DE102005061674A1

DE102005061674A1 - Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem

Info

Publication number: DE102005061674A1
Application number: DE102005061674A
Authority: DE
Inventors: Thomas Prof.Dr. Beuermann; Matthias Prof.Dr. Rädle; Friedrich Paul Elzenhans; Christian Dipl.-Ing. Heller; Luis Maldonado; Karola Pruss
Original assignee: HOCHSCHULE MANNHEIM
Current assignee: HOCHSCHULE MANNHEIM
Priority date: 2005-12-21
Filing date: 2005-12-21
Publication date: 2007-07-05
Anticipated expiration: 2025-12-22
Also published as: WO2007079943A1; EP1974202A1; DE102005061674B4

Abstract

Die Erfindung betrifft ein faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem zur Fluoreszenzuntersuchung einer, insbesondere biologischen, Fluorophore enthaltenden Probe, Verwendungen des faseroptischen Fluoreszenzsensorsystems und ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Fluorophoren in der Probe. DOLLAR A Das Anregungslicht wird zeitlich variiert und das Ausgangssignal des Fluoreszenzdetektors wird, angepasst an die zeitliche Variation des Anregungslichtes, elektronisch weiterverarbeitet, um eine Gleichlichtunterdrückung zu erzielen.

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem zur Fluoreszenzuntersuchung einer, insbesondere biologischen, Fluorophore enthaltenden Probe, Verwendungen des faseroptischen Fluoreszenzsensorsystems und ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Fluorophoren in der Probe.
Hintergrund der Erfindung
Fluoreszenzspektroskopie ist ein wirksames Verfahren zur Untersuchung der biochemischen und morphologischen Eigenschaften von Gewebe und anderen biologischen Proben. Insbesondere ist die Fluoreszenzspektroskopie schnell, nicht invasiv und erlaubt quantitative Messungen, so dass z.B. Gewebeeigenschaften, wie Metabolismusraten, Vaskularität, intravaskularer Sauerstoffgehalt und Änderungen in der Gewebemorphologie untersucht werden können. Derzeit wichtige Anwendungsgebiete sind die Untersuchung von karzinösem Zellwachstum und der Alzheimerschen Krankheit. Ein weiteres wichtiges Anwendungsgebiet ist die Prozesskontrolle bei Fermentationen, um nur einige Beispiele zu nennen.
Bei der Fluoreszenzspektroskopie werden sogenannte Fluorophore in einer Probe mit insbesondere kurzwelligem Licht bestrahlt, um deren Fluoreszenz anzuregen. Die Anregungsmaxima liegen dabei typischerweise im UV/Blau- Bereich zwischen 200 und 500 nm und die Maxima der Fluoreszenzemission im Bereich zwischen 280 und 700 nm.

Endogene Fluorophore sind z.B. Aminosäuren, wie Tryptophan und Tyrosin, strukturelle Proteine, wie Kollagen oder Elastin, Enzyme und Koenzyme, wie FAD, Flavine, NADH und NADPH, Vitamine, insbesondere Vitamin A, K und D, Vitamin B6-Bestandteile, Lipide sowie Porphyrine. Eine Übersicht über die Fluoreszenzspektroskopie findet sich in dem Artikel „Fluorescence Spectroscopy in Vivo" von Nirmala Ramanujam in „Encyclopedia of Analytical Chemistry", R. A. Meyers, Seiten 20–56, Verlag John Wiley and Sons Ltd., Cicester, 2000.

Bislang wurde die faseroptiosche Fluoreszenzanregung entweder mit Gasentladungslampen, wie Xenon- oder Quecksilber-Dampflampen oder kurzwelligen Lasern durchgeführt. Dabei wird das Anregungslicht über eine oder mehrere optische Fasern in die Probe eingekoppelt und das von den Fluorophoren in der Probe emittierte Fluoreszenzlicht über eine oder mehrere optische Fasern ausgekoppelt, um anschließend mit einem Spektrographen nachgewiesen zu werden.

Nachteilig bei der Verwendung von Xenon- oder Quecksilberdampf-Lampen ist, dass diese schwierig zu bedienen und störungsanfällig sind. Ferner erzeugen diese ein breites Emissionsspektrum, so dass typischerweise optische Filter zur Filterung des von den Lampen emittierten Lichtes verwendet werden, was wiederum thermische Probleme verursacht. Ferner bergen diese Lampen Sicherheitsrisiken durch die verwendete Hochspannung und in Bezug auf eine Explosionsgefahr.

Als Alternative zu den Gasentladungslampen werden Laser, wie z.B. Stickstoff-Laser oder Laser-gepumpte Dye-Laser, verwendet. Diese sind jedoch ebenfalls kostenintensiv und schwierig zu bedienen. Ferner bestehen strenge Sicherheitsauflagen für die Anwendung von derartigen Lasern, insbesondere im medizinischen Bereich.

Allgemeine Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung hat sich daher die Aufgabe gestellt, ein einfaches, kostengünstiges, anwenderfreundliches und kompaktes faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem bereit zu stellen.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem mit gutem Nutz-zu-Störsignal-Verhältnis bereit zu stellen, welches insbesondere auch unter Alltagsbedingungen bei Umgebungslicht betrieben werden kann.

Noch eine Aufgabe der Erfindung ist es, ein faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem bereit zu stellen, welches die Nachteile bekannter Systeme, wie z.B. in der Einleitung beschrieben, meidet oder zumindest mindert.

Die Aufgabe der Erfindung wird in überraschend einfacher Weise bereits durch den Gegenstand der unabhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen definiert.

Erfindungsgemäß wird ein faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem zur kontinuierlichen in-situ oder in-line Fluoreszenzuntersuchung einer, insbesondere biologischen, Fluorophore enthaltenden Probe bereitgestellt. In der Fachwelt wird auch von in-situ Fluorometrie gesprochen.

Das System umfasst einen Fluoroszenzsensor mit einer Lichtquelle, welche Anregungslicht oder Primärlicht zur Anregung von Fluoreszenz in der Probe emittiert, mit einer faseroptischen Sonde, über deren Sondenspitze das Anregungslicht in die Probe eingekoppelt und das von den Fluorophoren in der Probe emittierte – sekundäre – Fluoreszenzlicht ausgekoppelt wird, mit einem Lichtwellenleiter und mit einer Detektoreinrichtung. Die Lichtquelle emittiert Licht innerhalb eines schmalen Intervalls im Spektralbereich zwischen 200 und 700 nm. Das von der Lichtquelle emittierte Anregungslichtist jedoch besonders bevorzugt ultraviolettes bis blaues Licht, weshalb auch von UV/VIS-Fluorometrie gesprochen wird. Besonders bevorzugt wird UV-Licht oder blaues Licht mit einer Wellenlänge kleiner oder gleich 470 nm, insbesondere im Bereich zwischen 350 nm und 380 nm verwendet.

Die Detektoreinrichtung umfasst zumindest einen Detektor, insbesondere einen opto-elektrischen Konverter zum Nachweisen des Fluoreszenzlichtes. Der Lichtwellenleiter umfasst zumindest eine optische Empfangsfaser in Form einer Glasfaser, gegebenenfalls aus Quarzglas. Der Detektor ist mittels der Empfangsfaser mit der Sondenspitze verbunden, um das Fluoreszenzlicht von der Sondenspitze über die Empfangsfaser an den Detektor weiterzuleiten.

Der Fluoreszenzsensor umfasst somit eine faseroptische Messsonde, z.B. eine Tauchsonde für Fermentationsmessungen oder ein faseroptisches Endoskop für biomedizinische Anwendungen. Derartige Glasfasersensorsysteme sind in vorteilhafter Weise von kompakter Bauweise. Die Sondenspitze oder der Sensorkopf kann mit einem Durchmesser von kleiner oder gleich 5 mm, insbesondere im medizinischen Bereich von kleiner oder gleich 1 mm gebaut werden. Dabei haben die jeweiligen Glasfasern einen Außendurchmesser von typischer Weise 0,3 mm.

Der Detektor erzeugt ein kontinuierliches, elektrisches Ausgangssignal, dessen Höhe ein Maß für die Intensität des Fluoreszenzlichtes ist, um das Fluoreszenzlicht kontinuierlich und quantitativ zu messen. Mit anderen Worten ist die Höhe des elektrischen Ausgangssignals eine Funktion der Intensität des gemessenen Fluoreszenzlichtes.

Erfindungsgemäß umfasst die Lichtquelle zumindest eine inkohärente Leuchtdiode, eine sogenannte LED, zum Erzeugen des Anregungslichtes. Die Leuchtdiode bietet den Vorteil, dass ihr Licht bei geringem Energieverbrauch und hoher Lebensdauer und Stabilität optimal in die optische Faser eingekoppelt werden kann. Die LED zeichnet sich ferner gegenüber einer Gasentladungslampe durch einen sehr geringen Stromverbrauch und eine kleine Bauform aus, wodurch die thermische Belastung der Komponenten verringert und eine Miniaturisierung des Fluoreszenzsensors erzielt wird. Ferner sind sie kostengünstig und nahezu wartungsfrei.

Weiter ermöglicht der schmalbandige Spektralbereich der LEDs von kleiner als ± 20 nm eine maßgeschneiderte Fluoreszenzanregung. Es kann daher im Sendezweig vorzugsweise auf optische Filter oder Monochromatoren verzichtet werden, d.h. mit dem ungefilterten Primärlicht angeregt werden, und dennoch eine gezielte Fluoreszenzanregung bestimmter Fluorophore erreicht werden. Falls dennoch eine weitere Verschmälerung des Anregungsspektrums gewünscht ist, kann zusätzlich ein optisches Filter in die Sendefaser eingebaut werden, wobei dessen thermische Belastung gegenüber einer Gasentladungslampe aber erheblich reduziert ist.

Die Verwendung von Leuchtdioden verursacht in Verbindung mit den Gegebenheiten bei der Fluoreszenzspektroskopie jedoch ein zusätzliches gravierendes Problem. Aufgrund der Lichtschwäche der UV- oder Blaulicht-Leuchtdioden ist das Umgebungslicht unter Umständen relativ so stark, dass bei ersten Versuchen eine Abdunkelung des Umgebungslichts notwendig war. Dies mag bei Labormessungen noch akzeptabel sein, ist aber insbesondere bei Messungen am Patienten sehr störend.

Doch auch hierfür haben die Erfinder eine verblüffend einfache Lösung gefunden. Das von der Leuchtdiode emittierte Anregungslicht wird nämlich zeitlich variiert, insbesondere mit einer Modulationsfrequenz f vorzugsweise zeitkontinuierlich amplitudenmoduliert. Hierzu wird die Eingangsspannung der Leuchtdiode zeitlich verändert, insbesondere moduliert, so dass das Anregungslicht von der Leuchtdiode mit der Modulationsfrequenz amplitudenmoduliert emittiert wird. Die zeitliche Veränderung wird dabei langsam gegenüber dem Abklingverhalten der Fluoreszenz gewählt, insbesondere wird die Modulationsfrequenz klein gegen die inverse Abklingzeit des Fluoreszenzlichtes gewählt, wobei letztere typischerweise einige Nanosekunden beträgt, also insbesondere kleiner als 10 MHz. Dadurch beeinflusst das Abklingverhalten des Fluoreszenzlichtes den zeitlichen Verlauf des Fluoreszenzlichtes nicht oder nicht wesentlich. Es wird also eine sogenannte steady-state-Messung durchgeführt, bei der das von der Probe emittierte sekundäre Fluoreszenzlicht aber mit der Modulationsfrequenz f zeitkontinuierlich amplitudenmoduliert ist. Bevorzugt wird mit einer sinusförmigen, rechteckigen oder ähnlichen Modulationsfunktion angeregt. Somit können Zeitscans, insbesondere real-time-Messungen durchgeführt werden. Die Leuchtdiode kann jedoch auch gepulst betrieben werden.

Erfindungsgemäß wird das Ausgangssignal des Detektors im Empfangszweig angepasst an die Art und Periode der zeitlichen Veränderung des Anregungslichts elektronisch verarbeitet, um eine Gleichlichtunterdrückung zu erzielen.

Besonders einfach ist es, dem Detektor ein an die Modulationsfrequenz angepasstes elektronisches Filter nachzuschalten, um das Ausgangssignal des Detektors zu filtern. Der Frequenzbereich des Filters, insbesondere ein Bandpassfilter, ist an die Modulationsfrequenz angepasst, so dass im Wesentlichen nur modulierte Signalanteile durchgelassen und Gleichlicht- oder Gleichsignalanteile herausgefiltert werden. Insbesondere weist das Bandpassfilter somit eine Mittenfrequenz etwa gleich der Modulationsfrequenz f auf. Vorteilhafterweise können also Gleichlicht- oder Fremdlichtanteile unterdrückt werden, so dass das System auch bei hellem Umgebungslicht eingesetzt werden kann. Ferner ist hiermit ein automatischer Nullabgleich des Systems möglich.

Die Modulationsfrequenz beträgt vorzugsweise zwischen 200 Hz und 10 MHz, besonders bevorzugt zwischen 1 kHz und 1 MHz, so dass insbesondere auch netzfrequentes Umgebungslicht herausgefiltert wird. Damit wird die insbesondere für eine intrinsische Fluoreszenzmessung notwendige hohe Empfindlichkeit gewährleistet, womit sich der Sensor für die Zellforschung eignet. Es wurde gefunden, dass die Lichtintensität von Leuchtdioden mit hoher Lichtleistung dann ausreichend ist, um Fluoreszenzmessungen an biologischen Materialien (Zellsuspensionen, Gewebe, Lösungen usw.) durchführen zu können. Da sich je nach Stoffwechsel die Fluorophor-Zusammensetzung in biologischen Materialien bzw. Zellen ändert, ist es mit Hilfe dieses Fluoreszenzsensors und dem Auswerteverfahren möglich, Rückschlüsse auf den Zellzustand zu ziehen. Das System eignet sich daher insbesondere zur on-line Bioprozessverfolgung oder -überwachung, z.B. von Fermentationsprozessen, für die medizinische Diagnose, für die Krebsdiagnose und für die Bioanalytik. Mit der Erfindung ist ein einfaches, kostengünstiges und anwenderfreundliches System für Fluoreszenzmessungen an flüssigen und festen Proben ohne die Notwendigkeit der Probenvorbereitung geschaffen worden.

Besonders einfach wird ein Oszillator zur Modulation der Betriebsspannung der Leuchtdiode mit der Modulationsfrequenz f verwendet, so dass die Leuchtdiode mit einer Wechselspannung, insbesondere Sinus- oder Rechteck-förmigen Wechselspannung mit der Modulationsfrequenz f betrieben wird.

Aufgrund der Modulation der LED-Lichtemission in Kombination mit der anschließenden Filterung wird auch das elektronische Rauschen reduziert und das elektrische Ausgangssignal des Detektors, signalabwärts des elektronischen Filters, kann mit einem Verstärker höher verstärkt werden.

Ferner ist bevorzugt signalabwärts des elektronischen Filters, besonders bevorzugt signalabwärts des Verstärkers ein Gleichrichter zur Gleichrichtung des gefilterten Detektorsignals vorgesehen.

Weiter vorteilhaft kann eine Übersteuerungsanzeige mit dem elektronischen Filter und/oder dem Gleichrichter verbunden sein, um eine mögliche Übersteuerung zu detektieren.

Ferner besitzt das System eine Auswerteeinrichtung zur Aufzeichnung des Detektorsignals über einen makroskopischen Zeitraum und Mitteln zur zeitaufgelösten Darstellung der Fluoreszenzintensität über den Zeitraum um eine zeitkontinuierliche Messung, z.B. zur Prozessverfolgung zu ermöglichen.

Die Leuchtdiode kann entfernt von der Sondenspitze angeordnet sein. In diesem Fall weist der Lichtwellenleiter neben der Empfangsfaser zumindest eine optische Sendefaser auf, welche die Leuchtdiode mit der Sondenspitze verbindet, um das Anregungslicht von der Leuchtdiode über die Sendefaser zur Einkopplung in die Probe an die Sondenspitze weiterzuleiten. Alternativ kann die Leuchtdiode aufgrund ihrer geringen Größe sogar in die Sondenspitze integriert sein und direkt die Probe bestrahlen, so dass auf die Sendefaser verzichtet werden kann.

Als Detektor wird gemäß einer einfachen Ausführungsform ein Photomultiplier oder ein Photohalbleiter verwendet. Diesem ist bevorzugt ein optisches Filter vorgeschaltet, um eine spezifische Wellenlänge des Fluoreszenzlichtes zu detektieren. Um ein vollständiges Fluoreszenzspektrum aufzunehmen, kann aber unter Umständen ein Spektrometer mit einem CCD-Chip und einem dem CCD-Chip vorgeschalteten Polychromator eingesetzt werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine multiple Fluoreszenzanregung oder Multiwellenlängenfluoreszenzanregung durchgeführt, um unterschiedliche Fluorophore gezielt anzuregen. Bei dieser Ausführungsform umfasst die Lichtquelle eine Mehrzahl von Leuchtdioden mit unterschiedlichen Anregungslicht-Wellenlängen. Z. B. wird eine erste Anregungslicht- Wellenlänge derart ausgewählt, dass sie im Wesentlichen lediglich ein erstes Fluorophor anregt und eine zweite Anregungslicht-Wellenlänge derart, dass das erste und ein zweites Fluorophor angeregt werden. Mittels Subtraktion kann somit das Signal des zweiten Fluorophors herausprepariert werden. Vorzugsweise haben die mehreren Leuchtdioden also unterschiedliche Emissionswellenlängen jeweils im Spektralbereich zwischen 200 nm und 700 nm, vorzugsweise zwischen 250 nm und 500 nm, besonders bevorzugt zwischen 350 nm und 450 nm. Die Leuchtdioden haben den Vorteil, dass sie ein relativ enges Emissionsspektrum mit einer Halbwertsbreite im Bereich von etwa ± 5 nm bis ± 20 nm aufweisen, so dass unter Umständen auf ein optisches Filter im Sendezweig verzichtet werden kann, wobei zumindest einige der Wellenlängen der unterschiedlichen Leuchtdioden aus der folgenden Gruppe von Wellenlängen ausgewählt sind: 350 nm, 370 nm, 410 nm, 420 nm, 460 nm.

Die Multiwellenlängenfluoreszenzanregung wird mit den unterschiedlichen Wellenlängen gleichzeitig oder zeitversetzt durchgeführt. In letzterem Fall können die Fluoreszenzsignale oder Fluoreszenzspektren mit unterschiedlichen Anregungslichtwellenlängen voneinander subtrahiert werden, um bestimmte Fluorophore zu selektieren.

Es ist jedoch auch möglich, unterschiedliche Leuchtdioden mit unterschiedlichen Modulationsfrequenzen zu modulieren und die Fluoreszenzsignale mit entsprechenden unterschiedlichen elektronischen Filtern wieder zu trennen und/oder unterschiedliche Pulsformen zu verwenden.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine gleichzeitige Messung bei unterschiedlichen Wellenlängen mit mehreren parallelen Empfangszweigen durchgeführt. Hierzu umfasst der Fluoreszenzsensor eine Mehrzahl von parallelen Empfangszweigen mit jeweils einer optischen Empfangsfaser, jeweils einem an die zugehörige Empfangsfaser angeschlossenen Detektor, insbesondere einem Halbleiterdetektor oder einer Photodiode. Da diese ein relativ breites Nachweisspektrum besitzen, wird bevorzugt jedem Detektor ein optisches Filter mit unterschiedlichen Wellenlängenbereichen vorgeschaltet, so dass jeder Detektor Fluoreszenzlicht eines vorbestimmten Wellenlängenintervalls empfängt und eine gleichzeitige quantitative Erfassung von Fluoreszenzlicht unterschiedlicher Wellenlängenintervalle ermöglicht ist. Mit anderen Worten wird ein wellenlängendiskreter Nachweis des Fluoreszenzlichtes innerhalb vorbestimmter voneinander beabstandeter Intervalle durchgeführt. Die Auswerteeinrichtung kann diese dann ggfs. unterschiedlichen Fluorophoren zuordnen. Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, in den Empfangszweigen optische Filter mit einer Bandbreite von jeweils kleiner als ± 50 nm, bevorzugt kleiner als ± 20 nm, besonders bevorzugt kleiner als ± 10 nm zu verwenden. Die Erfindung ermöglicht also sowohl eine multiple Fluoreszenzanregung als auch einen multiplen Fluoreszenznachweis bzw. eine multiple Fluoreszenzauswertung.

Erfindungsgemäß wird demnach eine Mehrkomponentenanalyse bereitgestellt, welche eine Konzentrationsbestimmung von verschiedenen Biofluorophoren (z.B. NADH, NADPH, Flavine (FAD, FMN, Riboflavin), Porphyrine, Pyridoxine, Kollagen, Elastin, Lipo-Pigmente, fluoreszierende Aminosäuren wie Tryptophan usw.) in der Probe erlaubt. Hierzu sollten die Fluoreszenzemissionsspektren der Fluorophore in den jeweiligen Matrizes (Umgebungen) bekannt sein, was z.B. durch gezieltes An- und Abreichern einzelner Biofluorophore in der jeweiligen biologischen Matrix erreicht wird.

Die gleichzeitige quantitative Erfassung der unterschiedlichen Biofluorophore ist erfindungsgemäß also nicht nur mit einem wellenlängenselektiven Spektrometer, sondern auch mit den mehreren parallelen Halbleiterdetektoren in Verbindung mit den jeweiligen optischen Filtern ermöglicht. Dies ist deutlich kostengünstiger, kompakter und stromsparender als ein Spektrometer. Dadurch ist es unter anderem erstmals möglich, das System mit einer Batterie zu betreiben, welche zumindest die Lichtquelle und/oder die Detektoren versorgt.

Wird ein Fluoreszenzspektrum aufgenommen und sind die Fluoreszenzemissionsspektren der zu bestimmenden Fluorophore in den jeweiligen biologischen Matrizen bzw. Umgebungen bekannt, so ist es mit verschiedenen multivariaten Auswerteverfahren möglich, aus dem gemessenen Fluoreszenzspektrum der Probe auf die Konzentrationen der einzelnen Fluorophore zurückzurechnen.

Zusammenfassend wird demgemäß ein Fluoreszenzssensorsystem mit einem miniaturisierten faseroptischen Fluoreszenzsensor bereitgestellt, welches es gestattet, die Fluoreszenz von biologischen Materialien kontinuierlich und quantitativ zu messen.

Im Folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen und unter Bezugnahme auf die Figuren näher erläutert, wobei gleiche und ähnliche Elemente teilweise mit gleichen Bezugszeichen versehen sind und die Merkmale der verschiedenen Ausführungsbeispiele miteinander kombiniert werden können.

Kurzbeschreibung der Figuren

Es zeigen:

1 eine schematische Darstellung des faseroptischen Fluoreszenzsensorsystems gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung mit einer LED direkt an der Sondenspitze,

2 eine schematische Darstellung des faseroptischen Fluoreszenzsensorsystems gemäß einer zweiten Ausführungsform der Erfindung mit LED-Lichteinkopplung über eine Lichtleitfaser,

3 ein gemessenes Hefe-Kulturfluoreszenzspektrum (nach 10 Stunden Fermentationsdauer) aus den Anteilen der Biofluorophore NAD(P)H, Flavine (FAD, FMN) und Porphyrine,

4a den zeitlichen Verlauf der NAD(P)H-, Flavin (FAD, FMN) und Porphyrin-Fluoreszenzintensität,

4b den zeitlichen Verlauf der NAD(P)H-Fluoreszenzintensität und der Substratkonzentration,

5 eine schematische Darstellung des faseroptischen Fluoreszenzsensorsystems gemäß einer dritten Ausführungsform der Erfindung mit n Empfangsfasern, Spektralfiltern und Photodetektoren zur simultanen Fluoreszenzmessung bei n Wellenlängen,

6 eine Darstellung wie 5, jedoch zusätzlich mit m LEDs und m Sendefasern zur Anregung mit Primärlicht bei m Wellenlängen,

7 ein Blockdiagramm des Aufbaus für den modulierten Betrieb der LED und elektronische Filterung,

8 ein Blockschaltbild des Aufbaus für den modulierten Betrieb mit Rechtecksignalen und Integration.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Bezugnehmend auf 1 ist ein faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem umfassend einen Fluoreszenzsensor 1 mit einer Eintauchsonde 12 und einem Detektor 14 dargestellt. Der Detektor 14 umfasst eine Photodiode D1.
Eine UV-Leuchtdiode LED1 emittiert UV-Primärlicht zur Anregung der Fluoreszenz, welche wiederum die Emission von sekundärem Fluoreszenzlicht 20 aus der Probe 24 bewirkt. Das Fluoreszenzlicht 20 wird von den Fluorophoren in der Probe 24 emittiert. In dieser Ausführungsform ist die inkohärente Leuchtdiode LED1 innerhalb der Eintauchsonde 12 unmittelbar an der Sondenspitze 26 angeordnet. Dadurch kann auf eine Sendefaser verzichtet werden. Der Lichtwellenleiter 13 der Eintauchsonde 12 umfasst demgemäß in diesem Ausführungsbeispiel lediglich eine Empfangsfaser E1, die das Fluoreszenzlicht 20 an den Detektor 14 weiter leitet. Das von der Probe 24 bzw. den Fluorophoren in den Zellen in alle Raumrichtungen ausgesendete Fluoreszenzlicht 20 ist gegenüber dem Primär- oder Anregungslicht zu größeren Wellenlängen hin verschoben. Ein Bruchteil dieser Fluoreszenzemission gelangt schließlich über die Sondenspitze 26 und die Empfangsfaser E1 in die Detektoreinrichtung 14.
Die Detektoreinrichtung 14 ist ferner mit einer Recheneinrichtung 28 zur Datenaufnahme, -auswertung, -speicherung und -anzeige verbunden.
2 zeigt ein Fluoreszenzsensorsystem, bei welchem die Anregungslicht emittierende Leuchtdiode LED1 extern der Eintauchsonde 12 entfernt von der Sondenspitze 26 angeordnet ist. Das Anregungslicht der Leuchtdiode LED1 wird über eine Sendefaser S1 in dem Lichtwellenleiter 13, welche parallel zur Empfangsfaser E1 innerhalb der Eintauchsonde 12 bis zur Sensorspitze 26 verläuft, zur Probe 24 geführt.
Die Glasfaseroptische Sonde 12 bzw. deren Sondenspitze 26 gemäß 2 kommt ohne elektrische Versorgung aus. Daher kann die Sonde 12 temperaturstabil bis etwa 200°C oder mehr ausgelegt sein. Dies ist insbesondere für Anwendungen, die mit biologisch aktivem Material in Berührung kommen, von großem Vorteil, weil die Sondenspitze bzw. der Sensorkopf 26 erhitzt werden kann und daher autoklavierbar und sterilisierbar ist. Keime werden dadurch abgetötet und der Sensor 1 kann wiederholt eingesetzt werden, ohne Kontaminationen und Infektionen von Messort zu Messort weiter zu transportieren.
Derartige faseroptische Sensoren 1 lassen sich in unterschiedlichen Bauformen realisieren. So kann die Sondenspitze 26 so gefertigt werden, dass sie intravenös anwendbar ist. Ebenfalls kann mit gebogenen Kapillaren, die an Messorten wie der Augenhinterseite anwendbar sind, gearbeitet werden. Ferner kann die Sonde 12 eine große Länge aufweisen, um z.B. in großen Fermentern eingesetzt zu werden. Solche Sonden 12 können bis zu 10 m oder tiefer in biologische Reaktoren eintauchen und dennoch auf der ganzen Länge Temperaturen bis 200°C aushalten. Ein wichtiges weiteres Anwendungsgebiet für die Sensoren sind explosionsgefährdete Umgebungen. Hier können die meisten elektrischen Geräte nicht eingesetzt werden, wohl aber mit inkohärentem Licht betriebene rein optische Sonden. Nach Ex-Schutz-Richtlinie ist lediglich Sorge zu tragen, dass eine Lichtbelastung vom 5 mW/mm² nicht überschritten wird.
Der erfindungsgemäße Fluoreszenzsensor 1 besitzt demnach ein breites Anwendungsspektrum in der Bioanalytik, der Prozessverfolgung, in der biomedizinischen Fluoreszenzspektroskopie, der medizinischen Diagnostik insbesondere der Krebsdiagnostik und in der Wirkstoffforschung. Ein wesentlicher Vorteil der Fluoreszenzspektroskopie liegt darin, dass mit dieser Methode biochemische Vorgänge in Zellen nicht-invasiv und quantitativ verfolgt werden können. In lebenden Zellen sind verschiedene am Stoffwechsel beteiligte chemische Substanzen wie NAD(P)H, Flavine, Porphyrine etc. enthalten, welche bei Bestrahlung mit UV-Licht bzw. blauem Licht zur Fluoreszenz angeregt werden können. Dabei zeigt sich, dass jedes dieser Biofluorophore ein charakteristisches Fluoreszenzlicht mit entsprechender Spektralverteilung aussendet. Liegt nun in Folge einer Erkrankung wie Krebs eine Veränderung des intrazellulären Stoffwechsels vor, dann hat dies auch Einfluss auf die Konzentrationsverhältnisse der Biofluorophore und somit auf das Fluoreszenzemissionsspektrum der Zelle bzw. des biologischen Materials. Daher gestattet die Messung der Zellfluoreszenz nicht nur eine Gewebedifferenzierung zur Tumordiagnose (z.B. durch Bestimmung des Verhältnisses von NAD(P)H- zu Porphyrin-Fluoreszenz oder dem Verhältnis Flavin- zu Porphyrin-Fluoreszenz), sondern ermöglicht auch die Wirkung verschiedener Pharmazeutika auf den Organismus zu untersuchen wie auch Mechanismen und Verläufe bestimmter Erkrankungen aufzuklären.
In 3 wird diese Mehrkomponentenanalyse am Beispiel eines während einer Hefe-Fermentation in einem Bioreaktor online aufgenommenen Fluoreszenzspektrums veranschaulicht.
Das nach einer Fermentationsdauer von zehn Stunden aufgenommene Gesamt-Fluoreszenzspektrum 42 setzt sich im Wesentlichen aus den beiden Komponenten NAD(P)H mit einem Emissionsmaximum bei etwa 470 nm und Flavine bei einem Emissionsmaximum bei etwa 530 nm zusammen. Nach Subtraktion dieser beiden Hauptbestandteile der Kulturfluoreszenz erhält man ein Differenzspektrum 44, welches eine kleine Fluoreszenzbande bei etwa 630 nm aufweist, die von verschiedenen Porphyrinen herrührt.
Bezug nehmend auf 4a gelang es durch Anwendung der kontinuierlichen Mehrkomponentenanalyse während der Fermentation den zeitlichen Verlauf der NAD(P)H-, Flavin- und Porpyhyrin-Fluoreszenz zu verfolgen und diesen mit dem zellulären Stoffwechsel des untersuchten Mikroorganismus Bäckerhefe zu korrelieren.
Bezug nehmend auf 4b sind die plötzlichen Rückgänge der NAD(P)H-Fluoreszenz zu erkennen, als die Hefe ihren Stoffwechsel nach ca. acht Stunden von Glykolyse auf Ethanolabbau umstellen musste und als nach 22 Stunden auch das Substrat Ethanol aufgebraucht war.
Bei vielen biologischen oder medizinischen Anwendungen sind wie im Fall der Hefe-Fermentation (NAD(P)H, Flavine, Porphyrine) nur wenige relevante Fluorophore in der Probe vorhanden. In der Regel ist es dann möglich, direkt aus den Fluoreszenzintensitäten bei bestimmten die jeweiligen Biofluorophore charakterisierenden Wellenlängen die Fluorophor-Konzentrationen zu ermitteln. Im vorstehend beschriebenen Beispiel zur Hefe-Fermentation (3 bis 4b) ist in 3 zu erkennen, dass bei einer Wellenlänge von etwa 470 nm nahezu die gesamte Fluoreszenzintensität vom Fluorophor NAD(P)H herrührt. Nach Abzug dieser Komponente aus dem Gesamtspektrum 42 der Kulturfluoreszenz erhält man die Kurve 46, anhand derer es möglich ist, den Flavinanteil bei etwa 530 nm zu bestimmen, weil nun die NAD(P)H-Fluoreszenz nicht mehr spektral überlappt.
Schließlich kann nach weiterem Abzug des Anteils des Flavins auch der Porphyrin-Gehalt (Kurve 44) aus der verbliebenen Intensität bei etwa 630 nm bestimmt werden. Bei dieser Art der Auswertung genügt es somit, die Fluoreszenzintensitäten bei bestimmten Wellenlängen (in dem Beispiel: bei 470 nm, 530 nm, 630 nm) zu messen, um die entsprechenden Fluorophor-Konzentrationen zu ermitteln.
Um eine eventuelle Offset-Korrektur durchführen zu können, kann noch die Lichtintensität bei einer Wellenlänge aufgezeichnet werden, bei der keine Fluoreszenz zu erwarten ist. In dem Beispiel ist dies in dem Spektralbereich von 650 bis 700 nm der Fall.
5 zeigt ein Fluoreszenzsensorsystem 1 mit mehreren Empfangszweigen, wobei jeder Empfangszweig eine optische Empfangsfaser E1 bis En aufweist. Das von der Probe emittierte Fluoreszenzlicht wird in diese Empfangsfasern E1 bis En eingekoppelt. Am Ende einer jeden Empfangsfaser E1 bis En befindet sich ein optisches Spektralfilter F1 bis Fn, welches nur Licht einer bestimmten Wellenlänge bzw. eines bestimmten Wellenlängenbereichs durchlässt. Nach dem Passieren des jeweiligen Filters F1 bis Fn fällt das Licht zum Nachweis auf die Photo-Detektoren D1 bis Dn, bei welchen es sich z.B. um Photodioden oder Photovervielfacher (Photomultiplier) handelt. Die Messung der Fluoreszenzintensitäten bei den von den Filtern F1 bis Fn vorgegebenen Wellenlängen erfolgt gleichzeitig, damit auch bei schnellen biologischen Prozessen, die Fluorophor-Zusammensetzung der Probe richtig ermittelt wird.
Die in 5 dargestellte Ausführungsform kommt im Gegensatz zu den häufig in der Fluoreszenzspektroskopie eingesetzten Spektrometern ohne ein wellenlängendispersives Element wie einem Polychromator aus und ist daher wesentlich kostengünstiger zu fertigen. Aufgrund der geringen Abmessungen, kann der gesamte Sensor 1 kompakt in einem Gehäuse untergebracht werden.
Wird die in 5 dargestellte Ausführungsform z.B. mit vier Empfangszweigen mit optischen Interferenz- oder Bandpassfiltern bei 470 nm, 530 nm, 630 nm und 700 nm verwendet, kann die anhand der 3 bis 4b erläuterte selektiv quantitative und kontinuierliche Messung und Substraktion einschließlich Offset-Korrektur mit dem Sensor durchgeführt werden. Es ist dem Fachmann ersichtlich, dass auch optische Kantenfilter, z.B. Langpass- und/oder Kurzpassfilter eingesetzt werden können. Diese können insbesondere in Kombination mit einem beschränkten spektralen Empfangsbereich der Photodioden genügen.
6 zeigt eine weitere Ausführungsform der Erfindung mit einer Mehrzahl an Sende-Leuchtdioden LED1 bis LEDm, welche unterschiedliche Emissionswellenlängen zur Fluoreszenzanregung aufweisen und jeweils zugeordneten Sendefasern S1 bis Sm. Diese Ausführungsform ist insbesondere dann von Vorteil, wenn die Mehrkomponentenanalyse dadurch erschwert wird, dass die Fluorophore in der zu analysierenden Probe stark überlappende Fluoreszenzbanden aufweisen. So kann z.B. mit der LED1 gezielt nur der Fluorophor mit dem langwelligsten Fluoreszenzanregungsspektrum angeregt und bestimmt werden.
Werden anschließend mit der LED2 mit kürzerer Anregungswellenlänge neben dem erstgenannten Fluorophor noch ein weiterer angeregt, so kann dessen Konzentration nun ermittelt werden, da der Anteil des erstgenannten Fluorophors von der gemessenen Fluoreszenzintensität abgezogen werden kann.
Alternativ können auch mehrere oder alle Leuchtdioden LED1 bis LEDm in eine Sendefaser eingekoppelt werden. Ferner können die LED1 bis LEDm wie bei der in 1 dargestellten Ausführungsform auch in der Sondenspitze angeordnet sein, wenn die Sonde 12 nicht auf Miniaturisierung hin optimiert werden muss.
Bezug nehmend auf 7 wird die Gleichlichtunterdrückung anhand eines beispielhaften Aufbaus beschrieben. Die Leuchtdiode LED1 wird mit einer sinusförmigen Wechselspannung betrieben. Hierzu wird die LED1 von einem Oszillator 62 mit einer vorbestimmten Frequenz f betrieben, welcher von einer gemeinsamen Spannungsversorgung 64 gespeist wird.
Das hiermit angeregte Fluoreszenzlicht 20 ist ebenfalls sinusförmig moduliert und wird mit dem Detektor 14 mit der Photodiode D1 nachgewiesen. Das Ausgangssignal der Photodiode D1 ist in weiten Bereichen proportional zu der empfangenen Fluoreszenz-Lichtintensität, so dass das Detektorsignal ebenfalls mit der Frequenz f moduliert ist. Das Bandpassfilter 66 ist mit dem Detektor D1 verbunden und derart eingestellt, dass es lediglich den Wechselanteil des Detektorsignals mit der Frequenz f durchlässt. Damit werden durch Raumlicht oder Gleichlicht erzeugte Signale unterdrückt. Die Unterdrückung kann beispielsweise durch eine Bandpassfilterung mit einer Steilheit von vorzugsweise 20 bis 60 dB/Dekade erfolgen. Die Modulationsfrequenz f wird vorzugsweise zwischen 1 kHz und 1 MHz gewählt, besonders bevorzugt zwischen 2 kHz und 100 kHz. Hiermit werden auch netzfrequente Lichtanteile, bei 50 Hz oder bei doppelter Netzfrequenz von 100 Hz effektiv herausgefiltert.
Ein Verstärker 68 ist mit dem Bandpassfilter 66 verbunden, um das gefilterte Signal zu verstärken. Ein Gleichrichter 70 ist mit dem Verstärker 68 verbunden, um das verstärkte Signal gleich zu richten. Das gleichgerichtete Signal wird an die Auswerte- und Anzeigeeinrichtung 28 zur weiteren Verarbeitung weitergeleitet. Eine Übersteuerungsanzeige 72 ist mit dem Bandpass 66 und dem Gleichrichter 70 verbunden. Die Spannungsversorgung 64 speist alle Komponenten.
Erfindungsgemäß kann somit auch netzfrequentes Umgebungslicht herausgefiltert werden. Dies hat also insbesondere den Vorteil, dass man die Fluoreszenzmessungen auch bei Raum- bzw. Umgebungslicht, welches zu einer erheblichen Überlagerung mit dem intensitätsschwachen Fluoreszenzlicht 20, dem eigentlichen Messsignal, führt, durchführen kann. Insbesondere bei medizinischen Anwendungen, z.B. in der Endoskopie, ist es dadurch für den Arzt möglich, parallel zu den Fluoreszenzmessungen visuell das zu untersuchende Gewebe zu begutachten.
8 zeigt ein Blockschaltbild für einen modulierten Betrieb des Systems 1 mit Rechtecksignalen. D.h. die Modulation ist in Form einer Taktung realisiert. Hierfür wird eine dem Fachmann grundsätzlich bekannte Integratorschaltung verwendet. Die Integratorschaltung vereint ein sehr geringes Rauschen mit der Möglichkeit einer hohen Verstärkung für die eingehenden Signale. Die LED wird mit einem getakteten Spannungssignal in Form eines periodischen Rechtecksignals einer Zeitdauer von beispielsweise zwischen 5 ms und 2 s getrieben (An-Zeit) und anschließend für eine weitere Zeitdauer dunkel geschaltet (Aus-Zeit). Die Betriebsspannung der Leuchtdiode LED1 wird von einer Spannungsversorgung 80 erzeugt, welche von einem Taktgenerator 82 mit dem Taktsignal T1 getaktet wird. Somit wird die Anregungslicht emittierende Leuchtdiode LED1 getaktet versorgt und emittiert getaktetes Anregungslicht. Das Ausgangssignal des Detektors wird koinzident mit dem Spannungssignal gemessen, genauer während der Dauer der An-Zeit des Spannungssignals mittels des Integrators 84 integriert, wobei der Integrator 84 mit der Leuchtdiode LED1 verbunden ist. Das Nutzsignal wird dann als Differenz zwischen dem integrierten Ausgangssignal während der An-Zeit und der Aus-Zeit der LED ermittelt. Damit verkörpert der Integrator 84 ein Mittel zur Gleichlichtunterdrückung. Hierzu ist der Integrator 84 ebenfalls mit dem Taktgenerator 82 verbunden und wird von diesem mit dem Taktsignal T2 versorgt, derart dass die Leuchtdiode D1 und der Integrator 84 mit demselben Takt gesteuert werden. Das Ausgangssignal des Integrators 84 wird mittels eines Verstärkers 86 verstärkt und mittels eines A/D-Wandlers 88 digitalisiert, um anschließend von der Auswerte- und Anzeigeeinrichtung 28 digital weiterverarbeitet zu werden.
Eine weitere mögliche Variante einer zeitlich variierten Beleuchtung ist eine gepulste Betriebsweise der LED. Diese hat den Vorteil, dass man zum Zeitpunkt des Pulses ein hohes Signal erhält. Hierfür ist die Kombination mit einem schnellen Detektor sinnvoll, z.B. einem Ladungsverstärker, bei welchem die erste Stufe gering und eine zweite Verstärkungsstufe hoch verstärkt. Zwar gilt, dass die Lichtintensität von Leuchtdioden bei hoher und kurzzeitiger Belastung nicht proportional zum Versorgungsstrom ist, dennoch lassen sich Leuchtdioden, die z.B. für einen Dauerbetrieb mit 20 mA ausgelegt sind, mit bis zu 10 A kurzzeitig belasten und erreichen dann ein Vielfaches an kurzzeitiger Lichtemission. Die Pulsdauer wird vorzugsweise länger als 100 ns gewählt, um eine Überlagerung mit dem Abklingverhalten der Fluoreszenz zu vermeiden, so dass von einer „quasi-kontinuierlichen" Anregung gesprochen werden kann.

Claims

Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem zur Fluoreszenzuntersuchung einer Fluorophore enthaltenden, insbesondere biologischen Probe (24), mit einem Fluoreszenzsensor (1), umfassend: eine Lichtquelle, welche Anregungslicht zur Anregung von Fluoreszenz in der Probe (24) emittiert, eine Sonde (12) zum Einkoppeln des Anregungslichts in die Probe (24) und zum Auskoppeln des von den Fluorophoren in der Probe emittierten Fluoreszenzlichts (20), einen Lichtwellenleiter (13) und eine Detektoreinrichtung (14) mit zumindest einem Detektor (D1) zum Nachweisen des Fluoreszenzlichtes (24), wobei der Lichtwellenleiter (13) zumindest eine optische Empfangsfaser (E1) umfasst und der Detektor (D1) mittels der Empfangsfaser (E1) mit der Sondenspitze (26) verbunden ist, um das Fluoreszenzlicht (20) von der Sondenspitze (26) über die Empfangsfaser (E1) an den Detektor (D1) weiterzuleiten, wobei der Detektor (D1) ein Ausgangssignal erzeugt, welches ein Maß für die Intensität des Fluoreszenzlichtes (20) ist, um das Fluoreszenzlicht quantitativ zu messen, wobei die Lichtquelle eine Leuchtdiode (LED1) zum Erzeugen des Anregungslichtes umfasst, wobei die Betriebsspannung der Leuchtdiode zeitlich verändert wird, wodurch eine zeitlich variierende Lichtemission der Leuchtdiode (LED1) hervorgerufen wird und wobei elektronische Mittel (66, 84) zur Gleichlichtunterdrückung, angepasst an die zeitliche Variation der Lichtemission, umfasst sind.
Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach Anspruch 1, wobei die elektronischen Mittel (66, 84) zur Gleichlichtunterdrückung mit dem Detektor (D1) verbunden sind und auf das Ausgangssignal des Detektors (D1) wirken.
Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach Anspruch 1 oder 2, wobei die zeitliche Variation der Lichtemission langsam im Vergleich zum Abklingverhalten der Fluoreszenz ist.
Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das von der Leuchtdiode (LED1) emittierte Anregungslicht moduliert ist und die elektronischen Mittel (66, 84) zur Gleichlichtunterdrückung an die Modulation des Anregungslichtes angepasst sind.
Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei ein Oszillator (62) zur Modulation der Betriebsspannung der Leuchtdiode mit der Modulationsfrequenz (f) umfasst ist.
Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Anregungslicht mit einer Modulationsfrequenz (f) moduliert wird und die elektronischen Mittel zur Gleichlichtunterdrückung ein an die Modulationsfrequenz (f) angepasstes elektronisches Filter (66) zur Filterung des Ausgangssignals des Detektors (D1) umfassen.
Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach Anspruch 6, wobei das Filter (66) zur Filterung des elektrischen Ausgangssignals des Detektors (D1) ein Bandpassfilter ist.
Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Modulationsfrequenz (f) klein gegen die inverse Abklingzeit der Fluoreszenz ist.
Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei das Anregungslicht mit einer Frequenz zwischen 200 Hz und 10 MHz moduliert ist.
Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach einem der Ansprüche 6 bis 9, wobei signalabwärts des elektronischen Filters (66) ein Verstärker (68) zur Verstärkung des gefilterten Detektorsignals vorgesehen ist.
Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach einem der Ansprüche 6 bis 10, wobei signalabwärts des elektronischen Filters (66) ein Gleichrichter (70) zur Gleichrichtung des gefilterten Detektorssignals vorgesehen ist.
Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach einem der Ansprüche 6 bis 11, wobei eine Übersteuerungsanzeige (72) mit dem elektronischen Filter (66) und/oder dem Gleichrichter (70) verbunden ist, um eine mögliche Übersteuerung zu detektieren.
Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Anregungslicht mit regelmäßigen Rechtecksignalen und zwischen den Rechtecksignalen liegenden Pausen moduliert wird und die elektronischen Mittel (66, 84) zur Gleichlichtunterdrückung eine mit dem Rechtecksignal koinzident betriebene Integrationsschaltung umfasst.
Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach Anspruch 13, wobei die Dauer der Rechtecksignale lang gegen die Abklingzeit der Fluoreszenz ist.
Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach Anspruch 13 oder 14, wobei die Dauer der Rechtecksignale zumindest 100 ns beträgt.
Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Leuchtdiode (LED1) gepulst betrieben wird und das Ausgangssignal des Detektors koinzident zur Pulsung gemessen wird.
Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach Anspruch 16, wobei die Pulsdauer zumindest 100 ns beträgt.
Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei eine Auswerteeinrichtung (28) mit Mitteln zur Aufzeichnung des Detektorsignals über einen makroskopischen Zeitraum und Mitteln zur zeitaufgelösten Darstellung der Fluoreszenzintensität über den Zeitraum zur Prozessverfolgung umfasst ist.
Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Lichtquelle eine Mehrzahl von Leuchtdioden (LED1 bis LEDm) mit unterschiedlichen Anregungslicht-Wellenlängen zur Fluoreszenzanregung umfasst.
Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach Anspruch 19, wobei Mittel zur Subtraktion zweier Fluoreszenzsignale, welche mit unterschiedlichen Anregungslicht-Wellenlängen aufgenommen sind, umfasst sind.
Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Leuchtdiode (LED1 bis LEDm) in die Sondenspitze (26) integriert ist.
Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei die Leuchtdiode (LED1 bis LEDm) entfernt von der Sondenspitze (26) angeordnet ist und der Lichtwellenleiter (13) zumindest eine optische Sendefaser (S1 bis Sm) umfasst, welche die Leuchtdiode mit der Sondenspitze (26) verbindet, um das Anregungslicht von der Leuchtdiode zur Einkopplung in die Probe (24) an die Sondenspitze weiterzuleiten.
Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Fluoreszenzsensor (1) eine Mehrzahl von parallelen Empfangszweigen mit jeweils einem Detektor (D1 bis Dn) und jeweils einem optischen Filter (F1 bis Fn) aufweist, wobei die optischen Filter in den Empfangszweigen unterschiedliche Wellenlängenbereiche definieren, so dass jeder Detektor (D1 bis Dn) Fluoreszenzlicht eines vorbestimmten Wellenlängenintervalls empfängt.
Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach Anspruch 23, wobei die Detektoren (D1 bis Dn) jeweils Halbleiterdetektoren, insbesondere Photodioden oder CCD-Chips, sind.
Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach Anspruch 23 oder 24, wobei die optischen Filter (F1 bis Fn) Bandpassfilter sind und jeweils eine Bandbreite von ± 50 nm oder kleiner aufweisen.
Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach einem der Ansprüche 23 bis 25, wobei eine Batterie zur Stromversorgung zumindest der Leuchtdioden (LED1 bis LEDm) und/oder der Halbleiterdetektoren (D1 bis Dn) umfasst ist.
Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Probe mit dem spektral ungefilterten Anregungslicht aus den Leuchtdioden (LED1 bis LEDm) bestrahlt wird.
Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem zur Fluoreszenzuntersuchung einer Fluorophore enthaltenden Probe, insbesondere nach einem der vorstehenden Ansprüche, mit einem Fluoroszenzsensor (1), umfassend: eine Lichtquelle, welche Anregungslicht zur Anregung von Fluoreszenz in der Probe (24) emittiert, eine Sonde (12) zum Einkoppeln des Anregungslichts in die Probe (24) und zum Auskoppeln des von den Fluorophoren in der Probe emittierten Fluoreszenzlichts (20), einen Lichtwellenleiter (13) und eine Detektoreinrichtung (14) mit zumindest einem Detektor (D1) zum Nachweisen des Fluoreszenzlichtes (20), wobei der Lichtwellenleiter (13) zumindest eine optische Empfangsfaser (E1) umfasst und der Detektor (D1) mittels der Empfangsfaser (E1) mit der Sondenspitze (26) verbunden ist, um das Fluoreszenzlicht (20) von der Sondenspitze (26) über die Empfangsfaser (E1) an den Detektor (D1) weiterzuleiten, wobei der Detektor (D1) ein Ausgangssignal erzeugt, welches ein Maß für die Intensität des Fluoreszenzlichtes (20) ist, um das Fluoreszenzlicht (20) quantitativ zu messen und wobei die Lichtquelle eine Leuchtdiode (LED1) zum Erzeugen des Anregungslichtes umfasst.
Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Fluorophoren in einer, insbesondere biologischen Probe mittels eines faseroptischen Fluoreszenzsensorsystems, wobei die Probe (24) mit Anregungslicht aus einer Lichtquelle bestrahlt wird, um eine Fluoreszenz in der Probe anzuregen, wodurch die Fluorophore in der Probe (24) Fluoreszenzlicht (20) emittieren, zur Erzeugung des Anregungslichts eine Leuchtdiode (LED1) verwendet wird, das Anregungslicht moduliert wird, das von den Fluorophoren in der Probe (24) emittierte Fluoreszenzlicht (20) mittels einer optischen Faser (E1) zu einem Detektor (D1) weitergeleitet wird und die Intensität des Fluoreszenzlichts (20) mit dem Detektor (D1) gemessen wird, wobei der Detektor (D1) ein elektrisches Ausgangssignal ausgibt, welches ein Maß für die Intensität des Fluoreszenzlichtes (20) ist, das elektrische Ausgangssignal des Detektors (D1) mit der Modulationsfrequenz (6) gefiltert wird und das gefilterte Ausgangssignal ausgewertet wird.
Verwendung des Fluoreszenzsensorsystems nach einem der vorstehenden Ansprüche für die medizinische Diagnose.
Verwendung des Fluoreszenzsensorsystems nach einem der vorstehenden Ansprüche für die Krebsdiagnose.
Verwendung des Fluoreszenzsensorsystems nach einem der vorstehenden Ansprüche für die Bioanalytik.
Verwendung des Fluoreszenzsensorsystems nach einem der vorstehenden Ansprüche für die Online-Prozessverfolgung.