CN106957247B - 一种微蛋白指示剂的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种微蛋白指示剂的纯化方法，属于化合物制备技术领域。将3，4，5，6‐四溴酚磺酞碘代硝化后制得的DIDNTB粗品首先经与金属离子络和前后极性变化差，选择不同溶剂进行萃取分离，分离后的产品经重结晶后最终得到产品，络合分离是找到一种既能与DIDNTB络合又能在改变体系条件下解离的金属离子，从而在不改变DIDNTB结构，又使其极性发生改变的分离方法。重结晶是将沉淀产物与乙醚按比例混合或与石油醚按比例混合，超声溶解，过滤，滤饼干燥，制得最终产物。本发明优点在于：纯化方法工艺简单、成本低廉、便于生产、毒害性小，所用有机试剂均能回收，环境污染低。
Description
技术领域
本发明属于化合物制备技术领域，具体涉及一种微蛋白指示剂5′，5″-二硝基3′，3″-二碘-3，4，5，6-四溴酚磺酞(DIDNTB)的纯化方法。
背景技术
5′，5″-二硝基3′，3″-二碘-3，4，5，6-四溴酚磺酞(DIDNTB)是一种酚磺酞的衍生物，同时也是尿液分析试纸微蛋白指示剂的重要反应底物，其纯度的高低直接影响试纸显色的灵敏度和显色范围。目前该产品还未见国内厂家直接生产，一般都是进口，但国外的厂家也存在产品纯度低下的问题。制约产品的技术瓶颈之一就是合成后产品纯化的问题，其纯化的方法还未见文献报道。用于合成它的前体化合物3，4，5，6-四溴酚磺酞的纯化方法我公司已申请了专利，详见专利201210068919.5。
合成它的方法一般都是从本公司专利技术纯化后的3，4，5，6-四溴酚磺酞经碘代和硝化后制得DIDNTB粗品。该合成路线如下所示：
通过该硝化反应我们发现反应物和产物之间分子量差别不大，极性和酸碱性也差别不大，这样用传统的碱溶酸沉的方法很难将他们分开，如果用柱层析的办法费时费力另外产品损失也大。
因此，这就需要一种工艺简单、成本低廉、便于生产、毒害性小，低污染的纯化方法，能够充分去除杂质，提高产品纯度，确保其使用效果。
发明内容
本发明提供一种微蛋白指示剂的纯化方法，以解决用传统的碱溶酸沉的方法很难将DIDNTB粗品纯化，用柱层析的办法费时费力，产品损失较大的问题。
本发明采取的技术方案是，包括下列步骤：
将DIDNTB粗品溶于含金属离子的酸性溶剂中，过滤后得滤液，调pH值，用有机溶剂萃取，减压蒸馏后得络合分离产物，然后再重结晶，制得最终产物。
所述的金属离子是Ca2+、Mg2+、Fe3+、或Al3+中的一种。
所述金属离子的摩尔浓度0.1-5mol/l。
所述的酸性溶剂指酸性pH值1-5，所用溶剂水、甲醇、乙酸乙酯或正丁醇。
所述的得到的滤液调pH值10-13。
所述的萃取有机溶剂指乙醚或石油醚。
所述的重结晶，是指络合分离产物与乙醚1:2-6(w/v)混合或与石油醚1:8-15(w/v)混合，超声10-30min后静止过滤，滤饼于115度干燥2-3小时，制得最终产物。
通过对比硝化合成反应的前后化合物结构差异发现，硝化反应后产物分别在羟基和羰基两个临位上分别引入了一个硝基，这个硝基上的氧原子和临位羟基和羰基的氧原子就形成了多齿配位原子，易与金属离子形成分子内配位反应，对Ca2+、Mg2+、Fe3+、Al3+等金属离子有很强的螯合力。假如引入Al3+离子，其反应式如下所示：
这样络合Al3+离子的5′，5″-二硝基3′，3″-二碘-3，4，5，6-四溴酚磺酞要比3′，3″-二碘-3，4，5，6-四溴酚磺酞多六个电荷，这样极性大大增加，我们可以用相似相容的原理选择极性溶剂将反应物和产物分开，有些络合剂的络合能力在不同pH值变化很大,有的甚至会水解、分解或发生反应而失去络合力。我们选择这样的络合离子，分开后调整体系酸碱度使络合解离保证产物结构不被破坏，大大减少因反应不完全而留在产物里的反应物的量，从而提高反应物的纯度。通过重结晶进一步提升产物纯度。
本发明实验表明，当DIDNTB粗品遇到含金属离子的酸性溶剂时DIDNTB就会被络合从而极性变大溶解出来，而未反应的原料因缺两个硝化基团不能与金属离子络合，极性没改变不被溶解留在固相中。因此要满足这个过程的发生，络合的金属离子电荷越多对DIDNTB的极性改变越大，一般3价态的铝离子络合上两个之后DIDNTB就是6价态，对DIDNTB极性改变非常大，适合用于络合的金属离子。所用溶剂必须是酸性条件下的，因为一般络合反应的发生必须是酸性体系，同时溶剂必须选择极性的，这种溶剂不能溶解3′，3″-二碘-3，4，5，6-四溴酚磺酞而能溶解络合后的DIDNTB，实验发现水和甲醇效果要高于乙酸乙酯和正丁醇，因为原料3′，3″-二碘-3，4，5，6-四溴酚磺酞在这两种溶剂中有微量的溶解，影响了产率。而且水成本低，无毒无害，适合于工业化生产。
本发明实验表明，当调节络合了金属离子的DIDNTB滤液pH值时，一般调节到10-13，随着金属离子的解离，DIDNTB会部分析出，溶液出现浑浊现象，可忽略这种浑浊，直接加入乙醚或石油醚萃取，DIDNTB会被萃取出来，减压回收乙醚或石油醚得络合分离产物。
本发明所述的重结晶步骤中，采用的是非质子非极性的溶剂可以是四氯化碳、乙醚和石油醚，使用乙醚、石油醚与四氯化碳相比，所得产物杂质含量低、纯度高、生产成本低、毒害性小、污染小，因此，使用乙醚和石油醚效果较好。同时本实验采用的是超声溶解法，溶解比回流溶解的温度低，保护了DIDNTB结构受热不稳定的影响。
与已有的碱溶酸沉、柱层析方法比较，本发明的纯化方法具有以下优点：
1)本发明的纯化方法工艺简单、成本低廉、便于生产，而且不使用苯和四氯化碳等一类溶剂，毒害性小，所用有机溶剂均能回收，环境污染低，产品纯度能达到95％以上。
2)本发明的纯化方法，先后使用了络合分离和重结晶两种方法，即先在络合分离中有效的去除了因反应不完全残留的原料杂质，然后在重结晶步骤中使一些溶剂残留保留在结晶母液中。这样制得的产物几乎不包含原料药、有机溶剂残留，从而大幅度提高了产品纯度(95％以上)。
按照本发明所述方法实施，最终制得的DIDNTB杂质低、纯度高。因此本发明的纯化方法能够确保DIDNTB的质量。
本发明所述的纯化方法不仅可以制备纯度较高的DIDNTB，也可用于市售的DIDNTB的纯化，该方法能够克服现有技术的不足。另外对于具有相似结构的化合物也可开发这种分离方法。
具体实施方式
本发明中所述的纯度，其分析方法均采用RP-HPLC方法进行分析，用面积归一化法计算，该方法可具体应用如下色谱条件进行：
检测波长：254nm；色谱柱：C18柱(5μm,4.6×250mm)；流动相：含0.1％TFA的乙腈-水(40：60)溶液；柱温30℃；流速：1mL/分钟。
下面结合实施例，对本发明一种DIDNTB的纯化方法做进一步说明，但本发明的保护范围并不限于实施例。
实施例1DIDNTB粗品的纯化
将20gDIDNTB粗品溶于含摩尔浓度为0.5mol/lAl3+离子的1000ml酸性水中，体系pH值1，过滤后得滤液，用氢氧化钠调pH值10，1000无水乙醚萃取，减压蒸馏乙醚得DIDNTB络合分离产品15g，纯度91％；
取络合分离产品10g，与无水乙醚按1:10(w/v)混合，超声搅拌20min，过滤，滤饼于115度干燥2小时，制得最终产物7.5g，纯度95.7％。
实施例2DIDNTB粗品的纯化
将20gDIDNTB粗品溶于含摩尔浓度为0.8mol/lAl3+离子的1000ml酸性水中，体系pH值1，过滤后得滤液，用氢氧化钠调pH值10，1000无水乙醚萃取，减压蒸馏乙醚得DIDNTB络合分离产品14.8g，纯度92％；
取络合分离产品10g，与无水乙醚按1:8(w/v)混合，超声搅拌20min，过滤，滤饼于115度干燥2小时，制得最终产物7.6g，纯度96.6％。
实施例3DIDNTB粗品的纯化
将20gDIDNTB粗品溶于含摩尔浓度为2mol/lAl3+离子的1000ml酸性水中，体系pH值1，过滤后得滤液，用氢氧化钠调pH值10，1000无水乙醚萃取，减压蒸馏乙醚得DIDNTB络合分离产品13g，纯度90％；
取络合分离产品10g，与无水乙醚按1:6(w/v)混合，超声搅拌20min，过滤，滤饼于115度干燥2小时，制得最终产物7.2g，纯度94.3％。
实施例4DIDNTB粗品的纯化
将20gDIDNTB粗品溶于含摩尔浓度为4mol/lAl3+离子的1000ml酸性水中，体系pH值2，过滤后得滤液，用氢氧化钠调pH值10，1000无水乙醚萃取，减压蒸馏乙醚得DIDNTB络合分离产品16g，纯度92％；
取络合分离产品10g，与无水乙醚按1:12(w/v)混合，超声搅拌20min，过滤，滤饼于115度干燥2小时，制得最终产物7.8g，纯度95.8％。
实施例5DIDNTB粗品的纯化
将20gDIDNTB粗品溶于含摩尔浓度为5mol/lAl3+离子的1000ml酸性水中，体系pH值2，过滤后得滤液，用氢氧化钠调pH值10，1000无水乙醚萃取，减压蒸馏乙醚得DIDNTB络合分离产品15g，纯度92％；
取络合分离产品10g，与无水乙醚按1:15(w/v)混合，超声搅拌20min，过滤，滤饼于115度干燥2小时，制得最终产物7.5g，纯度95.8％。
实施例6DIDNTB粗品的纯化
将20gDIDNTB粗品溶于含摩尔浓度为0.8mol/lAl3+离子的1000ml酸性水中，体系pH值4，过滤后得滤液，用氢氧化钠调pH值12，1000无水乙醚萃取，减压蒸馏乙醚得DIDNTB络合分离产品15g，纯度90％；
取络合分离产品10g，与无水乙醚按1:15(w/v)混合，超声搅拌20min，过滤，滤饼于115度干燥2小时，制得最终产物7.5g，纯度94.8％。
实施例7DIDNTB粗品的纯化
将20gDIDNTB粗品溶于含摩尔浓度为0.5mol/lAl3+离子的1000ml酸性水中，体系pH值5，过滤后得滤液，用氢氧化钠调pH值13，1000无水乙醚萃取，减压蒸馏乙醚得DIDNTB络合分离产品16g，纯度92％；
取络合分离产品10g，与无水乙醚按1:10(w/v)混合，超声搅拌20min，过滤，滤饼于115度干燥2小时，制得最终产物7.2g，纯度95.4％。
实施例8DIDNTB粗品的纯化
将20gDIDNTB粗品溶于含摩尔浓度为0.5mol/lAl3+离子的1000ml酸性水中，体系pH值4，过滤后得滤液，用氢氧化钠调pH值13，1000无水乙醚萃取，减压蒸馏乙醚得DIDNTB络合分离产品14.8g，纯度92％；
取络合分离产品10g，与无水乙醚按1:10(w/v)混合，超声搅拌20min，过滤，滤饼于115度干燥2小时，制得最终产物7.7g，纯度95.6％。
实施例9DIDNTB粗品的纯化
将20gDIDNTB粗品溶于含摩尔浓度为0.5mol/lZn2+离子的1000ml酸性水中，体系pH值1，过滤后得滤液，用氢氧化钠调pH值10，1000无水乙醚萃取，减压蒸馏乙醚得DIDNTB络合分离产品14g，纯度85％；
取络合分离产品10g，与无水乙醚按1:10(w/v)混合，超声搅拌20min，过滤，滤饼于115度干燥2小时，制得最终产物7.3g，纯度90.1％。
实施例10DIDNTB粗品的纯化
将20gDIDNTB粗品溶于含摩尔浓度为0.8mol/l Zn2+离子的1000ml酸性水中，体系pH值1，过滤后得滤液，用氢氧化钠调pH值13，1000无水乙醚萃取，减压蒸馏乙醚得DIDNTB络合分离产品16g，纯度92％；
取络合分离产品10g，与无水乙醚按1:8(w/v)混合，超声搅拌20min，过滤，滤饼于115度干燥2小时，制得最终产物7.4g，纯度96.6％。
实施例11DIDNTB粗品的纯化
将20gDIDNTB粗品溶于含摩尔浓度为2mol/l Zn2+离子的1000ml酸性水中，体系pH值3，过滤后得滤液，用氢氧化钠调pH值14，1000无水乙醚萃取，减压蒸馏乙醚得DIDNTB络合分离产品14.5g，纯度86％；
取络合分离产品10g，与无水乙醚按1:6(w/v)混合，超声搅拌20min，过滤，滤饼于115度干燥2小时，制得最终产物7.2g，纯度92.3％。
实施例12DIDNTB粗品的纯化
将20gDIDNTB粗品溶于含摩尔浓度为0.5mol/l Zn2+离子的1000ml酸性水中，体系pH值5，过滤后得滤液，用氢氧化钠调pH值10，1000无水乙醚萃取，减压蒸馏乙醚得DIDNTB络合分离产品16.2g，纯度84％；
取络合分离产品10g，与无水乙醚按1:14(w/v)混合，超声搅拌20min，过滤，滤饼于115度干燥2小时，制得最终产物7.4g，纯度90.3％。
实施例13DIDNTB粗品的纯化
将20gDIDNTB粗品溶于含摩尔浓度为2mol/l Zn2+离子的1000ml酸性水中，体系pH值2，过滤后得滤液，用氢氧化钠调pH值14，1000无水乙醚萃取，减压蒸馏乙醚得DIDNTB络合分离产品16g，纯度87％；
取络合分离产品10g，与无水乙醚按1:10(w/v)混合，超声搅拌20min，过滤，滤饼于115度干燥2小时，制得最终产物7.6g，纯度92.2％。
实施例14DIDNTB粗品的纯化
将20gDIDNTB粗品溶于含摩尔浓度为3mol/l Zn2+离子的1000ml酸性水中，体系pH值4，过滤后得滤液，用氢氧化钠调pH值13，1000无水乙醚萃取，减压蒸馏乙醚得DIDNTB络合分离产品15g，纯度82％；
取络合分离产品10g，与无水乙醚按1:10(w/v)混合，超声搅拌20min，过滤，滤饼于115度干燥2小时，制得最终产物7.5g，纯度90.6％。
实施例15DIDNTB粗品的纯化
将20gDIDNTB粗品溶于含摩尔浓度为4mol/l Zn2+离子的1000ml酸性水中，体系pH值2，过滤后得滤液，用氢氧化钠调pH值13，1000无水乙醚萃取，减压蒸馏乙醚得DIDNTB络合分离产品15g，纯度86％；
取络合分离产品10g，与无水乙醚按1:10(w/v)混合，超声搅拌20min，过滤，滤饼于115度干燥2小时，制得最终产物7.5g，纯度91％。
实施例16DIDNTB粗品的纯化
将20gDIDNTB粗品溶于含摩尔浓度为5mol/l Zn2+离子的1000ml酸性水中，体系pH值2，过滤后得滤液，用氢氧化钠调pH值10，1000无水乙醚萃取，减压蒸馏乙醚得DIDNTB络合分离产品14.5g，纯度84％；
取络合分离产品10g，与无水乙醚按1:9(w/v)混合，超声搅拌20min，过滤，滤饼于115度干燥2小时，制得最终产物7.6g，纯度90.5％。
Claims (5)
1.一种微蛋白指示剂的纯化方法，其特征在于，包括下列步骤：
将DIDNTB粗品溶于含金属离子Al3+或Zn2+的酸性溶剂中，过滤后得滤液，调pH值10-13，用有机溶剂萃取，减压蒸馏后得络合分离产物，然后再重结晶，制得最终产物。
2.根据权利要求1所述的一种微蛋白指示剂的纯化方法，其特征在于，所述金属离子的摩尔浓度0.1-5mol/l。
3.根据权利要求1所述的一种微蛋白指示剂的纯化方法，其特征在于，所述的酸性溶剂指酸性pH值1-5，所用溶剂为水、甲醇、乙酸乙酯或正丁醇。
4.根据权利要求1所述的一种微蛋白指示剂的纯化方法，其特征在于，所述的萃取有机溶剂指乙醚或石油醚。
5.根据权利要求1所述的一种微蛋白指示剂的纯化方法，其特征在于，所述的重结晶，是指络合分离产物与乙醚1:2-6、以w/v计混合或与石油醚1:8-15、以w/v计混合，超声10-30min后静止过滤，滤饼于115度干燥2-3小时，制得最终产物。
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