KR100967620B1

KR100967620B1 - 에오신 ｙ를 함유하는 유기염료 조성물을 이용한폴리아크릴아미드 겔상의 단백질 검출방법 및 이를 위한유기염료 조성물

Info

Publication number: KR100967620B1
Application number: KR1020080005315A
Authority: KR
Inventors: 최중갑
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2008-01-17
Filing date: 2008-01-17
Publication date: 2010-07-05
Also published as: KR20090079391A; US20110053279A1; US8232106B2; WO2009091113A1

Abstract

본 발명은 에오신 Y(Eosin Y)를 함유하는 유기염료 조성물을 이용한 백그라운드 염색 또는 형광 염색에 의해 폴리아크릴아미드 겔상에서 단백질을 검출하는 방법 및 상기 방법에 사용하기 위한 유기염료 조성물에 관한 것으로서, 폴리아크릴아미드 겔상의 단백질을 신속하고 간단하게 고감도로 검출할 수 있다.

폴리아크릴아미드 겔, 전기영동, SDS-PAGE, 백그라운드 염색, 형광 염색, 에오신 Y, 단백질 검출

Description

에오신 Ｙ를 함유하는 유기염료 조성물을 이용한 폴리아크릴아미드 겔상의 단백질 검출방법 및 이를 위한 유기염료 조성물{Detection methods of proteins on polyacrylamide gels using organic dye compositions containing Eosin Y and organic dye compositions for the same}

본 발명은 유기염료 조성물을 이용한 폴리아크릴아미드 겔상의 단백질 검출에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 에오신 Y(Eosin Y)를 함유하는 유기염료 조성물을 이용한 백그라운드 염색 또는 형광 염색에 의해 폴리아크릴아미드 겔상에서 단백질을 검출하는 방법 및 상기 방법에 사용하기 위한 유기염료 조성물에 관한 것이다.

폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PolyAcrylamide Gel Electrophoresis: PAGE)은 단백질의 분리, 확인, 순도 검정 및 크기를 결정하는데 유용하게 사용되는 단백질 분석기술이다. 특히 SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate-PAGE)는 단백질이 음이온성 계면활성제인 SDS와 1.4:1의 비율로 강하게 결합하여 단백질 표면이 음전하를 띄게 하여 단백질 분자의 크기만이 분리인자로 작용하게 하는 방법으로서, 조작이 간단하고 분리도가 우수하여 단백질 분석기술로 널리 사용되고 있다(문헌 [A.T. Andrews, Electrophoresis, pp1~58]).

분석대상인 단백질은 대부분 무색이므로 적절한 검출수단을 필요로 한다. 현재까지 보고된 검출방법으로는 유기염료 염색법, 은 염색법, 형광 염색법 및 백그라운드 염색법 등이 있다. 유기염료 염색법은 아미도 블랙 10B(Amido Black 10B), 폰세아우스S(Ponceaus S), 패스트 그린 FCF(Fast Green FCF), 쿠마시 브릴리언트 블루 R(Coomassie Brilliant Blue R: CBBR)과 같은 유기염료로 단백질 밴드를 염색하여 단백질을 검출하는 방법이다(문헌 [J. of Chromatography A, 698, 123~143(1995)]). 특히 CBBR을 사용하는 염색법이 비교적 간편하고 비용이 적게 들어 일반적으로 사용되고 있지만, 염색 및 탈색과정에 장시간이 소요되고(8~12시간), 감도도 그다지 높지 않다는 문제점이 있다(우혈청 알부민(Bovine Serum Albumine: BSA) 단백질의 경우 50ng). 은 염색법은 비방사선 검출방법으로서는 가장 감도가 높은 것으로서, 은을 침착시킨 후 환원시키는 방법이다(문헌 [J. of Chromatography A, 698, 123~143(1995)]). 이 방법은 0.1ng, 즉 펨토그램(femtogram) 단위까지 검출할 수 있는 높은 감도를 나타내지만 조작이 까다롭고 다단계의 공정을 거쳐야 하는 문제점이 있다. 형광 염색법은 분석대상인 단백질을 형광 감응성 염료로 표지하여 검출하는 방법으로서, 높은 감도를 나타내지만 사용이 복잡하고 자외선을 조사하여야 하며 정밀한 정량기기를 사용하여야 하므로 비용이 증가하는 문제점이 있다. 백그라운드 염색법은 SDS를 함유하는 겔에만 국한되는 것으로서, 금속염을 이용하여 단백질 밴드를 제외한 겔 표면에 침전을 생성시키는 방법이다. 이 방법은 단시간 내에 검출이 가능하고 그 유용성이 크지만, 염색 상태의 유지시간이 짧아 보존 시 어려움이 따르는 문제점이 있다(문헌 [Anal. Biochem.174, 157~167(1988)]). 따라서 폴리아크릴아미드 겔상의 단백질을 검출하기 위하여 기존의 방법보다 신속하고 간단하면서도 감도가 높은 검출방법의 개발이 요구되어 왔다.

에오신 Y(문헌[Acid Red 87, C.I. 45380])는 하기 화학식 1의 구조를 갖는 황적색의 녹색 형광(λ_max = 514 ㎚)을 띄는 수용성 염료이다.

에오신 Y는 카복실 그룹을 포함하므로 CBBR과 같은 산성 염료로 분류된다. 조직화학적 염색에서, 에오신 Y는 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신 Y 방법에서 알럼 헤마톡실린(alum hematoxylin)에 대한 가장 흔한 대비염색으로 사용되고, 그램 양성 세균에 대한 그램-바이거트(Gram-Weigert) 방법에서 대비염색으로 사용되며, 염색박리세포학용 파파니콜라오우(Papanicolaou's) EA 용액의 성분이기도 하다. 에오신 Y는 또한 로마노프스키(Romanowsky) 염색(문헌 [Lillie, R.D. 1977. H.J. Conn's Biological Stains, 9th Edition. p. 335-344. Williams Wilkins, Baltimore, MD])에 사용될 수 있다. 에오신 Y는 폴리아크릴아미드 겔상에서 단백질을 염색하는데 최초로 사용되었다(문헌 [Lin, F., W. Fan and G.E. Wise. 1991. Eosin Y staining of proteins in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 196:279- 283]).

본 발명자는 폴리아크릴아미드 겔을 산성 유기염료와 염기성 유기염료를 함유하는 복합염료 조성물로 염색하는 것을 특징으로 하는 폴리아크릴아미드 겔상의 단백질의 검출방법 및 상기 방법에 사용하기 위한 복합염료 조성물을 개발하고 특허출원하여 한국특허등록 제298,471호 및 미국특허 제6,277,643호를 획득한 바 있다. 나아가, 본 발명자는 pH 2.2~3.8의 산성 용액에서 0.001~0.006w/v%의 에오신 Y를 단백질과 반응시켜 단백질-에오신 Y 복합체를 형성시키고, 530~555㎚의 파장에서 단백질-에오신 Y 복합체의 흡광도를 측정함으로써 단백질을 정량하는 것을 특징으로 하는, 단백질의 정량방법을 개발하고 특허출원하여 한국특허등록 제303,102호를 획득한 바 있다. 그러나 상기 방법들은 각각 2 이상의 유기염료를 함유하는 복합염료를 사용하거나 에오신 Y를 이용하여 단백질을 정량하는 것으로서, 에오신 Y를 함유하는 유기염료 조성물을 이용하여 백그라운드 염색 또는 형광 염색함으로써 폴리아크릴아미드 겔상에서 단백질을 검출하는 기술과는 상이한 것이다.

본 발명자는 기존의 단백질 검출방법의 문제점을 개선하고 감도가 더욱 향상된 염색방법을 확립하기 위하여 지속적인 연구를 수행하였다. 그 결과, 에오신 Y를 이용하여 에오신 Y의 농도에 따라 백그라운드 염색 또는 형광 염색을 수행함으로써 상기 목적을 달성할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 목적은 에오신 Y를 함유하는 유기염료 조성물을 이용하여 백그라 운드 염색을 수행함으로써 폴리아크릴아미드 겔 상의 단백질을 검출하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 에오신 Y를 함유하는 유기염료 조성물을 이용하여 형광 염색을 수행함으로써 폴리아크릴아미드 겔 상의 단백질을 검출하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 각각의 방법에 사용하기 위한 유기염료 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 제1면은 에오신 Y를 0.1~1.5w/v%로 함유하는 유기염료 조성물을 이용하여 폴리아크릴아미드 겔의 백그라운드를 염색하는 단계를 포함하는, 폴리아크릴아미드 겔상의 단백질의 검출방법에 관한 것이다.

본 발명의 제2면은

⑴ 에오신 Y를 0.00005~0.0005w/v%로 함유하는 유기염료 조성물을 이용하여 폴리아크릴아미드 겔의 단백질 밴드를 염색하고;

⑵ 자외선 하에서 염색된 단백질 밴드의 형광을 관찰하는:

단계를 포함하는, 폴리아크릴아미드 겔상의 단백질의 검출방법에 관한 것이다.

본 발명의 제3면은 에오신 Y를 0.1~1.5w/v%로 함유하는 상기 제1면에 따른 방법에 사용하기 위한 유기염료 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 제4면은 에오신 Y를 0.00005~0.0005w/v%로 함유하는 상기 제2면에 따른 방법에 사용하기 위한 유기염료 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 에오신 Y의 농도에 따라 백그라운드 염색 및/또는 형광 염색을 수행하여 폴리아크릴아미드 겔상의 단백질을 검출하는 것으로서, 단백질 검출시간을 40~60분 이내로 단축시켜 단백질을 신속하고 간단하게 검출할 수 있음은 물론, 에오신 Y 백그라운드 염색법의 경우 종래의 CBBR 염색법과 비교하여 60~320배, 아연-이미다졸(zinc-imidazole) 백그라운드 염색법과 비교하여 10배까지 향상된 높은 감도로, 에오신 Y 형광 염색법의 경우 CBBR 염색법에 비해 30~80배, 시프로 루비(SYPRO Ruby) 형광 염색법에 비해 2배 정도 향상된 높은 감도로, 검출할 수 있다.

본 발명은 유기염료 조성에 따라 백그라운드 염색법 또는 형광 염색법으로 폴리아크릴아미드 겔을 염색함으로써, 폴리아크릴아미드 겔상의 단백질을 신속하고 간단하게 고감도로 검출해낼 수 있는 방법 및 이를 위한 유기염료 조성물에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 '에오신 Y 백그라운드 염색법'과 '에오신 Y 형광 염색법'으로 나누어 설명한다.

⑴ 에오신 Y 백그라운드 염색법

아세트산 산성 에탄올 수용액으로 고정 및 세척의 과정을 거친 후, 에오신 Y를 폴리아크릴아미드 겔상의 단백질 염색에 적용시켜 본 결과, 에오신 Y의 농도가 0.1w/v% 미만인 경우에는 단백질이 염색되면서 분홍색으로 변화하여 색상 차이에 의한 구별이 가능하나, 감도는 CBBR 수준이었다. 에오신 Y의 농도를 0.1w/v% 이상으로 높인 경우에는, 백그라운드가 염색되면서 감도를 CBBR 염색법의 60~320배, 기존의 백그라운드 염색법인 아연-이미다졸 염색법의 10배까지 상승시킬 수 있었다. 또한 반응속도가 빠를 뿐만 아니라, 장시간의 탈색과정을 거치지 않고 50분 내에 검출이 가능하였다.

본 발명에 따른 백그라운드 염색법에서는, 염료의 농도가 매우 중요하며 염색 용액의 조성 또한 중요하다. 염색에 영향을 주는 인자로는 염료의 농도, 용매인 알콜의 종류와 비율 및 수소이온 농도 등을 들 수 있다. 상기한 측면을 모두 고려할 때, 에오신 Y의 바람직한 농도는 0.1~1.5w/v%이며, 가장 바람직한 농도는 0.3w/v%이다. 0.1w/v% 미만 또는 1.5w/v% 초과의 농도에서는 밴드 강도와 백그라운드 강도 차이가 감소하여 바람직하지 않다. 이는 에오신 Y 농도에 따른 단백질 밴드의 강도 변화 양상을 나타내는 도 1a로부터 명확히 확인할 수 있다.

본 방법에 사용하기 위한 염료 조성물은 아세트산 산성 메탄올 수용액을 용매로 하여 에오신 Y를 혼합하여 제조하는 것이 바람직하다. 특히, 염색의 효과를 높이는 0.1~2v/v% 아세트산 산성 30~50v/v% 메탄올 수용액, 보다 특히, 염색의 효과를 최대로 나타내는 1v/v% 아세트산 산성 50v/v% 메탄올 수용액을 용매로 하여 에오신 Y를 혼합하여 사용하는 것이 바람직하다. 이는 상기 염색 용액의 조성 하에서 염료의 백그라운드 겔로의 침투가 효과적으로 일어날 수 있는 조건이 형성되기 때문이다.

또한, 전기영동 후 고정 및 세척 과정을 수행하여 완충액, SDS 등의 방해 물질을 제거한 후 염색 과정을 수행하는 것이 바람직한 바, 고정을 위해서는 5~15v/v% 아세트산 산성 30~50v/v% 메탄올 수용액, 특히 10v/v% 아세트산 산성 40% 메탄올 수용액을, 세척을 위해서는 물과 30~50v/v% 메탄올 수용액, 특히 50v/v% 메탄올 수용액을 순차적으로 사용하는 것이 바람직하다.

⑵ 에오신 Y 형광 염색법

에오신 Y는 자외선 조사 하에 형광을 나타내는 특성을 가지고 있어 형광 염색이 가능하다. 아세트산 산성 에탄올 수용액으로 고정 및 세척의 과정을 거친 후, 에오신 Y를 폴리아크릴아미드 겔상의 단백질 염색에 적용시켜 자외선 조사 하에 관찰한 결과, 단백질이 염색되어 형광을 나타내면서 백그라운드와의 구별이 가능하여 CBBR 염색법에 비해 감도를 약 30~80배, 시프로 루비 형광 염색법에 비해 2배까지 상승시킬 수 있었다. 뿐만 아니라, 단백질과 결합하는 속도 또한 빨라 탈색 과정을 거치지 않고서도 60분 내에 검출이 가능하였다.

본 발명에 따른 형광 염색법에서는, 염료의 농도가 매우 중요하며 염색 용액의 조성 또한 중요하다. 염색에 영향을 주는 인자로는 염료의 농도, 용매인 알콜의 종류와 비율 및 수소이온 농도 등을 들 수 있다. 상기한 측면을 모두 고려할 때, 에오신 Y의 바람직한 농도는 0.00005~0.0005w/v%이며, 가장 바람직한 농도는 0.0002w/v%이다. 0.00005w/v% 미만의 농도에서는 단백질 밴드의 염색 효과가 미흡하고, 0.0005w/v% 초과의 농도에서는 밴드 강도와 백그라운드 강도 차이가 감소하게 된다. 이는 에오신 Y 농도에 따른 단백질 밴드의 강도 변화 양상을 나타내는 도 1b로부터 명확히 확인할 수 있다.

본 방법에 사용하기 위한 염료 조성물은 아세트산 산성 수용액을 용매로 하여 에오신 Y를 혼합하여 제조하는 것이 바람직하다. 특히, 과도한 백그라운드 염색이 일어나지 않으면서 염색의 효과를 높이는 0.1~2v/v% 아세트산 산성 수용액, 보다 특히, 염색의 효과를 최대로 나타내는 1v/v% 아세트산 산성 수용액을 용매로 하여 에오신 Y를 혼합하여 사용하는 것이 바람직하다. 이는 상기 염색 용액의 조성 하에서 염료의 백그라운드 겔로의 침투는 억제되고 단백질과의 결합은 방해되지 않아 단백질 밴드로의 염료 흡착이 효과적으로 일어날 수 있는 조건이 형성되기 때문이다.

또한, 전기영동 후 고정 및 세척 과정을 수행하여 완충액, SDS 등의 방해 물질을 제거한 후 염색 과정을 수행하는 것이 바람직한 바, 고정을 위해서는 5~15v/v% 아세트산 산성 30~50v/v% 에탄올 수용액, 특히 10v/v% 아세트산 산성 40% 에탄올 수용액을, 세척을 위해서는 물과 5~15v/v% 아세트산 산성 30~50v/v% 에탄올 수용액, 특히 10v/v% 아세트산 산성 50% 에탄올 수용액을 순차적으로 사용하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 보다 상세히 설명하나, 이들에 의해 본 발명의 범위가 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 에오신 Y 백그라운드 염색법에 의한 BSA 단백질의 검출

⑴ 겔의 제조 및 전기영동

렘리(Laemmli)의 방법에 따라 SDS 함유 슬랩(slab) 겔을 제조하였다. 단백질 농도는 바이오-래드(Bio Rad) 단백질 측정용 표준품 I을 사용하는 브래드포드(Bradford)법(문헌 [Anal. Biochem.151, 369~374])에 의해 측정하였다. 전기영동 전에 단백질 샘플로서 250, 125, 62, 31, 15, 8, 4, 2, 1, 0.5ng의 BSA를 샘플 완충액(70mM Tris-HCl, pH 6.8, 11.4% 글리세롤, 3% SDS, 0.01% 브로모페놀 블루, β-머캅토에탄올) 중에서 5분 동안 100℃로 가열하였다. 전개 완충액은 0.025M 트리스(Tris), 0.2M 글리신, 0.1% SDS를 포함하고, pH는 8.3이었다. 겔의 두께는 1㎜이며, 1.5㎝ 길이의 적층겔(Stacking gel, 4.5%)을 분리겔(Separating gel, 10%)상에 적층시켰다(아크릴아미드:비스아크릴아미드=30:0.8). 각 웰에 좌측으로부터 차례대로 250, 125, 62, 31, 15, 8, 4, 2, 1, 0.5ng의 BSA를 로딩한 후 미니-프로틴 II 슬랩 겔 기기에서 35 분 동안 200 V의 전압을 유지한 채로 전기영동을 행하였다.

⑵ 염색 및 탈색

염색의 효과를 상승시키기 위하여 전기영동 후 분리시킨 겔을 10v/v% 아세트산 산성 40v/v% 메탄올 수용액으로 20분 정도 진탕하면서 세척하였다. 물로 5분씩 2회 정도 세척한 후, 50v/v% 메탄올 수용액으로 10분 정도 겔을 세척하였다.

고정, 세척 및 염색시간을 하기 표 1a와 같이 조절하였다. 완충액, SDS 등의 방해 물질을 하기 표 1a와 같이 조절된 조성을 갖는 세척용액으로 겔을 세척해내고, 하기 표 1a에 나타낸 조성의 염료 조성물로 5분 정도 교반기로 진탕하면서 염색하였다. 염료 조성물은 사용직전에 1v/v% 아세트산 산성 50v/v% 메탄올 수용액에 에오신 Y를 용해시켜 제조하였다. 염색이 완료된 겔은 탈색과정을 수행하지 않아도 되며 물에서 1분 정도 잔여 염료를 제거하는 과정을 거쳤다. 염색된 겔은 검은색 바탕에서 관찰 가능하며 며칠이 지난 후에도 관찰이 가능하였다. 스캔 시에는 검은색 바탕 또는 암실에서 겔을 스캔하였다.

에오신 Y의 농도에 따른 염색 결과를 도 1a에 나타내었다. 도 1a에 나타낸 바와 같이, 에오신 Y의 바람직한 농도는 0.1~1.5w/v%이며, 가장 바람직한 농도는 0.3w/v%인 것으로 나타났다. 0.3w/v%의 에오신 Y로의 염색 결과를 도 2a에 나타내었다. 도 2a에 나타낸 바와 같이, CBBR 염색법은 BSA 62ng까지 가시화시킬 수 있음에 비해(도 2c 참조), 에오신 Y를 이용한 백그라운드 염색법은 BSA 1.0ng까지 가시화하여, 단백질 검출감도를 약 60배 향상시킬 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 2: 에오신 Y 형광 염색법에 의한 BSA 단백질의 검출

실시예 1과 실질적으로 동일한 과정에 따라 겔을 제조하고 전기영동을 수행하였다. 염색의 효과를 상승시키기 위하여 전기영동 후 분리시킨 겔을 10v/v% 아세트산 산성 40v/v% 에탄올 수용액으로 20분 정도 진탕하면서 세척하였다. 물로 5분씩 2회 정도 세척한 후, 10v/v% 아세트산 산성 50v/v% 에탄올 수용액으로 10분 정도 겔을 세척하였다.

고정, 세척 및 염색 시간을 하기 표 1b와 같이 조절하였다. 완충액, SDS 등의 방해 물질을 하기 표 1b와 같이 조절된 조성을 갖는 세척용액으로 겔을 세척해내고, 하기 표 1b에 나타낸 조성의 염료 조성물로 15분 정도 교반기로 진탕하면서 염색하였다. 염료 조성물은 사용직전에 1v/v% 아세트산 산성 수용액에 에오신 Y를 용해시켜 제조하였다. 형광 염색법에 의해 염색된 겔은 자외선 조사 하에 관찰 가능하며 30분 정도 관찰이 가능하였다. 자외선 필터를 장착한 카메라를 사용하여 염색된 겔을 촬영하였다.

에오신 Y의 농도에 따른 염색 결과를 도 1b에 나타내었다. 도 1b에 나타낸 바와 같이, 에오신 Y의 바람직한 농도는 0.00005~0.0005w/v%이며, 가장 바람직한 농도는 0.0002w/v%인 것으로 나타났다. 0.0002w/v%의 에오신 Y로의 염색 결과를 도 2b에 나타내었다. 도 2b에 나타낸 바와 같이, CBBR 염색법은 BSA 62ng까지 가시화시킬 수 있음에 비해(도 2c 참조), 에오신 Y를 이용한 형광 염색법은 BSA 2.0ng까지 가시화하여, 단백질 검출감도를 약 30배 향상시킬 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 3 및 4: 에오신 Y 백그라운드 염색법 및 에오신 Y 형광 염색법에 의한 표준 단백질의 검출

실시예 1 및 2에서, 표준 단백질로 미오신(205kDa), β-갈락토시다아제(116kDa), 포스포릴라아제 b(97.4kDa), BSA(66kDa), 오브알부민(45kDa) 및 카보닉 안하드라아제(29kDa)를 동량으로 혼합하여 좌측 웰로부터 200, 80, 32, 12, 12, 5, 2, 0.8, 0.3, 0.1, 0.04ng의 농도로 차례로 로딩하여 사용한 것을 제외하고는 실질적으로 동일하게 실시하였다.

그 결과를 도 3a 및 3b에 나타내었다. 도 3a 및 3b에 나타낸 바와 같이, 에오신 Y에 의한 백그라운드 염색법 및 형광 염색법의 염색 양상은 CBBR 염색, 아연-이미다졸 염색 및 시프로 루비 염색법과 동일하지만(도 3c 내지 3e 참조), 감도면에서는 에오신 Y 백그라운드 염색법은 표준 단백질 0.1ng까지 검출가능하여 CBBR 염색법(32ng까지 검출)에 비해 320배, 아연-이미다졸 백그라운드 염색법(1.0ng까지 검출)에 비해 10배 정도 향상되었고, 에오신 Y 형광 염색법은 표준 단백질 0.4ng까지 검출가능하여 CBBR 염색법(32ng까지 검출)에 비해 80배, 시프로 루비 형광 염색법(1.0ng까지 검출)에 비해 2배 정도 향상되었음을 알 수 있었다.

비교예 1: CBBR 염색법에 의한 BSA 단백질의 검출

실시예 1에서, 사용한 염료로 0.2% CBBR-250 용액을 사용하고, 7v/v% 아세트산 산성 40v/v% 메탄올 수용액을 용매로 사용하여 1시간 염색, 2시간 이상 탈색시킨 것을 제외하고는 실질적으로 동일하게 실시하였다. 그 결과를 도 2c에 나타내었다. 도 2c에 나타낸 바와 같이, CBBR 염색법의 경우 BSA 62ng까지 검출 가능하였다.

비교예 2: CBBR 염색법에 의한 표준 단백질의 검출

실시예 3에서, 사용한 염료로 0.2% CBBR-250 용액을 사용하고, 7v/v% 아세트산 산성 40v/v% 메탄올 수용액을 용매로 사용하여 1시간 염색, 2시간 이상 탈색시킨 것을 제외하고는 실질적으로 동일하게 실시하였다. 그 결과를 도 3c에 나타내었다. 도 3c에 나타낸 바와 같이, CBBR 염색법의 경우 표준 단백질 32ng까지 검출 가능하였다.

비교예 3: 아연-이미다졸 백그라운드 염색법에 의한 표준 단백질의 검출

실시예 3에서, 전기영동한 겔을 증류수로 30초 세척한 후, 0.2M 이미다졸, 0.1% SDS 용액에서 15분 정도 반응시킨 후 0.2M 황산아연 용액에서 겔의 백그라운드가 흰색을 띌 때까지 반응시키고, 증류수에 헹구는 염색 과정을 제외하고는 실질적으로 동일하게 실시하였다. 그 결과를 도 3d에 나타내었다. 도 3d에 나타낸 바와 같이, 아연-이미다졸 백그라운드 염색법의 경우 표준 단백질 1.0ng까지 검출 가능하였다.

비교예 4: 시프로 루비 형광 염색법에 의한 표준 단백질의 검출

실시예 3에서, 시판 중인 시프로 루비 염색 용액을 사용하여 3시간 이상 염색하고, 7v/v% 아세트산 산성 10v/v% 메탄올 수용액에서 30분 정도 세척한 것을 제외하고는 실질적으로 동일하게 실시하였다. 그 결과를 도 3e에 나타내었다. 도 3e에 나타낸 바와 같이, 시프로 루비 형광 염색법의 경우 표준 단백질 1.0ng까지 검출가능하였다.

도 1a 및 1b는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 후 에오신 Y의 농도에 따른 백그라운드 염색법(a) 및 형광 염색법(b)에 의해 염색된 단백질 밴드의 강도를 각각 나타낸 그래프이고;

도 2a 내지 2c는 에오신 Y 백그라운드 염색법(a), 에오신 Y 형광 염색법(b) 및 CBBR 염색법(c)에 의한 SDS-폴리아크릴아미드 겔상의 BSA 단백질의 감출감도를 각각 보여주는 사진이며;

도 3a 내지 3e는 에오신 Y 백그라운드 염색법(a), 에오신 Y 형광 염색법(b), CBBR 염색법(c), 아연-이미다졸 염색법(d) 및 시프로 루비 형광 염색법(e)에 의한 SDS-폴리아크릴아미드 겔상의 표준 단백질의 감출감도 및 염색양상을 각각 보여주는 사진이다.

Claims

0.1~2v/v% 아세트산 산성 30~50v/v% 메탄올 수용액 중에 에오신 Y(Eosin Y)를 0.1w/v% 내지 1.0w/v% 미만으로 함유하는 유기염료 조성물을 이용하여 폴리아크릴아미드 겔의 백그라운드를 염색하는 단계를 포함하는, 폴리아크릴아미드 겔상의 단백질의 검출방법.
제1항에 있어서, 유기염료 조성물이 에오신 Y(Eosin Y)를 0.3w/v%로 함유하는 것인, 폴리아크릴아미드 겔상의 단백질의 검출방법.
삭제
삭제
삭제
삭제