CN101871881B - 一种检测溶液中蛋白质含量的方法 - Google Patents
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Abstract
一种检测溶液中蛋白质含量的方法，包括：调节缓冲溶液的pH值到蛋白质的等电点之下，选用在溶液中始终带正电的色素指示剂，将待测蛋白质与色素指示剂共同溶于缓冲溶液中，蛋白质分子与色素指示剂在光波导表面形成竞争吸附，连续记录吸收光谱随时间的变化，直到吸收光谱随时间不再变化，即竞争吸附达到平衡状态；在此过程中，通过探测色素指示剂对导波光的吸收谱随时间的变化情况来检测溶液中蛋白质的含量；或通过探测光波导输出光强度随时间的变化情况来检测溶液中蛋白质的含量。本发明避免了对被测样品进行繁琐的前处理过程，操作简便、精确度高、成本低、无污染，可应用于生物、化学、医学以及日常生活中的蛋白质检测领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测溶液中蛋白质含量的方法。
背景技术
蛋白质作为生命的物质基础之一，与各种形式的生命活动紧密联系在一起，它在催化生命体内的各种反应、调节新陈代谢以及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用。因此对于蛋白质的检测在临床诊断、食品安全、生命现象研究等方面都有重要的应用价值。
传统的检测蛋白质含量的方法有很多种，操作时往往需要对待测样品进行复杂的生物或化学前处理，例如：Folin-酚试剂法(Lowry法)使蛋白质在碱性条件下与铜作用生成蛋白质铜复合物，该复合物随之将磷钼酸、磷钨酸还原成蓝色复合物；双缩脲法(Biuret法)基于蛋白质多肽的肽键与双缩脲的相似结构，以及它们都能与铜离子在碱性环境中形成紫红色复合物；凯氏(Kjeldahl)定氮法首先使有机物与浓硫酸共热，有机氮转变为无机氮氨，氨与硫酸作用成硫酸铵，后者与强碱作用释放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此过量酸液被中和的程度来计算样品的含氮量，再推知蛋白含量；考马斯亮蓝法(Bradford法)则需要考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中与蛋白质通过范德华键结合，上述方法的检测灵敏度在0.02mg/mL到10mg/mL之间。
根据我国乳粉标准中对于蛋白质检测的相关规定，所采用的方法是凯氏定氮法，近期一些不法厂商通过往乳粉中添加含氮量高达66％的对人体有害的三聚氢胺来提高乳粉含氮量，获取利润，对消费者的生命安全造成重大威胁，因此直接快速有效地检测蛋白质含量对于人们的日常生活也有极为重要的意义。
已有的利用光波导消逝波来检测蛋白质含量的方法主要是借助于蛋白质的特异性结合进行抗原抗体配对，有些还需要荧光标记。例如，2005年A.Ymeti等人利用光波导杨氏干涉计结合微流体系统对人血清蛋白与抗体之间的免疫反应进行了研究[A.Ymeti，J.S.Kanger，J.Greve，G.A.J.Besselink，P.V.Larnbeck，R.wijn，R.G.Heideman，Biosensors andBioelectronics，20(2005)1417-1421]；2007年Y.Enami等人利用绿色荧光分子标记待测蛋白，然后使用光波导技术对荧光强度进行测量，以此实现对蛋白质的探测[Y.Enami，T.Fukuda，S.Suye，Applied Physics Letters，91(2007)203507]；2008年Sonia Grego等人利用光栅耦合的平面光波导模式谱传感器研究蛋白质特异性结合现象[Sonia Grego，Jonathan R.McDaniel，Brian R.Stoner，Sensors and Actuators B，131(2008)347-355]；2009年Wen-Chi Tsai等人通过对表面等离子体共振(SPR)传感器进行复杂的表面功能化处理来检测葡萄糖球菌肠毒素A(SEA)[Wen-Chi Tsai，Ie-Chin Li，Sensors and Actuators B，136(2009)8-12]。但是上述公知技术中均需要进行前处理程序，而这些前处理过程使得整个测试过程复杂繁琐。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测溶液中蛋白质含量的方法及装置。
为实现上述目的，本发明提供的检测溶液中蛋白质含量的方法，包括：调节缓冲溶液的pH值到蛋白质的等电点之下，选用在溶液中始终带正电的色素指示剂，将待测蛋白质与色素指示剂共同溶于缓冲溶液中，蛋白质分子与色素指示剂在光波导表面形成竞争吸附，连续记录吸收光谱随时间的变化，直到吸收光谱随时间不再变化，即竞争吸附达到平衡状态；在此过程中，通过探测色素指示剂对导波光的吸收谱随时间的变化情况来检测溶液中蛋白质的含量；或通过探测光波导输出光强度随时间的变化情况来检测溶液中蛋白质的含量。
本发明所述的蛋白质，可以是牛血清蛋白、血红蛋白、细胞色素蛋白、肌红蛋白、胶原蛋白、免疫球蛋白、酪蛋白、溶菌酶、病毒蛋白中的一种或几种。
本发明的缓冲溶液满足以下条件：
(1)蛋白质和色素指示剂共同溶于缓冲溶液，且蛋白质、色素指示剂和缓冲溶液三者之间互不发生反应；
(2)缓冲溶液的pH值可以在一定范围内调节，既满足蛋白质的等电点条件又保证蛋白质不失活。
本发明提供的用于实现上述方法的装置，主要包括：
一玻璃光波导，置于一光波导衬底上；一样品池，置于平面玻璃光波导的上方；样品池的两侧分别各设置一棱镜耦合器；于棱镜耦合器的入射光和出射光的光路上各设有聚焦透镜；一光源，置于入射光的聚焦透镜的光路上；一光电检测仪，置于出射光的聚焦透镜的光路上；光源发出的光经过聚焦透镜聚焦后，由棱镜耦合器输入光波导中成为导波光，导波光在光波导内传播后又由棱镜耦合器输出，输出光通过聚焦透镜聚焦后又传输至光谱仪对光信号进行处理。
本发明是借助于高度敏感的光波导表面分析技术进行探测，需要的光学设备有：宽带或单色光源、棱镜耦合(或端面耦合、光纤耦合)光进/出的平面或三维光波导、光谱仪或光电二极管探测器等，检测的原理是蛋白质分子与色素指示剂在光波导表面的竞争性吸附。这种简单新颖的检测方法可以方便地应用在生物、化学、医学和日常生活中需要对蛋白质含量进行检测的场合。
本发明的检测方法是利用光波导消逝波吸光度测量技术通过探测蛋白质分子与色素指示剂在光波导表面的竞争吸附来间接检测蛋白质含量，操作简便快捷，不消耗样品，无需其它任何标记物，只要选择合适的缓冲溶液就可以检测各类蛋白质。对两种典型蛋白质的检测实验证实了本发明方法的测量灵敏度完全可以达到现有各种方法的水平，本发明的方法及相关内容未见有报道。
附图说明
图1为光波导光谱装置的结构示意图；
图2、图3、图4、图5为利用光波导光谱技术测得的从不同缓冲溶液中吸附到玻璃表面的亚甲基蓝在波长606.45纳米处的吸光度随时间的变化曲线；其中：
图2对应的被测样品为pH＝5.89的亚甲基蓝与BSA的混合水溶液；
图3a、b、c、d对应的被测样品为pH＝2.03的亚甲基蓝与不同浓度BSA的混合溶液；
图4a、b、c、d对应的被测样品为pH＝3.00的亚甲基蓝与不同浓度BSA的混合溶液；
图5a、b、c、d对应的被测样品为pH＝4.02的亚甲基蓝与不同浓度BSA的混合溶液。
图6a、b、c分别为对应于图3、图4、图5中的吸光度从峰值下降到峰值的40％所用时间与被测样品中BSA浓度的关系；
图7为利用光波导光谱技术测得的从pH＝4.02的缓冲溶液中吸附到玻璃表面的亚甲基蓝在波长606.45纳米处的吸光度随时间的变化曲线。图7a、b、c、d对应的被测样品为pH＝4.02的亚甲基蓝与不同浓度血红蛋白的混合溶液。
图8为对应于图7中的吸光度从峰值下降到峰值的40％所用时间与被测样品中血红蛋白浓度的关系。
具体实施方式
本发明公开了一种测量溶液中蛋白质含量的方法，并给出对两种典型蛋白质的测量结果，证实了这种简单廉价的新方法的可靠性和精确性。
本发明中测量蛋白质含量的方法是基于蛋白质分子与色素指示剂在平面或三维光波导表面的竞争吸附。蛋白质分子通常在可见光波段是无色的，直接探测比较困难，本发明方法通过探测色素指示剂对导波光的吸收来间接探测溶液中的蛋白质含量。每种蛋白质都有其特定的等电点(PI)，如果溶液的pH值在蛋白质的等电点之上，那么蛋白质分子在溶液中带负电，反之则带正电。这里所选用的色素指示剂在溶液中始终带正电，例如甲基蓝(分子式为[C16H18N3S]+Cl-)，罗丹明6G(分子式为[C28H31N2O3]+Cl-)等。由于未经修饰的玻璃光波导表面显负电性，如果调节溶液的pH值到蛋白质的等电点之下，将蛋白质与色素指示剂共同溶于缓冲溶液，然后将溶液注入密封在光波导表面的样品池，由于蛋白质分子与色素指示剂都带正电，它们在光波导表面形成竞争吸附的关系。通常蛋白质分子体积较大，吸附慢但吸附牢固，而色素分子小，吸附快但吸附不牢固，如果用宽带光源结合光谱仪进行探测，色素指示剂对于消逝波的吸收峰值应该是随时间迅速上升然后又逐渐下降至平衡的过程。对于每一种蛋白质，不同的浓度对应不同的下降速率，所以通过记录导波光吸收谱随时间的变化，就可以间接获得溶液中的蛋白质含量。
以下结合附图描述本发明方法的一种典型应用方式：
图1为本发明中用于检测溶液中蛋白质含量的光波导光谱测量装置的结构示意图。光波导为平面玻璃光波导1，置于光波导衬底3上。在平面玻璃光波导1的上方安置一样品池7，用于盛放待测的混合溶液。样品池7的两侧分别各设置一棱镜耦合器2，于棱镜耦合器的入射光和出射光的光路上各设有聚焦透镜4。光源5设置在入射光的聚焦透镜的光路上。光电检测仪6为一光谱仪，设置在出射光的聚焦透镜的光路上。光源发出的光经过聚焦透镜聚焦后，由棱镜耦合器输入光波导中成为导波光，导波光在光波导内传播后又由棱镜耦合器输出，输出光通过聚焦透镜聚焦后又传输至光谱仪对光信号进行处理。
本发明的装置中，光源发出的光由光纤8传输到聚焦透镜，经过聚焦透镜聚焦后由棱镜耦合器输入光波导中成为导波光，导波光在光波导内传播一段距离后又由棱镜耦合器输出，输出光通过聚焦透镜聚焦后又经光纤传输至光谱仪，这里使用光谱仪来接收和处理信号。选取pH值在待测蛋白质等电点之下的溶液作为缓冲溶液，应保证缓冲溶液是与蛋白质、色素指示剂、玻璃光波导表面都无明显反应的物质，并且待测蛋白质和色素指示剂都溶于缓冲溶液，这一条件在实验中很容易满足。将待测蛋白质与色素指示剂的混合溶液注入样品池的同时，使用光谱仪连续记录吸收光谱随时间的变化直到吸收光谱随时间不再变化，表明竞争吸附达到平衡状态。如果选取在吸收谱中峰值附近的某一波长的吸光度数据进行处理，可以发现对于不同的蛋白质浓度其吸光度随时间的变化趋势是相同的，但达到平衡所需的时间不同，而对于同一浓度的蛋白质，在不同pH值的缓冲溶液中，达到竞争吸附平衡所需的时间也不同，这就是本发明方法检测蛋白质含量的依据。
实验中使用的光波导是厚度为50μm的平面玻璃光波导，色素指示剂为亚甲基蓝，光源是涵盖可见光波段的卤钨灯，光谱仪每隔1秒钟记录一次吸收光谱，在测试不同浓度的牛血清蛋白(BSA)的多次实验中，竞争吸附多数可在十分钟内达到平衡。实验时采用往去离子水中添加磷酸的方法配置不同pH值的缓冲溶液，每次实验都保持缓冲溶液中亚甲基蓝的浓度始终不变，为18.8679μM/L。
牛血清蛋白(BSA)分子的等电点是4.7，为了对比实验结果，首先用去离子水(pH＝5.89)作为缓冲溶液进行实验，溶液中BSA的浓度为0.3770μM/L，亚甲基蓝浓度如上所述。图2为利用光波导光谱技术测得的从BSA与亚甲基兰混合水溶液中吸附到玻璃表面的亚甲基蓝在波长606.45纳米处的吸光度随时间的变化曲线。下文所述的吸光度均是这一波长下的测量值。由于去离子水的pH值高于BSA的等电点，从图2中可以看出在去离子水中BSA分子与亚甲基蓝之间没有竞争吸附现象。图3、图4、图5分别对应于从pH＝2.03、pH＝3.00、pH＝4.02的BSA与亚甲基兰混合溶液中吸附到玻璃表面的亚甲基蓝的吸光度随时间的变化曲线。在每一种pH值下4种不同BSA浓度的缓冲溶液被测试了，BSA浓度分别为0.0377μM/L、0.0754μM/L、0.1885μM/L和0.3770μM/L。图3至图5中的曲线反映出BSA分子与亚甲基蓝之间具有明显的竞争吸附现象，最初亚甲基蓝迅速吸附到光波导表面，吸光度迅速上升至峰值，之后BSA分子开始吸附并使得亚甲基蓝从光波导表面脱附，吸光度逐渐下降，最终达到平衡。对于某一特定BSA浓度的缓冲溶液，其pH值越低于蛋白质的等电点，竞争吸附现象越明显；对于某一特定pH值的缓冲溶液，BSA浓度越高，竞争吸附现象越明显。
如果对图3至图5中的各条曲线进行数据拟合，可以分别得出每种情况下亚甲基蓝的吸光度从峰值下降到峰值的40％所用的时间，从图中可看出在不同情况下，吸光度下降所用的时间与BSA浓度呈单调的规律性变化关系。图6a、b、c是分别在pH＝2.03、pH＝3.00、pH＝4.02三种情况下亚甲基蓝的吸光度从峰值下降到峰值的40％所用时间与BSA浓度的关系图。从图5中可看出在pH＝4.02的缓冲溶液中当BSA浓度为0.0377μM/L时，达到平衡时的吸光度已经无法下降到峰值的40％，所以图6c中BSA浓度为0.0377μM/L所对应的时间未能标出。此外用血红蛋白代替牛血清蛋白(BSA)，同样测试了血红蛋白浓度为0.0377μM/L、0.0754μM/L、0.1885μM/L和0.3770μM/L的4种混合溶液，得到了同样明显的实验结果。血红蛋白的等电点为6.8，图7是在pH＝4.02的缓冲溶液中亚甲基蓝吸光度随时间的变化图，图8是pH＝4.02时亚甲基蓝的吸光度从峰值下降到峰值的40％所用时间与血红蛋白浓度的关系图。实验结果说明血红蛋白在其等电点之下同样具有与亚甲基兰的竞争吸附现象。
上述的实验过程证实了本发明提出的基于蛋白质分子与色素指示剂在光波导表面的竞争吸附来检测蛋白质含量的方法是快速有效的，在蛋白质浓度不高于0.3770μM/L的情况下，本发明的方法具有较高的灵敏度。另外，如果将图1中的光源5换成固定波长的光源，还可以通过探测导波光强度随时间的变化来检测蛋白质含量。这种波长固定的光波导测试装置更加简单廉价。与传统的测量蛋白质含量的方法相比，本发明提出的方法操作简便快速、测量精度高、成本低、无污染，在探测技术领域有很大的发展潜力。
Claims (9)
1.一种检测溶液中蛋白质含量的方法，包括：
调节缓冲溶液的pH值到蛋白质的等电点之下，选用在溶液中始终带正电的色素指示剂，将待测蛋白质与色素指示剂共同溶于缓冲溶液中，蛋白质分子与色素指示剂在光波导表面形成竞争吸附，连续记录吸收光谱随时间的变化，直到吸收光谱随时间不再变化，即竞争吸附达到平衡状态；
在此过程中，通过探测色素指示剂对导波光的吸收谱随时间的变化情况来检测溶液中蛋白质的含量；或
通过探测光波导输出光强度随时间的变化情况来检测溶液中蛋白质的含量；
所述缓冲溶液满足以下条件：
(1)蛋白质和色素指示剂共同溶于缓冲溶液，且蛋白质、色素指示剂和缓冲溶液三者之间互不发生反应；
(2)缓冲溶液的pH值可以在一定范围内调节，既满足蛋白质的等电点条件又保证蛋白质不失活。
2.如权利要求1所述的方法，其中，缓冲溶液是去离子水稀释的磷酸。
3.如权利要求1所述的方法，其中，色素指示剂为阳离子色素。
4.如权利要求1或3所述的方法，其中，色素指示剂为亚甲基蓝、甲基兰或罗丹明6G。
5.如权利要求1所述的方法，其中，蛋白质是牛血清蛋白、血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素蛋白、胶原蛋白、免疫球蛋白、酪蛋白、溶菌酶、病毒蛋白中的一种或几种。
6.一种实现权利要求1所述检测溶液中蛋白质含量方法的装置，主要包括：
一平面玻璃光波导，置于一光波导衬底上；
一样品池，置于平面玻璃光波导的上方，并与平面玻璃光波导接触；
样品池的两侧各设置一棱镜耦合器，棱镜耦合器与平面玻璃光波导接触；
于棱镜耦合器的入射光和出射光的光路上各设有聚焦透镜；
一宽带光源或单色光光源，置于入射光的聚焦透镜的光路上；
一光谱仪或光电二极管探测仪，置于出射光的聚焦透镜的光路上；
光源发出的光经过聚焦透镜聚焦后，由棱镜耦合器输入平面玻璃光波导中成为导波光，导波光在平面玻璃光波导内传播后又由棱镜耦合器输出，输出光通过聚焦透镜聚焦后又传输至光谱仪或光电二极管探测仪对光信号进行处理。
7.如权利要求6所述检测溶液中蛋白质含量的装置，其中，光波导为平面光波导或三维光波导。
8.如权利要求6所述检测溶液中蛋白质含量的装置，其中，光源发出的光由光纤传输到入射光光路中的聚焦透镜上。
9.如权利要求6所述检测溶液中蛋白质含量的装置，其中，经过出射光聚焦透镜聚焦后的出射光由光纤传输至光谱仪或光电二极管探测仪。
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