EP1974202A1 - Faseroptisches fluoreszenzsensorsystem - Google Patents

Faseroptisches fluoreszenzsensorsystem

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EP1974202A1
EP1974202A1 EP06841049A EP06841049A EP1974202A1 EP 1974202 A1 EP1974202 A1 EP 1974202A1 EP 06841049 A EP06841049 A EP 06841049A EP 06841049 A EP06841049 A EP 06841049A EP 1974202 A1 EP1974202 A1 EP 1974202A1
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EP
European Patent Office
Prior art keywords
fluorescence
sensor system
light
fluorescence sensor
fiber optic
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP06841049A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Beuermann
Matthias RÄDLE
Friedrich Paul Elzenhans
Christian Heller
Luis Maldonado
Karola Pruss
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
HOCHSCHULE MANNHEIM
Original Assignee
Fachhochschule Mannheim
HOCHSCHULE MANNHEIM
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fachhochschule Mannheim, HOCHSCHULE MANNHEIM filed Critical Fachhochschule Mannheim
Publication of EP1974202A1 publication Critical patent/EP1974202A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Definitions

  • the invention relates to a fiber optic
  • Fluorescence sensor system for fluorescence examination of a particular biological sample containing fluorophores, uses of the fiber optic fluorescence sensor system and a method for the quantitative determination of fluorophores in the sample.
  • Fluorescence spectroscopy is an effective method for studying the biochemical and morphological properties of tissue and other biological samples.
  • fluorescence spectroscopy is fast, non-invasive and allows quantitative measurements, so that e.g. For example, tissue properties such as metabolism rates, vascularity, intravascular oxygen content, and changes in tissue morphology can be examined.
  • tissue properties such as metabolism rates, vascularity, intravascular oxygen content, and changes in tissue morphology can be examined.
  • tissue properties such as metabolism rates, vascularity, intravascular oxygen content, and changes in tissue morphology can be examined.
  • tissue properties such as metabolism rates, vascularity, intravascular oxygen content, and changes in tissue morphology can be examined.
  • process control in fermentations to name just a few examples.
  • fluorophores are irradiated in a sample, in particular with short-wave light, in order to excite their fluorescence.
  • the excitation maxima are typically in the UV / blue Range between 200 and 500 nm and the maxima of the fluorescence emission in the range between 280 and 700 nm.
  • Endogenous fluorophores are e.g. Amino acids, such as tryptophan and tyrosine, structural proteins, such as collagen or
  • Elastin enzymes and coenzymes, such as FAD, flavins, NADH and NADPH, vitamins, especially vitamins A, K and D, vitamin B6 ingredients, lipids and porphyrins.
  • the fiber-optic fluorescence excitation was carried out either with gas discharge lamps, such as xenon or mercury vapor lamps or short-wave lasers.
  • the excitation light is coupled into the sample via one or more optical fibers and emitted by the fluorophores in the sample
  • Fluorescence light coupled via one or more optical fibers to be subsequently detected with a spectrograph Fluorescence light coupled via one or more optical fibers to be subsequently detected with a spectrograph.
  • Mercury vapor lamps is that these are difficult to use and prone to failure. Furthermore, they produce a broad emission spectrum, so typically optical filters are used to filter the light emitted by the lamps, which in turn causes thermal problems. Furthermore, these lamps pose safety risks due to the high voltage used and with respect to an explosion hazard.
  • gas discharge lamps are laser, such. As nitrogen laser or laser-pumped dye laser used. However, these are also costly and difficult to use. Furthermore, there are strict safety requirements for the use of such lasers, especially in the medical field.
  • a fluorometer with a pulsed LED and a photodetector is also known, which distinguishes between weak fluorescence signals and superimposed signals.
  • this fluorometer is designed to observe light-induced chlorophyll fluorescence changes. A spectrally differentiated measurement is not provided.
  • a disadvantage is therefore that the fluorometer is only suitable for studies in which a prominent Flurozenzsignal is generated. Furthermore, this fluorometer does not appear to be suitable for medical application or online process tracking and requires complicated signal processing.
  • the invention is therefore based on the object to provide a fiber optic fluorescence sensor system with good pay-to-noise ratio, which can be operated under ambient conditions in ambient light and at the same time is suitable for the investigation of samples with little or superimposed by background fluorescence spectra ,
  • Yet another object of the invention is to provide a fiber optic fluorescence sensor system which overcomes the disadvantages of known systems, such as e.g. As described in the introduction, avoids or at least reduces.
  • the object of the invention is achieved in a surprisingly simple way already by the subject matter of the independent claims. Advantageous developments of the invention are defined in the subclaims.
  • a fiber optic According to the invention, a fiber optic
  • Fluorescence sensor system for continuous in situ or in-line fluorescence examination of a particular biological, containing fluorophores sample provided. Experts also speak of in-situ fluorometry.
  • Excitation of fluorescence emitted in the sample with a fiber optic probe, via the probe tip, the excitation light coupled into the sample and the emitted from the fluorophores in the sample - secondary - fluorescence light is coupled out with a fiber optic probe, via the probe tip, the excitation light coupled into the sample and the emitted from the fluorophores in the sample - secondary - fluorescence light is coupled out with a fiber optic probe, via the probe tip, the excitation light coupled into the sample and the emitted from the fluorophores in the sample - secondary - fluorescence light is coupled out with a
  • the light source emits light within a narrow interval in the spectral range between 200 and 700 nm.
  • the excitation light emitted by the light source and emerging from the probe into the sample is particularly preferably ultraviolet to blue light, which is why UV / VIS fluorometry is also used. It is particularly preferable to use UV light or blue light having a wavelength less than or equal to 470 nm, in particular in the range between 350 nm and 380 nm.
  • the detector device comprises at least one detector, in particular an opto-electrical converter for detecting the fluorescent light.
  • the optical waveguide comprises at least one optical receiving fiber in the form of a Glass fiber, possibly made of quartz glass.
  • the detector is connected to the probe tip by means of the receiving fiber in order to forward the fluorescent light from the probe tip via the receiving fiber to the detector.
  • the fluorescence sensor thus comprises a fiber optic probe, e.g. a dip probe for fermentation measurements or a fiber optic endoscope for biomedical applications.
  • a fiber optic probe e.g. a dip probe for fermentation measurements or a fiber optic endoscope for biomedical applications.
  • Such fiberglass sensor systems are advantageously of compact design.
  • Probe tip or the sensor head can be built with a diameter of less than or equal to 5 mm, in particular in the medical field of less than or equal to 1 mm.
  • the respective glass fibers have an outer diameter of typically 0.3 mm.
  • the detector produces a continuous electrical output whose magnitude is a measure of the intensity of the fluorescent light to continuously and quantitatively measure the fluorescent light.
  • the magnitude of the electrical output signal is a function of the intensity of the measured fluorescent light.
  • the light source comprises at least one light-emitting diode.
  • the light source consists of an incoherent light-emitting diode, a so-called LED, a laser diode or a diode-pumped laser for generating the excitation light.
  • the semiconductor-based light sources are also distinguished from a gas discharge lamp by a very low power consumption and a small design, whereby the thermal load of the components is reduced and a miniaturization of the fluorescence sensor is achieved. Furthermore, they are inexpensive and virtually maintenance free.
  • the narrowband spectral range of the semiconductor-based light sources e.g. incoherent LEDs, laser diodes or diode-pumped lasers of less than ⁇ 20 nm provide tailor-made fluorescence excitation. It can therefore be dispensed in the transmitting branch preferably on optical filters or monochromators, d. H. be excited with the unfiltered primary light, and yet a targeted fluorescence excitation of certain fluorophores can be achieved. If, nevertheless, a further narrowing of the excitation spectrum is desired, an optical filter can additionally be installed in the transmitting fiber, but its thermal load compared to a gas discharge lamp is considerably reduced.
  • Excitation light varies with time, in particular with a modulation frequency f preferably amplitude-modulated time-continuous.
  • the input voltage of the light source is changed over time, in particular modulated, so the excitation light is emitted amplitude-modulated by the light source at the modulation frequency.
  • the temporal change is chosen slowly compared to the decay behavior of the fluorescence, in particular, the modulation frequency is chosen to be small compared to the inverse decay time of the fluorescent light, the latter is typically a few nanoseconds, ie in particular less than 10 MHz.
  • the decay behavior of the fluorescent light does not or not significantly affect the time course of the fluorescent light.
  • a so-called steady-state measurement is carried out in which the secondary fluorescent light emitted by the sample is amplitude-modulated continuously with the modulation frequency f. Preferably, it is excited with a sinusoidal, rectangular or similar modulation function.
  • time scans in particular real-time measurements can be performed.
  • the light source can also be operated pulsed.
  • a constant light suppression is performed, for example, to filter out ambient light.
  • the fluorescence sensor system has two or a plurality of reception branches, which are designed for the temporal and spectrally resolved quantitative detection of the fluorescent light. That is, each reception branch measures a permanently defined spectral range of the fluorescent light, the spectral ranges of the different reception branches preferably not overlapping. Thus, the fluorescent light in the respective spectral range is selectively and quantitatively measured.
  • each reception branch comprises a detector which in each case generates an output signal which is a measure of the intensity of the fluorescent light in the associated spectral range.
  • each of the detectors is associated with an electronic means for light suppression, which is adapted in each case to the temporal variation of the light emission, so that the first receiving branch a gleichunterunteronnes quantitative first measurement signal of the intensity of the fluorescent light in the first spectral range and the second receiving branch a gleichunteruntersistedes quantitative second measurement signal generates the intensity of the fluorescent light in the second spectral range and thus a gleichunteruntercontactede quantitative spectrally resolved evaluation of the fluorescent light is possible.
  • the spectral ranges are preferably predefined in front of the detectors by means of optical filters of different wavelength intervals. For certain applications, however, it may also be sufficient to use detectors with spectrally limited detection efficiency.
  • the width of the spectral regions is preferably less than ⁇ 50 nm, more preferably between ⁇ 2 nm and ⁇ 20 nm.
  • the spectral resolution of the background extraction system is used.
  • the first spectral range is selected such that the expected fluorescence maximum of a first fluorophore to be detected in the sample is covered.
  • Spectral range is chosen to cover an expected background region of the fluorescence spectrum.
  • the system comprises a differential amplifier in which the first and second measurement signal are fed, so that only the difference between the two signals is amplified or the difference between the two channels is evaluated by means of a microcontroller.
  • a uniformly suppressed and spectrally sublimated measurement signal is obtained, which is a measure of the intensity of the fluorescent light of the fluorophore to be detected.
  • the output signal of the detectors in the respective reception branch is electronically processed in accordance with the type and period of the temporal change of the excitation light, in order to achieve a simultaneous light suppression in each reception branch.
  • the frequency range of the filter in particular bandpass filter, is adapted to the modulation frequency, so that essentially only modulated signal components are passed through and direct light or direct signal components are filtered out.
  • the bandpass filters thus have a center frequency approximately equal to the modulation frequency f.
  • the modulation frequency is preferably between 200 Hz and 10 MHz, more preferably between 1 kHz and 1 MHz, so that, in particular, also mains-frequency ambient light is filtered out electronically. This ensures the high sensitivity required in particular for intrinsic fluorescence measurement, making the sensor suitable for cell research. It has been found that the light intensity of light emitting diodes with high light output is then sufficient,. to perform fluorescence measurements on biological materials (cell suspensions, tissues, solutions, etc.). Since, depending on the metabolism, the fluorophore
  • composition in biological materials or cells changes, it is possible with the help of this fluorescence sensor and the evaluation process to draw conclusions about the cell state.
  • the system is therefore particularly suitable for on-line bioprocess tracking or monitoring, e.g. from
  • Fermentation processes for medical diagnosis, for cancer diagnosis and for bioanalytics.
  • With the invention is a simple, inexpensive and user-friendly system for fluorescence measurements liquid and solid samples without the need for sample preparation.
  • Modulation frequency f used so that the LED is operated with an AC voltage, in particular sine or square-wave AC voltage with the modulation frequency f.
  • the electronic noise is also reduced and the electrical output of the detectors, downstream of the electronic filters, can be amplified higher with an amplifier.
  • a rectifier is provided for rectifying the filtered detector signals.
  • an override indicator can be connected to the electronic filter and / or the rectifier in order to detect a possible overdrive.
  • the system has an evaluation device for recording the detector signal or signals over a macroscopic time period and means for the time-resolved representation of the fluorescence intensity over the time period around a time-continuous measurement, e.g. to enable process tracking.
  • the light emitting diode may be located remote from the probe tip.
  • the optical fiber at least one optical transmission fiber, which connects the light-emitting diode to the probe tip, in order to forward the excitation light from the light-emitting diode via the transmitting fiber to the probe tip for coupling into the sample, in addition to the receiving fiber.
  • the light-emitting diode may even be integrated into the probe tip due to its small size and directly irradiate the sample, so that it is possible to dispense with the transmitting fiber.
  • detectors photomultiplier or photosemiconductor are used according to a simple embodiment. These are preferably preceded by an optical filter in each case in order to detect a specific wavelength of the fluorescent light. In order to record a complete fluorescence spectrum, but under certain circumstances, a spectrometer with a CCD chip and a CCD chip upstream polychromator can be used.
  • the light source comprises a plurality of light emitting diodes having different excitation light wavelengths.
  • a first excitation light wavelength is selected such that it excites substantially only a first fluorophore and a second excitation light wavelength such that the first and a second fluorophore are excited.
  • the subtraction of the measurement signals can be further improved and thus the signals of the different fluorophores can be prepared even better.
  • the plurality of light-emitting diodes have different emission wavelengths, in each case in the spectral range between 200 nm and 700 nm, preferably between 250 nm and 500 nm, more preferably between 350 nm and 450 nm.
  • the light-emitting diodes have the advantage that they have a relatively narrow emission spectrum with a half-width in the range of about ⁇ 5 nm to ⁇ 20 nm, so that it may be possible to dispense with an optical filter in the transmitting branch wherein at least some of the wavelengths of the different light emitting diodes are selected from the following group of wavelengths: 350 nm, 370 nm, 410 nm, 420 nm, 460 nm.
  • the multi-wavelength fluorescence excitation is carried out with the different wavelengths simultaneously or with a time delay. In the latter case, the fluorescence signals or fluorescence spectra with different excitation light wavelengths can be subtracted even better from each other to select certain fluorophores.
  • the fluorescence sensor comprises a plurality of parallel receiving branches, preferably each with an optical receiving fiber, in each case one to the associated
  • Reception fiber connected detector in particular a semiconductor detector or a photodiode. Since these have a relatively broad detection spectrum, each detector is preferably an optical filter with different Wavelength ranges upstream, so that each detector receives fluorescent light of a predetermined wavelength interval and a simultaneous quantitative detection of fluorescent light of different wavelength intervals and / or a background subtraction is possible. In other words, wavelength-discrete detection of the fluorescent light is performed within predetermined spaced apart intervals or spectral ranges.
  • the evaluation device can then optionally assign them to different fluorophores. It has proven expedient to use optical filters with a bandwidth of in each case less than ⁇ 50 nm, preferably less than ⁇ 20 nm, particularly preferably less than ⁇ 10 nm, in the reception branches.
  • the invention allows both a multiple fluorescence excitation and a multiple fluorescence detection or a multiple fluorescence evaluation.
  • a multi-component analysis involves concentration determination of various biofluorophores (e.g., NADH, NADPH, flavins (FAD, FMN, riboflavin), porphyrins, pyridoxins, collagen, elastin, lipo-pigments, fluorescent amino acids such as
  • the fluorescence emission spectra of the fluorophores in the respective matrices should be known, e.g. is achieved by targeted accumulation and depletion of individual biofluorophore in the respective biological matrix.
  • the simultaneous quantitative detection of the different biofluorophores is thus according to the invention not only with a wavelength-selective spectrometer, but also with the multiple parallel semiconductor detectors in conjunction with the respective optical filters. This is significantly less expensive, more compact and less energy consuming than a spectrometer. This makes it possible, inter alia, for the first time to operate the system with a battery which supplies at least the light source and / or the detectors.
  • Fluorophores known in the respective biological Matrizen or environments it is possible with various multivariate evaluation, to calculate back from the measured fluorescence spectrum of the sample on the concentrations of the individual fluorophores.
  • a fluorescence sensor system is provided with a miniaturized fiber optic fluorescence sensor which allows the fluorescence of biological materials to be measured continuously and quantitatively.
  • Fig. 1 is a schematic representation of a single-channel fiber optic fluorescence sensor system with an LED directly on the probe tip
  • Fig. 2 is a schematic representation of a single-channel fiber optic fluorescence sensor system with LED light coupling via an optical fiber
  • Fig. 3 is a measured yeast culture fluorescence spectrum (after 10 hours of fermentation) from the
  • FIG. 4a shows the time course of NAD (P) H, flavin (FAD, FMN) and porphyrins
  • Fig. 4b shows the time course of
  • Fig. 5 is a schematic representation of the fiber optic
  • Fig. 6 is a representation like Fig. 5, but in addition with m LEDs and m transmitting fibers for excitation with
  • Fig. 7 is a block diagram of the structure for modulated operation of the LED and electronic filtering for a transmitting and receiving branch
  • Fig. 8 is a block diagram of the structure for the modulated operation with square wave signals and integration for a transmitting and receiving branch
  • Fig. 9 fluorescence image of a Hand with actinic keratosis after application of a Metvix® cream
  • Fig. 10 fluorescence spectra showing the increase of
  • FIG. 13 shows a block diagram of the structure for the modulated operation of a fluorescence sensor system with four receiving branches and microcontroller
  • FIG. 14 is a block diagram of the structure for the modulated operation of a
  • Fluorescence sensor system with two receiving branches and differential amplifier.
  • a fiber optic fluorescence sensor system comprising a fluorescence sensor 1 with a dip probe 12 and a detector 14 is shown.
  • the detector 14 comprises a photodiode Dl.
  • a UV LED LEDl emits UV primary light to excite the fluorescence, which in turn causes the emission of secondary fluorescent light 20 from the sample 24.
  • the fluorescent light 20 is emitted from the fluorophores in the sample 24.
  • the incoherent LED LED is disposed within the immersion probe 12 directly to the probe tip 26. This can be done on one
  • the optical waveguide 13 of the immersion probe 12 accordingly comprises only one receiving fiber El which forwards the fluorescent light 20 to the detector 14.
  • the fluorescent light 20 emitted by the sample 24 or the fluorophores in the cells in all directions in space is shifted towards larger wavelengths than the primary or the excitation light.
  • a fraction of this fluorescence emission finally passes via the probe tip 26 and the receiving fiber El into the detector device 14.
  • the detector device 14 is further connected to a computing device 28 for data acquisition, evaluation, storage and display.
  • FIG. 2 shows a fluorescence sensor system in which the excitation light-emitting light-emitting diode LED1 is arranged externally to the immersion probe 12 remote from the probe tip 26.
  • the excitation light of the LED LED is guided to the sample 24 via a transmitting fiber S1 in the optical waveguide 13, which runs parallel to the receiving fiber E1 within the immersion probe 12 as far as the sensor tip 26.
  • the optical fiber probe 12 or its probe tip 26 according to FIG. 2 comes without electrical supply. Therefore, the probe 12 can be temperature stable to about 200 0 C or more designed. This is particularly advantageous for applications that come in contact with biologically active material, because the probe tip or the sensor head 26 can be heated and therefore autoclavable and sterilized. Germs are thereby killed and the sensor 1 can be used repeatedly without further transporting contaminations and infections from site to site.
  • Such fiber optic sensors 1 can be realized in different designs.
  • the probe tip 26 can be made to be intravenously applicable. It is also possible to work with curved capillaries that can be used at measuring sites such as the back of the eye.
  • the probe 12 can have a large length, for example, to be used in large fermenters. Such probes 12 can dip up to 10 meters or more into biological reactors, and yet on the whole Length temperatures up to 200 0 C endure.
  • Another important area of application for the sensors is explosive environments. Here most of the electrical devices can not be used, but with incoherent light operated purely optical probes. According to the Ex protection guideline, care must be taken that a light load of 5 mW / mm 2 is not exceeded.
  • the fluorescence sensor 1 has a broad spectrum of applications in bioanalytics, process monitoring, biomedical fluorescence spectroscopy, medical diagnostics, in particular cancer diagnostics and in drug discovery.
  • a major advantage of fluorescence spectroscopy is that with this
  • Biochemical processes in cells can be followed non-invasively and quantitatively.
  • various chemical substances involved in the metabolism such as NAD (P) H, flavins, porphyrins, etc., which can be excited to fluoresce upon irradiation with UV light or blue light. It turns out that each of these biofluorophores emits a characteristic fluorescent light with a corresponding spectral distribution. If there is a change in the intracellular metabolism as a result of a disease such as cancer, then this has an influence on the
  • Tumor diagnosis eg, by determining the ratio of NAD (P) H to porphyrin fluorescence or the ratio of flavin to porphyrin fluorescence
  • P NAD
  • FIG. 3 illustrates a multi-component analysis using the example of a fluorescence spectrum recorded online during a yeast fermentation in a bioreactor.
  • the total fluorescence spectrum recorded after a fermentation period of ten hours consists essentially of the two components NAD (P) H with an emission maximum at about 470 nm and flavins in one
  • Living cells such as microorganisms (yeast, E. coli, etc.) contain biofluorophores such as NAD (P) H, flavins, porphyrins, etc., whose time course allows conclusions to be drawn on the metabolic status of the cell and the course of the process.
  • biofluorophores such as NAD (P) H, flavins, porphyrins, etc.
  • each reception branch Z1 to Zn in the fluorescence sensor covers a spectral range of approximately 475 nm ⁇ 10 nm (NAD (P) H), and the second reception branch Z2 covers a spectral range of approximately
  • the fluorescence intensities in the individual reception branches or channels Z1 to Z4 are measured and "offset" against each other so that concentration curves for the individual biofluorophores (NAD (P) H, flavins, porphyrins) finally result are shown in Fig. 4a.
  • the porphyrin content (curve 44) can be determined from the remaining intensity at about 630 nm. In this type of evaluation, it is therefore sufficient to measure the fluorescence intensities at specific wavelengths (in the example: at 470 nm, 530 nm, 630 nm) in order to determine the corresponding fluorophore concentrations.
  • Fig. 5 shows a fluorescence sensor system 1 having a plurality of reception branches, each reception branch Z1 to Zn having a receiving optical fiber El to En.
  • the fluorescent light emitted by the sample is coupled into these receiving fibers El to En.
  • At the end of each receiving fiber El to En there is an optical spectral filter Fl to Fn, which transmits only light of a specific wavelength or a specific wavelength range.
  • the photo-detectors D1 to Dn which are e.g. Photodiodes or photomultiplier (photomultiplier) acts.
  • Fluorescence intensities at the wavelengths specified by the filters F1 to Fn occur at the same time, so that the fluorophore composition of the sample is correctly determined even in rapid biological processes.
  • Fig. 5 When the embodiment shown in Fig. 5 is e.g. With four reception branches Z1 to Z4 with optical interference or bandpass filters at 470 nm, 530 nm, 630 nm and 700 nm, the selective quantitative and continuous measurement and subtraction, including offset correction, explained with reference to FIGS. 3 to 4b can be performed with the sensor , It will be apparent to those skilled in the art that also optical edge filters, e.g. Longpass and / or shortpass filters can be used. These can in particular satisfy in combination with a limited spectral reception range of the photodiodes.
  • optical edge filters e.g. Longpass and / or shortpass filters
  • FIG. 6 shows a further embodiment of the invention with a plurality of emitting light-emitting diodes LED1 to LEDm, which have different emission wavelengths for fluorescence excitation and respectively associated transmitting fibers S1 to Sm. This embodiment is particularly advantageous when the
  • Multi-component analysis is made difficult by the fact that the fluorophores have strongly overlapping fluorescence bands in the sample to be analyzed.
  • the LEDl specifically only the fluorophore with the long-wave fluorescence excitation spectrum can be excited and determined.
  • the concentration can now be determined since the proportion of the first-mentioned fluorophore can be subtracted from the measured fluorescence intensity.
  • several or all light-emitting diodes LED1 to LEDm can be coupled into a transmitting fiber.
  • the LEDs I to LEDm can also be arranged in the probe tip if the probe 12 does not have to be optimized for miniaturization.
  • the LED LEDl is operated with a sinusoidal AC voltage.
  • the LED is operated by an oscillator 62 with a predetermined frequency f, which is fed by a common voltage supply 64.
  • the fluorescent light 20 excited thereby is likewise sinusoidally modulated and detected by the detector 14 with the photodiode D1.
  • the output signal of the photodiode D 1 is largely proportional to the received fluorescence light intensity, so that the detector signal is also modulated at the frequency f.
  • the bandpass filter 66 is connected to the detector Dl and adjusted so that it passes only the alternating component of the detector signal with the frequency f. Thus signals generated by room light or constant light are suppressed.
  • the suppression can be effected, for example, by bandpass filtering with a slope of preferably 20 to 60 dB / decade.
  • the modulation frequency f is preferably chosen between 1 kHz and 1 MHz, more preferably between 2 kHz and 100 kHz.
  • An amplifier 68 is connected to the bandpass filter 66 to amplify the filtered signal.
  • a rectifier 70 is connected to the amplifier 68 to rectify the amplified signal. The rectified signal is sent to the evaluation and display device 28 for further
  • An overdrive indicator 72 is connected to the output of the detector 14 and the output of the amplifier 68.
  • the power supply 64 feeds all components.
  • Fluorescence light 20 the actual measurement signal leads, can perform. Especially in medical applications, e.g. In endoscopy, this makes it possible for the physician to visually inspect the tissue to be examined in parallel with the fluorescence measurements.
  • Fig. 8 shows a block diagram for a modulated operation of the system 1 with square wave signals. That the modulation is realized in the form of a clocking.
  • Integrator circuit used.
  • the integrator circuit combines very low noise with the possibility of high gain for the incoming signals.
  • the LED is driven with a clocked voltage signal in the form of a periodic square wave signal of a period of, for example, between 5 ms and 2 s (on-time) and then switched dark for a further period of time (off-time).
  • the operating voltage of the LED LEDl is generated by a voltage supply 80 which is clocked by a clock generator 82 with the clock signal Tl becomes.
  • the excitation light emitting LED LEDl is supplied clocked and emits pulsed excitation light.
  • the output signal of the detector is measured coincident with the voltage signal, more precisely integrated during the duration of the on-time of the voltage signal by means of the integrator 84, the integrator 84 being connected to the light-emitting diode LED1.
  • the useful signal is then determined as the difference between the integrated output signal during the on-time and the off-time of the LED.
  • the integrator 84 embodies a means for
  • the integrator 84 is also connected to the clock generator 82 and is supplied by the latter with the clock signal T2, such that the light-emitting diode D1 and the integrator 84 are controlled with the same clock.
  • the output signal of the integrator 84 is amplified by means of an amplifier 86 and digitized by means of an A / D converter 88, in order subsequently to be further processed digitally by the evaluation and display device 28.
  • a temporally varied illumination is a pulsed mode of operation of the LED.
  • This has the advantage that you get a high signal at the time of the pulse.
  • the combination with a fast detector makes sense, e.g. a charge amplifier in which the first stage amplifies low and a second amplification stage high. While it is true that the light intensity of light emitting diodes is not proportional to the supply current at high and short term loads, light emitting diodes, e.g. for one
  • Continuous operation with 20 mA are designed, with up to 10 A short-term load and then reach a multiple of short-term light emission.
  • the purging time is preferably chosen to be longer than 100 ns in order to avoid interference with the decay behavior of the fluorescence, so that a "quasi-continuous" suggestion can be spoken.
  • the marker can be administered intravenously, orally or externally, e.g. be applied in the form of an ointment.
  • the marker is a precursor, eg 5-aminolevulinic acid (5-ALA) or an ester of 5-ALA Typical concentrations for use are 20 to 40 mg per kg body weight, in the animal model also up to 150 mg / After a few hours, protoporphyrin IX (precursor of heme) forms in the cells, whereby - depending on the precursor substance - a higher, ie specific PPIX accumulation in tumor cells is observed PPIX has a high light absorption in the blue spectral range at about 405 When PPIX is irradiated with blue light, some of the absorbed photons are converted to fluorescence light (emission maximum at 635 nm), which results in a visual contrast of the tumorous tissue to the surrounding healthy tissue.
  • 5-ALA 5-aminolevulinic acid
  • Typical concentrations for use are 20 to 40 mg
  • an aminolevulinic acid-containing ointment was externally applied to a back of the hand with actinic keratosis as a marker drug.
  • actinic keratosis is e.g. available as Metvix® cream.
  • the photosensitizer protoporphyrin IX selectively accumulates in tumorous tissue.
  • the spectra were measured immediately after application (0 hours) and after 1, 2 and 3 hours.
  • the superimposed endogenous fluorescence (collagen, NAD (P) H, flavins etc.) is measured at two wavelengths in the spectral ranges of the reference channels 1 and 2 and, if necessary. after mathematical factor calculation, subtracted from the fluorescence in the spectral range to be measured at 635 nm (measuring channel).
  • the three non-overlapping spectral regions have a width of about ⁇ 10 nm.
  • a spectral range to be measured is used for the fluorophore to be detected (in this case protoporphyrin IX) and two background spectral ranges (so-called reference channels 1 and 2).
  • PPIX In light absorption, PPIX is first excited from S 0 to Si. By "intersystem crossing", a small part of the PPIX molecules goes into the triplet state Ti. Since molecular oxygen O 2 has a triplet ground state, the excitation energy of the PPIX can now be transferred to O 2 in the Ti state
  • an ointment containing aminolaevulinic acid was applied to a back of the hand with actinic keratosis, such as the back of the hand shown in FIG.
  • actinic keratosis such as the back of the hand shown in FIG.
  • the protoporphyrin concentration in the dysplastic tissue reaches its maximum (see Fig. 10), so that it is possible to start the therapeutic light irradiation (for example by means of the Aktilite® light source) for several minutes.
  • the photosensitizer PPIX degrades over time via the intermediate product photoprotoporphyrin (PPP) (emission maximum at about 675 nm).
  • PPP intermediate product photoprotoporphyrin
  • Fig. 11 shows a fluorescence spectrum before and during the PDT. There is a decrease in protoporphyrin IX fluorescence and the formation of the degradation product photo-protoporhyrin during PDT compared to prior to PDT.
  • the background from the reference spectral regions is subtracted from the fluorescence intensities to be detected in the spectral regions around 635 nm and 675 nm (here protoporphyrin IX and photo-protoporphyrin, measuring channels 1 and 2) by means of the circuit according to FIG.
  • four reception branches Z1 to Z4 (measuring channels 1 and 2, reference 1 and 2) are used.
  • FIG. 13 shows a block diagram with four reception branches Z 1 to Z 4 for carrying out the measurement explained with reference to FIG. 11.
  • the four reception branches Z1 to Z4 are each designed in accordance with FIG. 7, but each detector D1 to D4 is preceded by an optical filter F1 to F4.
  • the evaluation including background subtraction takes place in a common evaluation device 28 in the form of a microcontroller.
  • FIG. 14 shows a block diagram of an alternative embodiment with two reception branches Z1 and Z2 according to FIG. 7, wherein the reception branch Z1 processes a background signal and the reception branch Z2 processes a measurement signal.
  • An adjustment amplifier or attenuator 28a for example, which can be set by means of a potentiometer, serves to equalize different sensitivities of the two reception branches Z1 and Z2. Subsequently, the two signals in one Differential amplifier 28b fed and thus amplifies the difference signal between the measurement and background signal to cause by means of the evaluation device 28, a subtraction of the background signal from the measurement signal.
  • Fluorescence sensor system e.g. According to FIG. 5, a cancer diagnosis without a marker is even possible. This is due to the following effect.
  • porphyrins seem to accumulate - even without any marker. When illuminated with short-wave light, these fluoresce in the spectral range approximately at 630 nm.
  • a spectrum of this - endogenous - fluorescence is shown in FIG. 12 using the example of a glioblastoma.
  • the spectral range to be measured is thus about 630 nm, but is very much superimposed on the fluorescence background.
  • the fluorescence background is about one order of magnitude higher than the fluorescence intensity of the porphyrins to be measured.
  • the measurement signal of the background fluorescence intensity (reference channel) is subtracted from the measurement signal of the fluorescence intensity to be measured.
  • this characteristic porphyrin fluorescence is not observed, so that a diagnosis of certain malignant tumors is possible.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem zur Fluoreszenzuntersuchung einer, insbesondere biologischen, Fluorophore enthaltenden Probe, Verwendungen des faseroptischen Fluoreszenzsensorsystems und ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Fluorophoren in der Probe. Das Anregungslicht wird zeitlich variiert und das Ausgangssignal des Fluoreszenzdetektors wird, angepasst an die zeitliche Variation des Anregungslichtes, elektronisch weiterverarbeitet, um eine Gleichlichtunterdrückung zu erzielen. Es wird ferner eine Mehrkomponentenanalyse durchgeführt.

Description

Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem
Beschreibung
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein faseroptisches
Fluoreszenzsensorsystem zur Fluoreszenzuntersuchung einer, insbesondere biologischen, Fluorophore enthaltenden Probe, Verwendungen des faseroptischen Fluoreszenzsensorsystems und ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Fluorophoren in der Probe .
Hintergrund der Erfindung Fluoreszenzspektroskopie ist ein wirksames Verfahren zur Untersuchung der biochemischen und morphologischen Eigenschaften von Gewebe und anderen biologischen Proben. Insbesondere ist die Fluoreszenzspektroskopie schnell, nicht invasiv und erlaubt quantitative Messungen, so dass z. B. Gewebeeigenschaften, wie Metabolismusraten, Vaskularität , intravaskularer Sauerstoffgehalt und Änderungen in der Gewebemorphologie untersucht werden können. Derzeit wichtige Anwendungsgebiete sind die Untersuchung von karzinösem Zellwachstum und der Alzheimerschen Krankheit. Ein weiteres wichtiges Anwendungsgebiet ist die Prozesskontrolle bei Fermentationen, um nur einige Beispiele zu nennen.
Bei der Fluoreszenzspektroskopie werden sogenannte Fluorophore in einer Probe mit insbesondere kurzwelligem Licht bestrahlt, um deren Fluoreszenz anzuregen. Die Anregungsmaxima liegen dabei typischerweise im UV/Blau- Bereich zwischen 200 und 500 nm und die Maxima der Fluoreszenzemission im Bereich zwischen 280 und 700 nm.
Endogene Fluorophore sind z.B. Aminosäuren, wie Tryptophan und Tyrosin, strukturelle Proteine, wie Kollagen oder
Elastin, Enzyme und Koenzyme, wie FAD, Flavine, NADH und NADPH, Vitamine, insbesondere Vitamin A, K und D, Vitamin B6-Bestandteile, Lipide sowie Porphyrine. Eine Übersicht über die Fluoreszenzspektroskopie findet sich in dem Artikel „Fluorescence Spectroscopy in Vivo" von Nirmala
Ramanujam in „Encyclopediä of Analytical Chemistry", R. A. Meyers, Seiten 20-56, Verlag John Wiley and Sons Ltd., Cicester, 2000.
Bislang wurde die faseroptiosche Fluoreszenzanregung entweder mit Gasentladungslampen, wie Xenon- oder Quecksilber-Dampflampen oder kurzwelligen Lasern durchgeführt. Dabei wird das Anregungslicht über eine oder mehrere optische Fasern in die Probe eingekoppelt und das von den Fluorophoren in der Probe emittierte
Fluoreszenzlicht über eine oder mehrere optische Fasern ausgekoppelt, um anschließend mit einem Spektrographen nachgewiesen zu werden.
Nachteilig bei der Verwendung von Xenon- oder
Quecksilberdampf-Lampen ist, dass diese schwierig zu bedienen und störungsanfällig sind. Ferner erzeugen diese ein breites Emissionsspektrum, so dass typischerweise optische Filter zur Filterung des von den Lampen emittierten Lichtes verwendet werden, was wiederum thermische Probleme verursacht. Ferner bergen diese Lampen Sicherheitsrisiken durch die verwendete Hochspannung und in Bezug auf eine Explosionsgefahr. Als Alternative zu den Gasentladungslampen werden Laser, wie z. B. Stickstoff-Laser oder Laser-gepumpte Dye-Laser, verwendet. Diese sind jedoch ebenfalls kostenintensiv und schwierig zu bedienen. Ferner bestehen strenge Sicherheitsauflagen für die Anwendung von derartigen Lasern, insbesondere im medizinischen Bereich.
Aus der DE 35 18 527 C2 ist ferner ein Fluorometer mit einer gepulsten LED und einem Photodetektor bekannt, welches zwischen schwachen Fluoreszenzsignalen und überlagerten Signalen unterscheidet. Dieses Fluorometer ist jedoch für die Beobachtung lichtinduzierter Chlorophyllfluoreszenz-Veränderungen ausgebildet. Eine spektral differenzierte Messung ist nicht vorgesehen. Nachteilig ist daher, dass sich das Fluorometer nur für Untersuchungen eignet, bei welchen ein prominentes Flurozenzsignal erzeugt wird. Ferner scheint dieses Fluorometer nicht für die medizinische Anwendung oder die Online-Prozessverfolgung geeignet und erfordert eine komplizierte Signalverarbeitung.
Allgemeine Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung hat sich daher die Aufgabe gestellt, ein faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem mit gutem Nutz-zu- Störsignal-Verhältnis bereit zu stellen, welches auch unter Alltagsbedingungen bei Umgebungslicht betrieben werden kann und gleichzeitig zur Untersuchung von Proben mit wenig ausgeprägten oder durch Untergrund überlagerten Fluoreszenzspektren geeignet ist.
Noch eine Aufgabe der Erfindung ist es, ein faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem bereit zu stellen, welches die Nachteile bekannter Systeme, wie z. B. in der Einleitung beschrieben, meidet oder zumindest mindert. Die Aufgabe der Erfindung wird in überraschend einfacher Weise bereits durch den Gegenstand der unabhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen definiert.
Erfindungsgemäß wird ein faseroptisches
Fluoreszenzsensorsystem zur kontinuierlichen in-situ oder in-line Fluoreszenzuntersuchung einer, insbesondere biologischen, Fluorophore enthaltenden Probe bereitgestellt. In der Fachwelt wird auch von in-situ Fluorometrie gesprochen.
Das System umfasst einen Fluoroszenzsensor mit einer Lichtquelle, welche Anregungslicht oder Primärlicht zur
Anregung von Fluoreszenz in der Probe emittiert, mit einer faseroptischen Sonde, über deren Sondenspitze das Anregungslicht in die Probe eingekoppelt und das von den Fluorophoren in der Probe emittierte - sekundäre - Fluoreszenzlicht ausgekoppelt wird, mit einem
Lichtwellenleiter und mit einer Detektoreinrichtung. Die Lichtquelle emittiert Licht innerhalb eines schmalen Intervalls im Spektralbereich zwischen 200 und 700 nm. Das von der Lichtquelle emittierte und aus der Sonde in die Probe austretende Anregungslicht ist jedoch besonders bevorzugt ultraviolettes bis blaues Licht, weshalb auch von UV/VIS-Fluorometrie gesprochen wird. Besonders bevorzugt wird UV-Licht oder blaues Licht mit einer Wellenlänge kleiner oder gleich 470 nm, insbesondere im Bereich zwischen 350 nm und 380 nm verwendet.
Die Detektoreinrichtung umfasst zumindest einen Detektor, insbesondere einen opto-elektrischen Konverter zum Nachweisen des Fluoreszenzlichtes. Der Lichtwellenleiter umfasst zumindest eine optische Empfangsfaser in Form einer Glasfaser, gegebenenfalls aus Quarzglas. Der Detektor ist mittels der Empfangsfaser mit der Sondenspitze verbunden, um das Fluoreszenzlicht von der Sondenspitze über die Empfangsfaser an den Detektor weiterzuleiten.
Der Fluoreszenzsensor umfasst somit eine faseroptische Messsonde, z.B. eine Tauchsonde für Fermentationsmessungen oder ein faseroptisches Endoskop für biomedizinische Anwendungen. Derartige Glasfasersensorsysteme sind in vorteilhafter Weise von kompakter Bauweise. Die
Sondenspitze oder der Sensorkopf kann mit einem Durchmesser von kleiner oder gleich 5 mm, insbesondere im medizinischen Bereich von kleiner oder gleich 1 mm gebaut werden. Dabei haben die jeweiligen Glasfasern einen Außendurchmesser von typischer Weise 0,3 mm.
Der Detektor erzeugt ein kontinuierliches, elektrisches Ausgangssignal, dessen Höhe ein Maß für die Intensität des Fluoreszenzlichtes ist, um das Fluoreszenzlicht kontinuierlich und quantitativ zu messen'. Mit anderen
Worten ist die Höhe des elektrischen Ausgangssignals eine Funktion der Intensität des gemessenen Fluoreszenzlichtes.
Vorzugsweise umfasst die Lichtquelle zumindest eine Leuchtdiode. Besonders bevorzugt besteht die Lichtquelle aus einer inkohärenten Leuchtdiode, einer sogenannten LED, einer Laserdiode oder einem diodengepumpten Laser zum Erzeugen des Anregungslichtes. Diese halbleiterbasierten Lichtquellen bieten den Vorteil, dass ihr Licht bei geringem Energieverbrauch und hoher Lebensdauer und
Stabilität optimal in die optische Faser eingekoppelt werden kann und sie schnell modulierbar oder pulsbar sind. Die halbleiterbasierten Lichtquellen zeichnen sich ferner gegenüber einer Gasentladungslampe durch einen sehr geringen Stromverbrauch und eine kleine Bauform aus, wodurch die thermische Belastung der Komponenten verringert und eine Miniaturisierung des Fluoreszenzsensors erzielt wird. Ferner sind sie kostengünstig und nahezu wartungsfrei .
Weiter ermöglicht der schmalbandige Spektralbereich der halbleiterbasierten Lichtquellen, z.B. inkohärente LEDs, Laserdioden oder diodengepumpte Laser von kleiner als ± 20 nm eine maßgeschneiderte Fluoreszenzanregung. Es kann daher im Sendezweig vorzugsweise auf optische Filter oder Monochromatoren verzichtet werden, d. h. mit dem ungefilterten Primärlicht angeregt werden, und dennoch eine gezielte Fluoreszenzanregung bestimmter Fluorophore erreicht werden. Falls dennoch eine weitere Verschmälerung des Anregungsspektrums gewünscht ist, kann zusätzlich ein optisches Filter in die Sendefaser eingebaut werden, wobei dessen thermische Belastung gegenüber einer Gasentladungslampe aber erheblich reduziert ist.
Die Verwendung von halbleiterbasierten Lichtquellen verursacht in Verbindung mit den Gegebenheiten bei der Fluoreszenzspektroskopie jedoch ein zusätzliches gravierendes Problem. Aufgrund der Lichtschwäche insbesondere von UV- oder Blaulicht-Leuchtdioden ist das Umgebungslicht häufig relativ so stark, dass bei ersten Versuchen eine Abdunkelung des Umgebungslichts notwendig war. Dies mag bei Labormessungen noch akzeptabel sein, ist aber insbesondere bei Messungen am Patienten sehr störend.
Daher wird das von der Lichtquelle emittierte
Anregungslicht zeitlich variiert, insbesondere mit einer Modulationsfrequenz f vorzugsweise zeitkontinuierlich amplitudenmoduliert. Hierzu wird die Eingangsspannung der Lichtquelle zeitlich verändert, insbesondere moduliert, so dass das Anregungslicht von der Lichtquelle mit der Modulationsfrequenz amplitudenmoduliert emittiert wird. Die zeitliche Veränderung wird dabei langsam gegenüber dem Abklingverhalten der Fluoreszenz gewählt, insbesondere wird die Modulationsfrequenz klein gegen die inverse Abklingzeit des Fluoreszenzlichtes gewählt, wobei letztere typischerweise einige Nanosekunden beträgt, also insbesondere kleiner als 10 MHz. Dadurch beeinflusst das Abklingverhalten des Fluoreszenzlichtes den zeitlichen Verlauf des Fluoreszenzlichtes nicht oder nicht wesentlich. Es wird also eine sogenannte steady-state-Messung durchgeführt, bei der das von der Probe emittierte sekundäre Fluoreszenzlicht aber mit der Modulationsfrequenz f zeitkontinuierlich amplitudenmoduliert ist. Bevorzugt wird mit einer sinusförmigen, rechteckigen oder ähnlichen Modulationsfunktion angeregt. Somit können Zeitscans, insbesondere real-time-Messungen durchgeführt werden. Die Lichtquelle kann jedoch auch gepulst betrieben werden. Mittels der zeitlichen Variation wird, wie weiter unten erläutert, eine Gleichlichtunterdrückung durchgeführt, um z.B. Umgebungslicht herauszufiltern .
Problematisch bei vielen medizinischen Anwendungen oder Prozessüberwachungen ist aber ferner, dass teilweise mehrere Fluorophore enthalten sind die ähnlich hohe und überlagerte Messsignale erzeugen und teilweise ein hoher Untergrund an Fluoreszenzlicht enthalten ist. Da diese Signale durch die Lichtquelle des Systems erzeugt werden, weist das hierdurch erzeugte Signal das gleiche zeitliche Verhalten wie das eigentliche Messsignal auf und kann also zumindest nicht vollständig mittels der Gleichlichtunterdrückung eliminiert werden.
Daher wird zusätzlich zu der Gleichlichtunterdrückung eine spektrale Analyse des Fluoreszenzlichtes vorgenommen. Erfindungsgemäß weist das Fluoreszenzsensorsystem zwei oder eine Mehrzahl von Empfangszweigen auf, welche zum zeitlich und spektral aufgelösten quantitativen Nachweis des Fluoreszenzlichtes ausgebildet sind. D.h. jeder Empfangszweig misst einen fest definierten Spektralbereich des Fluoreszenzlichtes, wobei die Spektralbereiche der verschiedenen Empfangszweige vorzugsweise nicht überlappen. Somit wird das Fluoreszenzlicht in dem jeweiligen Spektralbereich selektiv und quantitativ gemessen. Jeder Empfangszweig umfasst hierzu einen Detektor, welcher jeweils ein Ausgangssignal erzeugt, welches ein Maß für die Intensität des Fluoreszenzlichtes in dem zugehörigen Spektralbereich ist.
Ferner ist jedem der Detektoren ein elektronisches Mittel zur Gleichlichtunterdrückung zugeordnet, das jeweils an die zeitliche Variation der Lichtemission angepasst ist, so dass der erste Empfangszweig ein gleichlichtunterdrücktes quantitatives erstes Messsignal der Intensität des Fluoreszenzlichtes in dem ersten Spektralbereich und der zweite Empfangszweig ein gleichlichtunterdrücktes quantitatives zweites Messsignal der Intensität des Fluoreszenzlichtes in dem zweiten Spektralbereich erzeugt und somit eine gleichlichtunterdrückte quantitative spektral aufgelöste Auswertung des Fluoreszenzlichtes ermöglicht ist. Vorzugsweise sind die Spektralbereiche mittels optischer Filter unterschiedlicher Wellenlängenintervalle vor den Detektoren fest vorgegeben. Für bestimmte Anwendungen kann jedoch auch genügen, Detektoren mit spektral beschränkter Nachweiseffizienz einzusetzen. Die Breite der Spektralbereiche beträgt vorzugsweise weniger ± 50 nm, besonders bevorzugt zwischen ± 2 nm und ± 20 nm. Somit kann eine in Bezug auf das nachzuweisende Fluorophor außerordentlich empfindliche und gleichzeitig auf Störlicht und zwar sowohl Umgebungslicht als auch moduliertes aber unerwünschtes Fluoreszenzlicht aus der Probe unempfindliche Messung durchgeführt werden, welche sogar zeitlich aufgelöst sein kann, um eine präzise und zuverlässige Prozessverfolgung zu gestatten. Dies ist z.B. bei der pathogenen Anreicherung von Flurophoren in tumorösem Gewebe von großem Vorteil.
Vorzugsweise wird die spektrale Auflösung des Systems zum Untergrundabzug verwendet. Hierfür wird der erste Spektralbereich so gewählt, dass das erwartete Fluoreszenzmaximum eines ersten in der Probe nachzuweisenden Fluorophors abgedeckt ist. Der zweite
Spektralbereich wird so gewählt, dass er einen erwarteten Untergrundbereich des Fluoreszenzspektrums abdeckt. Ferner umfasst das System einen Differenzverstärker in welchen das erste und zweite Messsignal eingespeist werden, so dass nur die Differenz beider Signale verstärkt wird oder der Unterschied der beiden Kanäle wird mittels eines Mikrocontrollers ausgewertet. Somit wird ein gleichlichtunterdrücktes und spektral untergrundbereinigtes Messsignal erhalten, welches ein Maß für die Intensität des Fluoreszenzlichtes des nachzuweisenden Fluorophors ist.
Erfindungsgemäß wird das Ausgangssignal der Detektoren in dem jeweiligen Empfangszweig angepasst an die Art und Periode der zeitlichen Veränderung des Anregungslichts elektronisch verarbeitet, um eine Gleichlichtunterdrückung in jedem Empfangszweig zu erzielen.
Besonders einfach ist es, jedem Detektor ein an die Modulationsfrequenz angepasstes elektronisches Filter nachzuschalten, um das Ausgangssignal jedes Detektors zu filtern. Der Frequenzbereich der Filter, insbesondere Bandpassfilter, ist an die Modulationsfrequenz angepasst, so dass im Wesentlichen nur modulierte Signalanteile durchgelassen und Gleichlicht- oder Gleichsignalanteile herausgefiltert werden. Insbesondere weisen dieBandpassfilter somit eine Mittenfrequenz etwa gleich der Modulationsfrequenz f auf. Vorteilhafterweise können hierdurch also Gleichlicht- oder anders modulierte Fremdlichtanteile, z.B. von Leuchtstoffröhren . unterdrückt werden, so dass das System auch bei hellem Umgebungslicht eingesetzt werden kann. Ferner ist hiermit ein automatischer Nullabgleich des Systems möglich.
Die Modulationsfrequenz beträgt vorzugsweise zwischen 200 Hz und 10 MHz, besonders bevorzugt zwischen 1 kHz und 1 MHz, so dass insbesondere auch netzfrequentes Umgebungslicht elektronisch herausgefiltert wird. Damit wird die insbesondere für eine intrinsische Fluoreszenzmessung notwendige hohe Empfindlichkeit gewährleistet, womit sich der Sensor für die Zellforschung eignet. Es wurde gefunden, dass die Lichtintensität von Leuchtdioden mit hoher Lichtleistung dann ausreichend ist, . um Fluoreszenzmessungen an biologischen Materialien (Zellsuspensionen, Gewebe, Lösungen usw.) durchführen zu können. Da sich je nach Stoffwechsel die Fluorophor-
Zusammensetzung in biologischen Materialien bzw. Zellen ändert, ist es mit Hilfe dieses Fluoreszenzsensors und dem Auswerteverfahren möglich, Rückschlüsse auf den Zeilzustand zu ziehen. Das System eignet sich daher insbesondere zur on-line Bioprozessverfolgung oder -Überwachung, z.B. von
Fermentationsprozessen, für die medizinische Diagnose, für die Krebsdiagnose und für die Bioanalytik. Mit der Erfindung ist ein einfaches, kostengünstiges und anwenderfreundliches System für Fluoreszenzmessungen an flüssigen und festen Proben ohne die Notwendigkeit der Probenvorbereitung geschaffen worden.
Besonders einfach wird ein Oszillator zur Modulation der Betriebsspannung der Leuchtdiode mit der
Modulationsfrequenz f verwendet, so dass die Leuchtdiode mit einer Wechselspannung, insbesondere Sinus- oder Rechteck-förmigen Wechselspannung mit der Modulationsfrequenz f betrieben wird.
Aufgrund der Modulation der LED-Lichtemission in Kombination mit der anschließenden Filterung wird auch das elektronische Rauschen reduziert und das elektrische Ausgangssignal der Detektoren, signalabwärts der elektronischen Filter, kann mit einem Verstärker höher verstärkt werden.
Ferner ist bevorzugt signalabwärts der elektronischen Filter,- besonders bevorzugt signalabwärts des Verstärkers je ein Gleichrichter zur Gleichrichtung der gefilterten Detektorsignale vorgesehen.
Weiter vorteilhaft kann eine Übersteuerungsanzeige mit dem elektronischen Filter und/oder dem Gleichrichter verbunden sein, um eine mögliche Übersteuerung zu detektieren.
Ferner besitzt das System eine Auswerteeinrichtung zur Aufzeichnung des oder der Detektorsignale über einen makroskopischen Zeitraum und Mitteln zur zeitaufgelösten Darstellung der Fluoreszenzintensität über den Zeitraum um eine zeitkontinuierliche Messung, z.B. zur Prozessverfolgung zu ermöglichen.
Die Leuchtdiode kann entfernt von der Sondenspitze angeordnet sein. In diesem Fall weist der Lichtwellenleiter neben der Empfangsfaser zumindest eine optische Sendefaser auf, welche die Leuchtdiode mit der Sondenspitze verbindet, um das Anregungslicht von der Leuchtdiode über die Sendefaser zur Einkopplung in die Probe an die Sondenspitze weiterzuleiten. Alternativ kann die Leuchtdiode aufgrund ihrer geringen Größe sogar in die Sondenspitze integriert sein und direkt die Probe bestrahlen, so dass auf die Sendefaser verzichtet werden kann.
Als Detektoren werden gemäß einer einfachen Ausführungsform Photomultiplier oder Photohalbleiter verwendet. Diesen ist bevorzugt jeweils ein optisches Filter vorgeschaltet, um eine spezifische Wellenlänge des Fluoreszenzlichtes zu detektieren. Um ein vollständiges Fluoreszenzspektrum aufzunehmen, kann aber unter Umständen ein Spektrometer mit einem CCD-Chip und einem dem CCD-Chip vorgeschalteten Polychromator eingesetzt werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine multiple Fluoreszenzanregung oder
Multiwellenlängenfluoreszenzanregung durchgeführt, um unterschiedliche Fluorophore gezielt anzuregen. Bei dieser Ausführungsform umfasst die Lichtquelle eine Mehrzahl von Leuchtdioden mit unterschiedlichen Anregungslicht- Wellenlängen. Z. B. wird eine erste Anregungslicht- Wellenlänge derart ausgewählt, dass sie im Wesentlichen lediglich ein erstes Fluorophor anregt und eine zweite Anregungslicht-Wellenlänge derart, dass das erste und ein zweites Fluorophor angeregt werden. Hiermit kann die Subtraktion der Messsignale weiter verbessert werden und somit die Signale der unterschiedlichen Fluorophore noch besser herauspräpariert werden. Vorzugsweise haben die mehreren Leuchtdioden also unterschiedliche Emissionswellenlängen jeweils im Spektralbereich zwischen 200 nm und 700 nm, vorzugsweise zwischen 250 nm und 500 nm, besonders bevorzugt zwischen 350 nm und 450 nm. Die Leuchtdioden haben den Vorteil, dass sie ein relativ enges Emissionsspektrum mit einer Halbwertsbreite im Bereich von etwa ± 5 nm bis ± 20 nm aufweisen, so dass unter Umständen auf ein optisches Filter im Sendezweig verzichtet werden kann, wobei zumindest einige der Wellenlängen der unterschiedlichen Leuchtdioden aus der folgenden Gruppe von Wellenlängen ausgewählt sind: 350 nm, 370 nm, 410 nm, 420 nm, 460 nm.
Die Multiwellenlängenfluoreszenzanregung wird mit den unterschiedlichen Wellenlängen gleichzeitig oder zeitversetzt durchgeführt. In letzterem Fall können die Fluoreszenzsignale oder Fluoreszenzspektren mit unterschiedlichen Anregungslichtwellenlängen noch besser voneinander subtrahiert werden, um bestimmte Fluorophore zu selektieren .
Es ist jedoch auch möglich, unterschiedliche Leuchtdioden mit unterschiedlichen Modulationsfrequenzen zu modulieren und die Fluoreszenzsignale mit entsprechenden unterschiedlichen elektronischen Filtern wieder zu trennen und/oder unterschiedliche Pulsformen zu verwenden.
Erfindungsgemäß wird also eine gleichzeitige Messung bei unterschiedlichen Wellenlängen mit mehreren parallelen Empfangszweigen durchgeführt. Hierzu umfasst der Fluoreszenzsensor eine Mehrzahl von parallelen Empfangszweigen, vorzugsweise mit jeweils einer optischen Empfangsfaser, jeweils einem an die zugehörige
Empfangsfaser angeschlossenen Detektor, insbesondere einem Halbleiterdetektor oder einer Photodiode. Da diese ein relativ breites Nachweisspektrum besitzen, wird bevorzugt jedem Detektor ein optisches Filter mit unterschiedlichen Wellenlängenbereichen vorgeschaltet, so dass jeder Detektor Fluoreszenzlicht eines vorbestimmten Wellenlängenintervalls empfängt und eine gleichzeitige quantitative Erfassung von Fluoreszenzlicht unterschiedlicher Wellenlängenintervalle und/oder ein Untergrundabzug ermöglicht ist. Mit anderen Worten wird ein wellenlängendiskreter Nachweis des Fluoreszenzlichtes innerhalb vorbestimmter voneinander beabstandeter Intervalle oder Spektralbereiche durchgeführt. Die Auswerteeinrichtung kann diese dann ggfs. unterschiedlichen Fluorophoren zuordnen. Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, in den Empfangszweigen optische Filter mit einer Bandbreite von jeweils kleiner als ± 50 nm, bevorzugt kleiner als ± 20 nm, besonders bevorzugt kleiner als ± 10 nm zu verwenden.
Die Erfindung ermöglicht also sowohl eine multiple Fluoreszenzanregung als auch einen multiplen Fluoreszenznachweis bzw. eine multiple Fluoreszenzauswertung .
Erfindungsgemäß wird demnach eine Mehrkomponentenanalyse bereitgestellt, welche eine Konzentrationsbestimmung von verschiedenen Biofluorophoren (z.B. NADH, NADPH, Flavine (FAD, FMN, Riboflavin) , Porphyrine, Pyridoxine, Kollagen, Elastin, Lipo-Pigmente, fluoreszierende Aminosäuren wie
Tryptophan usw.) in der Probe erlaubt. Hierzu sollten die Fluoreszenzemissionsspektren der Fluorophore in den jeweiligen Matrizes (Umgebungen) bekannt sein, was z.B. durch gezieltes An- und Abreichern einzelner Biofluorophore in der jeweiligen biologischen Matrix erreicht wird.
Die gleichzeitige quantitative Erfassung der unterschiedlichen Biofluorophore ist erfindungsgemäß also nicht nur mit einem wellenlängenselektiven Spektrometer, sondern auch mit den mehreren parallelen Halbleiterdetektoren in Verbindung mit den jeweiligen optischen Filtern ermöglicht. Dies ist deutlich kostengünstiger, kompakter und stromsparender als ein Spektrometer . Dadurch ist es unter anderem erstmals möglich, das System mit einer Batterie zu betreiben, welche zumindest die Lichtquelle und/oder die Detektoren versorgt.
Wird ein Fluoreszenzspektrum aufgenommen und sind die Fluoreszenzemissionsspektren der zu bestimmenden
Fluorophore in den jeweiligen biologischen Matrizen bzw. Umgebungen bekannt, so ist es mit verschiedenen multivariaten Auswerteverfahren möglich, aus dem gemessenen Fluoreszenzspektrum der Probe auf die Konzentrationen der einzelnen Fluorophore zurückzurechnen.
Zusammenfassend wird demgemäß ein Fluoreszenzssensorsystem mit einem miniaturisierten faseroptischen Fluoreszenzsensor bereitgestellt, welches es gestattet, die Fluoreszenz von biologischen Materialien kontinuierlich und quantitativ zu messen .
Im Folgenden wird die Erfindung anhand von
Ausführungsbeispielen und unter Bezugnahme auf die Figuren näher erläutert, wobei gleiche und ähnliche Elemente teilweise mit gleichen Bezugszeichen versehen sind und die Merkmale der verschiedenen Ausführungsbeispiele miteinander kombiniert werden können.
Kurzbeschreibung der Figuren Es zeigen:
Fig. 1 eine schematische Darstellung eines einkanaligen faseroptischen Fluoreszenzsensorsystems mit einer LED direkt an der Sondenspitze, Fig. 2 eine schematische Darstellung eines einkanaligen faseroptischen Fluoreszenzsensorsystems mit LED- Lichteinkopplung über eine Lichtleitfaser, Fig. 3 ein gemessenes Hefe-Kulturfluoreszenzspektrum (nach 10 Stunden Fermentationsdauer) aus den
Anteilen der Biofluorophore NAD(P)H, Flavine (FAD, FMN) und Porphyrine, Fig. 4a den zeitlichen Verlauf der NAD(P)H-, Flavin (FAD,
FMN) und Porphyrin-Fluoreszenzintensität, Fig. 4b den zeitlichen Verlauf der
NAD(P) H-Fluoreszenzintensität und der Substratkonzentration, Fig. 5 eine schematische Darstellung des faseroptischen
Fluoreszenzsensorsystems gemäß einer Ausführungsform der Erfindung mit n
Empfangsfasern, Spektralfiltern und Photodetektoren zur simultanen Fluoreszenzmessung bei n Wellenlängen,
Fig. 6 eine Darstellung wie Fig. 5, jedoch zusätzlich mit m LEDs und m Sendefasern zur Anregung mit
Primärlicht bei m Wellenlängen,
Fig. 7 ein Blockdiagramm des Aufbaus für den modulierten Betrieb der LED und elektronische Filterung für einen Sende- und Empfangszweig, Fig. 8 ein Blockschaltbild des Aufbaus für den modulierten Betrieb mit Rechtecksignalen und Integration für einen Sende- und Empfangszweig, Fig. 9 Fluoreszenzaufnahme einer Hand mit aktinischer Keratose nach Applikation einer Metvix®-Creme, Fig. 10 Fluoreszenzspektren, die die Zunahme der
Protoporphyrin IX-Fluoreszenz der in Fig. 9 dargestellten Hautpartie zeigen,
Fig. 11 Fluoreszenzspektren, die die Verfolgung der Photodynamischen Therapie einer aktinischen Keratose zeigen, Fig. 12 Fluoreszenzspektrum eines Glioblastoms ohne
Markerapplikation, Fig. 13 ein Blockschaltbild des Aufbaus für den modulierten Betrieb eines Fluoreszenzsensorsystems mit vier Empfangszweigen und MikroController, Fig. 14 ein Blockschaltbild des Aufbaus für den modulierten Betrieb eines
Fluoreszenzsensorsystems mit zwei Empfangszweigen und Differenzverstärker.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung Bezugnehmend auf Fig. 1 ist ein faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem umfassend einen Fluoreszenzsensor 1 mit einer Eintauchsonde 12 und einem Detektor 14 dargestellt. Der Detektor 14 umfasst eine Photodiode Dl.
Eine UV-Leuchtdiode LEDl emittiert UV-Primärlicht zur Anregung der Fluoreszenz, welche wiederum die Emission von sekundärem Fluoreszenzlicht 20 aus der Probe 24 bewirkt. Das Fluoreszenzlicht 20 wird von den Fluorophoren in der Probe 24 emittiert. Die inkohärente Leuchtdiode LEDl ist innerhalb der Eintauchsonde 12 unmittelbar an der Sondenspitze 26 angeordnet. Dadurch kann auf eine
Sendefaser verzichtet werden. Der Lichtwellenleiter 13 der Eintauchsonde 12 umfasst demgemäß lediglich eine Empfangsfaser El, die das Fluoreszenzlicht 20 an den Detektor 14 weiter leitet. Das von der Probe 24 bzw. den Fluorophoren in den Zellen in alle Raumrichtungen ausgesendete Fluoreszenzlicht 20 ist gegenüber dem Primäroder Anregungslicht zu größeren Wellenlängen hin verschoben. Ein Bruchteil dieser Fluoreszenzemission gelangt schließlich über die Sondenspitze 26 und die Empfangsfaser El in die Detektoreinrichtung 14. Die Detektoreinrichtung 14 ist ferner mit einer Recheneinrichtung 28 zur Datenaufnahme, -auswertung, -speicherung und -anzeige verbunden.
Fig. 2 zeigt ein Fluoreszenzsensorsystem, bei welchem die Anregungslicht emittierende Leuchtdiode LEDl extern der Eintauchsonde 12 entfernt von der Sondenspitze 26 angeordnet ist. Das Anregungslicht der Leuchtdiode LEDl wird über eine Sendefaser Sl in dem Lichtwellenleiter 13, welche parallel zur Empfangsfaser El innerhalb der Eintauchsonde 12 bis zur Sensorspitze 26 verläuft, zur Probe 24 geführt.
Die Glasfaseroptische Sonde 12 bzw. deren Sondenspitze 26 gemäß Fig. 2 kommt ohne elektrische Versorgung aus. Daher kann die Sonde 12 temperaturstabil bis etwa 2000C oder mehr ausgelegt sein. Dies ist insbesondere für Anwendungen, die mit biologisch aktivem Material in Berührung kommen, von großem Vorteil, weil die Sondenspitze bzw. der Sensorkopf 26 erhitzt werden kann und daher autoklavierbar und sterilisierbar ist. Keime werden dadurch abgetötet und der Sensor 1 kann wiederholt eingesetzt werden, ohne Kontaminationen und Infektionen von Messort zu Messort weiter zu transportieren.
Derartige faseroptische Sensoren 1 lassen sich in unterschiedlichen Bauformen realisieren. So kann die Sondenspitze 26 so gefertigt werden, dass sie intravenös anwendbar ist. Ebenfalls kann mit gebogenen Kapillaren, die an Messorten wie der Augenhinterseite anwendbar sind, gearbeitet werden. Ferner kann die Sonde 12 eine große Länge aufweisen, um z.B. in großen Fermentern eingesetzt zu werden. Solche Sonden 12 können bis zu 10 m oder tiefer in biologische Reaktoren eintauchen und dennoch auf der ganzen Länge Temperaturen bis 2000C aushalten. Ein wichtiges weiteres Anwendungsgebiet für die Sensoren sind explosionsgefährdete Umgebungen. Hier können die meisten elektrischen Geräte nicht eingesetzt werden, wohl aber mit inkohärentem Licht betriebene rein optische Sonden. Nach Ex-Schutz-Richtlinie ist lediglich Sorge zu tragen, dass eine Lichtbelastung vom 5 mW/mm2 nicht überschritten wird.
Der Fluoreszenzsensor 1 besitzt demnach ein breites Anwendungsspektrum in der Bioanalytik, der Prozessverfolgung, in der biomedizinischen Fluoreszenzspektroskopie, der medizinischen Diagnostik insbesondere der Krebsdiagnostik und in der Wirkstoffforschung . Ein wesentlicher Vorteil der Fluoreszenzspektroskopie liegt darin, dass mit dieser
Methode biochemische Vorgänge in Zellen nicht-invasiv und quantitativ verfolgt werden können. In lebenden Zellen sind verschiedene am Stoffwechsel beteiligte chemische Substanzen wie NAD(P)H, Flavine, Porphyrine etc. enthalten, welche bei Bestrahlung mit UV-Licht bzw. blauem Licht zur Fluoreszenz angeregt werden können. Dabei zeigt sich, dass jedes dieser Biofluorophore ein charakteristisches Fluoreszenzlicht mit entsprechender Spektralverteilung aussendet. Liegt nun in Folge einer Erkrankung wie Krebs eine Veränderung des intrazellulären Stoffwechsels vor, dann hat dies auch Einfluss auf die
Konzentrationsverhältnisse der Biofluorophore und somit auf das Fluoreszenzemissionsspektrum der Zelle bzw. des biologischen Materials. Daher gestattet die Messung der Zellfluoreszenz nicht nur eine Gewebedifferenzierung zur
Tumordiagnose (z.B. durch Bestimmung des Verhältnisses von NAD(P)H- zu Porphyrin-Fluoreszenz oder dem Verhältnis Flavin- zu Porphyrin-Fluoreszenz), sondern ermöglicht auch die Wirkung verschiedener Pharmazeutika auf den Organismus zu untersuchen wie auch Mechanismen und Verläufe bestimmter Erkrankungen aufzuklären.
In Fig. 3 wird eine Mehrkomponentenanalyse am Beispiel eines während einer Hefe-Fermentation in einem Bioreaktor online aufgenommenen Fluoreszenzspektrums veranschaulicht. Das nach einer Fermentationsdauer von zehn Stunden aufgenommene Gesamt-Fluoreszenzspektrum 42 setzt sich im Wesentlichen aus den beiden Komponenten NAD(P)H mit einem Emissionsmaximum bei etwa 470 nm und Flavine bei einem
Emissionsmaximum bei etwa 530 nm zusammen. Nach Subtraktion dieser beiden Hauptbestandteile der Kulturfluoreszenz erhält man ein Differenzspektrum 44, welches eine kleine Fluoreszenzbande bei etwa 630 nm aufweist, die von verschiedenen Porphyrinen herrührt.
Bezug nehmend auf Fig. 4a gelang es durch Anwendung der kontinuierlichen Mehrkomponentenanalyse während der Fermentation den zeitlichen Verlauf der NAD(P)H-, Flavin- und Porpyhyrin-Fluoreszenz zu verfolgen (Prozessverfolgung) und diesen mit dem zellulären Stoffwechsel des untersuchten Mikroorganismus Bäckerhefe zu korrelieren.
Lebende Zellen wie Mikroorganismen (Hefe, E. coli, etc.) enthalten Biofluorophore wie NAD(P)H, Flavine, Porphyrine etc., deren zeitlicher Verlauf Rückschlüsse auf den Stoffwechselstatus der Zelle und den Prozessverlauf erlaubt. Obwohl die Fluoreszenzspektren der genannten Verbindungen gegenseitig überlappen, ist es mit Hilfe einer Mehrkomponentenanalyse möglich, die Konzentration jedes einzelnen Fluorophors zu berechnen.
Bezug nehmend auf Fig. 3 werden mit Hilfe der spektralen Bandpassfilter Fl bis Fn (vgl. Fig. 5 und 6) in jedem Empfangszweig Zl bis Zn im Fluoreszenzsensor 1 nur die mit Balken markierten vier Spektralbereiche (± 5 nm) des Fluoreszenzspektrums einer Hefe-Kultur erfasst. Von links nach rechts deckt der erste Empfangszweig Zl einen Spektralbereich von etwa 475 nm ± 10 nm (NAD(P)H), der zweite Empfangszweig Z2 einen Spektralbereich von etwa
530 nm ± 10 nm (Flavine) , der dritte Empfangszweig Z3 einen
Spektralbereich von etwa 630 nm ± 10 nm (Porphyrine) und der vierte Empfangszweig Z4 einen Spektralbereich von etwa 665 nm ± 10 nm (Untergrund) ab. Nach einer für die jeweilige Anwendung durchgeführten Kalibrierung werden die Fluoreszenzintensitäten in den einzelnen Empfangszweigen oder Kanälen Zl bis Z4 gemessen und gegeneinander „verrechnet", so dass sich schließlich Konzentrationsverläufe für die einzelnen Biofluorophore (NAD(P)H, Flavine, Porphyrine) ergeben, welche in Fig. 4a dargestellt sind.
Bezug nehmend auf Fig. 4b sind die plötzlichen Rückgänge der NAD(P) H-Fluoreszenz zu erkennen, als die Hefe ihren Stoffwechsel nach ca. acht Stunden von Glykolyse auf
Ethanolabbau umstellen musste und als nach 22 Stunden auch das Substrat Ethanol aufgebraucht war.
Bei vielen biologischen oder medizinischen Anwendungen sind wie im Fall der Hefe-Fermentation (NAD(P)H, Flavine,
Porphyrine) nur wenige relevante Fluorophore in der Probe vorhanden. In der Regel ist es dann möglich, direkt aus den Fluoreszenzintensitäten bei bestimmten die jeweiligen Biofluorophore charakterisierenden Wellenlängen die Fluorophor-Konzentrationen zu ermitteln. Im vorstehend beschriebenen Beispiel zur Hefe-Fermentation (Fig. 3 bis 4b) ist in Fig. 3 zu erkennen, dass bei einer Wellenlänge von etwa 470 nm nahezu die gesamte Fluoreszenzintensität vom Fluorophor NAD(P)H herrührt. Nach Abzug dieser Komponente aus dem Gesamtspektrum 42 der Kulturfluoreszenz erhält man die Kurve 46, anhand derer es möglich ist, den Flavinanteil bei etwa 530 nm zu bestimmen, weil nun die NAD (P) H-Fluoreszenz nicht mehr spektral überlappt.
Schließlich kann nach weiterem Abzug des Anteils des Flavins auch der Porphyrin-Gehalt (Kurve 44) aus der verbliebenen Intensität bei etwa 630 nm bestimmt werden. Bei dieser Art der Auswertung genügt es somit, die Fluoreszenzintensitäten bei bestimmten Wellenlängen (in dem Beispiel: bei 470 nm, 530 nm, 630 nm) zu messen, um die entsprechenden Fluorophor-Konzentrationen zu ermitteln.
Fig. 5 zeigt ein Fluoreszenzsensorsystem 1 mit mehreren Empfangszweigen, wobei jeder Empfangszweig Zl bis Zn eine optische Empfangsfaser El bis En aufweist. Das von der Probe emittierte Fluoreszenzlicht wird in diese Empfangsfasern El bis En eingekoppelt. Am Ende einer jeden Empfangsfaser El bis En befindet sich ein optisches Spektralfilter Fl bis Fn, welches nur Licht einer bestimmten Wellenlänge bzw. eines bestimmten Wellenlängenbereichs durchlässt. Nach dem Passieren des jeweiligen Filters Fl bis Fn fällt das Licht zum Nachweis auf die Photo-Detektoren Dl bis Dn, bei welchen es sich z.B. um Photodioden oder Photovervielfacher (Photomultiplier) handelt. Die Messung der
Fluoreszenzintensitäten bei den von den Filtern Fl bis Fn vorgegebenen Wellenlängen erfolgt gleichzeitig, damit auch bei schnellen biologischen Prozessen, die Fluorophor- Zusammensetzung der Probe richtig ermittelt wird.
Die in Fig. 5 dargestellte Ausführungsform kommt im Gegensatz zu den häufig in der Fluoreszenzspektroskopie eingesetzten Spektrometern ohne ein wellenlängendispersives Element wie einem Polychromator aus und ist daher wesentlich kostengünstiger zu fertigen. Aufgrund der geringen Abmessungen, kann der gesamte Sensor 1 kompakt in einem Gehäuse untergebracht werden.
Wird die in Fig. 5 dargestellte Ausführungsform z.B. mit vier Empfangszweigen Zl bis Z4 mit optischen Interferenzoder Bandpassfiltern bei 470 nm, 530 nm, 630 nm und 700 nm verwendet, kann die anhand der Fig. 3 bis 4b erläuterte selektiv quantitative und kontinuierliche Messung und Substraktion einschließlich Offset-Korrektur mit dem Sensor durchgeführt werden. Es ist dem Fachmann ersichtlich, dass auch optische Kantenfilter, z.B. Langpass- und/oder Kurzpassfilter eingesetzt werden können. Diese können insbesondere in Kombination mit einem beschränkten spektralen Empfangsbereich der Photodioden genügen.
Fig. 6 zeigt eine weitere Ausführungsform der Erfindung mit einer Mehrzahl an Sende-Leuchtdioden LEDl bis LEDm, welche unterschiedliche Emissionswellenlängen zur Fluoreszenzanregung aufweisen und jeweils zugeordneten Sendefasern Sl bis Sm. Diese Ausführungsform ist insbesondere dann von Vorteil, wenn die
Mehrkomponentenanalyse dadurch erschwert wird, dass die Fluorophore in der zu analysierenden Probe stark überlappende Fluoreszenzbanden aufweisen. So kann z.B. mit der LEDl gezielt nur der Fluorophor mit dem langwelligsten Fluoreszenzanregungsspektrum angeregt und bestimmt werden.
Werden anschließend mit der LED2 mit kürzerer Anregungswellenlänge neben dem erstgenannten Fluorophor noch ein weiterer angeregt, so kann dessen Konzentration nun ermittelt werden, da der Anteil des erstgenannten Fluorophors von der gemessenen Fluoreszenzintensität abgezogen werden kann. Alternativ können auch mehrere oder alle Leuchtdioden LEDl bis LEDm in eine Sendefaser eingekoppelt werden. Ferner können die LEDl bis LEDm wie bei der in Fig. 1 dargestellten Ausführungsform auch in der Sondenspitze angeordnet sein, wenn die Sonde 12 nicht auf Miniaturisierung hin optimiert werden muss.
Bezug nehmend auf Fig. 7 wird die Gleichlichtunterdrückung anhand eines beispielhaften Aufbaus beschrieben. Die Leuchtdiode LEDl wird mit einer sinusförmigen Wechselspannung betrieben. Hierzu wird die LEDl von einem Oszillator 62 mit einer vorbestimmten Frequenz f betrieben, welcher von einer gemeinsamen Spannungsversorgung 64 gespeist wird.
Das hiermit angeregte Fluoreszenzlicht 20 ist ebenfalls sinusförmig moduliert und wird mit dem Detektor 14 mit der Photodiode Dl nachgewiesen. Das Ausgangssignal der Photodiode Dl ist in weiten Bereichen proportional zu der empfangenen Fluoreszenz-Lichtintensität, so dass das Detektorsignal ebenfalls mit der Frequenz f moduliert ist. Das Bandpassfilter 66 ist mit dem Detektor Dl verbunden und derart eingestellt, dass es lediglich den Wechselanteil des Detektorsignals mit der Frequenz f durchlässt. Damit werden durch Raumlicht oder Gleichlicht erzeugte Signale unterdrückt. Die Unterdrückung kann beispielsweise durch eine Bandpassfilterung mit einer Steilheit von vorzugsweise 20 bis 60 dB/Dekade erfolgen. Die Modulationsfrequenz f wird vorzugsweise zwischen 1 kHz und 1 MHz gewählt, besonders bevorzugt zwischen 2 kHz und 100 kHz. Hiermit werden auch netzfrequente Lichtanteile, bei 50 Hz oder bei ' doppelter Netzfrequenz von 100 Hz effektiv herausgefiltert. Ein Verstärker 68 ist mit dem Bandpassfilter 66 verbunden, um das gefilterte Signal zu verstärken. Ein Gleichrichter 70 ist mit dem Verstärker 68 verbunden, um das verstärkte Signal gleich zu richten. Das gleichgerichtete Signal wird an die Auswerte- und Anzeigeeinrichtung 28 zur weiteren
Verarbeitung weitergeleitet. Eine Übersteuerungsanzeige 72 ist mit dem Ausgang des Detektors 14 und dem Ausgang des Verstärkers 68 verbunden. Die Spannungsversorgung 64 speist alle Komponenten.
Erfindungsgemäß kann somit auch netzfrequentes Umgebungslicht herausgefiltert werden. Dies hat also insbesondere den Vorteil, dass man die Fluoreszenzmessungen auch bei Raum- bzw. Umgebungslicht, welches zu einer erheblichen Überlagerung mit dem intensitätsschwachen
Fluoreszenzlicht 20, dem eigentlichen Messsignal, führt, durchführen kann. Insbesondere bei medizinischen Anwendungen, z.B. in der Endoskopie, ist es dadurch für den Arzt möglich, parallel zu den Fluoreszenzmessungen visuell das zu untersuchende Gewebe zu begutachten.
Fig. 8 zeigt ein Blockschaltbild für einen modulierten- Betrieb des Systems 1 mit Rechtecksignalen. D.h. die Modulation ist in Form einer Taktung realisiert. Hierfür wird eine dem Fachmann grundsätzlich bekannte
Integratorschaltung verwendet. Die Integratorschaltung vereint ein sehr geringes Rauschen mit der Möglichkeit einer hohen Verstärkung für die eingehenden Signale. Die LED wird mit einem getakteten Spannungssignal in Form eines periodischen Rechtecksignals einer Zeitdauer von beispielsweise zwischen 5 ms und 2 s getrieben (An-Zeit) und anschließend für eine weitere Zeitdauer dunkel geschaltet (Aus-Zeit) . Die Betriebsspannung der Leuchtdiode LEDl wird von einer Spannungsversorgung 80 erzeugt, welche von einem Taktgenerator 82 mit dem Taktsignal Tl getaktet wird. Somit wird die Anregungslicht emittierende Leuchtdiode LEDl getaktet versorgt und emittiert getaktetes Anregungslicht. Das Ausgangssignal des Detektors wird koinzident mit dem Spannungssignal gemessen, genauer während der Dauer der An-Zeit des Spannungssignals mittels des Integrators 84 integriert, wobei der Integrator 84 mit der Leuchtdiode LEDl verbunden ist. Das Nutzsignal wird dann als Differenz zwischen dem integrierten Ausgangssignal während der An-Zeit und der Aus-Zeit der LED ermittelt. Damit verkörpert der Integrator 84 ein Mittel zur
Gleichlichtunterdrückung. Hierzu ist der Integrator 84 ebenfalls mit dem Taktgenerator 82 verbunden und wird von diesem mit dem Taktsignal T2 versorgt, derart dass die Leuchtdiode Dl und der Integrator 84 mit demselben Takt gesteuert werden. Das Ausgangssignal des Integrators 84 wird mittels eines Verstärkers 86 verstärkt und mittels eines A/D-Wandlers 88 digitalisiert, um anschließend von der Auswerte- und Anzeigeeinrichtung 28 digital weiterverarbeitet zu werden.
Eine weitere mögliche Variante einer zeitlich variierten Beleuchtung ist eine gepulste Betriebsweise der LED. Diese hat den Vorteil, dass man zum Zeitpunkt des Pulses ein hohes Signal erhält. Hierfür ist die Kombination mit einem schnellen Detektor sinnvoll, z.B. einem Ladungsverstärker, bei welchem die erste Stufe gering und eine zweite Verstärkungsstufe hoch verstärkt. Zwar gilt, dass die Lichtintensität von Leuchtdioden bei hoher und kurzzeitiger Belastung nicht proportional zum Versorgungsstrom ist, dennoch lassen sich Leuchtdioden, die z.B. für einen
Dauerbetrieb mit 20 mA ausgelegt sind, mit bis zu 10 A kurzzeitig belasten und erreichen dann ein Vielfaches an kurzzeitiger Lichtemission. Die Pülsdauer wird vorzugsweise länger als 100 ns gewählt, um eine Überlagerung mit dem Abklingverhalten der Fluoreszenz zu vermeiden, so dass von einer „quasi-kontinuierlichen" Anregung gesprochen werden kann .
Bezug nehmend auf Fig. 9 und 10 wird der Einsatz des faseroptischen Fluoreszenzsensors 1 in der Fluoreszenz- Krebsdiagnostik mit Markergabe erläutert.
Der Marker kann intravenös, oral oder äußerlich, z.B. in Form einer Salbe appliziert werden. Der Marker ist eine Vorläufersubstanz („precursor"), z.B. 5-Aminolävulinsäure (5-ALA) oder ein Ester von 5-ALA. Typische Konzentrationen für die Anwendung sind 20 bis 40 mg pro kg Körpergewicht; im Tiermodell auch bis zu 150 mg / kg. Nach wenigen Stunden bildet sich Protoporphyrin IX (Vorstufe von Häm) in den Zellen, wobei - je nach Vorläufersubstanz - eine höhere, d.h. spezifische PPIX-Anreicherung in Tumorzellen zu verzeichnen ist. PPIX besitzt eine hohe Lichtabsorption im blauen Spektralbereich bei ca. 405 nm. Wird PPIX mit blauem Licht bestrahlt, so wird ein Teil der absorbierten Photonen in Fluoreszenz-Licht (Emissionsmaximum bei 635 nm) umgewandelt. Diese rötliche Fluoreszenzemission führt zu einem visuellen Kontrast des tumorösen Gewebes gegenüber dem umliegenden gesunden Gewebe.
In dem in Fig. 9 und 10 dargestellten Beispiel wurde als Markermedikament äußerlich eine Aminolävulinsäure-haltige Salbe auf einen Handrücken mit aktinischer Keratose appliziert. Eine derartige Salbe ist z.B. als Metvix®-Creme erhältlich .
Fig. 9 zeigt die Fluoreszenzaufnahme des Handrückens, welcher drei Stunden zuvor mit der Aminolävulinsäure- haltigen Salbe eingecremt worden war bei Beleuchtung mit blauem Licht. Gut erkennbar ist die helle (in Realität rötliche) PPIX-Fluoreszenz 102 um die bereits chirurgisch behandelten dunklen Stellen 104 mit aktinischer Keratose.
Bezug nehmend auf Fig. 10 ist die Zunahme der Protoporphyrin IX - Fluoreszenz nach Applikation der Salbe dargestellt.
Nach Gabe oder Applikation von Aminolävulinsäure (5-ALA) oder eines ihrer Ester reichert sich der Photosensibilisator Protoporphyrin IX (PPIX) selektiv in tumorösem Gewebe an. Bei Bestrahlung mit kurzwelligem Licht fluoresziert PPIX rötlich mit einem Fluoreszenzmaximum bei ca. 635 nm und einer Nebenbande bei ca. 705 nm. Die Spektren wurden unmittelbar nach Applikation (0 Stunden) und nach 1, 2 und 3 Stunden gemessen. Um PPIX mit dem erfindungsgemäßen Fluoreszenzsensorsystem 1 gemäß Fig. 5 quantitativ bestimmen zu können, wird die überlagerte endogene Fluoreszenz (Kollagen, NAD(P)H, Flavine etc.) bei zwei Wellenlängen in den Spektralbereichen der Referenzkanäle 1 und 2 gemessen und, ggfs. nach mathematischer Faktorberechnung, von der Fluoreszenz im zu messenden Spektralbereich bei 635 nm (Messkanal) abgezogen. Die drei nicht überlappenden Spektralbereiche weisen eine Breite von etwa ± 10 nm auf. Es wird also mit einem zu messenden Spektralbereich für das nachzuweisende Fluorophor (hier Protoporphyrin IX) und zwei Untergrund- Spektralbereichen (sog. Referenzkanäle 1 und 2) gearbeitet. Es ist dem Fachmann ersichtlich, das hiermit eine gleichlichtunterdrückte, untergrundbereinigte und zeitlich aufgelöste quantitative Messung der Protoporphyrin- Anreicherung durchgeführt wird. Bezug nehmend auf Fig. 11 wird nachfolgend der Einsatz des faseroptischen Fluoreszenzsensors zur Verfolgung der Photodynamischen Therapie (PDT) erläutert.
Bei der Lichtabsorption wird PPIX zunächst von S0 nach Si angeregt. Durch „intersystem crossing" geht ein kleiner Teil der PPIX-Moleküle in den Triplettzustand Ti über. Da molekularer Sauerstoff O2 einen Triplett-Grundzustand besitzt, kann nun die Anregungsenergie des PPIX im Ti-Zustand auf O2 übertragen werden. Dabei geht der
Sauerstoff in den angeregten Singulett-Zustand über und PPIX- in den So-Grundzustand. Da Singulett-Sauerstoff ein Zellgift ist, wird aufgrund der spezifischen Anreicherung von PPIX gezielt tumoröses Gewebe zerstört. Die Bestrahlung erfolgt vorzugsweise mit rotem Licht (<635 nm) , da in diesem Spektralbereich die Lichtabsorption der Haut geringer ist als im kurzwelligeren blauen oder grünen Bereich und so eine tiefergehende Behandlung erreicht wird.
In einem Beipiel wurde eine Aminolävulinsäure-haltige Salbe auf einen Handrücken mit aktinischer Keratose wie den in Fig. 9 dargestellten Handrücken appliziert. Wenige Stunden nach Markergabe erreicht die Protoporphyrin-Konzentration im dysplastischen Gewebe ihr Maximum (vgl. Fig. 10), so dass mit der mehrminütigen therapeutischen Bestrahlung mit Licht (z.B. mittels Lichtquelle Aktilite®) begonnen werden kann. Dabei baut sich der Photosensibilisator PPIX im Laufe der Zeit über das Zwischenprodukt Photo-Protoporphyrin (PPP) (Emissionsmaximum bei ca. 675 nm) ab.
Fig. 11 zeigt je ein Fluoreszenzspektrum vor und während der PDT. Es ist ein Rückgang der Protoporphyrin IX - Fluoreszenz und die Bildung des Abbauprodukts Photo- Protoporhyrin während der PDT im Vergleich zu vor der PDT zu erkennen. Erfindungsgemäß werden mit dem Fluoreszenzsensorsystem gemäß Fig. 5 die Fluoreszenzintensitäten in Spektralbereichen um 635 nm (PPIX, Messkanal 1), 675 nm (PPP, Messkanal 2) und in zwei ausgewählten Untergrund- oder Referenzspektralbereichen (Referenz 1 und 2) zur Untergrundbestimmung gemessen.
Anschließend wird mittels der Schaltung gemäß Fig. 13 der Untergrund aus den Referenzspektralbereichen von den in den Spektralbereichen um 635 nm und 675 nm zu messenden Fluoreszenzintensitäten nachzuweisender Fluorophore (hier Protoporphyrin IX und Photo-Protoporphyrin; Messkanal 1 und 2) abgezogen. In diesem Beispiel werden also vier Empfangszweige Zl bis Z4 (Messkanal 1 und 2, Referenz 1 und 2) verwendet. Somit kann mittels der gleichlichtunterdrückten und untergrundbereinigten Messung bei zwei (Mess-) Wellenlängen (635 nm und 675 nm) die
Abbaukinetik des Photosensibilisators verfolgt werden.
Fig. 13 zeigt ein Blockschaltbild mit vier Empfangszweigen Zl bis Z4 zur Durchführung der anhand Fig. 11 erläuterten Messung. Die vier Empfangszweige Zl bis Z4 sind jeweils entsprechend Fig. 7 ausgebildet, wobei jedoch jedem Detektor Dl bis D4 ein optisches Filter Fl bis F4 vorgeschaltet ist. Die Auswertung einschließlich Untergrundabzug erfolgt in einer gemeinsamen Auswerteeinrichtung 28 in Form eines MikroControllers.
Fig. 14 zeigt ein Blockschaltbild einer alternativen Ausführungsform mit zwei Empfangszweigen Zl und Z2 entsprechend Fig. 7, wobei der Empfangszweig Zl ein Untergrundsignal und der Empfangszweig Z2 ein Messsignal verarbeitet. Ein z.B. mittels eines Potentiometers einstellbarer Abgleichsverstärker oder -abschwächer 28a dient zum Ausgleichen von unterschiedlichen Empfindlichkeiten der beiden Empfangszweige Zl und Z2. Anschließend werden die beiden Signale in einen Differenzverstärker 28b eingespeist und somit das Differenzsignal zwischen Mess- und Untergrundsignal verstärkt, um mittels der Auswerteeinrichtung 28 eine Subtraktion des Untergrundsignals vom Messsignal zu bewirken.
Mit dem erfindungsgemäßen faseroptischen
Fluoreszenzsensorsystem, z.B. gemäß Fig. 5 ist sogar eine Krebsdiagnostik ohne Markergabe möglich. Dies beruht auf folgendem Effekt. In bösartigen Tumoren scheinen sich - auch ohne Markergabe - Porphyrine anzureichern. Bei Beleuchtung mit kurzwelligem Licht fluoreszieren diese im Spektralbereich etwa um 630 nm. Ein Spektrum dieser - endogenen - Fluoreszenz ist in Fig. 12 am Beispiel eines Glioblastoms dargestellt. Der zu messende Spektralbereich liegt also um etwa 630 nm, ist aber sehr stark von Fluoreszenz-Untergrund überlagert. Der Fluoreszenz- Untergrund ist um etwa eine Größenordnung höher als die zu messende Fluoreszenzintensität der Porphyrine. Für eine quantitative Erfassung der Porphyrine wird daher erfindungsgemäß ein Untergrund-Spektralbereich bei etwa
565 nm ± 10 nm und ein Spektralbereich bei etwa 630 nm
± 10 nm für das zu messende Fluoreszenzlicht durch Auswahl entsprechender optischer Filter festgelegt. Schließlich wird das Messsignal der Untergrundfluoreszenzintensität (Referenzkanal) von dem Messsignal der zu messenden Fluoreszenzintensität abgezogen. Bei gesundem Gewebe und auch bei einer Vielzahl gutartiger Tumore wird diese charakteristische Porphyrin-Fluoreszenz nicht beobachtet, so dass eine Diagnose bestimmter bösartiger Tumore ermöglicht ist.

Claims

Patentansprüche
1. Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem zur Fluoreszenzuntersuchung einer Fluorophore enthaltenden, insbesondere biologischen Probe (24) , mit einem Fluoreszenzsensor (1), umfassend: eine modulierbare oder pulsbare Lichtquelle, welche Anregungslicht zur Anregung von Fluoreszenz in der Probe (24) emittiert, eine faseroptische Sonde (12) mit einer Sondenspitze mit einem Lichtaustrittsbereich aus dem das Anregungslicht austritt, um in die zu untersuchende Probe (24) eingekoppelt zu werden und einem Lichteintrittsbereich in den das von den Fluorophoren in der Probe emittierten Fluoreszenzlicht (20) in die Sonde eintritt, um aus der zu untersuchenden Probe ausgekoppelt zu werden, einen Lichtwellenleiter (13) und eine Detektoreinrichtung (14) mit zumindest einem ersten und zweiten Empfangszweig (Zl, Z2) mit jeweils einem Detektor (Dl, D2) zum Nachweisen des Fluoreszenzlichtes (20), wobei der erste Empfangszweig (Zl) zum Nachweisen eines ersten Spektralbereichs des aus der Probe in die Sondenspitze ausgekoppelten
Fluoreszenzlichtes (20) und der zweite Empfangszweig (Z2) zum Nachweisen eines zweiten Spektralbereichs des aus der Probe in die Sondenspitze ausgekoppelten Fluoreszenzlichtes (20) ausgebildet ist, wobei der erste und zweite Spektralbereich unterschiedlich sind, wobei der Lichtwellenleiter (13) zumindest eine optische Empfangsfaser (El) umfasst und die Detektoren (Dl, D2) mittels der zumindest einen Empfangsfaser (El) mit der Sondenspitze (26) verbunden sind, um das aus der Probe in den Lichteintrittsbereich der Sondenspitze ausgekoppelte Fluoreszenzlicht (20) von der Sondenspitze (26), über die zumindest eine Empfangsfaser (El) an die Detektoren (Dl, D2) weiterzuleiten, wobei jeder der Detektoren (Dl, D2) ein Ausgangssignal erzeugt, welches ein Maß für die
Intensität des Fluoreszenzlichtes (20) ist, um das Fluoreszenzlicht in dem jeweiligen Spektralbereich selektiv quantitativ zu messen, wobei die Betriebsspannung der Lichtquelle zeitlich verändert wird, wodurch eine zeitlich variierende
Lichtemission der Lichtquelle (LEDl) hervorgerufen wird und wobei jedem der Detektoren (Dl, D2) ein elektronisches Mittel (66, 84) zur Gleichlichtunterdrückung zugeordnet ist, das jeweils an die zeitliche Variation der Lichtemission angepasst ist, so dass der erste Empfangszweig (Zl) ein gleichlichtunterdrücktes quantitatives erstes Messsignal der Intensität des Fluoreszenzlichtes in dem ersten Spektralbereich und der zweite Empfangszweig
(Z2) ein gleichlichtunterdrücktes quantitatives zweites Messsignal der Intensität des Fluoreszenzlichtes in dem zweiten Spektralbereich erzeugt und eine gleichlichtunterdrückte quantitative spektral aufgelöste Auswertung des Fluoreszenzlichtes ermöglicht ist.
2. Fluoreszenzsensorsystem nach Anspruch 1, wobei ein Differenzverstärker zur Subtraktion des ersten und zweiten Messsignals umfasst ist.
3. Fluoreszenzsensorsystem nach Anspruch 1 oder 2, wobei der erste Spektralbereich ein erwartetes Fluoreszenzmaximum eines ersten in der Probe nachzuweisenden Fluorophors abdeckt und der zweite Spektralbereich einen erwarteten Untergrundbereich des Fluoreszenzspektrums abdeckt.
4. Fluoreszenzsensorsystem nach Anspruch 3, wobei das gleichlichtunterdrückte erste und zweite Messsignal voneinander subtrahiert werden, sodass ein gleichlichtunterdrückter und untergrundbereinigter Intensitätswert für das Fluoreszenzlicht des ersten Fluorophors erhalten wird.
5. Fluoreszenzsensorsystem nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der erste Spektralbereich das Fluoreszenzmaximum von Protoporhyrin abdeckt.
6. Fluoreszenzsensorsystem nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der erste und/oder zweite Spektralbereich eine Breite von ± 50 nm oder kleiner (vzw. ± 2 nm bis ± 20 nm) aufweist.
7. Fluoreszenzsensorsystem nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der erste Spektralbereich ein erwartetes Fluoreszenzmaximum eines ersten in der Probe nachzuweisenden Fluorophors abdeckt und der zweite Spektralbereich ein erwartetes Fluoreszenzmaximum eines zweiten in der Probe nachzuweisenden Fluorophors abdeckt .
8. Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die elektronischen Mittel (66, 84) zur Gleichlichtunterdrückung mit dem jeweiligen Detektor (Dl, D2 ) verbunden sind und auf die Ausgangssignale der Detektoren (Dl, D2) wirken.
9. Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die zeitliche Variation der Lichtemission langsam im Vergleich zum Abklingverhalten der Fluoreszenz ist.
10. Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das von der Lichtquelle (LEDl) emittierte Anregungslicht moduliert ist und die elektronischen Mittel (66, 84) zur Gleichlichtunterdrückung an die Modulation des Anregungslichtes angepasst sind.
11. Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei ein Oszillator (62) zur Modulation der Betriebsspannung der Lichtquelle mit der Modulationsfrequenz (f) umfasst ist.
12. Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Anregungslicht mit einer Modulationsfrequenz (f) moduliert wird und die elektronischen Mittel zur Gleichlichtunterdrückung jeweils ein an die Modulationsfrequenz (f) angepasstes elektronisches Filter (66) zur Filterung des Ausgangssignals des jeweiligen Detektors (Dl, D2) umfassen.
13. Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach Anspruch 12, wobei die Filter (66) zur Filterung der elektrischen Ausgangssignale der Detektoren (Dl, D2 ) jeweils ein Bandpassfilter ist.
14. Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach Anspruch 12 oder 13, wobei die Modulationsfrequenz (f) klein gegen die inverse Abklingzeit der Fluoreszenz ist.
15. Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei das Anregungslicht mit einer Frequenz zwischen 200 Hz und 10 MHz moduliert ist.
16. Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach einem der Ansprüche 12 bis 15, wobei signalabwärts der elektronischen Filter (66) jeweils ein Verstärker (68) zur Verstärkung der gefilterten Detektorsignale vorgesehen ist.
17. Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach einem der Ansprüche 12 bis 16, wobei signalabwärts der elektronischen Filter (66) jeweils ein Gleichrichter (70) zur Gleichrichtung der gefilterten Detektorssignale vorgesehen ist.
18. Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach einem der Ansprüche 12 bis 17, wobei eine Übersteuerungsanzeige (72) mit den elektronischen Filtern (66) und/oder den Gleichrichtern (70) verbunden ist, um eine mögliche Übersteuerung zu detektieren.
19. Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Anregungslicht mit regelmäßigen Rechtecksignalen und zwischen den
Rechtecksignalen liegenden Pausen moduliert wird und die elektronischen Mittel (66, 84) zur Gleichlichtunterdrückung eine mit dem Rechtecksignal koinzident betriebene Integrationsschaltung umfassen.
20. Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach Anspruch 19, wobei die Dauer der Rechtecksignale lang gegen die Abklingzeit der Fluoreszenz ist.
21. Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach Anspruch 19 oder 20, wobei die Dauer der Rechtecksignale zumindest 100 ns beträgt.
22. Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Lichtquelle (LEDl) gepulst betrieben wird und das Ausgangssignal des Detektors koinzident zur Pulsung gemessen wird.
23. Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach Anspruch 22, wobei die Pulsdauer zumindest 100 ns beträgt.
24. Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei eine Auswerteeinrichtung (28) mit Mitteln zur parallelen Aufzeichnung der
Detektorsignale über einen makroskopischen Zeitraum und Mitteln zur spektral- und zeitaufgelösten Darstellung der Fluoreszenzintensität über den Zeitraum zur Prozessverfolgung umfasst ist.
25. Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Lichtquelle eine Mehrzahl von Leuchtdioden (LEDl bis LEDm) mit unterschiedlichen Anregungslicht-Wellenlängen zur Fluoreszenzanregung umfasst, wobei die
Emissionsspektren der Leuchtdioden an die jeweils anzuregenden Fluorophore angepasst sind.
26. Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach Anspruch 25, wobei Mittel zur Subtraktion zweier
Fluoreszenzsignale, welche mit unterschiedlichen Anregungslicht-Wellenlängen aufgenommen sind, umfasst sind.
27. Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Lichtquelle (LEDl bis LEDm) in die Sondenspitze (26) integriert ist.
28. Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 26, wobei die Lichtquelle (LEDl bis LEDm) entfernt von der Sondenspitze (26) angeordnet ist und der Lichtwellenleiter (13) zumindest eine optische Sendefaser (Sl bis Sm) umfasst, welche die Lichtquelle mit der Sondenspitze (26) verbindet, um das
Anregungslicht von der Lichtquelle zur Einkopplung in die Probe (24) an die Sondenspitze weiterzuleiten.
29. Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach Anspruch 28, wobei die Detektoren (Dl bis Dn) jeweils
Halbleiterdetektoren, insbesondere Photodioden oder CCD-Chips, sind.
30. Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach Anspruch 28 oder 29, wobei die optischen Filter (Fl bis Fn)
Bandpassfilter sind und jeweils eine Bandbreite von ± 50 nm oder kleiner aufweisen.
31. Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach einem der Ansprüche 28 bis 30, wobei eine Batterie zur
Stromversorgung zumindest der Leuchtdioden (LEDl bis LEDm) und/oder der Halbleiterdetektoren (Dl bis Dn) umfasst ist.
32. Faseroptisches Fluoreszenzsensorsystem nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Leuchtdioden unterschiedliche Emissionsspektren aufweisen und wobei die Probe mit dem spektral ungefilterten Anregungslicht aus den Leuchtdioden (LEDl bis LEDm) bestrahlt wird.
33. Diagnosesystem zur Krebserkennung umfassend ein Fluoreszenzsensorsystem, insbesondere gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, und ein Markermedikament, welches eine Anreicherung eines vorbestimmten Fluorophors in tumorösem Gewebe bewirkt, wobei das Fluoreszenzsensorsystem Fluoreszenzlicht eines vordefinierten Spektralbereichs nachweist, welcher an das Fluoreszenzmaximum dieses Fluorophors angepasst ist.
34. Diagnosesystem nach Anspruch 33, wobei das Markermedikament ein Medikament zur äußerlichen Anwendung ist.
35. Diagnosesystem nach Anspruch 33 oder 34, wobei das Markermedikament eine Anreicherung von Protoporphyrin in tumorösem Gewebe bewirkt und der gemessene Spektralbereich eine Wellenlänge von etwa 635 nm selektiv abdeckt.
36. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Fluorophoren in einer, insbesondere biologischen Probe mittels eines faseroptischen Fluoreszenzsensorsystems, wobei die Probe (24) mit Anregungslicht aus einer Lichtquelle bestrahlt wird, um eine Fluoreszenz in der Probe anzuregen, wodurch die Fluorophore in der Probe (24) Fluoreszenzlicht (20) emittieren, das Anregungslicht zeitlich variiert wird, das von den Fluorophoren in der Probe (24) emittierte Fluoreszenzlicht (20) mittels einer optischen Faser (El) zu zumindest zwei Detektoren (Dl,
D2) weitergeleitet wird und die Intensität des Fluoreszenzlichts (20) mit den Detektoren (Dl, D2 ) gemessen wird, wobei mittels des ersten Detektors selektiv ein erster Spektralbereich des aus der Probe in die Sondenspitze ausgekoppelten Fluoreszenzlichtes (20) und mittels des zweiten Detektors ein zweiter Spektralbereich des aus der Probe in die Sondenspitze ausgekoppelten Fluoreszenzlichtes (20) nachgewiesen wird, wobei der erste und zweite Spektralbereich unterschiedlich sind und wobei jeder Detektor (Dl, D2) ein elektrisches Ausgangssignal ausgibt, welches ein Maß für die Intensität des Fluoreszenzlichtes (20) in dem zugehörigen Spektralbereich ist, die elektrischen Ausgangssignale der Detektoren (Dl, D2 ) entsprechend dem Anregungslicht zeitlich variiert sind und an beiden Ausgangssignalen mittels der zeitlichen Variation eine elektronische Gleichlichtunterdrückung zur Reduktion des Umgebungslichts durchgeführt wird, so dass ein gleichlichtunterdrücktes quantitatives erstes Messsignal der Intensität des Fluoreszenzlichtes in dem ersten Spektralbereich und ein gleichlichtunterdrücktes quantitatives zweites Messsignal der Intensität des Fluoreszenzlichtes in dem zweiten Spektralbereich erzeugt wird und eine quantitative gleichlichtunterdrückte und spektral aufgelöste Auswertung des Fluoreszenzlichtes durchgeführt wird.
37. Verwendung des Fluoreszenzsensorsystems nach einem der vorstehenden Ansprüche für die medizinische Diagnose.
38. Verwendung des Fluoreszenzsensorsystems nach einem der vorstehenden Ansprüche für die Krebsdiagnose.
39. Verwendung des Fluoreszenzsensorsystems nach einem der vorstehenden Ansprüche für die Bioanalytik.
40. Verwendung des Fluoreszenzsensorsystems nach einem der vorstehenden Ansprüche für die Online- Prozessverfolgung .
41. Verfahren zur Krebsdiagnose, wobei an dem Patienten ein Markermedikament appliziert wird, welches eine Anreicherung eines vorbestimmten Fluorophors in tumorösem Gewebe bewirkt, wobei mittels des Fluoreszenzsensorsystems gemäß einem der vorstehenden Ansprüche Fluoreszenzlicht zumindest in einem
Spektralbereich nachgewiesen wird, welcher an das Fluoreszenzmaximum des angereicherten Fluorophors angepasst ist.
42. Verfahren nach Anspruch 41, wobei das Markermedikament eine Anreicherung von Protoporphyrin in tumorösem Gewebe bewirkt und der Spektralbereich eine Wellenlänge von etwa 635 nm selektiv abdeckt.
43. Verfahren nach Anspruch 41 oder 42, wobei der zeitliche Verlauf der Intensität des Fluoreszenzlichtes in dem Spektralbereich verfolgt wird und hiermit die Anreicherung von Protoporphyrin in dem tumorösen Gewebe zeitlich aufgelöst bestimmt wird.
44. Verfahren nach Anspruch 41 oder 42, wobei der zeitliche Verlauf der Intensität des Fluoreszenzlichtes in dem Spektralbereich verfolgt wird und hiermit der zeitliche Verlauf der nach der Anreicherung nachfolgenden Abreicherung von Protoporphyrin in dem tumorösen Gewebe zeitlich aufgelöst bestimmt wird und gleichzeitig der zeitliche Verlauf der Intensität des Fluoreszenzlichtes in einem zweitem Spektralbereich, welcher an das Fluoreszenzmaximum von Photo-Protoporphyrin angepasst ist, verfolgt wird und hiermit der zeitliche Verlauf der Anreicherung von Photo-Protoporphyrin in dem tumorösen Gewebe zeitlich aufgelöst bestimmt wird.
45. Verfahren zur Krebsdiagnose, bei welchem kein
Markermedikament appliziert wird und mittels des Fluoreszenzsensorsystems gemäß einem der vorstehenden Ansprüche Fluoreszenzlicht endogener Fluorophore ausgewertet wird.
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