CN108064264A - 用于变应原检测的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基于核酸适体的信号传递多核苷酸(SPN)，其用于样品中的变应原检测。本文中公开了使用所述SPN检测样品中的一种或多种变应原、特别是食物产品中的食物变应原的组合物、化合物、测定和方法。

Description

用于变应原检测的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年4月29日提交的美国临时申请系列号62/154,200的优先权；其内容通过引用整体并入本文。

对序列表的提及

本申请与电子格式的序列表一起提交。所述序列表作为标题为20661002PCTSEQLST.txt的文件提交，该文件创建于2016年4月26日，大小为10,528字节。所述序列表的电子格式中的信息通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明涉及基于适体的信号传递多核苷酸(SPN)，包含这样的SPN的组合物，使用这样的SPN检测蛋白靶标、特别是食物变应原的测定和方法。

背景技术

变态反应是影响世界范围内成百上千万人的严重医学病症，其中约1500万人在美国，包括许多儿童。在变态反应过程中，免疫系统错误地靶向变应原作为威胁并且攻击它。变态反应可以影响皮肤、消化系统、胃肠道、呼吸系统、循环系统和心血管系统；且在某些变态反应中，影响多个器官系统。变态反应的程度从轻微至严重或者危及生命。严重的症状可以包括呼吸困难、低血压、胸痛、意识丧失和过敏反应。食物变态反应是所有工业化国家的一个重大健康问题。具有食物变态反应的人目前通过避免可能含有该特定变应原的任何食物来控制他们的变态反应。这些限制对患者的生活质量具有重大影响，并且还没有用于评估食物的真实变应原含量的方法。在美国，每三分钟就有人因食物变态反应症状被送至急诊室。

由于许多原因，变应原检测是重要的。快速且准确的检测方法和便携式装置(其可以被具有食物变态反应的人容易地操作以测试他们的食物并准确地和立即地确定变应原含量)对提供关于是否消费的告知决定将是有益的。在食品工业中，变应原检测对于确保食品标记的准确度和在食品生产过程中有效地清除污染物而言是关键性的。

目前可得到的用于检测变应原的方法主要使用基于抗体的免疫化学方法(例如，ELISA、侧向流装置)、肽(例如，质谱法)、酶、基于DNA的方法(例如，PCR)和其它一般的/非特异性的方法(例如，肉眼检查、ATP试验)。这些方法有时是非常复杂的、昂贵的、耗时的和不可靠的。用于确定变应原的存在与否的快速且准确的方法将具有重大益处。可以检测痕量变应原的超灵敏的检测分子对于开发灵敏的检测方法而言是必需的。

适体(其为单链(ss)DNA和RNA分子)由于它们的特异性三维结构而可以结合它们的靶标；它们提供特异性性质，所述特异性性质有助于它们成为用于蛋白识别(包括变应原)的新检测分子。在许多其它有用的应用(例如，诊断试验)中，适体和基于适体的测定已经表现为食品安全控制中的有前途的替代物。一篇最近的综述描述了使用适体开发的分析策略，其用于控制病原体、变应原、掺杂物、毒素和其它被禁止的污染物以确保食品安全(Amaya-Gonzalez,等人,Aptamer-Based Analysis:A Promising Alternative for FoodSafety Control,Sensors,2013,13:16292-16311；和Amaya-Gonzalez,等人,Aptamerbinding to coelic disease-triggering hydrophobic proteins:Towards a sensitivegluten detection system.Anal.Chem.2014,86(5),2733-2739)。一种检测谷蛋白的方法也描述在PCT公开PCT/ES2013/000133(2013年6月28日，Amaya-Gonzalez,等人)中。其它例子包括PCT申请公开号:WO2013064818和WO2012081908(特异性地结合金黄色葡萄球菌的适体)；WO2012081906(针对salmonella tiphimirium菌株中的ompc蛋白的适体)；WO2009070749(用于检测沙门氏菌污染的适体)；和美国专利号:7645582和7838242(结合李斯特菌表面蛋白的适体)(它们中的每一篇通过引用整体并入本文)。

本发明提供了新的基于适体的信号传递多核苷酸，包含这样的SPN的组合物，和用于检测变应原的不存在或存在和/或定量地测量试验样品中的变应原的量的快速、灵敏且准确的测定。在本公开内容中开发的信号传递多核苷酸和检测测定可以用在本领域的任何变应原检测装置中，诸如在美国专利号8,617,903中教导的微流体芯片和在以下文献中教导的便携式装置：2014年10月28日提交的共同拥有的PCT专利申请号PCT/US14/62656，和2015年3月16日提交的美国临时申请号62/133,632(它们中的每一篇通过引用整体并入本文)。

发明内容

本发明涉及用于检测样品中的一种或多种变应原的组合物、化合物、测定和方法。在某些实施方案中，变应原是食物变应原。

在某些实施方案中，本发明的组合物包含基于核酸适体的信号传递多核苷酸(SPN)，其可以以高亲和力特异性地结合变应原。在其它实施方案中，所述SPN还包含在所述核酸序列的一个末端处的荧光团和在相对末端处的猝灭剂。本发明的SPN可以包含这样的多核苷酸序列，其中在所述序列的5′-末端处的5-20个核苷碱基残基与在所述序列的3′-末端处的能够形成发夹结构的5-20个核苷碱基残基具有至少80％互补性，由此使所述猝灭剂与所述荧光团足够接近以猝灭所述荧光团的荧光。

在某些实施方案中，SPN可以包含选自本公开内容的表1中列出的序列的多核苷酸序列。

在某些实施方案中，在本发明中提供了用于检测试验样品中的一种或多种变应原的测定和方法。在某些实施方案中，所述方法可以包括以下步骤：(a)得到疑似含有变应原的试验样品；(b)处理所述试验样品并使用提取缓冲液从处理过的样品提取蛋白；(c)将步骤(b)的蛋白提取物与特异性地结合所述变应原的SPN混合；(d)借助于能量激发来活化所述SPN；和(e)观察所述SPN和所述变应原蛋白之间的相互作用，并检测所述变应原在所述试验样品中的不存在或存在。在某些实施方案中，测定从所述试验样品提取的总蛋白，并优化所述提取缓冲液以获得最大蛋白提取。在其它实施方案中，测定存在于所述试验样品中的变应原的量。

附图说明

图1显示了由信号传递多核苷酸SPN-A*200代表的检测分子的二级序列，所述信号传递多核苷酸SPN-A*200包含核心序列202、荧光团204、猝灭剂206和接头序列208。

图2显示了由发夹型信号传递多核苷酸SPN-E 300代表的检测分子与它的靶分子溶菌酶之间的反应。也显示了适体核心序列302、荧光团304和猝灭剂306。

图3显示了由二聚体信号传递多核苷酸SPN-E*400(包括退火的接头序列408)代表的检测分子与它的靶分子溶菌酶之间的反应。也显示了适体核心序列402、荧光团404和猝灭剂406。

具体实施方式

在下面的伴随描述中阐述了本发明的一个或多个实施方案的细节。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何材料和方法可以用在本发明的实践或试验中，但是现在描述优选的材料和方法。本发明的其它特征、目的和优点将从描述中显而易见。在描述中，单数形式也包括复数形式，除非上下文另外清楚地指明。除非另外定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。在冲突的情况下，以本说明书为准。

选择可以以高亲和力特异性地结合变应原蛋白的核酸适体，并使用选择的适体设计信号传递多核苷酸和针对本公开内容中变应原的检测进行试验。

变应原包括来自食物产品、环境或动物的那些，诸如家养宠物毛皮垢屑。食物变应原包括但不限于豆类(诸如花生、豌豆、小扁豆和豆(beans))、树坚果、小麦、奶、鱼、卵清和海鲜中的蛋白。其它变应原可以来自环境，诸如花粉、其它动物(例如，宠物)、病原体和药物。下面讨论了来自不同来源的变应原性蛋白的综合列表。

本发明的组合物

本文描述了组合物，用于设计、制备、使用和生产所述组合物的方法，以及用于检测样品中的靶蛋白、特别是变应原蛋白的方法和测定。

适体

根据本发明，本发明的组合物包括但不限于能够与一种或多种变应原缔合或结合的任何一种或多种分子。在某些实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种适体。

本文中使用的“适体”是已经通过重复多轮的体外选择或者等同地SELEX(指数富集法配体系统进化)工程改造成结合各种分子靶标(诸如小分子、蛋白、核酸)和甚至细胞、组织和生物体的核酸种类。核酸适体通过除经典的沃森-克里克碱基配对以外的相互作用具有对分子的特异性结合亲和力。核酸适体(像通过噬菌体展示产生的肽或者单克隆抗体(mAb))能够特异性地结合选择的靶标，并且通过结合而阻断它们的靶标起作用的能力。在某些情况下，适体还可以是肽适体。本文中使用的“适体”特别地表示核酸适体。

适体(经常称为“化学抗体”)具有与抗体的特征类似的特征。典型的核酸适体是大约10-15kDa大小(20-45个核苷酸)，以至少纳摩尔亲和力结合其靶标，并且区分密切相关的靶标。

核酸适体可以是单价的或多价的。适体可以是单体、二聚体、三聚体、四聚体或者更高的多聚体。单个适体单体可以连接以形成多聚适体融合分子。作为一个非限制性例子，可以将连接寡核苷酸(即，接头)设计成含有与随机适体的5′-臂区和3′-臂区二者互补的序列以形成二聚适体。对于三聚或四聚适体，将小的三聚或四聚(即Holiday结状("Holidayjunction-like"))DNA纳米结构工程改造成包括与随机适体的3′-臂区互补的序列，因此通过杂交建立多聚适体融合。另外，可以将3-5个或5-10个富含dT的核苷酸工程改造成接头多核苷酸作为适体结合基序之间的单链区，其提供多个适体的柔性和自由以配合和协作与细胞配体或受体的多价相互作用。

可替换地，还可以通过将生物素化的适体与抗生蛋白链菌素混合而形成多聚适体。

本文中使用的术语“多聚适体”或“多价适体”表示包含多个单体单元的适体，其中所述单体单元中的每一个可以是它本身的适体。多价适体具有多价结合特征。多聚适体可以是同多聚体或杂多聚体。术语“同多聚体”表示包含多个相同种类的结合单元的多聚适体，即每个单元结合相同靶分子的相同结合位点。术语“杂多聚体”表示包含多个不同种类的结合单元的多聚适体，即每个结合单元结合相同靶分子的不同结合位点，或者每个结合单元结合不同靶分子上的结合位点。因而，杂多聚体可以表示结合一个靶分子的不同结合位点的多聚适体或者结合不同靶分子的多聚适体。结合不同靶分子的杂多聚体还可以被称为多特异性的多聚体。

核酸适体包含一系列连接的核苷或核苷酸。术语“核酸”在其最宽的含义上包括任何包含核苷酸聚合物的化合物和/或物质。这些聚合物经常被称作多核苷酸。本发明的示例性核酸分子或多核苷酸包括但不限于：D-或L-核酸、核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、苏糖核酸(TNA)、乙二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA，包括具有β-D-核糖构型的LNA、具有α-L-核糖构型的α-LNA(LNA的非对应异构体)、具有2′-氨基官能化的2′-氨基-LNA和具有2′-氨基官能化的2′-氨基-α-LNA)或它们的杂交体。

技术人员会认识到，术语“RNA分子”或“核糖核酸分子”不仅包括在自然界中表达或发现的RNA分子，而且包括含有本文中所述的或本领域已知的一种或多种核糖核苷酸/核糖核苷类似物或衍生物的RNA的类似物和衍生物。严格来说，“核糖核苷”包括核苷碱基和核糖，并且“核糖核苷酸”是具有一个、两个或三个磷酸酯部分的核糖核苷。但是，术语“核糖核苷”和“核糖核苷酸”可以被认为如本文使用的等同的。可以在核苷碱基结构、呋喃核糖基环或核糖-磷酸主链中修饰RNA。

核酸适体可以是核糖核酸、脱氧核糖核酸、或混合的核糖核酸和脱氧核糖核酸。适体可以是单链的核糖核酸、脱氧核糖核酸、或混合的核糖核酸和脱氧核糖核酸。

在某些实施方案中，所述适体包含至少一种化学修饰。在某些实施方案中，所述化学修饰选自核酸在糖位置处的化学取代、在磷酸酯位置处的化学取代和在碱基位置处的化学取代。在其它实施方案中，所述化学修饰选自：掺入修饰的核苷酸；3′加帽；缀合至高分子量、非免疫原性的化合物；缀合至亲脂化合物；和将硫代磷酸酯掺入磷酸酯主链。在一个优选的实施方案中，所述高分子量、非免疫原性的化合物是聚亚烷基二醇，且更优选地是聚乙二醇(PEG)。PEG与另一种分子(通常是药物或治疗性蛋白)的共价缀合过程被称为聚乙二醇化。聚乙二醇化常规地通过PEG的反应性衍生物与靶分子的温育实现。PEG与药物或治疗性蛋白的共价连接可以掩蔽所述药剂躲过宿主的免疫系统，由此提供降低的免疫原性和抗原性，并且增加所述药剂的流体动力学尺寸(在溶液中的大小)，这通过降低肾清除率而延长其循环时间。聚乙二醇化还可以给疏水药物和蛋白提供水溶性。

在另一个优选的实施方案中，3'帽是反向脱氧胸苷帽。

在某些实施方案中，提供核酸适体，其中P(O)O基团被P(O)S(“硫代酸酯”)、P(S)S(“二硫代酸酯”)、P(O)NR2(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR′、CO或CH2(“甲缩醛”)或3′-胺(-NH-CH2-CH2-)替代，其中每个R或R′独立地为H或被取代的或未被取代的烷基。连接基团可以通过-O-、-N-或-S-键连接至邻近核苷酸。并非核酸适体中的所有键都需要是相同的。

作为非限制性例子，核酸适体可以包括D-核糖或L-核糖核酸残基，并且还可以包括至少一个经修饰的核糖核苷，包括但不限于2'-O-甲基修饰的核苷，包含5'硫代磷酸酯基的核苷、连接至胆甾醇基衍生物或十二烷酸二癸基酰胺基团的末端核苷、锁核苷、无碱基核苷、反向脱氧核苷或反向核糖核苷、2'-脱氧-2'-氟修饰的核苷、2'-氨基修饰的核苷、2'-烷基修饰的核苷、吗啉代核苷、氨基磷酸酯或包含核苷的非天然碱基或它们的任意组合。可替换地，核酸适体可以包含至少两个经修饰的核糖核苷，至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个或更多个经修饰的核糖核苷，直到分子的整个长度。核酸分子中的这样多个经修饰的脱氧核糖核苷或核糖核苷中的每一个的修饰不需要是相同的。

基于核酸的检测分子可以包括核苷碱基(在本领域中常简称为“碱基”)修饰或者置换。本文中使用的“未修饰的”或“天然的”核苷碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)和嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经修饰的核苷碱基包括其它合成的和天然的核苷碱基，诸如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟基甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基及其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基及其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫基烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代(特别是5-溴、5-三氟甲基)和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤(7-daazaadenine)和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。其它核苷碱基包括：在美国专利号3,687,808中公开的那些，在Modified Nucleosides in Biochemistry,Biotechnology and Medicine,Herdewijn,P.编.Wiley-VCH,2008中公开的那些；在The Concise Encyclopedia Of Polymer ScienceAnd Engineering,第858-859页,Kroschwitz,J.L,编.John Wiley&Sons,1990中公开的那些；由Englisch等人,Angewandte Chemie,国际版,1991,30,613公开的那些；和由Sanghvi,Y S.,第15章,dsRNA Research and Applications,第289-302页,Crooke,S.T.和Lebleu,B.,编,CRC Press,1993公开的那些。

适体的合适核苷酸长度是在约15个至约100个核苷酸(nt)范围内，并且在不同的其它优选的实施方案中，长度为15-30nt、20-25ntnt、30-100nt、30-60nt、25-70nt、25-60nt、40-60nt、25-40nt、30-40nt，18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40nt或40-70nt中的任一种。在某些实施方案中，适体可以是41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66，67、68、69或70nt的长度。在其它实施方案中，适体可以是71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100nt的长度。但是，可以将序列设计成具有足够的柔性使得它可以适应适体在本文描述的距离处与两种靶标的相互作用。

在某些实施方案中，所述核酸适体包含具有双链特征的一个或多个区域。这样的双链区域可以源自内部自身互补性或与第二个或其它适体或寡核苷酸分子的互补性。在某些实施方案中，双链区域可以是4-12、4-10、4-8个碱基对的长度。在某些实施方案中，双链区域可以是5、6、7、8、9、10、11或12个碱基对。在某些实施方案中，双链区域可以形成茎区。这样的具有双链特征的延伸茎区可以用来使核酸适体稳定化。本文中使用的术语“双链特征”是指，在两个核酸分子的任何长度上，它们的序列形成超过长度50％的碱基配对(标准的或者非标准的)。

可以进一步修饰适体以提供免于核酸酶和其它酶活性影响的保护。可以通过本领域已知的任意合适的方法修饰适体序列。例如，可以将硫代磷酸酯掺入主链中，并且可以将5′-修饰的嘧啶包括在DNA适体的ssDNA的5′端中。对于RNA适体，通过使用T7RNA聚合酶突变体，可以将修饰的核苷酸(诸如核糖主链的2′-OH基团的置换，例如，用2′-脱氧-NTP或2′-氟-NTP)掺入RNA分子中。可以如下试验这些经修饰的适体对核酸酶的抗性：将它们与经纯化的核酸酶或者来自小鼠血清的核酸酶一起温育，并且可以通过凝胶电泳来分析适体的完整性。

在某些实施方案中，这样的经修饰的核酸适体可以完全由经修饰的核苷酸合成，或者用经修饰的核苷酸的子集合成。所述修饰可以是相同的或者不同的。所有核苷酸可以被修饰，并且都可以含有相同的修饰。所有核苷酸可以被修饰，但是含有不同的修饰，例如含有相同碱基的所有核苷酸可以具有一个类型的修饰，而含有其它碱基的核苷酸可以具有不同类型的修饰。例如，所有嘌呤核苷酸可以具有一个类型的修饰(或者是未修饰的)，而所有嘧啶核苷酸具有另一个不同类型的修饰(或者是未修饰的)。以此方式，使用如本文公开的修饰的任何组合产生寡核苷酸或者寡核苷酸的文库。

根据本发明的某些实施方案，提供了适体的变体和衍生物。术语“衍生物”与术语“变体”同义地使用，且表示相对于参考或起始适体已经以任何方式修饰或改变的分子。与参考或起始序列相比，适体变体的核酸序列可以具有在核苷酸序列内的某些位置处的置换、缺失和/或插入。通常，变体将与参照序列具有至少约50％同一性(同源性)，且优选地，它们与参照序列具有至少约80％、更优选地至少约90％同一性(同源性)。

在某些实施方案中，提供了本发明的适体的变体模仿物。本文中使用的术语“变体模仿物”是这样的模仿物：其含有一个或多个模仿经活化的序列的核酸。变体模仿物的核酸序列可以包含天然存在的核酸，或可替换地，非天然存在的核酸。

适体缀合物和标记

在某些实施方案中，本发明的适体可以包含缀合物。本发明的这样的缀合物可以包括天然存在的物质或配体，诸如蛋白；碳水化合物(例如，葡聚糖、普鲁兰多糖、甲壳质、壳聚糖、菊糖、环糊精或透明质酸)；或脂质；以及重组的或合成的分子，诸如合成的聚合物。

缀合物的例子可以包括但不限于磁性纳米颗粒(MNP)(例如，超顺磁的氧化铁纳米颗粒(SPION)、金NP和量子点(QD))；壳聚糖；和药物缀合物。

在某些实施方案中，本发明的适体可以包含可检测的试剂，诸如各种有机小分子、无机化合物、纳米颗粒、酶或酶底物、荧光材料、发光材料(例如，鲁米诺)、生物发光材料(例如，萤光素酶、萤光素和水母荧光素)、化学发光材料、放射性物质(例如，18F、67Ga、81mKr、82Rb、111In、123I、133Xe、201Tl、125I、35S、14C、3H或99mTc(例如，如高锝酸盐(锝酸盐(VII),TcO4))和造影剂(例如，金(例如，金纳米颗粒)、钆(例如，螯合的Gd)、氧化铁(例如，超顺磁氧化铁(SPIO)、单晶氧化铁纳米颗粒(MION)和超小超顺磁氧化铁(USPIO))、锰螯合物(例如，Mn-DPDP)、硫酸钡、碘化造影剂(碘海醇)、微泡或者全氟烷烃)。这样的光学上可检测的标记包括例如但不限于，4-乙酰氨基-4′-异硫氰酰基均二苯乙烯-2,2′-二磺酸；吖啶和衍生物(例如，吖啶和异硫氰酸吖啶)；5-(2′-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)；4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘二甲酰亚胺-3,5二磺酸酯；N-(4-苯胺基-l-萘基)马来酰亚胺；邻氨基苯甲酰胺(anthranilamide)；BODIPY；亮黄；香豆素和衍生物(例如，香豆素,7-氨基-4-甲基香豆素(AMC,香豆素120),和7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151))；花青染料；焰红染料；4′,6-二脒基(aminidino)-2-苯基吲哚(DAPI)；5′5”-二溴邻苯三酚-磺基萘酚肽(溴邻苯三酚红)；7-二乙基氨基-3-(4′-异硫氰酰基苯基)-4-甲基香豆素；二亚乙基三胺五乙酸盐；4,4′-二异硫氰酰基二氢-均二苯乙烯-2,2′-二磺酸；4,4′-二异硫氰酰基均二苯乙烯-2,2′-二磺酸；5-[二甲基氨基]-萘-1-磺酰氯(DNS,丹磺酰氯)；4-二甲基氨基苯基偶氮基苯基-4′-异硫氰酸酯(DABITC)；曙红和衍生物(例如，曙红和异硫氰酸曙红)；赤藓红和衍生物(例如，赤藓红B和异硫氰酸赤藓红)；乙锭(ethidium)；荧光素和衍生物(例如，5-羧基荧光素(FAM),5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF),2′,7’-二甲氧基-4′,5′-二氯-6-羧基荧光素,荧光素,异硫氰酸荧光素,X-罗丹明-5-(和-6)-异硫氰酸酯(QFITC或XRITC),和荧光胺)；2-[2-[3-[[1,3-二氢-1,1-二甲基-3-(3-磺丙基)-2H-苯并[e]吲哚-2-亚基]亚乙基]-2-[4-(乙氧基羰基)-1-哌嗪基]-1-环戊烯-1-基]乙烯基]-1,1-二甲基-3-(3-磺丙基)-1H-苯并[e]吲哚鎓氢氧化物,内盐,具有N,N-二乙基乙胺(1:1)的化合物(IR144)；5-氯-2-[2-[3-[(5-氯-3-乙基-2(3H)-苯并噻唑-亚基)亚乙基]-2-(二苯基氨基)-1-环戊烯-1-基]乙烯基]-3-乙基苯并噻唑鎓高氯酸盐(IR140)；异硫氰酸孔雀绿；4-甲基伞形酮邻甲酚酞；硝基酪氨酸；副蔷薇苯胺；酚红；B-藻红蛋白；邻苯二甲醛；芘和衍生物(例如，芘、丁酸芘和琥珀酰亚胺基1-芘)；丁酸盐量子点；活性红4(CIBACRONTM亮红3B-A)；罗丹明和衍生物(例如，6-羧基-X-绕丹宁(ROX),6-羧基罗丹明(R6G),丽丝胺罗丹明B磺酰氯罗丹明(Rhod),罗丹明B,罗丹明123,异硫氰酸罗丹明X,磺酰罗丹明B,磺酰罗丹明101,磺酰罗丹明101的磺酰氯衍生物(德克萨斯红),N,N,N′,N′-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)四甲基罗丹明,和异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC))；核黄素；玫红酸；铽螯合物衍生物；花青-3(Cy3)；花青-5(Cy5)；花青-5.5(Cy5.5),花青-7(Cy7)；IRD 700；IRD 800；Alexa 647；LaJolta Blue；酞花青；和萘酞花青(naphthalo cyanine)。

在某些实施方案中，所述可检测的试剂可以是在活化后变成可检测的不可检测的前体(例如，发荧光的四嗪-荧光团构建体(例如，四嗪-BODIPY FL,四嗪-俄勒冈绿488,或四嗪-BODIPY TMR-X)或酶可活化的发荧光试剂(例如，(VisEn Medical)3)。例如，在某些实施方案中，所述不可检测的前体包含荧光团和猝灭剂的组合，诸如荧光素和DABCYL的组合。关于选择荧光团和猝灭剂对的指南描述在S.A.E.Marras Selection ofFluorophore and Quencher Pairs for Fluorescent Nucleic Acid HybridizationProbes，Didenko,Vladimir V.,编.Fluorescent energy transfer nucleic acidprobes:designs and protocols.第335卷.Springer,2006中，其通过引用整体并入本文。

信号传递多核苷酸(SPN)

根据某些实施方案，提供了当以高亲和力和特异性结合变应原靶标时可检测的多核苷酸序列。使用如上文中所述的SELEX方法可以生产这样的多核苷酸序列。

在某些类型的示例性信号传递多核苷酸中，序列的5’-末端结合荧光分子，并且3’-末端携带结合5’-末端的5-20个核苷酸长的反向互补序列。这导致序列的折叠和茎-环结构的形成。猝灭剂分子结合3’-末端。技术人员会认识到，替代布置是可能的，其中猝灭剂结合5’-末端，并且荧光团结合3’-末端。技术人员在本说明书的背景下无需过多实验就可以制备这样的替代信号传递多核苷酸。

下文将在实施例1中描述一种示例性的信号传递多核苷酸，其被设计成具有茎-环结构用于结合作为分子靶标的溶菌酶。

在某些实施方案中，在5’-末端的荧光团分子结合T核苷酸残基以防止由G核苷酸残基造成的猝灭。

认识到要避免较高的解链温度(Tm)，两个链的Tm或者ΔG需要低于分子靶标的结合亲和力，以使信号传递多核苷酸具有结合分子靶标的热力学优先。为了保留优选的分子靶标结合，可以添加Mg⁺²或K⁺以改变平衡。多至约37mM KCl的添加会将给定信号传递多核苷酸的平衡改变为有利于分子靶标的结合，而添加多至约5mM MgCl₂会将平衡改变为双链结构的维持，由此降低信号传递多核苷酸对其分子靶标的亲和力。

两个反向互补链不一定在对侧以建立茎-环结构。反向互补链可以与5’-末端连接/退火。所述序列必须足够长以在物理上干扰所述结构。双链结合需要防止二级结构折叠的形成，需要所述二级结构折叠以结合分子靶标。

在某些实施方案中，所述信号传递多核苷酸二聚实体，其具有连接至荧光团的核心序列和连接至猝灭剂的较短退火的接头序列，或者反之亦然。在一个实施例中，所述信号传递多核苷酸可以包含5-20个核苷碱基长度的接头序列，其与信号传递多核苷酸的序列的5′-末端退火，且与信号传递多核苷酸的序列的5′-末端具有至少80％互补性，其中所述信号传递多核苷酸包含荧光团，且所述接头序列包含猝灭剂。

在某些实施方案中，所述信号传递多核苷酸序列用2’-O-甲基修饰进行化学修饰。预期这样的修饰不会显著地影响就分子靶标的结合而言的结合亲和力和敏感性，同时提高稳定性。

在某些实施方案中，使用以如上文所述的SELEX方法选出的多核苷酸(例如，适体)设计针对几种常见食物变应原的信号传递多核苷酸。这样的适体的核酸序列具有针对变应原的高结合亲和力和特异性。表1列出了用于设计信号传递多核苷酸的适体序列。

表1：结合食物变应原的SPN

除了用实施例中所述的SELEX方法选择的核酸适体以外，可以使用用其它研究选择的适体设计信号传递多核苷酸。根据上述标准可以进一步设计5’-末端和3’末端核苷酸、荧光团/猝灭剂对和茎-环结构，并试验它们针对靶标的结合亲和力和特异性。

在某些实施方案中，使用针对本领域中公开的食物变应原的适体可以开发SPN。这样的适体可以包括但不限于对以下对象特异的适体：Lup an 1(β-羽扁豆球蛋白)(Nadal P等人,DNA Aptamers against the Lup an 1 Food Allergen,PLos One,2012,7:e35253)；瘦素(lep3)(Ashley和Li,Three-dimensional selection of leptin aptamers usingcapillary electrophoresis and implications for clone validation,AnalBiochem.,2013,434:146-152)；和溶菌酶(卵清)(Kirby等人,Aptamer-based sensorarrays for the detection and quantitation of proteins,Anal Chem.2004,76(14):4066-4075；Zou M等人,The homogeneous fluorescence anisotropic sensing ofsalivary lysozyme using the 6-carboxyfluorescein-labeled DNA aptamer,BiosensBioelectron,2012,32(1):148-154；Robertson和Ellington,In vitro selection ofnucleootein enzymes,Nature Biotechnology,2001:650-655；和Hesselberth等人,Simultaneous detection of diverse analytes with an aptazyme ligase array,Analytical Biochemistry,2003,312:106-112；它们中的每一篇均通过引用整体并入本文)。在表2中列出了来自每篇公开内容的适体的核酸序列。

在某些实施方案中，通过使用结合日本香柏(Japanese cedar)花粉的Cry j 2变应原(Ogihara等人,DNA aptamers against Cry j 2 allergen of Japanese cedarpollen for biosensing applications,Biosens Bioelectron.,2015,63,159-165)、存在于羽扇豆粉中的lup an 1(β-羽扁豆球蛋白)亚基(Svobodova等人,Ultrasensitiveaptamer based detection ofβ-conglutin food allergen,Food Chem.,2014,165,419-423；和Mairal等人,FRET-based dimeric aptamer probe for selective and sensitiveLup an 1allergen detection,Biosens Bioelectron.,2014,54:207-210)和麦醇溶蛋白(谷蛋白)(Pinto A等人,Label-free detection of gliadin food allergen mediatedby real-time apta-PCR,Anal Bioanal Chem.,2014,406(2):515-524)(它们中的每一篇通过引用整体并入本文)的适体，可以开发信号传递多核苷酸。

表2:针对食物变应原的适体

在某些实施方案中，通过使用被选择为针对病原体的检测分子的适体，可以开发信号传递多核苷酸。作为非限制性例子，可以特异性地识别沙门氏菌属(Salmonella)、李斯特菌属(Listeria)、大肠杆菌(E.coli)和烟曲霉(aspergillus fumigatus)的适体可以用于设计如本文中所述的信号传递多核苷酸(SPN)。这样的适体在例如以下文献中讨论：Han和Lee,In Vitro Selection of RNA Aptamer Specific to Salmonella Typhimurium,Journal of Microbiology and Biotechnology,2013,23:878-884；Hyeon,J.等人.Development of RNA Aptamers for Detection of Salmonellas Enteritidis,Journalof Microbiological Methods,2012,89:79-82；Ohk等人,Antibody-aptamerfunctionalized fibre-optic biosensor for specific detection of Listeriamonocytogenes from food,J.Appl.Microbiol.,2010,109:808-817；Li,H.等人,Aptamerselection for the detection of Escherichia coli K88,Canadian Journal ofMicrobiology,2011,57:453-459；Lee等人,In vitro selection of Escherichia coliO157:H7-specific RNA aptamer,Biochemical and Biophysical ResearchCommunications,2012,417:214-220；Ali等人,Fluorogenic DNAzyme obes as BacterialIndicators,Angewandte Chemie International Edition,2011,50:3751-3754；和DeGrasse JA,A Single-Stranded DNA Aptamer That Selectively Binds toStaphylococcus aureus Enterotoxin B,Plos One,2012,7:e33410；它们中的每一篇通过引用整体并入本文。表3列出了来自那些公开内容的此类适体的序列。

表3:针对病原体的适体

在其它实施方案中，如技术人员所能预见到的，特异性地结合非蛋白靶标(例如，小分子)的适体也可以用于设计本文中公开的信号传递多核苷酸。表4列出了一些适体的序列作为非限制性例子(Ferguson等人,A novel strategy for selection of allostericribozymes yields RiboReporter TM sensors for caffeine and aspartame,NucleicAcids Research,2004,32:1756-1766；和Ono and Togashi,Highly selectiveoligonucleotide-based sensor for mercury(II)in aqueous solutions,Angew.Chem.Int.Ed.,2004,43:4300-4302)。

表4:针对非蛋白靶标的适体

信号传递多核苷酸的靶标

本发明提供了结合靶分子的基于适体的信号传递多核苷酸(SPN)。如下面所述，所述靶分子可以是变应原蛋白或其变体。在某些实施方案中，可以将SPN设计成与蛋白或其它生物分子(其本身与变应原有关)结合或缔合。

根据本发明，并且虽然不希望受理论约束，检测多核苷酸可以完全地或部分地结合变应原。

变应原

在某些实施方案中，变应原是食物变应原。与食物有关的变应原蛋白的例子包括但不限于：咸水虾(Art fr 5)、蟹(Cha f 1)、北海虾(Cra c 1、Cra c 2、Cra c 4、Cra c 5、Cra c 6、Cra c 8)、美洲龙虾(Hom a 1、Hom a 3、Hom a 6)、白虾(Lit v 1、Lit v 2、Lit v3、Lit v4)、罗氏沼虾(Giant freshwater prawn)(Mac r 1)、对虾(shrimp)(Met e 1、Pena 1、Pen i 1)、北方对虾(Panb 1)、龙虾(Pan s 1)、黑虎虾(Pen m 1、Pen m 2、Pen m 3、Pen m 4、Pen m 6)、窄爪小龙虾(Pon i 4、Pon i 7)、蓝蟹(Por p 1)、家牛(Bos d 4、Bos d5、Bos d 6、Bos d 7、Bos d 8、Bos d 9、Bos d 10、Bos d 11、Bos d 12)、大西洋鲱(Clu h1)、鲤鱼(Cyp c 1)、波罗的海鳕鱼(Gad c 1)、大西洋鳕鱼(Gad m 1、Gad m 2、Gad m 3)、鳕鱼(Gad c 1)、鸡(Gal d 1、Gal d 2、Gal d 3、Gal d 4、Gal d 5)、澳洲肺鱼(Lat c 1)、帆鳞鲆(Lep w 1)、鲑鱼(Onc k 5)、大西洋鲑(Sal s 1、Sal s 2、Sal s 3)、虹鳟(Onc m 1)、莫桑比克罗非鱼(Ore m 4)、食用蛙(Ran e 1、Ran e 2)、太平洋沙瑙鱼(Sar sa 1)、大洋鲈(Seb m 1)、黄鳍金枪鱼(Thu a 1,、Thu a 2、Thu a 3)、剑鱼(Xip g 1)、鲍鱼(Hal m 1)、庭园大蜗牛(Hel as 1)、鱿鱼(Tod p 1)、菠萝(Ana c 1、Ana c 2)、芦笋(Aspa o 1)、大麦(Hor v 12、Hor v 15、Hor v 16、Hor v 17、Hor v 20、Hor v 21)、香蕉(Mus a 1、Mus a 2、Mus a 3、Mus a 4、Mus a 5)、香蕉(Musxp1)、稻(Ory s 12)、黑麦(Sec c 20)、小麦(Tri a12、Tri a 14、Tri a 18、Tri a 19、Tri a 25、Tri a 26、Tri a36、Tri a 37)、玉蜀黍(玉米)(Zea m 14、Zea m 25)、猕猴桃(Act c1、Act c 2、Act c 5、Act c 8、Act c 10、Act d1、Act d 2、Act d 3、Act d 4、Act d 5、Act d 6、Act d 7、Act d 8、Act d 9、Act d 10、Act d 11)、腰果(Ana o 1、Ana o 2、Ana o 3)、芹菜(Api g 1、Api g 2、Api g 3、Api g 4、Api g 5、Api g 6)、花生(Ara h 1、Ara h 2、Ara h 3、Ara h 4、Ara h 5、Ara h 6、Ara h7、Ara h 8、Ara h 9、Ara h 10、Ara h 11、Ara h 12、Ara h 13)、巴西坚果(Ber e 1、Ber e2)、东方芥末(Bra j 1)、菜籽(Bra n 1)、卷心菜(Bra o 3)、芜菁(Bra r 1、Bra r 2)、柿子椒(Cap a 1w、Cap a 2)、山核桃(Car i 1、Car i 4)、栗子(Cas s 1、Cas s 5、Cas s 8、Cass 9)、柠檬(Cit I 3)、柑橘(Cit r 3)、甜橙(Cit s 1、Cit s 2、Cit s 3)、榛子(Cor a 1、Cor a 2、Cor a 8、Cor a 9、Cor a 11、Cor a 12、Cor a 13、Cor a 14)、甜瓜(Cuc m 1、Cucm 2、Cuc m3)、胡萝卜(Dau c 1、Dau c 4、Dau c 5)、荞麦(Fag e 2、Fag e 3)、苦荞(Fag t2)、草莓(Fra a 1、Fra a 3、Fraa 4)、大豆(Gly m 1、Gly m 2、Gly m 3、Gly m 4、Gly m 5、Gly m 6、Gly m 7、Gly m 8)、向日葵(Hel a1、Hel a 2、Hel a 3)、黑胡桃(Jug n 1、Jug n2)、胡桃(Jug r 1、Jug r 2、Jug r 3、Jug r 4)、栽培莴苣(Lac s 1)、小扁豆(Len c 1、Lenc 2、Len c 3)、荔枝(Lit c 1)、狭叶蓝羽扇豆(Lup an 1)、苹果(Mal d 1、Mal d 2、Mal d3、Mal d 4)、木薯(Man e 5)、桑葚(Mor n 3)、牛油果(Pers a 1)、四季豆(Pha v 3)、开心果(Pis v 1、Pis v 2、Pis v 3、Pis v 4、Pis v 5)、豌豆(Pis s 1、Pis s 2)、杏(Pru ar1、Pru ar 3)、甜樱桃(Pru av 1、Pru av 2、Pru av 3、Pru av 4)、欧洲李(Pru d 3)、扁桃(Pru du 3、Pru du 4、Pru du 5、Pru du 6)、桃(Pru p 1、Pru p 2、Pru p3、Pru p 4、Pru p7)、石榴(Pun g 1)、梨(Pyr c 1、Pyr c 3、Pyr c 4、Pyr c 5)、蓖麻(Ric c 1)、红悬钩子(Rub i 1、Rub i 3)、芝麻(Ses i 1、Ses i 2、Ses i 3、Ses i 4、Ses i 5、Ses i 6、Ses i7)、黄芥(Sin a 1、Sin a 2、Sin a 3、Sin a 4)、西红柿(Sola I 1、Sola I 2、Sola I 3、Sola I 4)、马铃薯(Sola t 1、Sola t 2、Sola t 3、Sola t 4)、绿豆(Vig r 1、Vig r 2、Vig r 3、Vig r 4、Vig r 5、Vig r 6)、葡萄(Vit v 1)、红枣(Ziz m 1)、腰果(Anacardiumoccidentale)(Ana o 1.0101、Ana o 1.0102)、旱芹(Apium graveolens)(Api g 1.0101、Api g 1.0201)、野胡萝卜(Daucus carota)(Dau c1.0101、Dau c1.0102、Dau c1.0103、Dauc1.0104、Dau c1.0105、Dau c1.0201)、甜橙(Cit s3.0101、Cit s3.0102)、大豆(Glym1.0101、Gly m1.0102、Gly m3.0101、Gly m3.0102)、兵豆(Lens culinaris)(Lenc1.0101、Len c1.0102、Len c1.0103)、豌豆(Pis s1.0101、Pis s1.0102)、乔茄(Lycopersicon sativum)(Lyc e2.0101、Lyc e2.0102)、松草莓(Fra a3.0101、Fraa3.0102、Fra a3.0201、Fra a3.0202、Fra a3.0203、Fra a3.0204、Fra a3.0301)、苹果(Mald1.0101、Mal d1.0102、Mal d1.0103、Mal d1.0104、Mal d1.0105、Mal d1.0106、Mald1.0107、Mal d1.0108、Mal d1.0109、Mal d1.0201、Mal d1.0202、Mal d1.0203、Mald1.0204、Mal d1.0205、Mal d1.0206、Mal d1.0207、Mal d1.0208、Mal d1.0301、Mald1.0302、Mal d1.0303、Mal d1.0304、Mal d1.0401、Mal d1.0402、Mal d1.0403、Mald3.0101w、Mal d3.0102w、Mal d3.0201w、Mal d3.0202w、Mal d3.0203w、Mal d4.0101、Mald4.0102、Mal d4.0201、Mal d4.0202、Mal d4.0301、Mal d4.0302)、欧洲甜樱桃(Prunusavium)(Pru av1.0101、Pru av1.0201、Pru av1.0202、Pru av1.0203)和桃(Prunuspersica)(Pru p4.0101、Pru p4.0201)；以及它们的任何变体。系统地命名与食物有关的变应原的名称，并且根据IUIS变应原命名法小组委员会(IUIS Allergen Nomenclature Sub-Committee)列出(参见国际免疫学会联合会变应原命名法小组委员会(InternationalUnion of Immunological Societies Allergen Nomenclature Sub-Committee)，异变应原和变体的名单)。

除了食物变应原以外，本发明的信号传递多核苷酸可以检测空气传播的微粒/变应原和其它环境变应原。含有变应原的样品可以得自植物(例如，野草、草、树、花粉)、动物(例如，在诸如猫、狗、牛、猪、绵羊、马、兔、大鼠、豚鼠、小鼠和沙鼠等哺乳动物的毛皮垢屑、尿、唾液、血液或其它体液中发现的变应原)、真菌/霉菌、昆虫(例如，螫刺昆虫，诸如蜜蜂、黄蜂和大黄蜂及摇蚊科(chirnomidae)(非咬蠓)以及其它昆虫，诸如家蝇、果蝇、绵羊丽蝇、螺旋锥蝇、谷象、蚕、蜜蜂、非咬蠓幼虫、蜡螟幼虫、粉虫、蟑螂和黄粉虫(Tenibrio molitor)甲虫的幼虫；蜘蛛和螨类诸如屋尘螨)、橡胶(例如，胶乳)、金属、化学物质(例如，药品、蛋白质去污添加剂)和自身变应原和人自身变应原(例如Hom s 1、Hom s 2、Hom s 3、Hom s 4、Hom s 5)(参见变应原命名法：国际免疫学会联合会变应原命名法小组委员会，变应原名单，以及变应原命名法：国际免疫学会联合会命名法小组委员会，异变应原和变体的名单)。

使用本发明的组合物可以检测的来自植物的变应原蛋白的例子包括但不限于：白蜡树(Fra e 1)、日本扁柏(Cha o1、Cha o 2)、sugi(Cry j1、Cry j 2)、柏树(Cup a 1)、线柏(Cup s 1、Cup s 3)、雪松(Jun a 1、Jun a 2、Jun a 3、Jun s 1)、阿伯刺桧(Jun o 4)、铅笔柏(Jun v 1、Jun v 3)、黄花草(Ant o 1)、藏红花(Cro s 1、Cro s 2)、百慕大草(Cynd 1、Cyn d 7、Cyn d 12、Cyn d 15、Cyn d 22w、Cyn d 23、Cyn d 24)、鸭茅(Dac g 1、Dac g2、Dac g 3、Dac g 4、Dac g 5)、草甸狐茅(Fes p 4)、绒毛草(Hol I 1、Hol I 5)、大麦(Horv 1、Hor v 5)、黑麦草(Lol p 1、Lol p 2、Lol p 3、Lol p 4、Lol p 11)、巴哈雀稗(Pas n1)、金丝雀草(Pha a 1、Pha a 5)、梯牧草(Phl p 1、Phl p 2、Phl p 4、Phl p 5、Phl p 6、Phl p 7、Phl p 11、Phl p 12、Phl p13)、枣椰子(Pho d 2)、肯塔基蓝草(Poa p 1、Poa p5)、黑麦(Sec c 1、Sec c 5、Sec c 38)、约翰逊草(Sor h 1)、小麦(Tri a 15、Tri a 21、Tri a 27、Tri a28、Tri a 29、Tri a 30、Tri a 31、Tri a 32、Tri a 33、Tri a 34、Tri a35、Tri a 39)、玉蜀黍(Zea m 1、Zea m 12)、桤木(Aln g 1、Aln g 4)、反枝苋(Ama r 2)、矮豚草(Amb a 1、Amb a 2、Amb a 3、Amb a 4、Amb a 5、Amb a 6、Amb a 7、Amb a 8、Amb a9、Amb a 10、Amb a 11)、西部豚草(Amb p 5)、巨豚草(Amb t 5)、艾蒿(Art v 1、Art v 2、Art v 3、Art v 4、Art v 5、Art v6)、甜菜(Beta v 1、beta v 2)、欧洲白桦(Bet v 1、Betv 2、Bet v 3、Bet v4、Bet v 6、Bet v 7)、芜菁(Bra r 5)、角树(Car b 1)、栗子(Cas s1)、紫长春花(Cat r 1)、藜、苋(Che a 1、Che a 2、Che a 3)、阿拉伯咖啡(Cof a 1、Cof a2、Cof a 3)、榛子(Cor a 6、Cor a 10)、榛仁(Cora1.04、Cora2、Cora8)、欧洲山毛榉(Fag s1)、白蜡树(Fra e 1)、向日葵(Hel a 1、Hel a 2)、巴拉橡胶树(Hev b 1、Hev b 2、Hev b3、Hev b 4、Hev b 5、Hev b 6、Hev b 7、Hev b 8、Hev b 9、Hev b 10、Hev b 11、Hev b 12、Hev b 13、Hev b 14)、日本葎草(Hum j 1)、女贞(Lig v 1)、一年生山靛(Mercurialisannua)(Mer a 1)、橄榄(Ole e 1、Ole e 2、Ole e 3、Ole e 4、Ole e 5、Ole e 6、Ole e 7、Ole e8、Ole e 9、Ole e 10、Ole e 11)、欧洲铁木(European hophornbeam)(Ost c1)、欧墙草(Parietaria judaica)(Par j 1、Par j 2、Par j 3、Par j 4)、药用墙草(Parietariaofficinalis)(Par o 1)、长叶车前(Plantago lanceolata)(Pal I 1)、伦敦悬铃树(Pla a1、Pla a 2、Pla a 3)、法国梧桐(Platanus orientalis)(Pla or1、Pla or 2、Pla or 3)、白橡(Que a 1)、俄国蓟(Sal k 1、Sal k 2、Sal k 3、Sal k 4、Sal k 5)、西红柿(Sola I5)、紫丁香(Syr v 1、Syr v 5)、俄国蓟(Sal k 1)、英国车前草(Pla l1)、豚草(Ambrosiaartemisiifolia)(Amb a8.0101、Amb a8.0102、Amb a9.0101、Amb a9.0102)、长叶车前(Plantago lanceolata)(Pla l1.0101、Pla l1.0102、Pla l1.0103)、欧墙草(Parietariajudaica)(Par j 3.0102)、狗牙根(Cynodon dactylon)(Cyn d1.0101、Cyn d1.0102、Cynd1.0103、Cyn d1.0104、Cyn d1.0105、Cyn d1.0106、Cyn d1.0107、Cyn d1.0201、Cynd1.0202、Cyn d1.0203、Cyn d1.0204)、绒毛草(Holcus lanatus)(Hol I1.0101、HolI1.0102)、黑麦草(Lolium perenne)(Phl p1.0101、Phl p1.0102、Phl p4.0101、Phlp4.0201、Phl p5.0101、Phl p5.0102、Phl p5.0103、Phl p5.0104、Phl p5.0105、Phlp5.0106、Phl p5.0107、Phl p5.0108、Phl p5.0201、Phl p5.0202)、黑麦(Secale cereale)(Sec c20.0101、Sec c20.0201)、疣皮桦(Betula Verrucosa)(Bet v1.0101、Bet v1.0102、Bet v 1.0103、Bet v 1.0201、Bet v 1.0301、Bet v1.0401、Bet v 1.0402、Bet v 1.0501、Bet v 1.0601、Bet v 1.0602、Bet v1.0701、Bet v1.0801、Bet v1.0901、Bet v1.1001、Betv1.1101、Bet v1.1201、Bet v 1.1301、Bet v1.1401、Bet v1.1402、Bet v1.1501、Betv1.1502、Bet v1.1601、Bet v1.1701、Bet v 1.1801、Bet v1.1901、Bet v1.2001、Betv1.2101、Bet v1.2201、Bet v1.2301、Bet v1.2401、Bet v 1.2501、Bet v1.2601、Betv1.2701、Bet v1.2801、Bet v1.2901、Bet v1.3001、Bet v1.3101、Bet v 6.0101、Betv6.0102)、欧洲鹅耳枥(Carpinus betulus)(Car b1.0101、Car b1.0102、Car b1.0103、Carb1.0104、Car b1.0105、Car b1.0106、Car b1.0106、Car b1.0106、Car b1.0106、Carb1.0107、Car b1.0107、Car b1.0108、Car b1.0201、Car b1.0301、Car b1.0302)、欧洲榛(Corylus avellana)(Cor a1.0101、Cor a1.0102、Cor a1.0103、Cor a1.0104、Cora1.0201、Cor a1.0301、Cor a1.0401、Cor a1.0402、Cor a1.0403、Cor a1.0404)、普通女贞(Ligustrum vulgare)(Syr v1.0101、Syr v1.0102、Syr v1.0103)、日本柳杉(Cryptomeriajaponica)(Cry j2.0101、Cry j2.0102)和地中海柏木(Cupressussempervirens)(Cups1.0101、Cup s1.0102、Cup s1.0103、Cup s1.0104、Cup s1.0105)；以及它们的任何变体。

羽扇豆是属于羽扇豆属(Lupinus)的豆科草本植物。在欧洲，羽扇豆粉及种子被广泛用于面包、饼干、糕点、意大利面、酱，以及在饮料中作为牛奶或大豆的替代物，并且用于无谷蛋白的食物中。国际免疫学会联合会(IUIS)变应原命名法小组委员会最近将β-羽扇豆球蛋白命名为Lup an 1变应原(Nadal,等人,(2012)DNA Aptamers against the Lup an1Food Allergen.PLoS ONE 7(4):e35253)，并且新近报道了针对Lup an 1(β-羽扇豆球蛋白)的高亲和力11-聚体DNA适体(Nadal,等人,(2013)Probing high-affinity 11-mer DNAaptamer against Lup an 1(β-conglutin).Anal.Bioanal.Chem.405:9343-9349)。

可以使用本发明的组合物检测的来自螨类的变应原蛋白的例子包括但不限于：螨(Blo t 1、Blo t 3、Blo t 4、Blo t 5、Blo t 6、Blo t 10、Blo t 11、Blo t 12、Blo t 13、Blo t 19、Blot t 21)；美洲屋尘螨(Der f 1、Der f 2、Der f 3、Der f 7、Der f 10、Der f11、Der f 13、Der f 14、Der f 15、Der f 16、Der f 17、Der f 18、Der f 22、Der f 24)；微角尘螨(Dermatophagoides microceras)(屋尘螨)(Der m 1)；欧洲屋尘螨(Der p 1、Derp 2、Der p 3、Der p 4、Der p 5、Der p 6、Der p 7、Der p 8、Der p 9、Der p 10、Der p11、Der p 14、Der p 15、Der p 20、Der p 21、Der p 23)；欧宇尘螨(Euroglyphus maynei)(屋尘螨)(Eur m 2、Eur m 2、Eur m 3、Eur m 4、Eur m 14)；贮藏螨(Aca s 13、Gly d 2、Lep d 2、Lep d 5、Lep d 7、Lep d 10、Lep d 13、Tyr p 2、Tyr p 3、Tyr p 10、Tyr p 13、Tyr p 24)、法嗜皮螨(Dermatophagoides farinae)(Der f1.0101、Der f1.0102、Derf1.0103、Der f1.0104、Der f1.0105、Der f2.0101、Der f2.0102、Der f2.0103、Derf2.0104、Der f2.0105、Der f2.0106、Der f2.0107、Der f2.0108、Der f2.0109、Derf2.0110、Der f2.0111、Der f2.0112、Der f2.0113、Der f2.0114、Der f2.0115、Derf2.0116、Der f2.0117)、屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)(Der p1.0101、Derp1.0102、Der p1.0103、Der p1.0104、Der p1.0105、Der p1.0106、Der p1.0107、Derp1.0108、Der p1.0109、Der p1.0110、Der p1.0111、Der p1.0112、Der p1.0113、Derp1.0114、Der p1.0115、Der p1.0116、Der p1.0117、Der p1.0118、Der p1.0119、Derp1.0120、Der p1.0121、Der p1.0122、Der p1.0123、Der p2.0101、Der p2.0102、Derp2.0103、Der p2.0104、Der p2.0105、Der p2.0106、Der p2.0107、Der p2.0108、Derp2.0109、Der p2.0110、Der p2.0111、Der p2.0112、Der p2.0113)、欧宇尘螨(Eurm2.0101、Eur m2.0102)、害鳞嗜螨(Lepidoglyphus destructor)(Lep d2.0101、Lepd2.0101、Lep d2.0101、Lep d2.0102、Lep d2.0201、Lep d2.020)和家食甜螨(Glycyphagusdomesticus)(Gly d2.0101、Gly d2.0201)；以及它们的任何变体。

可以使用本发明的组合物检测的来自动物的变应原蛋白的例子包括但不限于：家牛(Bos d 2、Bos d 3、Bos d 4、Bos d 5、Bos d 6、Bos d 7、Bos d 8)、犬(Can f 1、Can f2、Can f 3、Can f 4、Can f 5、Can f 6)、家马(Equ c 1、Equ c 2、Equ c 3、Equ c 4、Equ c5)、猫(Fel d 1、Fel d 2、Fel d 3、Fel d 4、Fel d 5w、Fel d 6w、Fel d 7、Fel d 8)、小鼠(Mus m 1)、豚鼠(Cav p 1、Cav p 2、Cav p 3、Cav p 4、Cav p 6)、兔(Ory c 1、Ory c 3、Ory c 4)、大鼠(Rat n 1)、家牛(Bos domesticus)(Bos d 2.0101、Bos d 2.0102、Bos d2.0103)和家马(Equus caballus)(Equ c2.0101、Equ c 2.0102)；以及它们的任何变体。

可以使用本发明的组合物检测的来自昆虫的变应原蛋白的例子包括但不限于：黄热病蚊(Aed a 1、Aed a 2、Aed a 3)、东方蜜蜂(Api c 1)、大蜜蜂(Api d 1)、蜜蜂(Api m1、Api m 2、Api m 3、Api m 4、Api m5、Api m 6、Api m 7、Api m 8、Api m 9、Api m 10、Apim 11、Api m 12)、鸽锐缘蜱(Arg r 1)、德国小蠊(Bla g 1、Bla g 2、Bla g 3、Bla g 4、Blag 5、Bla g 6、Bla g 7、Bla g 8、Bla g 11)、熊蜂(Bom p 1、Bom p 4、Bom t 1、Bom t 4)、蚕蛾(Bomb m 1)、蠓(Chi k 10、Chi t 1、Chi t 1.01、Chi t 2、Chi t 2.0101、Chi t2.0102、Chi t 3、Chi t 4、Chi t 5、Chi t 6、Chi t 6.01、Chi t 7、Chi t 8、Chi t 9)、猫蚤(Cte f 1、Cte f 2、Cte f 3)、黄蜂(Dol a 5)、白脸大黄蜂(Dol m 1、Dol m 2、Dol m5)、吸血蠓(For t 1、For t 2)、萨凡纳采采蝇(Glo m 5)、亚洲瓢虫(Har a 1、Har a 2)、蠹虫(Lep s 1)、书虱(Lip b 1)、澳大利亚跳蚁(Myr p 1、Myr p 2、Myr p 3)、美洲蟑螂(Pera1、Per a 3、Per a 6、Per a 7、Per a 9、Per a 10)、印度谷螟(Plo i 1、Plo i 2)、黄蜂(Pol a 1、Pol a 2、Pol a 5、Pol e 1、Pol e 4、Pol e 5、Pol f 5、Pol g 1、Pol g 5、Polm 5、Poly p 1、Poly s 5、Ves vi 5)、地中海胡蜂(Pol d 1、Pol d 4、Pol d 5)、热带火蚁(Sol g 2、Sol g 3、Sol g 4)、红火蚁(外引红火蚁)(Sol I 1、Sol I 2、Sol I 3、Sol I4)、黑火蚁(Sol r 2、Sol r 3)、巴西火蚁(Sol s 2、Sol s 3)、马蝇(Tab y 1、Tab y 2、Taby 5)、松毛虫队列蛾(Tha p 1、Tha p 2)、加利福尼亚猎蝽(Tria p 1)、欧洲大黄蜂(Vesp c1、Vesp c 5)、大胡蜂(Vespa magnifica)(大黄蜂)(Vesp ma 2、Vesp ma 5)、金环胡蜂(Vespa mandarinia)(巨亚洲大黄蜂)(Vesp m1、Vesp m 5)、小黄蜂(Ves f 5、Ves g 5、Vesm 1、Ves m 2、Ves m 5)、德国黄胡蜂(Vespula germanica)(小黄蜂)(Ves p 5)、大黄蜂(Vespula squamosa)(小黄蜂)(Ves s 1、Ve s s5)、黄胡蜂(Vespula vulgaris)(小黄蜂)(Ves v 1、Ves v 2、Ves v 3、Ves v 4、Ves v 5、Ves v 6)、德国小蠊(Blattellagermanica)(Bla g 1.0101、Bla g 1.0102、Bla g 1.0103、Bla g 1.02、Bla g 6.0101、Blag 6.0201、Bla g6.0301)、美洲大蠊(Periplaneta Americana)(Per a1.0101、Pera1.0102、Per a1.0103、Per a1.0104、Per a1.02、Per a3.01、Per a3.0201、Per a3.0202、Per a3.0203、Per a7.0101、Per a7.0102)、黄边胡蜂(Vespa crabo)(Ves pc5.0101、Vespc 5.0101)、金环胡蜂(Vespa mandarina)(Vesp m 1.01、Vesp m 1.02)；以及它们的任何变体。

可以使用本发明的信号传递多核苷酸和测定检测的来自真菌/霉菌的变应原蛋白的例子包括但不限于：链格孢菌(Alternaria alternata)(链格孢腐菌)(Alt a 1、Alt a3、Alt a 4、Alt a 5、Alt a 6、Alt a 7、Alt a 8、Alt a 10、Alt a 12、Alt a 13)、黄曲霉(Aspergillus flavus)(真菌)(Asp fl 13)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)(真菌)(Aspf 1、Asp f 2、Asp f 3、Asp f 4、Asp f5、Asp f 6、Asp f 7、Asp f 8、Asp f 9、Asp f 10、Asp f 11、Asp f 12、Asp f 13、Asp f 15、Asp f 16、Asp f 17、Asp f 18、Asp f 22、Asp f23、Asp f 27、Asp f 28、Asp f 29、Asp f 34)、黑曲霉(Aspergillus niger)(Asp n 14、Asp n18、Asp n 25)、米曲霉(Aspergillus oryzae)(Asp o 13、Asp o 21)、杂色曲霉(Aspergillus versicolor)(Asp v 13)、白色念珠菌(Candida albicans)(酵母菌)(Canda 1、Cand a 3)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)(酵母菌)(Cand b 2)、芽枝状枝孢(Cladosporium cladosporioides)(Cla c 9、Cla c 14)、多主枝孢(Cladosporiumherbarum)(Cla h 2、Cla h 5、Cla h 6、Cla h 7、Cla h8、Cla h 9、Cla h 10、Cla h 12)、弯孢叶斑病菌(Curvularia lunata)(异名：旋孢腔菌)(Cur l 1、Cur I 2、Cur I 3、Cur I4)、黑附球菌(Epicoccum purpurascens)(土壤真菌)(Epi p 1)、黄色镰刀菌(Fusariumculmorum)(N.A.)(Fus c 1、Fus c 2)、层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)(Fus p 4)、短密青霉(Penicillium brevicompactum)(Pen b 13、Pen b 26)、产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)(Pen ch 13、Pen ch 18、Pen ch 20、Pen ch 31、Pen ch 33、Pen ch 35)、桔青霉(Penicillium citrinum)(Pen c 3、Pen c 13、Pen c 19、Pen c 22、Pen c 24、Pen c30、Pen c 32)、皮壳青霉(Penicillium crustosum)(Pen cr 26)、草酸青霉(Penicilliumoxalicum)(Pen o 18)、葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum)(Sta c 3)、红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)(Tri r 2、Tri r 4)、断发毛癣菌(Trichophyton tonsurans)(Trit 1、Tri t 4)、古巴光盖伞(Psilocybe cubensis)(Psi c 1、Psi c 2)、毛头鬼伞(Cop c1、Cop c 2、Cop c 3、Cop c 5、Cop c 7)、胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)(Rho m1、Rho m 2)、糠秕马拉色氏霉菌(Malassezia furfur)(Malaf2、Malaf3、Malaf4)、合轴马拉色菌(Malassezia sympodialis)(Malas1、Malas5、Malas6、Malas7、Malas8、Malas9、Malas10、Malas11、Malas12、Malas13)和链格孢霉(Alternaria alternate)(Alt a1.0101、Alt a1.0102)；以及它们的任何变体。

另外的变应原的例子包括但不限于：线虫(Ani s 1、Ani s 2、Ani s 3、Ani s 4)、蠕虫(Asc s 1)、软珊瑚(Den n 1)、橡胶(乳胶)(Hev b 1、Hev b 2、Hev b 3、Hev b 5、Hevb 6、Hev b 7、Hev b 8、Hev b 9、Hev b 10、Hev b11、Hev b 12、Hev b 13)、非洲白木(Trips 1)和巴西橡胶树(Hev b6.01、Hev b6.0201、Hev b6.0202、Hev b6.03、Hev b8.0101、Hevb8.0102、Hev b8.0201、Hev b8.0202、Hev b8.0203、Hev b8.0204、Hev b10.0101、Hevb10.0102、Hev b10.0103、Hev b11.0101、Hev b11.0102)；以及它们的任何变体。

在某些实施方案中，本发明的SPN和组合物可以用在医院中用于临床食物变态反应或变态反应测试和鉴别患者对其过敏的食物/变应原。此外，本发明的SPN和组合物可以用作具有食物/环境变态反应的人的随身测试仪，例如，在家测试市售食物或者在饭店检查他们所点的菜肴。食物样品可以是含有动物来源的肉和/或蔬菜的新鲜食物、冷冻食物、冷却食物或者经加工的食物。

其它靶分子

在某些实施方案中，本发明的SPN和组合物可以检测其它靶分子，包括但不限于，来自样品中的病原性微生物(诸如细菌、酵母、真菌、孢子、病毒或朊病毒)的病原体；疾病蛋白(例如，用于疾病诊断和预后的生物标志物)；在环境中残留的杀虫剂和肥料；和毒素。在其它实施方案中，本发明的SPN和组合物可以结合非蛋白靶标，诸如矿物质和小分子(例如，抗生素)。

应用

根据本发明，本发明的检测分子、信号传递多核苷酸(SPN)、化合物和组合物在广义上可以在很多种应用中用于检测样品中的任何蛋白，诸如食物安全、在民用和战场场所中的诊断和预后试验、环境监测/控制和用于检测生物武器的军事应用。在甚至更宽的应用中，本发明的检测分子、信号传递多核苷酸(SPN)、化合物和组合物可以用于检测基于核酸的检测分子所结合的任何物质，诸如水中的矿物质。

在食物安全控制中的应用可以包括但不限于：检测和监测食物污染物(例如，病原体和毒素)、食物质量(例如，营养物)、饮食添加物和食物变应原。在战场场合中的应用可以包括但不限于，抗生素和生物药物的测试、生物武器、感染性疾病监测和食物安全。

多种方法和测定可以与本发明的检测分子、信号传递多核苷酸、化合物和组合物联合使用；选择可能取决于应用领域。

检测方法和测定：食物变应原

在某些实施方案中，提供了用于检测样品中的各种变应原(例如，食物变应原)的分析测定和方法。提供的测定和方法可以检测目标变应原在样品中的存在或不存在，和/或确定样品中变应原的量。

在某些实施方案中，用于检测试验样品(诸如食物样品)中的一种或多种变应原的方法包括以下步骤：(a)得到疑似含有变应原的试验样品；(b)处理所述试验样品并使用提取缓冲液从处理过的样品提取蛋白；(c)将步骤(b)的蛋白提取物与特异性地结合所述变应原的SPN混合；(d)借助于能量激发来活化所述样品和SPN混合物；和(e)观察所述SPN和所述变应原蛋白之间的相互作用，并检测所述变应原在所述试验样品中的不存在或存在。在某些实施方案中，发光二极管(LED)光可以用作激发装置。

样品处理和提取缓冲液

检测测定和方法检测试验样品中的变应原蛋白的能力受以下因素影响：从样品中提取这些蛋白的效率，以及在本发明中使用的检测分子检测样品提取物中的这些蛋白的效率。在某些实施方案中，处理样品并提取变应原蛋白以确保快速、可靠且灵敏的检测测定。可以为有效的且无破坏性的反应优化样品大小和重量、提取溶液和提取过程。可以单独或联合使用可破碎样品的任何机制(诸如切割、碾磨、匀浆化和过滤)以处理样品。

在某些实施方案中，通用蛋白提取缓冲液可以用于回收足够的靶蛋白(例如变应原)(最小2mg/ml总蛋白)用于来自任何食物基质的分析。在某些实施方案中，通用蛋白提取缓冲液的制剂可以在室温下并且以最小的时间提取蛋白。在某些方面，可以在小于约2分钟、或小于约1分钟、或小于约30秒中提取变应原蛋白。缓冲液可能需要与包括食物取样、匀浆化和过滤的提取方案合并。可以以随时间并且在不同食物基质中有效并且可重复的方式实施提取方案。此通用制剂将是临床上有关的，以尽量最低限度地影响测试的食物，并且仅仅取样大约0.5g食物，从而允许检测痕量的变应原，所述变应原的浓度在样品中最小。这种经优化的蛋白提取过程将提供允许检测任何食物基质中的变应原的快速、准确且通用的方案。

该通用提取缓冲液可以使蛋白提取和变应原回收最大化。所述通用提取缓冲液将可应用于任何变应原和所有食物(例如处理前的或处理后的)。另外，所述通用提取缓冲液可以提高信号传递多核苷酸(SPN)结合亲和力、使非特异性结合最小化和增加信噪比。

变应原检测测定

在某些实施方案中，本发明的组合物、化合物和信号传递多核苷酸可以用于替代抗体作为酶联免疫吸附测定(ELISA)中的替代性分子识别元件。基于适体的信号传递多核苷酸在ELISA中的应用会产生ELISA衍生的测定，其被称作酶联适体吸附(apta-sorbent)测定(ELASA)。与ELISA方法一样，ELASA可以以几种不同构型使用，包括直接、间接和夹心测定(Toh等人,Biosens.Bioelectron,2015,64,392-403，其内容通过引用整体并入本文)。

在某些实施方案中，本发明的组合物、化合物和信号传递多核苷酸可以用在实时适体-PCR(apta-PCR)中用于检测样品中的靶蛋白。在该测定中，试验样品中的靶标和固定化的相同靶标将竞争适体结合。竞争以后，可以将与固定化的靶蛋白结合的任何适体热洗脱，并使用实时PCR定量地扩增。用于该测定的适体可以是无标记的(Pinto等人,Anal-Bioanal Chem.,2014,406(2),515-524；和Svobodova等人,Food Chem.,2014,165,419-423；它们中的每一篇的内容整体并入本文)。

在某些实施方案中，变应原检测测定可能依赖于来自荧光共振能量转移(FRET)的荧光发射信号。信号传递多核苷酸(SPN)在序列的末端处用荧光团标记。与靶标的特异性相互作用会诱导双适体结构的变化，从而导致荧光发射的增加。所述方法是高度特异性的和灵敏的。

在某些实施方案中，可以使用一种或多种信号传递多核苷酸(SPN)，这取决于食物基质的性质。有些食物含有几种变应原蛋白，例如，至少8种花生蛋白(诸如Ara h1和Arah2)可以潜在地造成免疫学应答。在这样的情况下，针对超过一种变应原蛋白的超过一种信号传递多核苷酸(SPN)可以用在混合的混合液中用于检测花生的不存在或存在。在其它方面，有些食物基质(诸如鱼、贝类和软体动物)仅含有一种主要变应原蛋白。一种或多种特异性地结合该主要变应原蛋白的SPN可以用于变应原检测。

为了在变应原检测测定中提供准确且可靠的检测结果，测量从试验样品提取的总蛋白。通过使用本领域技术人员已知的任何蛋白测定，例如，双金鸡宁酸测定(BCA)，可以确定从试验样品提取的总蛋白。在某些方面，使用蛋白指示分子(例如，邻苯三酚红钼酸盐,PRM)来确定总蛋白。通过总蛋白测量来指定从检测分子-变应原相互作用检测到的任何信号。

在某些实施方案中，本发明的变应原检测测定和方法会提供特定变应原和使用的SPN的校准标准(即校正曲线)。可以从含有这样的变应原的原始或经加工的材料或经纯化的变应原产生特定变应原蛋白的校准标准。

在某些实施方案中，本发明的变应原检测测定和方法可以检测食物样品中较低浓度的变应原。核酸适体的敏感性使得可能检测低至0.0001ppm的变应原的存在。在某些方面，可检测的变应原的浓度或质量可以是在0.001ppm至5ppm、或0.001ppm至0.1ppm、或0.1ppm至3ppm、或1ppm至5ppm、或5ppm至10ppm的范围内。在某些方面，食物样品中可检测的变应原的浓度或质量可以是0.001ppm、0.002ppm、0.003ppm、0.004ppm、0.005ppm、0.006ppm、0.007ppm、0.008ppm、0.009ppm、0.01ppm、0.02ppm、0.03ppm、0.04ppm、0.05ppm、0.06ppm、0.07ppm、0.08ppm、0.09ppm、0.1ppm、0.2ppm、0.3ppm、0.4ppm、0.5ppm、0.6ppm、0.7ppm、0.8ppm、0.9ppm、1.0ppm、1.5ppm、2ppm、2.5ppm、3ppm、3.5ppm、4ppm、4.5ppm、5ppm或10ppm。

在某些实施方案中，本发明的变应原检测测定和方法可以在小于5分钟内完成执行。在某些方面，所述测定时间可以是约1分钟至约5分钟、约1分钟至约3分钟、约2分钟至约10分钟、约5分钟至约10分钟。在其它方面，所述测定时间可以持续小于1min、2min 3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min或10min。在另外的其它方面，所述测定时间可以持续小于约10秒、约15秒、约20秒、约25秒、约30秒、约35秒、约40秒、约45秒、约50秒、约55秒或约60秒。

检测系统和展示平台

用于检测和展示适体和蛋白相互作用的方法和系统可以用于展示检测结果。

本领域中的一种常用方法是使用电化学指示剂，其检测适体和靶标相互作用过程中的质量和电荷转移。根据该方法，将适体加载至电极，且电化学指示剂与目标靶标结合。电化学指示剂可以包括但不限于亚甲蓝(MB)。

用于检测适体-靶标相互作用的方法的一些非限制性例子包括：使用对CCRF-CEM细胞(CCL-119T-细胞、人急性成淋巴细胞性白血病)和Ramos细胞(CRL-1596、B-细胞、人伯基特淋巴瘤)上的细胞表面分子具有选择性的、适体缀合的金纳米颗粒(ACGNP)来直接检测癌细胞的测定(Medley,等人,Gold Nanoparticle-Based Colorimetric Assay for theDirect Detection of Cancerous Cells.Anal.Chem.2008,80:1067-1072)；使用在结合靶分析物后快速分解成红色分散纳米颗粒的、适体连接的金纳米颗粒(AuNP)(Lu,等人.第14章:Nanoparticles/Dip Stick,in Nucleic Acid and Peptide Aptamers:Methods andProtocols,Günter Mayer(编).535:223-239)；和采用适体-AuNP缀合物作为夹心扩增元件的基于差分脉冲伏安法(DPV)的生物传感器，所述夹心扩增元件用于人血清中的IgE的超灵敏检测(在1-10,000ng/mL的范围内，具有低至0.52ng/mL的LOD)(Wang,等人,Aptamer-AuNPs conjugates-accumulated methylene blue for the sensitive electrochemicalimmunoassay of protein,Talanta,2010年4月15日,81(1-2):63-67)。

但是，许多电化学生物传感器共有的至少一个缺点是测量的离线(off-line)性质，需要与分析物溶液的长温育时间，而不是实时检测(Pilloli,等人,Advances inbiosensor development based on integrating nanotechnology and applied tofood-allergen management.Trends in Analytical Chemistry,2013年6月,47:12-26)。

根据本发明，可以使用光学部件来检测SPN和靶变应原之间的相互作用。所述光学部件可以包含发光二极管(LED)，其提供适合激发信号传递多核苷酸的荧光团的激发波长的光。可以过滤从SPN的荧光团发出的荧光，并仅传输目标波长。然后可以使用装置处理荧光信号并转化成有用的读出(即数字信号)。

来自本发明的测定的检测结果可以在用户可容易地读出的平台(诸如展示窗)中展示。在一个实施方案中，它可以是在手机中的平台应用(Coskun等人,A personalizedfood allergen testing platform on a cellphone,Lab Chip.,2013,13(4),636-640；其内容通过引用整体并入本文)。

制剂、包装、试剂盒、装置和系统

制剂：可以按照标准操作配制本发明的检测分子、化合物、信号传递多核苷酸。在某些实施方案中，可以将本发明的检测分子、SPN配制在有利于检测分子和变应原之间的相互作用的溶液中。

包装：可以将本发明的检测分子、信号传递多核苷酸的制剂和/或组合物使用任何可接受的容器封装来包装用在多种药学上或诊断上可接受的容器中，因为所述制剂与含有PVC的和无PVC的容器和容器封装相容。可接受的容器的例子包括但不限于安瓿和预填充注射器、筒等。

可替换地，所述制剂可以含有在混合包的一个隔室中的冻干适体和在混合包的单独隔室中的可接受溶剂，使得两个隔室可以在施用给患者之前混合在一起。可接受的容器是本领域众所周知的和商购可得的。优选地，将所述制剂存储在具有丁基橡胶塞的1型玻璃小瓶中。液体形式的制剂可以存储在冷藏环境中。可替换地，冻干制剂可以在室温存储或者冷藏或冷冻。

优选地，所述制剂是无菌的。本文中使用的“无菌”制剂是指这样的制剂：其已经达到无菌状态并且尚未随后暴露于微生物污染，即，容纳所述无菌组合物的容器未受损害。通常由药品生产商根据美国食品和药品管理局的现行良好生产规范(“cGMP”)条例来制备无菌组合物。

在某些实施方案中，可以使用无菌处理技术制备无菌药物制剂。通过使用无菌材料和受控制的工作环境来维持无菌。在填充前，所有容器和设备优选地通过热杀菌来灭菌。然后，在无菌条件下填充容器，诸如通过使组合物穿过过滤器并且填充所述单元。因此，可以将制剂无菌填充到容器中以避免最终灭菌的热应力。

在某些实施方案中，通过使用湿热来将所述制剂最终灭菌。最终灭菌可以用于破坏含有药物制剂的最终密闭容器内的所有活微生物。通常使用高压灭菌器完成处于它们的最终包装中的药物产品的最终热灭菌。在制药工业中用于实现终产品的最终灭菌的典型高压灭菌器循环是在121℃维持至少10分钟。

试剂盒：可以将本发明的检测分子、化合物和组合物与其它成分或试剂组合，或制备为用于商业销售或分配的试剂盒或其它零售产品的组分。所述试剂盒将含有化合物或组合物，以及关于试剂盒的施用和/或应用的说明书。所述试剂盒还可以含有以下的一种或多种：注射器、袋或瓶。

装置和系统：本发明的信号传递多核苷酸、化合物和组合物可以用在任何变应原检测装置和系统中。一些非限制性例子包括侧向流装置(LFD)、微流体芯片(美国专利号8,617,903)、在2015年3月16日提交的共同拥有的美国专利申请号62/133,632中描述的便携式检测装置/系统和在2014年10月28日提交的共同拥有的PCT专利申请号PCT/US14/62656中描述的筒，它们中的每一篇通过引用整体并入本文。

定义

在本说明书中的不同地方，本公开内容的化合物的取代基以群组或以范围公开。本公开内容特别地意图包括这样的群组或范围的成员的各个和每个单独子组合。下面是术语定义的非限制性列表。

约：当表示可测量的值诸如重量、时间、剂量等的量时，本文中使用的术语“约”意在包括从指定量变动±20％或±10％，更优选地±5％，甚至更优选地±1％和更优选地±0.1％，因为这样的变动对于执行公开的方法是适当的。

活性：本文使用的术语“活性”表示其中事情正在发生或进行的情况。本发明的组合物可能具有活性，且该活性可能涉及与靶分子的结合。

变应原：本文中使用的术语“变应原”是指，在受试者中造成、引起或触发免疫反应的化合物、物质或组合物。这样，变应原通常被称作抗原。变应原通常是蛋白或多肽。

变应原检测分子：本文中使用的术语“变应原检测分子”表示，能够或者实现与一种或多种变应原相互作用和/或结合(以允许检测样品中这样的变应原的方式)的任何分子在本文中被称作“变应原检测分子”或“检测分子”。

结合亲和力：本文中使用的术语“结合亲和力”表示检测分子(例如，适体)的结合或不结合靶标(例如，变应原)的趋势，并描述了检测分子结合靶标的结合或亲和强度的量度。

生物分子：本文使用的术语“生物分子”是基于氨基酸的、基于核酸的、基于碳水化合物的或基于脂质的和类似的任何天然分子。

互补的和基本上互补的：本文使用的术语“互补的”表示多核苷酸彼此形成碱基对的能力。碱基对通常由反向平行的多核苷酸链中的核苷酸单元之间的氢键形成。互补多核苷酸链可以以沃森-克里克方式(例如，A-T、A-U、C-G)或以允许形成双链体的任意其它方式形成碱基对。本领域技术人员会明白，当使用RNA而不是DNA时，尿嘧啶(而不是胸腺嘧啶)是被认为与腺苷互补的碱基。但是，当在本发明的上下文中提及U时，暗示置换T的能力，除非另有说明。完美互补性或100％互补性表示这样的情形：其中一个多核苷酸链的每个核苷酸单元可以与第二个多核苷酸链的核苷酸单元形成氢键。小于完美互补性表示这样的情形：其中两条链的一些(并非所有的)核苷酸单元可以彼此形成氢键。例如，对于两个20-聚体，如果每条链上的仅两个碱基对可以彼此形成氢键，那么所述多核苷酸链表现出10％互补性。在相同的例子中，如果在每个链上的18个碱基对可以彼此形成氢键，那么所述多核苷酸链表现出90％互补性。

检测：本文中使用的术语“检测”是指来自许多非靶蛋白的混合物的特定靶蛋白的提取，从而指示来自许多非靶蛋白的混合物的靶蛋白的不存在、存在和/或量。

可检测标记物：本文中使用的“可检测标记物”表示与另一个实体连接、掺入或结合的一个或多个标志物、信号或部分，所述标志物、信号或部分通过本领域已知的方法容易地检测到，所述方法包括放射摄影术、荧光、化学发光、酶活性、吸光度、免疫学检测等。可检测标记物可以包括放射性同位素、荧光团、生色团、酶、染料、金属离子、配体、生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素和半抗原、量子点、聚组氨酸标签、myc标签、flag标签、人流感血凝素(HA)标签等。可检测标记物可以位于它们所连接、掺入或结合的实体中的任何位置。例如，当与肽或蛋白连接、掺入或结合时，它们可以是在氨基酸、肽或蛋白质内部，或位于N-末端或C-末端处。

包括：本文中使用的术语“包括”表示“包括、但不限于”。“包括”和“包括但不限于”互换使用。

相互作用:本文中使用的术语“相互作用”表示，因为两种或更多种分子对彼此具有影响而发生的一类作用。在本发明的上下文中，检测分子和靶标之间的相互作用会影响检测分子的结构，并且这样的影响将产生可以观察到的能量变化。

病原体：本文中使用的术语“病原体”是指任何产生疾病的介质(特别是病毒或细菌或其它微生物)。

多核苷酸：本文中使用的术语“多核苷酸”表示核苷碱基聚合物或寡聚体，其中核苷碱基通过糖磷酸酯键(糖-磷酸主链)连接。示例性的多核苷酸和寡核苷酸包括2′脱氧核糖核苷酸(DNA)的聚合物和核糖核苷酸(RNA)的聚合物。多核苷酸可以完全由核糖核苷酸组成，完全由2′脱氧核糖核苷酸组成，或它们的组合。

多核苷酸变体：本文中使用的术语“多核苷酸变体”表示，与天然或起始序列相比，在它们的核酸序列中具有一些差异的分子。

ppm:本文中使用的术语“ppm”是每百万的份数的缩写。ppm是代表以1/1000000为单位的整数的部分的值。ppm是无量纲的量，相同单位的2个量的比率。例如:mg/kg。1ppm等于整体的1/1000000:1ppm＝1/1000000＝0.000001＝1×10^-6。ppm在本文中用于测量化学(蛋白)浓度，经常在溶液中。1ppm的溶质浓度是所述溶液的1/1000000的溶质浓度。从溶质质量m_溶质(以毫克为单位)和溶液质量m_溶液(以毫克为单位)计算以ppm为单位的浓度C：C_(ppm)＝1000000×m_溶质/(m_溶液+m_溶质)。

样品：本文中使用的术语“样品”表示可能含有要分析的目标靶标的任何组合物，包括但不限于，得自受试者(包括人类和下面详述的动物)的生物样品，得自环境的样品例如土壤样品、水样品、农业样品(包括植物和作物样品)或食物样品。食物样品可以得自新鲜食物、经加工的/经烹调的食物或冷冻的食物。

灵敏度：本文中使用的术语“灵敏度”是指检测分子的结合靶分子的能力。

特异性地结合：本文中使用的术语“特异性地结合”是指，检测分子(例如，适体)相对于替代靶标更经常地、更快速地、以更大的持续时间和/或以更大的亲和力与特定靶标(诸如变应原蛋白)反应或结合。例如，相对于它与无关蛋白和/或其片段的结合，特异性地结合变应原蛋白的适体会以更大的亲和力、亲合力、更容易地和/或以更大的持续时间结合该蛋白或其片段。技术人员通过该定义还会理解，例如，特异性地结合第一靶标的检测分子(例如，适体)可能或不可能特异性地结合第二靶标。这样，“特异性结合”不一定要求另一种分子的排它结合或不可检测的结合，这被术语“选择性结合”包括。通常，但不一定，对结合的提及是指特异性结合。相对于就环境中的适体和其它物质或一般无关分子而言的解离常数，以适体对靶标的可比较解离常数(Kd)的方式定义结合的特异性。通常，适体就靶标而言的Kd比就环境中的靶标和无关物质或伴随物质而言的Kd小2倍、5倍或10倍。甚至更优选地，所述Kd将小25倍、50倍、75倍、100倍、150倍或200倍。

靶标：本文中使用的术语“靶标”和“靶分子”表示这样的分子：其可以在试验的样品中发现，且其能够结合检测分子诸如适体或抗体。

通用缓冲液:本文中使用的术语“通用缓冲液”表示可以用于多种样品的缓冲液。

等同方案和范围

本领域技术人员会认识到或使用不超过例行实验能够确定根据本文描述的发明的具体实施方案的许多等同方案。本发明的范围无意限于上面的描述，而是如所附权利要求所述。

在权利要求中，冠词诸如“一个”、“一种”和“所述”可以是指一个/种或超过一个/种，除非指示相反情形或以其它方式从上下文显而易见。如果群体成员中的一个、超过一个或所有成员存在于指定的产品或过程中、在指定的产品或过程中使用、或以其它方式与指定的产品或过程相关，认为满足在一组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或描述，除非指示相反情形或以其它方式从上下文显而易见。本发明包括这样的实施方案，其中所述组的刚好一个成员存在于给定产品或方法中、用于给定产品或方法中或者以其它方式与给定产品或方法相关。本发明包括这样的实施方案，其中超过一个或整个群体成员存在于、用在给定的产品或方法中或以其它方式与给定的产品或方法相关。

还应当指出，术语“包含”意图是开放式的，并且允许但不要求包括额外的要素或步骤。当在本文中使用术语“包含”时，因此还包括和公开术语”由……组成”。

在给出范围的情况下，包括端点。此外，应当理解，除非另外指示或以其它方式从上下文和本领域普通技术人员的理解显而易见，以范围表述的数值在本发明的不同实施方案中可呈现处于所述范围内的任何具体数值或子范围，其精确至该范围的下限单位的十分之一，除非上下文另外清楚地指明。

另外，应当理解，可以从任意一项或多项权利要求中明确地排除落在现有技术内的本发明的任何特定实施方案。因为这样的实施方案被视为本领域普通技术人员已知的，所以可以排除它们，即使所述排除并未在本文中明确地阐明。本发明的组合物的任何特定实施方案(例如，任何抗生素、治疗或活性成分；任何生产方法；任何使用方法；等)可以因为任何原因从任意一项或多项权利要求排除，无论是否与现有技术的存在相关。

应当理解，已经使用的词语是描述而不是限制的词语，并且可以在所附权利要求的范围内做出变化，而不背离在它的更宽方面的本发明的真实范围和精神。

尽管已经就几个描述的实施方案而言相当详尽地且相当特定地描述了本发明，但是无意将本发明限于任何这样的细节或实施方案或任何具体实施方案，而是应当参考所附权利要求来解释本发明，从而考虑到现有技术提供这类权利要求的最广泛的可能解释，并因此有效地包括本发明的预期范围。

实施例

实施例1：作为信号传递多核苷酸的适体的设计

在该概念验证(proof-of-concept)实施例中，使用两种先前已知的适体序列设计三种不同的信号传递多核苷酸。针对Ara h 1蛋白变应原的适体描述在Tran等人.Selection of aptamers against Ara h 1 protein for FO-SPR biosensing ofpeanut allergens in food matrices.Biosensors and Bioelectronics,2013,43,245-251(通过引用整体并入本文)。在下面显示了该适体的序列。

5′CGCACATTCCGCTTCTACCGGGGGGGTCGAGCTGAGTGGATGCGAATCTGTGGGTGGGCCGTAAGTCCGTGTGTGCGAA3′(SEQ ID NO:1)

修饰SEQ ID NO:1的原始适体以添加5′-T残基来改善荧光团-猝灭剂对的功能。然后将荧光素连接至如下所示的5’-T残基。

5′荧光素TCGCACATTCCGCTTCTACCGGGGGGGTCGAGCTGAGTGGATGCGAATCTGTGGGTGGGCCGTAAGTCCGTGTGTGCGAA3′(SEQ ID NO:2)

如下所示设计具有3′-DABCYL猝灭剂的9-核苷酸接头，以与SEQ ID NO:2的T-修饰适体的5’-末端的前十个残基互补。

3′DABCYLAGCGTGTAA5’(SEQ ID NO:3)

然后使9-核苷酸接头(SEQ ID NO:3)与主要修饰的抗-花生变应原适体序列(SEQID NO:2)的5’-末端退火，以使荧光素荧光团靠近DABCYL猝灭剂部分。下面显示了用于检测花生变应原Ara h 1的经组装的信号传递多核苷酸的结构。

从退火的SEQ ID NO:2和3制备的信号传递多核苷酸是二聚实体，在本文中被命名为SPN-A*。SPN-A*的二级结构显示在图1中。信号传递多核苷酸200的组分的排列是核心序列202、荧光团204、猝灭剂206和接头序列208。

以类似的方式，基于由Tran等人.Selection and Characterization of DNAAptamers for Egg White Lysozyme.Molecules 2010,15(3),1127-1140(通过引用整体并入本文)描述的针对卵清溶菌酶的适体的序列，设计信号传递多核苷酸。在下面显示了此适体的序列。

5′GCAGCTAAGCAGGCGGCTCACAAAACCATTCGCATGCGGC3′(SEQ ID NO:4)

修饰SEQ ID NO:4的原始适体以添加5’-T残基来改善荧光团-猝灭剂对的功能。然后将荧光素连接至如下所示的5’-T残基。

5′荧光素TGCAGCTAAGCAGGCGGCTCACAAAACCATTCGCATGCGGC3′(SEQ ID NO:5)

如下所示设计具有3’-DABCYL猝灭剂的10-核苷酸接头，以与SEQ ID NO:5的T-修饰的适体的5’-末端的前十个残基互补。

3’DABCYLACGTCGATTC5’(SEQ ID NO:6)

然后使10-核苷酸接头(SEQ ID NO:6)与主要修饰的抗-溶菌酶适体序列(SEQ IDNO:5)的5’-末端退火，以使荧光素荧光团靠近DABCYL猝灭剂部分。下面显示了用于检测溶菌酶的经组装的信号传递多核苷酸的结构。

从SEQ ID NO:5和6制备的二聚信号传递多核苷酸在本文中被命名为SPN-E*。SPN-E*与溶菌酶之间的反应示意性地显示在图3中。信号传递多核苷酸SPN-E*400的组分的排列是核心序列402、荧光团404、猝灭剂406和接头序列408。可以看到，溶菌酶的结合会扰乱发夹结构并且造成荧光团404移离猝灭剂406，从而允许荧光团404在激发后发荧光。

基于上述的SEQ ID NO:4的适体序列设计第三个信号传递多核苷酸。将5′-T残基附加至SEQ ID NO:4，并且通过添加与SEQ ID NO:4的原始适体序列的5’-末端的最后五个核苷碱基互补的五个核苷碱基片段来修饰3’-末端。然后，将5′-荧光素和3′-DABCYL部分连接以产生下面显示的序列(SEQ ID NO:7)，其中另外的五个核苷碱基片段与原始适体序列的5’-末端处的前五个核苷碱基一起标有下划线(不包含添加的5’-T残基)。

5′荧光素TGCAGCTAAGCAGGCGGCTCACAAAACCATTCGCATGCGGCGCTGCDABCYL3′(SEQ IDNO:7)

此信号传递多核苷酸是发夹实体，在本文中被命名为SPN-E。应当认识到，为了形成如图2的最左边结构所示的发夹二级结构(核心序列302)，在5’-末端和3’-末端处的标有下划线的残基是互补的。此结构使荧光团304和猝灭剂306彼此紧密靠近以允许猝灭剂306猝灭荧光团304。信号传递多核苷酸与溶菌酶的结合可以扰乱信号传递多核苷酸300的两个末端的杂交(如核心序列302的最右边结构所示)，从而导致荧光团304与猝灭剂306分离，由此活化荧光团304。

实施例2：适体多核苷酸的选择和优化

进行基于SELEX方法的体外筛选实验，并且选择超过反靶标(counter-target)(非靶蛋白的组合)针对变应原靶标(包括蛋、谷蛋白、奶、豆、鱼、花生、腰果和甲壳动物)的适体，并且针对它们在检测靶食物变应原中的能力进一步工程改造。

实验计划

使用各个RNA文库选择在23℃在选择缓冲液中的结合能力，所述选择缓冲液由100mM Tris(pH 8)、5mM EDTA、150mM NaCl、10mM MgCl2、0.1％SDS、0.1％明胶、1％NP-40(Tergitol)、0.5％脱氧胆酸钠组成。给定的选择轮开始于在任一种单独缓冲液中温育RNA文库成员(负选择)，然后收集未响应(即切割)的文库的部分。各轮的第二部分(当需要时)由用非正靶标(如相反靶标)的完全组合温育来自先前负选择步骤的非响应分子组成，或者将仅仅选择缓冲液再次用于第二负选择。再次地，收集非响应(非切割)分子。各轮的最终步骤由用缓冲液中的正靶标(变应原中的每一种，视情况而定)温育来自先前步骤的材料、然后收集响应材料(即切割的RNA)组成。各选择轮之后为：反转录以生成cDNA，通过PCR进行文库扩增，和通过转录再生RNA文库。在使不同随机序列的初始文库经受不同的连续选择轮(即负选择、反选择和正选择)之后，再次项目依赖性地，并且将富集的文库分成三个部分以执行平行评估。

负选择、反选择和正选择轮以后富集的文库的平行评估涉及将富集的文库的三分之一同时暴露于单独的选择缓冲液，另外三分之一暴露于选择缓冲液中的相反靶标复合物，并且将富集的文库的最终三分之一暴露于缓冲液中的靶变应原。鉴定与靶变应原和相反靶标无差别地反应或者在没有靶变应原存在下仍产生响应的任何残余RNA分子，并且在进一步生物信息学分析中抛弃。

在平行评估之后对富集的RNA文库进行PAGE凝胶评估。将40pmol的富集的文库单独地暴露于在选择缓冲液中的负(仅缓冲液)靶标、相反靶标或靶变应原(例如，奶、小麦、卵清和花生)。在23℃温育5分钟之后，将表现出正响应(即切割)材料的文库收集，进行乙醇沉淀、逆转录并且PCR扩增用于测序和生物信息学分析。

材料和方法

如果必要的话，将靶标(来自腰果、花生、鱼、奶、大豆、谷蛋白、蛋和甲壳动物的蛋白的复合物)干燥，然后与不含RNA酶的水组合用于初步分析和适体筛选。当需要时，通过组合适当量的靶标(其没有被命名为选择的正靶标)，将靶标合并以产生相反靶标混合物。初始适体文库模板和引物由IDT(Coralville,IA)合成为单链DNA。然后使用来自Clontech(Mountain View,CA)的Titanium Taq DNA聚合酶将所述文库进行引物延伸以提供双链DNA(dsDNA)。

遵循实验计划，对于文库的给定代，用来自Epicentre(Madison,WI)的AmpliScribe T7转录试剂盒从上述dsDNA转录RNA，并使用10％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)纯化。将纯化的RNA与选择缓冲液组合，然后将其稀释至1X浓度(100mM Tris(pH 8),5mM EDTA,150mM NaCl,10mM MgCl2,0.1％SDS,0.1％明胶,1％NP-40(Tergitol),0.5％脱氧胆酸钠)用于负选择。负选择开始于重折叠循环，其涉及将样品加热至65℃以将RNA变性，然后使样品达到23℃用于剩余的温育。温育以后，使用10％变性PAGE将未切割的RNA与经切割的RNA分离。将回收的未切割的物质与相反靶标和缓冲液、靶标和缓冲液或单独缓冲液组合(取决于选择步骤)，在23℃温育，并在10％变性PAGE上分离。如果需要的话，完成回收和另一个选择步骤。然后使用SuperScript II逆转录酶(Life Technologies；Carlsbad,CA)从洗脱的选择后文库产生cDNA，然后用Titanium Taq DNA聚合酶(Clontech；MountainView,CA)进行PCR扩增以完成选择轮。几轮选择步骤以后，将文库富集，并表明负切割量小于30％，并且与相反相比在正处理中存在多至少5％的切割。

对由大约10¹⁴个随机序列组成的最初文库进行不同轮的基于核酶的SELEX以在多轮选择中富集结合靶变应原的序列并消除结合相反靶标的序列。所以，预期要测序的群体含有潜在适体候选物的多个拷贝(Van Simaeys等人,Study of the MolecularRecognition of Aptamers Selected through Ovarian Cancer Cell-SELEX,2010,PLOSOne,5(11):e13770)。

测序和生物信息学

使用成对末端读出技术执行Illumina(San Diego,CA)MiSeq系统以对选择以后的适体测序。测序数据的生物信息学分析鉴别出候选适体分子。深度测序和随后的数据分析简化了执行大量选择的传统方案，这可能归因于筛选过程而引入错误和偏好(Schütze等人,Probing the SELEX Process with Next-Generation Sequencing,PLos One,2011,6(12):e29604)。

适体候选物选择

序列家族构建聚焦于基序存在，这意味着序列在正靶标群体中的频率被计入，但是更加强调子序列在总群体中的普及(在整个序列上的100％匹配不是加入家族所必需的)。使用两个其它因素来调节基序-家族大小的重要性以确定候选序列。一个因素是所述序列在负和相反靶标群体中的存在。从平行评估收集三个文库：正靶标暴露的文库，仅缓冲液的负文库，和相反靶标暴露的文库。分析所有文库以发现在负选择或相反选择步骤中尚未除去、但是仍然对靶标和相反靶标具有亲和力的任何序列。与在相反靶标暴露的群体中相比，给定的序列更频繁地出现在正群体中，使它成为用于进一步试验的有吸引力的候选物。

还使用Mfold二级结构建模软件预测给定的候选序列的二级结构(Zucker,Mfoldweb server for nucleic acid folding and hybridization prediction,NucleicAcids Res.,2003,31(13):3406-3415)。

选择一组适体序列，并进一步设计为信号传递多核苷酸用于检测不同的食物变应原，包括花生、卵清、小麦和奶。选择的适体列出在表1中。然后在5’末端和3’末端中的一个或两个处进一步修饰为每种食物变应原选择的适体，以优化与它的靶变应原的结合亲和力。意图具有5’末端上的荧光素(例如，FITC/FAM分子)和在3’末端上的猝灭剂的经修饰的序列是如本文中所述的将针对变应原检测进行试验的信号传递多核苷酸。

实施例3:总蛋白测量

使用邻苯三酚红-钼酸盐(PRM)蛋白染料-结合测定测试总蛋白测量。首先在含有0.156mM邻苯三酚红、0.209mM钼酸钠和50mM Tris-HCl的溶液中制备PRM。

通过加入20μl/孔PRM溶液来制备试验平板，并将所述平板干燥过夜。处理试验食物基质以后，将经处理的样品溶液(400μl)加入每个孔中，并立即在600nm读出蛋白吸光度。

Claims (22)

1.一种检测变应原的信号传递多核苷酸(SPN)，其包含选自由SEQ IDNO.:8-26表示的序列组成的组的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的SPN，其中所述核苷酸序列或所述核苷酸序列的部分特异性地结合所述变应原。

3.根据权利要求2所述的SPN，所述SPN还包含荧光团和猝灭剂，它们足够接近以使所述猝灭剂猝灭所述荧光团的荧光。

4.根据权利要求3所述的SPN，其中所述荧光团和所述猝灭剂连接至所述SPN的序列的相对末端，且其中在所述序列5′-末端处的5-20个核苷碱基残基与在所述序列3′-末端处的能够形成发夹结构的5-20个核苷碱基残基具有至少80％互补性，由此使所述猝灭剂与所述荧光团足够接近以猝灭所述荧光团的荧光。

5.根据权利要求4所述的SPN，其中用于检测花生的SPN包含选自由SEQ ID NO.:8-10表示的序列组成的组的核苷酸序列。

6.根据权利要求4所述的SPN，其中用于检测卵清的SPN包含选自由SEQ ID NO.:11-14表示的序列组成的组的核苷酸序列。

7.根据权利要求4所述的SPN，其中用于检测小麦的SPN包含选自由SEQ ID NO.:15-23表示的序列组成的组的核苷酸序列。

8.根据权利要求4所述的SPN，其中用于检测奶的SPN包含选自由SEQ ID NO.:24-26表示的序列组成的组的核苷酸序列。

9.一种检测样品中的一种或多种变应原的方法，所述方法包括：

(a)得到疑似含有所述一种或多种变应原的试验样品，

(b)处理所述试验样品并使用提取缓冲液从处理过的样品提取蛋白，

(c)将提取的蛋白与信号传递多核苷酸(SPN)混合，

(d)用激发装置处理步骤(c)的混合物，和

(e)测量所述信号传递多核苷酸和所述变应原之间的相互作用，其指示所述变应原在试验样品中的不存在或存在。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述信号传递多核苷酸(SPN)包含特异性地结合一种或多种变应原的核苷酸序列或其部分。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述SPN包含荧光团和猝灭剂，它们足够接近以使所述猝灭剂猝灭所述荧光团的荧光。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述荧光团和所述猝灭剂连接至所述适体的序列的相对末端，且其中在所述序列5′-末端处的5-20个核苷碱基残基与在所述序列3′-末端处的能够形成发夹结构的5-20个核苷碱基残基具有至少80％互补性，由此使所述猝灭剂与所述荧光团足够接近以猝灭所述荧光团的荧光。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述SPN还包含5-20个核苷碱基长度的接头序列，所述接头序列与所述适体的序列的5′-末端退火且与所述适体的序列的5′-末端具有至少80％互补性，其中所述适体序列包含荧光团且所述接头序列包含猝灭剂，或其中所述适体序列包含猝灭剂且所述接头序列包含荧光团。

14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述SPN与所述变应原的结合将所述猝灭剂与所述荧光团分离，由此允许检测所述荧光团的荧光。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述SPN与所述变应原的结合会造成所述SPN的二级结构的变化。

16.根据权利要求9-15任一项所述的方法，其中所述SPN包含选自由SEQ ID NO.:8-26组成的组的核苷酸序列。

17.根据权利要求9所述的方法，其中在步骤(b)中使用的提取缓冲液是通用提取缓冲液。

18.根据权利要求9所述的方法，其中测量处理过的样品的总蛋白。

19.根据权利要求18所述的方法，其中使用PRM试剂测量所述总蛋白。

20.根据权利要求19所述的方法，其中将所述总蛋白确定为在600nm的吸光度。

21.根据权利要求9所述的方法，其中所述激发装置是发光二极管(LED)光。

22.根据权利要求9所述的方法，其中所述试验样品是食物样品。