエタリア・オフィシナリス(Parietaria officinalis)(Par o 1)、プランタゴ・ランセオラタ(Plantago lanceolata)(Pal I 1)、ロンドン・プレイン・ツリー(Pla a
1、Pla a 2、Pla a 3)、プラタナス・オリエンタリス(Platanus orientalis)(Pla or 1、Pla or 2、Pla or 3)、ホワイトオーク(Que a 1)、ロシアアザミ(Russian thistle)(Sal k 1、Sal k 2、Sal k 3、Sal k 4、Sal k 5)、トマト(Sola I 5)、ライラック(Syr v 1、Syr v 5)、ロシアアザミ(Russian−thistle)(Sal k 1)、イギリスオオバコ(Pla l1)、アムブロシア・アルテミシフォリア(Ambrosia artemisiifolia)(Amb a8.0101、Amb a8.0102、Amb a9.0101、Amb a9.0102)、プランタゴ・ランセオラタ(Plantago lanceolata)(Pla 11.0101、Pla 11.0102、Pla 11.0103)、パリエタリア・ジュダイカ(Parietaria judaica)(Par j 3.0102)、シノドン・ダクチロン(Cynodon dactylon)(Cyn d1.0101、Cyn d1.0102、Cyn d1.0103、Cyn d1.0104、Cyn d1.0105、Cyn d1.0106、Cyn d1.0107、Cyn d1.0201、Cyn d1.0202、Cyn d1.0203、Cyn d1.0204)、ホルクス・ラナツス(Holcus lanatus)(Hol I1.0101、Hol I1.0102)、ロリウム・ペレネ(Lolium perenne)(Phl p1.0101、Phl p1.0102、Phl p4.0101、Phl p4.0201、Phl p5.0101、Phl p5.0102、Phl p5.0103、Phl p5.0104、Phl p5.0105、Phl p5.0106、Phl p5.0107、Phl p5.0108、Phl p5.0201、Phl p5.0202)、セカレ・セレアル(Secale cereale)(Sec c20.0101、Sec c20.0201)、ベツラ・ベルコサ(Betula Verrucosa)(Bet v1.0101、Bet v1.0102、Bet v1.0103、Bet v1.0201、Bet v1.0301、Bet v1.0401、Bet v1.0402、Bet v1.0501、Bet v1.0601、Bet v1.0602、Bet v1.0701、Bet v1.0801、Bet v1.0901、Bet v1.1001、Bet v1.1101、Bet v1.1201、Bet v1.1301、Bet v1.1401、Bet v1.1402、Bet v1.1501、Bet v1.1502、Bet v1.1601、Bet v1.1701、Bet v1.1801、Bet v1.1901、Bet v1.2001、Bet v1.2101、Bet v1.2201、Bet v1.2301、Bet v1.2401、Bet v1.2501、Bet v1.2601、Bet v1.2701、Bet v1.2801、Bet v1.2901、Bet v1.3001、Bet v1.3101、Bet v6.0101、Bet v6.0102)、カルピナス・ベツルス(Carpinus betulus)(Car b1.0101、Car b1.0102、Car b1.0103、Car b1.0104、Car b1.0105、Car b1.0106、Car
b1.0106、Car b1.0106、Car b1.0106、Car b1.0107、Car b1.0107、Car b1.0108、Car b1.0201、Car b1.0301、Car b1.0302)、コリルス・アベラナ(Corylus avellana)(Cor a1.0101、Cor a1.0102、Cor a1.0103、Cor a1.0104、Cor a1.0201、Cor a1.0301、Cor a1.0401、Cor a1.0402、Cor a1.0403、Cor a1.0404)、リグストルム・ブルガレ(Ligustrum vulgare)(Syr v1.0101、Syr v1.0102、Syr v1.0103)、クリプトメリア・ジャポニカ(Cryptomeria japonica)(Cry j2.0101、Cry j2.0102)、及びキュプレッサス・セムパービレンス(Cupressus sempervirens)(Cup s1.0101、Cup s1.0102、Cup s1.0103、Cup s1.0104、Cup s1.0105);ならびにそれらの任意のバリアントが含まれる。
against Lup an 1 (β−conglutin))、Anal. Bioanal. Chem.405:9343−9349)。
12、Blo t 13、Blo t 19、Blot t 21);アメリカハウスダストダニ(Der f 1、Der f 2、Der f 3、Der f 7、Der f 10、Der f 11、Der f 13、Der f 14、Der f 15、Der f 16、Der f 17、Der f 18、Der f 22、Der f 24);デルマトファゴイデス・ミクロセラス(Dermatophagoides microceras)(ハウスダストダニ)(Der m 1);ヨーロッパハウスダストダニ(Der p 1、Der p 2、Der p 3、Der p 4、Der p 5、Der p 6、Der p 7、Der p 8、Der p 9、Der p 10、Der p 11、Der p 14、Der p 15、Der
p 20、Der p 21、Der p 23);ユーログリファス・マイネイ(Euroglyphus maynei)(ハウスダストダニ)(Eur m 2、Eur
m 2、Eur m 3、Eur m 4、Eur m 14);貯蔵庫ダニ(Aca
s 13、Gly d 2、Lep d 2、Lep d 5、Lep d 7、Lep d 10、Lep d 13、Tyr p 2、Tyr p 3、Tyr p 10、Tyr p 13、Tyr p 24)、デルマトファゴイデス・ファリナエ(Dermatophagoides farinae)(Der f1.0101、Der f1.0102、Der f1.0103、Der f1.0104、Der f1.0105、Der f2.0101、Der f2.0102、Der f2.0103、Der f2.0104、Der f2.0105、Der f2.0106、Der f2.0107、Der f2.0108、Der f2.0109、Der f2.0110、Der f2.0111、Der f2.0112、Der f2.0113、Der f2.0114、Der f2.0115、Der f2.0116、Der f2.0117)、デルマトファゴイデス・プテロニシヌス(Dermatophagoides pteronyssinus)(Der p1.0101、Der p1.0102、Der p1.0103、Der p1.0104、Der p1.0105、Der p1.0106、Der p1.0107、Der p1.0108、Der p1.0109、Der p1.0110、Der p1.0111、Der p1.0112、Der p1.0113、Der p1.0114、Der p1.0115、Der p1.0116、Der p1.0117、Der p1.0118、Der p1.0119、Der p1.0120、Der p1.0121、Der p1.0122、Der p1.0123、Der p2.0101、Der p2.0102、Der p2.0103、Der p2.0104、Der p2.0105、Der p2.0106、Der p2.0107、Der p2.0108、Der p2.0109、Der p2.0110、Der p2.0111、Der p2.0112、Der p2.0113)、ユーログリファス・マイネイ(Euroglyphus maynei)(Eur m2.0101、Eur m2.0102)、レピドグリファス・デストラクター(Lepidoglyphus destructor)(Lep d2.0101、Lep d2.0101、Lep d2.0101、Lep d2.0102、Lep d2.0201、Lep d2.020)及びグリシファガス・ドメスティカス(Glycyphagus domesticus)(Gly d2.0101、Gly d2.0201);ならびにそれらの任意のバリアントが含まれる。
f 1、Can f 2、Can f 3、Can f 4、Can f 5、Can
f 6)、畜馬(Equ c 1、Equ c 2、Equ c 3、Equ c 4、Equ c 5)、ネコ(Fel d 1、Fel d 2、Fel d 3、Fel
d 4、Fel d 5w、Fel d 6w、Fel d 7、Fel d 8)、マウス(Mus m 1)、モルモット(Cav p 1、Cav p 2、Cav p
3、Cav p 4、Cav p 6)、ウサギ(Ory c 1、Ory c 3、Ory c 4)ラット(Rat n 1)、ボース・ドメスティカス(Bos domesticus)(Bos d 2.0101、Bos d 2.0102、Bos d
2.0103)及びエクゥウス・カバルス(Equus caballus)(Equ
c2.0101、Equ c2.0102);ならびにそれらの任意のバリアントが含まれる。
3)、東ハイブハチ(Eastern hive bee)(Api c 1)、オオミツバチ(Api d 1)、ミツバチ(Api m 1、Api m 2、Api m
3、Api m 4、Api m 5、Api m 6、Api m 7、Api m
8、Api m 9、Api m 10、Api m 11、Api m 12)、鳩扁ダニ(Arg r 1)、チャバネゴキブリ(Bla g 1、Bla g 2、Bla g 3、Bla g 4、Bla g 5、Bla g 6、Bla g 7、Bla g 8、Bla g 11)、クマバチ(Bom p 1、Bom p 4、Bom
t 1、Bom t 4)、カイコガ(Bomb m 1)、ユスリカ(Chi k 10、Chi t 1、Chi t 1.01、Chi t 2、Chi t 2.0101、Chi t 2.0102、Chi t 3、Chi t 4、Chi t 5、Chi t 6、Chi t 6.01、Chi t 7、Chi t 8、Chi t
9)、ネコノミ(Cte f 1、Cte f 2、Cte f 3)、キイロスズメバチ(Dol a 5)、北米産スズメバチ(Dol m 1、Dol m 2、Dol
m 5)、ヌカカ(For t 1、For t 2)、サバンナツェツェバエ(Glo m 5)、アジアテントウムシ(Har a 1、Har a 2)、シミ(Lep
s 1)、チャタテムシ(Lip b 1)、ブルドッグアリキバハリアリ(Australian jumper ant)(Myr p 1、Myr p 2、Myr p
3)、アメリカゴキブリ(Per a 1、Per a 3、Per a 6、Per
a 7、Per a 9、Per a 10)、ノシメマダラメイガ(Plo i 1、Plo i 2)、アシナガバチ(Pol a 1、Pol a 2、Pol a 5、Pol e 1、Pol e 4、Pol e 5、Pol f 5、Pol g 1、Pol g 5、Pol m 5、Poly p 1、Poly s 5、Ves vi 5)、地中海コアシナガバチ(Pol d 1、Pol d 4、Pol d 5)、熱帯ヒアリ(Sol g 2、Sol g 3、Sol g 4)、ソレノプシス・インビクタ(Solenopsis invicta)(アカヒアリ)(Sol I 1、Sol I 2、Sol I 3、Sol I 4)、クロヒアリ(Sol r 2、Sol r 3)、ブラジルヒアリ(Sol s 2、Sol s 3)、ウシアブ(Tab y 1、Tab y 2、Tab y 5)、マツカレハ(pine processionary moth)(Tha p 1、Tha p 2)、オオサシガメ(Tria p 1)、モンスズメバチ(Vesp c 1、Vesp c 5)、ベスパ・マグニフィカ(Vespa magnifica)(スズメバチ)(Vesp ma 2、Vesp ma 5)、ベスパ・マンダリニア(Vespa mandarinia)(アジアオオスズメバチ(Giant asian hornet))(Vesp m1、Vesp m 5)、イエロージャケット(Ves f 5、Ves g 5、Ves m 1、Ves m 2、Ves m 5)、ベスプラ・ゲルマニカ(Vespula germanica)(イエロージャケット)(Ves p 5)、ベスプラ・スクアモサ(Vespula squamosa)(イエロージャケット)(Ves s 1、Ve s s5)、ベスプラ・ブルガリス(Vespula vulgaris)(イエロージャケット)(Ves v 1、Ves v 2、Ves v 3、Ves v 4、Ves v 5、Ves v 6)、ブラテラ・ゲルマニカ(Blattella germanica)(Bla g 1.0101、Bla g 1.0102、Bla g
1.0103、Bla g 1.02、Bla g 6.0101、Bla g 6.0201、Bla g 6.0301)、ペリプラネタ・アメリカナ(Periplaneta Americana)(Per a1.0101、Per a1.0102、Per a1.0103、Per a1.0104、Per a1.02、Per a3.01、Per a3.0201、Per a3.0202、Per a3.0203、Per a7.0101、Per a7.0102)、モンスズメバチ(Vespa crabo)(Ves pc 5.0101、Ves pc 5.0101)、ベスパ・マンダリナ(Vespa mandarina)(Vesp m 1.01、Vesp m 1.02);ならびにそれらの任意のバリアントが含まれる。
fl 13)、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)(真菌)(Asp f 1、Asp f 2、Asp f 3、Asp f 4、Asp f 5、Asp f 6、Asp f 7、Asp f 8、Asp f 9、Asp f 10、Asp f 11、Asp f 12、Asp f 13、Asp f 15、Asp f 16、Asp f 17、Asp f 18、Asp f 22、Asp f 23、Asp f 27、Asp f 28、Asp f 29、Asp f 34)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)(Asp n 14、Asp n 18、Asp n 25)、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)(Asp o 13、Asp o 21)、アスペルギルス・ベルシカラー(Aspergillus versicolor)(Asp v 13)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)(酵母)(Cand a 1、Cand a 3)、カンジダ・ボイジニイ(Candida boidinii)(酵母)(Cand b 2)、クラドスポリウム・クラドスポリオイデス(Cladosporium cladosporioides)(Cla c 9、Cla c 14)、クラドスポリウム・ヘルバルム(Cladosporium herbarum)(Cla h 2、Cla h 5、Cla h 6、Cla h 7、Cla h 8、Cla h 9、Cla h 10、Cla h 12)、カルブラリア・ルナタ(Curvularia lunata)(同義語:コクリオ・ボルスルナトゥス(Cochliobolus lunatus))(Cur I 1、Cur I 2、Cur I 3、Cur I 4)、エピコッカム・パープラスセンス(Epicoccum purpurascens)(土壌菌)(Epi p 1)、フザリウム・クルモルム(Fusarium culmorum)(N.A.)(Fus c 1、Fus c 2)、フザリウム・プラリフェラタム(Fusarium proliferatum)(Fus p 4)、ペニシリウム・ブレビコンパクツム(Penicillium brevicompactum)(Pen b 13、Pen b 26)、ペニシリウム・クリソゲナム(Penicillium chrysogenum)(Pen ch 13、Pen ch 18、Pen ch 20、Pen ch 31、Pen ch 33、Pen ch 35)、ペニシリウム・シトリナム(Penicillium citrinum)(Pen c 3、Pen c 13、Pen c 19、Pen c 22、Pen c 24、Pen c 30、Pen c 32)、ペニシリウム・クルストサム(Penicillium crustosum)(Pen cr 26)、ペニシリウム・オキサリカム(Penicillium oxalicum)(Pen o 18)、スタキボトリス・チャータラム(Stachybotrys chartarum)(Sta c 3)、トリコフィトン・ルブルム(Trichophyton rubrum)(Tri r 2、Tri r 4)、トリコフィトン・トンズランス(Trichophyton tonsurans)(Tri t 1、Tri t 4)、シロシベ・クベンシス(Psilocybe cubensis)(Psi c 1、Psi c 2)、キクバナイグチ(Shaggy cap)(Cop c
1、Cop c 2、Cop c 3、Cop c 5、Cop c 7)、ロドトルラ・ムシラギノーサ(Rhodotorula mucilaginosa)(Rho m 1、Rho m 2)、マラセジア・フルフール(Malassezia furfur)(Malaf2、Malaf3、Malaf4)、マラセチア・シンポジアリス(Malassezia sympodialis)(Malas1、Malas5、Malas6、Malas7、Malas8、Malas9、Malas10、Malas11、Malas12、Malas13)及びアルタナリア・アルタナータ(Alternaria alternate)(Alt a1.0101、Alt a1.0102);ならびにそれらの任意のバリアントが含まれる。
他の標的分子
一部の実施形態では、本発明のSPN及び組成物は、他の標的分子、限定されないが、試料中の病原体微生物、細菌、酵母、真菌、胞子、ウイルス又はプリオン由来などの病原体;疾患タンパク質(例えば、疾患の診断及び予後のためのバイオマーカー);環境中に残存している農薬及び化学肥料;ならびに毒素を検出してもよい。他の実施形態では、本発明のSPN及び組成物は、非タンパク質標的、ミネラル及び小分子(例えば、抗生物質)などに結合しうる。
適用
本発明によれば、本発明の分子、シグナル生成ポリヌクレオチド(SPN)、化合物及び組成物の検出は、広い概念で、多種多様な適用、民間及び戦場での食品安全、診断及び予後試験、環境モニタリング/コントロール、及び生物兵器のための軍事的使用などにおいて、試料中の任意のタンパク質を検出するために使用されうる。さらに広い適用ては、本発明の検出分子、シグナル生成ポリヌクレオチド(SPN)、化合物及び組成物は、核酸に基づく検出分子が結合する任意の物質、水中のミネラルなどを検出するために使用されうる。
検出方法及びアッセイ:食物アレルゲン
一部の実施形態では、試料中の種々のアレルゲン(例えば、食物アレルゲン)を検出するための分析アッセイ及び方法が提供される。提供されるアッセイ及び方法が、試料中の目的のアレルゲンの存在もしくは不在を検出、ならびに/又は試料中のアレルゲンの量を決定することができる。
試料処理及び抽出バッファー
試験試料中のアレルゲンタンパク質を検出するための検出アッセイ及び方法の能力は、本発明で使用される検出分子が試料抽出物中のこれらのタンパク質を検出する効率に加えて、これらのタンパク質が試料から抽出される効率によって影響される。一部の実施形態では、検出アッセイの迅速性、信頼性、高感度を確保するために、試料は処理され、アレルゲンタンパク質が抽出される。試料のサイズ及び重量、抽出溶液及び抽出プロセスは、有効で非破壊的な反応のために、最適化されてもよい。試料を分解できる任意の機構、切断、粉砕、均質化及びろ過などを、単独で又は組み合わせて使用して、試料を処理してもよい。
アレルゲン検出アッセイ
一部の実施形態では、本発明の組成物、化合物、及びシグナル生成ポリヌクレオチドは、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)における代替的分子認識要素として抗体に置き換えて使用されうる。ELISAにおけるアプタマーに基づくシグナル生成ポリヌクレオチドの適用は、酵素結合アプタ吸着アッセイ(enzyme−linked apta−sorbent assay、ELASA)と呼ばれるELISA由来アッセイを生じさせる。ELISA法と同様に、ELASAは、いくつかの異なる構成、直接的、間接的、及びサンドイッチアッセイなどで使用されうる(トーら(Toh et al.)、Biosens. Bioelectron、2015、64、392−403、この文献の内容は全体として本願明細書に援用する)。
al.)、Anal−Bioanal Chem.、2014、406(2)、515−524;及びスボボドバら(Svobodova et al.)、Food Chem.、2014、165、419−423;これらの文献の内容はそれぞれ全体として本願明細書に援用する)。
検出システム及び表示プラットフォーム
アプタマーとタンパク質との相互作用を検出及び表示するために使用される方法及びシステムは、検出結果を表示するために使用されうる。
a cellphone)、Lab Chip.、2013、13(4)、636−640;この文献の内容は全体として本願明細書に援用する)。
製剤、パッケージング、キット、装置及びシステム
製剤:本発明の検出分子、化合物、シグナル生成ポリヌクレオチドは、標準的手順にしたがって製剤化されうる。一部の実施形態では、検出分子、本発明のSPNは、検出分子とアレルゲンとの間の相互作用に有利な溶液中で製剤化されてもよい。
定義
本明細書の様々な箇所において、本開示の化合物の置換基は、群又は範囲で開示されている。本開示は、そのような群及び範囲のメンバーのそれぞれ及び全ての個々の部分組合せも含むことが、とりわけ意図されている。以下は、用語の定義の非限定的列挙である。
相補性及び実質的相補性:本明細書で使用されるとき、用語「相補性」は、互いに塩基対を形成するためのポリヌクレオチドの能力を指す。塩基対は、逆平行ポリヌクレオチド鎖におけるヌクレオチド単位間の水素結合によって典型的に形成される。相補性ポリヌクレオチド鎖は、ワトソン−クリック様式(例えば、A対T、A対U、C対G)又は二重鎖の形成を可能にする任意の他の様式で塩基対を形成することができる。当業者であれば、DNAではなくRNAを使用するとき、チミンではなくウラシルが、アデノシンと相補性であると考えられている塩基であることを知っている。しかしながら、本発明の文脈でUが示されるとき、そうでないことが示されない限り、Tを代替する能力が示唆される。完全に相補性又は100%相補性とは、1つのポリヌクレオチド鎖のそれぞれのヌクレオチド単位が、第2のポリヌクレオチド鎖のヌクレオチド単位と水素結合を形成することができる状況を指す。完全より低い相補性は、2つの鎖の全てではないが一部のヌクレオチド単位が互いに水素結合を形成することができる状況を指す。例えば、20マーでは、各鎖における2つの塩基対のみが互いに水素結合を形成可能である場合、ポリヌクレオチド鎖は10%の相補性を呈する。同じ例で、各鎖における18塩基対が互いに水素結合を形成可能である場合、ポリヌクレオチド鎖は90%の相補性を呈する。
ポリヌクレオチド:本明細書で使用されるとき、用語「ポリヌクレオチド」は、核酸塩基が、糖ホスフェート連結(糖−ホスフェート骨格)により接続されている核酸塩基ポリマー又はオリゴマーを指す。例示的なポリ−及びオリゴヌクレオチドには、2’デオキシリボヌクレオチド(DNA)のポリマー及びリボヌクレオチド(RNA)のポリマーが含まれる。ポリヌクレオチドは、完全にリボヌクレオチドで構成されてもよく、完全に2’デオキシリボヌクレオチドで構成されてもよく、又はそれらの組合せで構成されてもよい。
特異的に結合する:本明細書で使用されるとき、用語「特異的に結合する」は、検出分子(例えば、アプタマー)が、特定の標的、アレルゲンタンパク質などに、代替標的よりも高い頻度で、より迅速に、より長期間及び/又はより高い親和性で、反応又は会合することを意味する。例えば、アレルゲンタンパク質に対して特異的に結合するアプタマーは、そのタンパク質又はその断片に、無関係のタンパク質及び/又はその断片に対する結合よりも高い親和性で、結合活性で、より容易に、及び/又はより長期間結合する。この定義によって、例えば、第1の標的に対して特異的に結合する検出分子(例えば、アプタマー)が、第2の標的に、特異的に結合してもしなくてもよいことが、当業者によって理解される。したがって「特異的結合」は、排他的結合又は別の分子の結合が検出不可であることを必ずしも必要とせず、用語「選択的結合」によって包含される。全体的に、必ずしもそうではないが、結合への参照は、特異的結合を意味する。結合の特異性は、アプタマー及び環境中の他の材料又は一般の無関係の分子についての解離定数と比較した、標的についてのアプタマーの比較解離定数(Kd)という意味で定義される。典型的に、標的についてのアプタマーのKdは、標的及び環境中の無関係の材料又は付随する材料についてのKdよりも、2倍、5倍又は10倍低い。さらにより好適には、Kdは、25倍、50倍、75倍、100倍、150倍、又は200倍低い。
均等物及び範囲
当業者は、本明細書に記載された発明による特定の実施形態に対する多くの均等物を、認識し、通例にすぎない実験を使用して確認することができる。本発明の範囲は、上記説明により限定されることは意図されておらず、添付の請求項において示される通りである。
実施例
この概念実証例では、2つの既知のアプタマー配列を使用して、3つの異なるシグナル生成ポリヌクレオチドを設計した。Ara h 1タンパク質アレルゲンに対するアプタマーは、トランら(Tran et al.) 食品マトリックス中の落花生アレルゲンのFO−SPRバイオセンシングのためのAra h 1タンパク質に対するアプタマーの選択(Selection of aptamers against Ara h 1 protein for FO−SPR biosensing of peanut allergens in food matrices)、Biosensors及びBioelectronics、2013、43、245−251(全体として本願明細書に援用する)に記載されている。このアプタマーの配列は下記に示される。
and Characterization of DNA Aptamers for Egg White Lysozyme)、Molecules,2010、15(3)、1127−1140(全体として本願明細書に援用する)において記載された卵白リゾチームに対するアプタマー配列に基づいて設計された。このアプタマーの配列は下記に示される。
SELEX法に基づくin vitroスクリーニング実験が実施され、アプタマーは、卵、グルテン、乳、大豆、魚類、落花生、カシューナッツ、甲殻類を含むアレルゲン標的に対して、カウンター標的(非標的タンパク質の組合せ)を上回って選択され、さらに標的食物アレルゲンを検出するそれらの性能について工学的に操作された。
実験計画
種々のRNAライブラリーが使用され、100mMのTris(pH8)、5mMのEDTA、150mMのNaCl、10mMのMgC12、0.1%SDS、0.1%ゼラチン、1%NP−40(Tergitol)、0.5%のデオキシコール酸ナトリウムからなる選択バッファー中の結合能力について23℃で選択された。所与の選択ラウンドは、RNAライブラリーメンバーを単独のバッファー中でインキュベート(陰性選択)し、次いで応答(つまり、切断)がなかったライブラリーの一部を回収することで開始した。各ラウンドの第2の部分(要求されるとき)は、先の陰性選択工程からの非応答分子を、非陽性標的の全組合せ(カウンターとして)と、又は第2の陰性選択のため再び選択バッファーのみとインキュベートすることからなった。再び非応答(非切断)分子が回収されることになる。それぞれのラウンドの最終工程は、前工程由来の材料を、陽性標的(必要に応じてアレルゲンのそれぞれ)とバッファー中でインキュベートすること、次いで応答材料(つまり、切断されたRNA)を回収することからなる。各選択ラウンドの後は、DNAを生成するための逆転写、PCRを通じたライブラリー増幅、及び転写によるRNAライブラリーの再生が続いた。多様なランダム配列の初期ライブラリーを、変化のある連続的な選択(つまり、陰性、カウンター及び陽性選択)ラウンドに、再びプロジェクト依存的にかけた後、濃縮されたライブラリーが3つの画分に分割され、並行評価が実行された。
材料及び方法
標的(カシューナッツ、落花生、魚類、乳、大豆、グルテン、卵及び甲殻類由来のタンパク質の複合体)が、必要に応じて乾燥された後、予備分析及びアプタマースクリーニングのためにRNアーゼ不含水と混合された。必要な場合、標的はプールされ、陽性選択標的として指定されていなかった標的の適切な量と組み合わせてカウンター標的混合物が生成された。初期アプタマーライブラリー鋳型及びプライマーが、IDT(米国アイオワ州コーラルビル(Coralville)所在)により一本鎖DNAとして合成された。次いで、ライブラリーは、クロンテック(Clontech)(米国カリフォルニア州マウンテン・ビュー(Mountain View)所在)製のTitanium Taq DNA ポリメラーゼを使用して、二本鎖DNA(dsDNA)を提供するためにプライマー拡張された。
シーケンシング及びバイオインフォマティクス
イルミナ(Illumina)(米国カリフォルニア州サンディエゴ(San Diego)所在)MiSeqシステムが実装されて、ペアエンドリード技術を使用して選択した後のアプタマーがシーケンシングされた。シーケンシングデータのバイオインフォマティクス解析により、候補アプタマー分子を識別した。ディープシーケンシング及びその後のデータ解析は、スクリーニングプロセスによるエラー及びバイアスを誘導しうる、多数の選択を実行する従来的アプローチを簡潔化した(シュッツら(Schutze et al)、次世代シーケンシングを用いたSELEX プロセスのプロービング(Probing the SELEX Process with Next−Generation Sequencing)、PLos One、2011、6(12):e29604)。
アプタマー候補選択
配列ファミリー構築により、モチーフの存在が強調された。このことは陽性標的集団における配列の頻度が因子として含まれたことを意味するが、全集団におけるサブ配列の広がりに対してより重点をおくものである(全配列に対する100%一致はファミリーに属するために必ずしも必要でない)。2つの他の因子が使用されて、モチーフ−ファミリーサイズの重要性が調節され、候補配列が決定された。1つの因子は、陰性及びカウンター標的集団における配列の存在である。3つのライブラリー:陽性標的曝露ライブラリー、バッファーのみの陰性ライブラリー、及びカウンター標的曝露ライブラリーが、並行評価から回収された。全てのライブラリーが分析されて、陰性−又はカウンター選択工程の間に除去されていないが標的及びカウンター標的の両方に親和性を有するいくつかの配列が発見された。所与の配列は、カウンター標的曝露集団よりも陽性集団で頻度が高いようであり、さらなる試験のための魅力的な候補である。
prediction)、Nucleic Acids Res、2003、31(13):3406−3415)。
本明細書に記載されるアレルゲン検出のために試験されるシグナル生成ポリヌクレオチドである。
総タンパク質の測定は、ピロガロールレッド−モリブデン酸塩(PRM)タンパク質色素結合アッセイを使用して試験される。PRMは、0.156mMのピロガロールレッド、0.209mMのモリブデン酸ナトリウム、及び50mMのTris−HClを含む溶液中で最初に作製される。試験プレートは、20μl/ウェルのPRM溶液を添加することにより調製され、プレートは一晩乾燥される。試験食品マトリックスを処理した後、処理された試料溶液(400μl)は、各ウェルに添加され、タンパク質吸光度が、600nmで即座に読みとられる。
Claims (12)
- 落花生アレルゲンを検出するためのシグナル生成ポリヌクレオチド(SPN)において、コアヌクレオチド配列であって、前記アレルゲンに特異的に結合し、かつ前記ヌクレオチド配列の一端でフルオロフォアと結合し、前記ポリヌクレオチドは配列番号8のヌクレオチド配列を有したコアヌクレオチド配列を含んでなる、落花生アレルゲンを検出するためのシグナル生成ポリヌクレオチド(SPN)。
- クエンチャーをさらに有し、前記クエンチャーが前記フルオロフォアの蛍光をクエンチするために十分に前記フルオロフォアに近接している、請求項1に記載のシグナル生成ポリヌクレオチド。
- 前記フルオロフォアと前記クエンチャーとが、前記シグナル生成ポリヌクレオチド配列の反対の端に連結されており、ここで前記配列の5’端の5〜20核酸塩基残基が、ヘアピン構造を形成することができる前記配列の3’端の5〜20核酸塩基残基と少なくとも80%相補性であり、それにより前記クエンチャーを、前記フルオロフォアの蛍光をクエンチするために前記フルオロフォアに対して十分近接させている、請求項2に記載のシグナル生成ポリヌクレオチド。
- 試料中の1つの落花生アレルゲンの検出方法において、
(a)前記落花生アレルゲンを含む疑いがある試験試料を得る工程と、
(b)前記試験試料を処理し、前記処理された試料から抽出バッファーを使用してタンパク質を抽出する工程と、
(c)前記抽出されたタンパク質を、シグナル生成ポリヌクレオチド(SPN)と混合する工程であって、前記シグナル生成ポリヌクレオチド(SPN)は前記アレルゲン及びフルオロフォアと特異的に結合する配列番号8のコアヌクレオチド配列を有する、前記抽出されたタンパク質を、シグナル生成ポリヌクレオチド(SPN)と混合する工程と、
(d)工程(c)の前記混合物を励起手段で処置する工程と、
(e)前記試験試料中の前記アレルゲンの不在又は存在を示す、前記シグナル生成ポリヌクレオチドと前記アレルゲンとの間の相互作用を測定する工程と、
(f)前記処理された試料について総タンパク質を測定し、及び、工程(e)で測定した信号との比較において検出した信号を判定する工程と
を備える、方法。 - 前記シグナル生成ポリヌクレオチドがクエンチャーをさらに有し、前記フルオロフォアと前記クエンチャーとは、前記クエンチャーが前記フルオロフォアの蛍光をクエンチするために十分近接している、請求項4に記載の方法。
- 前記フルオロフォアと前記クエンチャーとが、アプタマー配列の反対の端に連結されており、ここで配列の5’端の5〜20核酸塩基残基が、ヘアピン構造を形成することができる配列の3’端の5〜20核酸塩基残基と少なくとも80%相補性であり、それにより前記クエンチャーを、前記フルオロフォアの蛍光をクエンチするために前記フルオロフォアに対して十分近接させている、請求項5に記載の方法。
- 前記シグナル生成ポリヌクレオチドが、アプタマー配列の5’端にアニールされており、前記アプタマー配列の5’端と少なくとも80%相補性を有する5〜20核酸塩基長のリンカー配列をさらに含んでなり、ここで前記アプタマー配列がフルオロフォアを含み、前記リンカー配列がクエンチャーを含むか、又は前記アプタマー配列がクエンチャーを含み、前記リンカー配列がフルオロフォアを含む、請求項5に記載の方法。
- 前記シグナル生成ポリヌクレオチドのアレルゲンへの結合が、前記クエンチャーを前記フルオロフォアから分離させ、それにより前記フルオロフォアの蛍光の検出を可能とする、請求項6又は7に記載の方法。
- 前記シグナル生成ポリヌクレオチドのアレルゲンへの結合は、前記シグナル生成ポリヌクレオチドの二次構造における変化を生じさせる、請求項8に記載の方法。
- 前記総タンパク質が、PRM因子を使用して測定される、請求項4に記載の方法。
- 前記総タンパク質が、600nmでの吸光度として決定される、請求項10に記載の方法。
- 前記励起手段が、発光ダイオード(LED)光である、請求項4に記載の方法。
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