KR102413619B1 - 측방 유동 분석용 스트립에 고정된 포획 구간에서의 무표지 광학 검출 - Google Patents
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Abstract
다공성 매트릭스를 포함하는 검사 스트립으로서, 상기 검사 스트립은 검체를 포함하는 액체 샘플을 적용하기 위한 샘플 적용 구간; 감지 물질을 포함하는 리포터 방출 구간으로서, 상기 감지 물질은 광학 리포터를 방출함으로써 검체와 선택적으로 상호반응하도록 적합화되고, 상기 리포터 방출 구간은 샘플 적용 구간의 하류에 배치된 것인 리포터 방출 구간; 및 포획 물질을 포함하는 검출 구간으로서, 상기 포획 물질은 광학 리포터에 선택적으로 결합하도록 적합화되고 리포터 방출 구간의 하류에 배치된 것인 검출 구간을 포함하는 검사 스트립.
Description
분야 및 배경
[0001] 본 발명은 식품관련 분야 뿐만 아니라 예컨대 의료 진단 및 환경 모니터링 분야, 건강 및 안전 분야에서 검체의 신속하고도 감도 높은 검출을 위한 방법에 관한 것이다. 검체가 어떤 핵산인 경우, 그 검출은 법의학 또는 세균이나 다른 미생물 오염과 같은 미생물학 관련 이슈에 있어서도 중요하다. 특히, 본 발명은 측방 유동 분석 포맷에 관한다.
[0002] 신속한 검사에 이용되는 모든 방법 중에서도, 측방 유동 분석은 가장 널리 이용되며, 이 기술에 기반한 수백여종의 키트가 시판되고 있다. 이 분석 유형은 대체로 스트립의 다공성 구조 내에서 샘플-표시자 복합체가 액체의 모세관력을 통해 이송될 수 있는, 종종 니트로셀룰로스 또는 유리 섬유인 막 스트립을 포함한다. 이 막 스트립은 대체로 샘플 적용 구간 및 검체에 대한 포획 시약(종종 항체 또는 항체 단편)이 고정되어 있는 검출 구간을 포함한다. 마지막으로, 스트립 말단의 흡수 패드가 액체의 지속적인 모세관 흐름을 보장한다.
[0003] 그러나, 공지의 측방 유동 분석법의 주요한 단점은 포획제의 대부분이 표지된 유사체와의 경쟁을 통해 간접적으로만 검체를 가리키거나 또는 전통적인 표시자 접근법을 따른다는 것으로, 즉 선택적이고도 감도 높은 결합을 달성하는 것과 강한 신호 생성이 동시에 요구된다는 것이다. 이러한 요구사항은 대부분의 경우 달성하기 어렵고, 감도를 크게 떨어드린다. 공지의 측방 유동 분석법의 또 다른 단점은 분석 당 오직 소수의 검체만이 측정가능하다는 것이다. 뿐만 아니라, 대부분의 경우 검체에 직접 또는 간접적으로 결합가능한 제2의 결합제, 예컨대 제2의 표지된 항체 또는 항체 단편이 요구된다.
[0004] 공지 방법들은 주로 검체와 표시자 또는 면역시약 간의 상호작용이 소정의 화학양론을 따라야 하고 결합 이벤트와 표시 이벤트가 본질적으로 커플링될 것을 요구하는 전통적인 표시자 접근법에 기반한다. 많은 경우, 검출은 오직 제2의 결합제를 사용한 후에야 달성되는데, 이러한 제2 결합제의 사용은 비용을 상승시킬 뿐만 아니라 잠재적으로 더 많은 오차를 일으킨다.
간단한 요약
[0005] 이 배경에 대해, 제1 구현예에 따라, 다공성 매트릭스를 포함하는 검사 스트립에 제안된다. 검사 스트립은:
- 검체를 포함하는 액체 샘플을 적용하기 위한 샘플 적용 구간으로서, 상기 검체는 전형적으로 액체에 용해되거나 가용화된 것인 샘플 적용 구간;
- 감지 물질(sensing material)을 포함하는 리포터 방출 구간으로서, 상기 감지 물질은 검체의 존재에 대한 반응으로 광학 리포터를 방출함으로써 검체와 선택적으로 상호반응하도록 적합화되고, 상기 리포터 방출 구간은 샘플 적용 구간의 하류에 배치된 것인 리포터 방출 구간;
- 포획 물질을 포함하는 검출 구간으로서, 상기 포획 물질은 광학 리포터에 선택적으로 결합하도록 적합화되고 리포터 방출 구간의 하류에 배치된 것인 검출 구간
을 포함한다.
[0006] 달리 말해서, 검체를 함유하는 액체가 감지 물질을 적시면 리포터는 검사 스트립 상의 감지 물질로부터 방출된다. 검사 스트립은 다공성 매트릭스를 포함하기 때문에, 모세관력에 의해 구동되는 액체 (예컨대 용매)는 다공성 매트릭스 사이로 흘러 모든 구간을 적실 수 있다. 방출된 리포터는 액체 스트림, 전형적으로 용매 플로우(스트림)에 의해 검출 구간으로 이송된다. 액체 플로우 또는 스트림과 관련하여, 리포터 방출 구간은 샘플 적용 구간보다 하류에 위치한다. 또한, 검출 구간은, 액체 플로우 또는 스트림에 대해 리포터 방출 구간보다 하류에 위치한다. 여러 상이한 구간들의 서열과 관련하여 요약하면, 샘플 적용 구간이 제일 앞에, 리포터 방출 구간이 두 번째, 그리고 검출 구간이 세 번째 구간으로 스트리밍 액체의 연속 또는 불연속 흐름 방향으로 배치된다. 적어도 하나의 검출 구간에서 리포터의 존재 여부 및/또는 양은 일반적으로 검출 수단에 의해 정량화된다. 그러나, 검체의 존재와 겉보기 양(apparent amount)은 때로, 검출 구간의 적절한 규명을 이용하여 추가 장비 없이 단순한 육안 검사만으로도 평가가능하다.
[0007] 또 다른 구현예에 따라 검체를 검출하는 방법이 제안된다. 이 방법은:
- 다공성 매트릭스를 포함하는 검사 스트립을 제공하는 단계로서, 상기 검사 스트립은 적어도 하나의 샘플 적용 구간; 감지 물질을 포함하는 리포터 방출 구간으로서, 상기 감지 물질은 검체와 접촉된 후 리포터를 방출시킴으로써 검체와 선택적으로 상호작용하도록 적합화된 것인 리포터 방출 구간; 및 포획 물질을 포함하는 검출 구간으로서, 상기 포획 물질은 리포터에 선택적으로 결합하도록 적합하된 것인 검출 구간을 포함하는 것인 단계;
- 샘플을 샘플 적용 구간에 적용하는 단계;
- 상기 적어도 하나의 검출 구간에서 리포터의 존재 여부 및/또는 양 및/또는 농도를 탐지하는 단계
를 포함한다.
[0008] 일 구현예에서, 전술한 방법은 샘플 적용 구간으로부터 리포터 방출 구간으로의 연속 또는 불연속적인 유체 스트림(fluid stream) 및 리포터 방출 구간으로부터 적어도 하나의 검출 구간으로의 연속 또는 불연속적인 유체 스트림을 포함한다.
[0009] 통상의 기술자에게 본 발명을 수행하기 위한 최상의 모드를 비롯한 완전하고도 실시가능한 개시내용을 첨부된 도면을 참조로, 이하의 설명을 통해 더욱 구체적으로 설명한다.
[0010] 도 1은 단일 검체 (도 1A) 및 3개의 검체 (도 1B)를 검출하기 위한, 측방 유동 분석에 적합화된 검사 스트립 또는 딥 스틱(dip stick)의 작동 원리를 나타낸다. i)은 유동 전, ii)는 검체 부재하(a) 및 존재하(b-e)에서의 유동 중, 그리고 iii)은 유동 후의 각 스트립을 도시한다.
[0011] 도 2a는 다공성 매트릭스 상에 6 mm 폭으로, 17% 용액으로서 적용되어 포획 구간을 형성하는 폴리(디알릴디메틸암모늄 클로라이드) = PDDAC 라인을 포함하고 바닥으로부터 2 cm에서 리포터 방출 구간을 자극하도록 1 μL의 설포로다민 B 용액 (SURB; H2O 중 10 mg mL- 1)을 함유하는, 측방 유동 분석에 적합하된 검사 스트립 또는 딥 스틱을 나타낸다. 도 2b는 용매로서 H2O(1 및 2) 및 용매로서 인산염 완충염수 = PBS (0.8 mM; 3 및 4)을 이용하여 유동 5분 후 (1 및 2) 및 1시간 후 (3 및 4)에서의 대응하는 검사 스트립을 나타낸 도면이다. 도 2c는 용매(0.8 mM, pH 7.5)로서 PBS를 이용하여 플로우 3분 후 (1) 및 10분 후 (2)에 포획 구간으로서 PDDAC 라인 (35% 3 mm)을 함유하는 검사 스트립을 도시한다. 도 2d는 PBS 완충액 플로우 20분 후 포획 구간으로서 PDDAC 라인 (35 %, 6 mm)을 함유하는 검사 스트립을 나타낸다.
[0012] 도 3a는 샘플 적용 구간 1), 염료 2,7-디클로로플루오레신을 여기에 함유하는 리포터 방출 구간 2), 및 APTES-개질된 메조포러스 물질을 함유하는 검출 구간 3)을 함유하는, 소수성 왁스 장벽에 의해 개질된 니트로셀룰로스 스트립의 사진이다. 여기서 APTES는 (3-아미노프로필)트리에톡시실란을 의미한다. 도 3b는 검출 구간 3)에 APTES-MCM을 함유하는 스트립 상에서 2,7-디클로르플루오레신(FLU)의 유동 후 집에서 만든 UV 램프 아래에서 찍은 사진이다. MCM은 메조포러스 실리카 물질 MCM-41을 의미한다. 유동 후 검출 구간 3)에서 APTES-SBA를 갖는 대응하는 스트립을 도 3c에 도시하고 검출 구간 3)에서 COOH-MCM을 갖는 대응하는 스트립을 도 3d에 도시하였다. 여기서 SBA는 메조포러스 실리카 물질 SBA-15를 의미한다. COOH-MCM은 COOH-관능화된 MCM을 나타낸다. 사용된 약어들에 대하여는 이하에 후술한다.
[0013] 도 4a는 용매로서 PBS (80 mM)와 함께 유동시킨 후 리포터 방출 구간 2에 1 mg mL-1의 농도로 적용된 염료 SURB (좌) 및 FLU (우)와 포획 구간으로서 APTES-MCM의 라인을 포함하는 스트립을 UV 광 하에서 찍은 사진이다. 도 4b는 검출 구간으로서 COOH-MCM (L1) 및 APTES-MCM (L2)의 라인 및 용매로서 80 mM PBS와 함께 유동 후 리포터 방출 구간 2에 염료인 로다민 6G (R6G) 및 FLU (1 mg mL- 1)의 혼합물을 함유하는 스트립을 UV 광 하에서 찍은 사진이다. 도 4c는 검출 구간으로서 L1에 PVP-APTES-MCM 및 L2에 PA-COOH-MCM의 라인 및 용매로서 80 mM PBS와 함께 유동 후 리포터 방출 구간 2에 염료인 R6G 및 FLU (1 mg mL- 1)의 혼합물을 함유하는 스트립을 UV 광 하에서 찍은 사진이다. 여기서 PVP-APTES-MCM은 폴리(비닐피롤리돈)- (PVP) 개질된 APTES-MCM을 나타내고 PA-COOH-MCM은 PDDAC-개질된 COOH-MCM을 나타낸다. R6G은 색상과 형광 면에서 FLU 보다는 SURB에 더 유사하다.
[0014] 도 5a는 검출 구간 3 내의 포획 물질에서의 APTES-C (1) 및 APTES-GF (2) 페이퍼 조각 및 리포터 방출 구간 2 상에 FLU 염료 (10 mg mL-1) 스폿을 함유하는 스트립의 사진을 나타낸다. 여기서 APTES-C는 APTES-개질된 셀룰로스 페이퍼를 나타내고 및 APTES-GF는 APTES-개질된 유리 섬유 페이퍼를 나타낸다. 도 5b는 유동 중 검출 구간 3에서 PTES-C (1), APTES-GF (2) 및 COOH-GF (3)을 함유하는 대응 스트립의 UV 광 하에서의 사진을 시간에 대한 함수로서 나타낸 도면이다. 도 5c는 포획 물질 APTES-C (1), APTES-GF (2) 및 COOH-GF (3)에 대한 포획 구간 영역의 일체형 형광(integrated fluorescence)을 ImageJ 소프트웨어를 이용하여 시간에 대한 함수로서 평가한 것을 나타낸 도면이다. 약어에 대해서는 이하에 더 구체적으로 설명한다.
[0015] 도 6a는 포획 구간의 FLU-M-GF 페이퍼 조각 및 리포터 방출 구간 (시뮬레이션된 상호작용 구간) 상의 FLU 염료 스폿을 함유하는 스트립의 사진이다. 도 6b는 1) NIG-M-GF 및 2) 염료로서 FLU를 이용한 FLU-M-GF, 및 3) 염료로서 SURB를 이용한 FLU-M-GF를 함유하는 대응 스트립의, 일정 시간 간격 경과 후, UV 광 하에서의 사진이다. 여기서 NIG-M-GF는 비-각인된(non-imprinted) 젤-개질된 3-(트리메톡시실릴)프로필 메타크릴레이트-개질된 유리 섬유 페이퍼를 나타낸다. FLU-M-GF는 FLU-각인된 M-GF를 나타낸다. 도 6c는 ImageJ 소프트웨어를 이용하여 시간에 대한 함수로서 평가된, 검출 구간 영역의 임의 유닛에서의, 물질 1) NIG-M-GF 및 2) 염료로서 FLU를 이용한 FLU-M-GF, 및 3) 염료로서 SURB를 이용한 FLU-M-GF에 대한 대응하는 일체형 형광 강도의 그래프를 나타낸다. 이들 염료는 리포터 방출 구간으로부터 방출된 리포터를 시뮬레이션하기 위해 수용액으로서 적용되었으며, 이에 대해서는 이하에서 더욱 상세히 설명한다.
[0016] 도 7a는 검출 구간으로서 FLU-M-GF (F) 페이퍼 및 SURB-M-GF (S) 조각을 함유하는 유리 섬유 스트립의 사진을 나타낸다. 도 7b는 검출 구간으로서 FLU-M-GF (1-F 및 2-F) 페이퍼 및 SURB-M-GF (1-S 및 2-S) 조각을 함유하는 스트립의 바닥(bottom)에서 FLU 및 SURB (1 mM)의 혼합물 1 μL의 부재(2) 및 존재(1) 하에서의 유동 후 대응하는 스트립 사진이다. 도 7c는 시간에 대한 함수로서 형광 광 (여기의 경우 λexc 470 nm 및 505 nm, 방출 필터로서 532 nm 컷-오프 및 550 nm 롱-패스) 하에서 스트립의 대응하는 사진을 나타낸다. 도 7d는 2종의 ImageJ 소프트웨어를 이용하여 시간에 대한 함수로서 평가된 2종의 상이한 포획 물질에 대한 검출 구간 영역의 대응하는 일체형 형광 강도를 나타낸다.
[0017] 도 8a는 용매로서 2.5% MeOH를 함유하는 80 mM PBS를 이용하여 PETN (25 ppm)의 존재(1) 및 부재(2) 하에서 유동 후, 포획 물질로서 PDDAC 라인 (17%, 6 mm) 및 리포터 방출 구간 2)에서 PETN을 탐지할 수 있는 감지 물질을 함유하는 측방 유동 분석에 적합화된 검사 스트립을 나타낸다. 여기서 PETN은 모델 검체 펜타에리트리톨 테트라니트레이트를 나타낸다. 도 8b는 포획 구간으로서 PDDAC 라인(17%, 6 mm) 대신 PDDAC 라인(35%, 3 mm)을 이용하는 대응하는 분석 결과를 포함하고 도 8c는 포획 구간으로서 PDDAC 라인(6 mm 폭의 라인에 35% 용액으로서 적용됨)을 이용한 대응한 분석 결과를 나타낸다.
[0018] 도 9는 수직 적층된(stacked) 상이한 구간들을 함유하는 적층된 측방 유동 분석의 작동 원리를 나타낸다. 샘플 주입 구간 1은 최상층에 배치되고 리포터 방출 구간 2는 페이퍼의 제2층에 위치한다. 제3층으로서, 검출 구간 3을 함유하는 스트립이 바닥에 배치된다. 수직 유동 F 동안, 리포터 방출 구간 2의 감지 물질 내에 캡슐화된 리포터 (예컨대 광학 리포터 분자)는 각각의 검체가 샘플 b에 존재하는 경우에만 방출된 다음 모세관력에 의해 유동과 함께 포획 구간 3을 향해 이동되며, 이 포획 구간에서 검출을 위해 유지된다. 샘플에 검체가 부재할 경우(a에 나타낸 바와 같이), 방출이 기록되지 않는 반면, 존재할 경우 (b에 나타낸 바와 같이), 샘플로부터의 검체가 검출 구간에서 검출될 수 있다.
[0019] 도 10은 복수의 검체를 검출하는 경우의 적층된 측방 유동 분석의 작동 원리를 도식적으로 나타낸 도면이다. 상호 적층된 상이한 여러 다공성 매트릭스 층들은 샘플 주입 구간 (1), 및 2종의 상이한 검체와 선택적으로 상호작용하도록 적합화된, 2종의 상이한 리포터 분자들을 함유하는 예컨대 2종의 감지 입자의 혼합물을 함유하는 리포터 방출 구간을 포함한다. 적층체는 또한 구조화된 검출 구간 3을 포함하는 다공성 매트릭스 층도 포함한다. 두 가지 상이한 검출 구간이 있는 바닥 층은 예컨대 밀랍 인쇄(wax print)에 의해 생성될 수 있는 채널 패턴을 포함한다. 대응하는 리포터 분자들에 대해 선택적인 2종의 상이한 포획 물질을 지닌 두 가지 상이한 검출 구간이 도시되어 있다. 유동 F가 일어나는 동안, 대응하는 리포터 분자들은 적용된 상기 샘플 (b-c) 중에 각각의 검체가 존재하는 경우에만 방출된 다음 모세관력에 의해 유동과 함께 포획 구간 3으로 이동하며, 이들은 여기서 검출을 위해 유지된다. 샘플 중에 검체가 부재할 경우 (이 도면의 파트 a)에 도시된 바와 같이), 방출은 기록되지 않으며, 어떠한 검출 구간도 신호를 생성하지 않는다. 여러 상이한 리포터 방출 구간들 역시도 검출 구간을 포함하는 매트릭스 층 최상층에 적층된 상이한 매트릭스 층들에 적용될 수 있다. 바닥 층에 형성된 채널 말단에 흡수 패드가 배치될 수 있다. 검출 구간(들)을 포함하는 층에 광학 검출 수단이 위로부터 또는 아래로부터 접근가능하다
[0020] 다음의 상세한 설명에서, 도면을 참조로 본 발명을 더욱 설명하나, 첨부된 도면은 본원의 일부를 구성하는 것으로 단지 본 발명의 특정 구현예와 특징을 설명하기 위한 방편으로 제공된 것일 뿐이다. 다른 구현예도 얼마든지 이용가능하며, 본 발명의 범위를 벗어남이 없이, 구조적 및 논리적 변경이 가능함을 이해하여야 한다. 그러므로, 다음의 상세한 설명은 제한적인 의미로 해석되어서는 아니되며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해 정의된다.
[0010] 도 1은 단일 검체 (도 1A) 및 3개의 검체 (도 1B)를 검출하기 위한, 측방 유동 분석에 적합화된 검사 스트립 또는 딥 스틱(dip stick)의 작동 원리를 나타낸다. i)은 유동 전, ii)는 검체 부재하(a) 및 존재하(b-e)에서의 유동 중, 그리고 iii)은 유동 후의 각 스트립을 도시한다.
[0011] 도 2a는 다공성 매트릭스 상에 6 mm 폭으로, 17% 용액으로서 적용되어 포획 구간을 형성하는 폴리(디알릴디메틸암모늄 클로라이드) = PDDAC 라인을 포함하고 바닥으로부터 2 cm에서 리포터 방출 구간을 자극하도록 1 μL의 설포로다민 B 용액 (SURB; H2O 중 10 mg mL- 1)을 함유하는, 측방 유동 분석에 적합하된 검사 스트립 또는 딥 스틱을 나타낸다. 도 2b는 용매로서 H2O(1 및 2) 및 용매로서 인산염 완충염수 = PBS (0.8 mM; 3 및 4)을 이용하여 유동 5분 후 (1 및 2) 및 1시간 후 (3 및 4)에서의 대응하는 검사 스트립을 나타낸 도면이다. 도 2c는 용매(0.8 mM, pH 7.5)로서 PBS를 이용하여 플로우 3분 후 (1) 및 10분 후 (2)에 포획 구간으로서 PDDAC 라인 (35% 3 mm)을 함유하는 검사 스트립을 도시한다. 도 2d는 PBS 완충액 플로우 20분 후 포획 구간으로서 PDDAC 라인 (35 %, 6 mm)을 함유하는 검사 스트립을 나타낸다.
[0012] 도 3a는 샘플 적용 구간 1), 염료 2,7-디클로로플루오레신을 여기에 함유하는 리포터 방출 구간 2), 및 APTES-개질된 메조포러스 물질을 함유하는 검출 구간 3)을 함유하는, 소수성 왁스 장벽에 의해 개질된 니트로셀룰로스 스트립의 사진이다. 여기서 APTES는 (3-아미노프로필)트리에톡시실란을 의미한다. 도 3b는 검출 구간 3)에 APTES-MCM을 함유하는 스트립 상에서 2,7-디클로르플루오레신(FLU)의 유동 후 집에서 만든 UV 램프 아래에서 찍은 사진이다. MCM은 메조포러스 실리카 물질 MCM-41을 의미한다. 유동 후 검출 구간 3)에서 APTES-SBA를 갖는 대응하는 스트립을 도 3c에 도시하고 검출 구간 3)에서 COOH-MCM을 갖는 대응하는 스트립을 도 3d에 도시하였다. 여기서 SBA는 메조포러스 실리카 물질 SBA-15를 의미한다. COOH-MCM은 COOH-관능화된 MCM을 나타낸다. 사용된 약어들에 대하여는 이하에 후술한다.
[0013] 도 4a는 용매로서 PBS (80 mM)와 함께 유동시킨 후 리포터 방출 구간 2에 1 mg mL-1의 농도로 적용된 염료 SURB (좌) 및 FLU (우)와 포획 구간으로서 APTES-MCM의 라인을 포함하는 스트립을 UV 광 하에서 찍은 사진이다. 도 4b는 검출 구간으로서 COOH-MCM (L1) 및 APTES-MCM (L2)의 라인 및 용매로서 80 mM PBS와 함께 유동 후 리포터 방출 구간 2에 염료인 로다민 6G (R6G) 및 FLU (1 mg mL- 1)의 혼합물을 함유하는 스트립을 UV 광 하에서 찍은 사진이다. 도 4c는 검출 구간으로서 L1에 PVP-APTES-MCM 및 L2에 PA-COOH-MCM의 라인 및 용매로서 80 mM PBS와 함께 유동 후 리포터 방출 구간 2에 염료인 R6G 및 FLU (1 mg mL- 1)의 혼합물을 함유하는 스트립을 UV 광 하에서 찍은 사진이다. 여기서 PVP-APTES-MCM은 폴리(비닐피롤리돈)- (PVP) 개질된 APTES-MCM을 나타내고 PA-COOH-MCM은 PDDAC-개질된 COOH-MCM을 나타낸다. R6G은 색상과 형광 면에서 FLU 보다는 SURB에 더 유사하다.
[0014] 도 5a는 검출 구간 3 내의 포획 물질에서의 APTES-C (1) 및 APTES-GF (2) 페이퍼 조각 및 리포터 방출 구간 2 상에 FLU 염료 (10 mg mL-1) 스폿을 함유하는 스트립의 사진을 나타낸다. 여기서 APTES-C는 APTES-개질된 셀룰로스 페이퍼를 나타내고 및 APTES-GF는 APTES-개질된 유리 섬유 페이퍼를 나타낸다. 도 5b는 유동 중 검출 구간 3에서 PTES-C (1), APTES-GF (2) 및 COOH-GF (3)을 함유하는 대응 스트립의 UV 광 하에서의 사진을 시간에 대한 함수로서 나타낸 도면이다. 도 5c는 포획 물질 APTES-C (1), APTES-GF (2) 및 COOH-GF (3)에 대한 포획 구간 영역의 일체형 형광(integrated fluorescence)을 ImageJ 소프트웨어를 이용하여 시간에 대한 함수로서 평가한 것을 나타낸 도면이다. 약어에 대해서는 이하에 더 구체적으로 설명한다.
[0015] 도 6a는 포획 구간의 FLU-M-GF 페이퍼 조각 및 리포터 방출 구간 (시뮬레이션된 상호작용 구간) 상의 FLU 염료 스폿을 함유하는 스트립의 사진이다. 도 6b는 1) NIG-M-GF 및 2) 염료로서 FLU를 이용한 FLU-M-GF, 및 3) 염료로서 SURB를 이용한 FLU-M-GF를 함유하는 대응 스트립의, 일정 시간 간격 경과 후, UV 광 하에서의 사진이다. 여기서 NIG-M-GF는 비-각인된(non-imprinted) 젤-개질된 3-(트리메톡시실릴)프로필 메타크릴레이트-개질된 유리 섬유 페이퍼를 나타낸다. FLU-M-GF는 FLU-각인된 M-GF를 나타낸다. 도 6c는 ImageJ 소프트웨어를 이용하여 시간에 대한 함수로서 평가된, 검출 구간 영역의 임의 유닛에서의, 물질 1) NIG-M-GF 및 2) 염료로서 FLU를 이용한 FLU-M-GF, 및 3) 염료로서 SURB를 이용한 FLU-M-GF에 대한 대응하는 일체형 형광 강도의 그래프를 나타낸다. 이들 염료는 리포터 방출 구간으로부터 방출된 리포터를 시뮬레이션하기 위해 수용액으로서 적용되었으며, 이에 대해서는 이하에서 더욱 상세히 설명한다.
[0016] 도 7a는 검출 구간으로서 FLU-M-GF (F) 페이퍼 및 SURB-M-GF (S) 조각을 함유하는 유리 섬유 스트립의 사진을 나타낸다. 도 7b는 검출 구간으로서 FLU-M-GF (1-F 및 2-F) 페이퍼 및 SURB-M-GF (1-S 및 2-S) 조각을 함유하는 스트립의 바닥(bottom)에서 FLU 및 SURB (1 mM)의 혼합물 1 μL의 부재(2) 및 존재(1) 하에서의 유동 후 대응하는 스트립 사진이다. 도 7c는 시간에 대한 함수로서 형광 광 (여기의 경우 λexc 470 nm 및 505 nm, 방출 필터로서 532 nm 컷-오프 및 550 nm 롱-패스) 하에서 스트립의 대응하는 사진을 나타낸다. 도 7d는 2종의 ImageJ 소프트웨어를 이용하여 시간에 대한 함수로서 평가된 2종의 상이한 포획 물질에 대한 검출 구간 영역의 대응하는 일체형 형광 강도를 나타낸다.
[0017] 도 8a는 용매로서 2.5% MeOH를 함유하는 80 mM PBS를 이용하여 PETN (25 ppm)의 존재(1) 및 부재(2) 하에서 유동 후, 포획 물질로서 PDDAC 라인 (17%, 6 mm) 및 리포터 방출 구간 2)에서 PETN을 탐지할 수 있는 감지 물질을 함유하는 측방 유동 분석에 적합화된 검사 스트립을 나타낸다. 여기서 PETN은 모델 검체 펜타에리트리톨 테트라니트레이트를 나타낸다. 도 8b는 포획 구간으로서 PDDAC 라인(17%, 6 mm) 대신 PDDAC 라인(35%, 3 mm)을 이용하는 대응하는 분석 결과를 포함하고 도 8c는 포획 구간으로서 PDDAC 라인(6 mm 폭의 라인에 35% 용액으로서 적용됨)을 이용한 대응한 분석 결과를 나타낸다.
[0018] 도 9는 수직 적층된(stacked) 상이한 구간들을 함유하는 적층된 측방 유동 분석의 작동 원리를 나타낸다. 샘플 주입 구간 1은 최상층에 배치되고 리포터 방출 구간 2는 페이퍼의 제2층에 위치한다. 제3층으로서, 검출 구간 3을 함유하는 스트립이 바닥에 배치된다. 수직 유동 F 동안, 리포터 방출 구간 2의 감지 물질 내에 캡슐화된 리포터 (예컨대 광학 리포터 분자)는 각각의 검체가 샘플 b에 존재하는 경우에만 방출된 다음 모세관력에 의해 유동과 함께 포획 구간 3을 향해 이동되며, 이 포획 구간에서 검출을 위해 유지된다. 샘플에 검체가 부재할 경우(a에 나타낸 바와 같이), 방출이 기록되지 않는 반면, 존재할 경우 (b에 나타낸 바와 같이), 샘플로부터의 검체가 검출 구간에서 검출될 수 있다.
[0019] 도 10은 복수의 검체를 검출하는 경우의 적층된 측방 유동 분석의 작동 원리를 도식적으로 나타낸 도면이다. 상호 적층된 상이한 여러 다공성 매트릭스 층들은 샘플 주입 구간 (1), 및 2종의 상이한 검체와 선택적으로 상호작용하도록 적합화된, 2종의 상이한 리포터 분자들을 함유하는 예컨대 2종의 감지 입자의 혼합물을 함유하는 리포터 방출 구간을 포함한다. 적층체는 또한 구조화된 검출 구간 3을 포함하는 다공성 매트릭스 층도 포함한다. 두 가지 상이한 검출 구간이 있는 바닥 층은 예컨대 밀랍 인쇄(wax print)에 의해 생성될 수 있는 채널 패턴을 포함한다. 대응하는 리포터 분자들에 대해 선택적인 2종의 상이한 포획 물질을 지닌 두 가지 상이한 검출 구간이 도시되어 있다. 유동 F가 일어나는 동안, 대응하는 리포터 분자들은 적용된 상기 샘플 (b-c) 중에 각각의 검체가 존재하는 경우에만 방출된 다음 모세관력에 의해 유동과 함께 포획 구간 3으로 이동하며, 이들은 여기서 검출을 위해 유지된다. 샘플 중에 검체가 부재할 경우 (이 도면의 파트 a)에 도시된 바와 같이), 방출은 기록되지 않으며, 어떠한 검출 구간도 신호를 생성하지 않는다. 여러 상이한 리포터 방출 구간들 역시도 검출 구간을 포함하는 매트릭스 층 최상층에 적층된 상이한 매트릭스 층들에 적용될 수 있다. 바닥 층에 형성된 채널 말단에 흡수 패드가 배치될 수 있다. 검출 구간(들)을 포함하는 층에 광학 검출 수단이 위로부터 또는 아래로부터 접근가능하다
[0020] 다음의 상세한 설명에서, 도면을 참조로 본 발명을 더욱 설명하나, 첨부된 도면은 본원의 일부를 구성하는 것으로 단지 본 발명의 특정 구현예와 특징을 설명하기 위한 방편으로 제공된 것일 뿐이다. 다른 구현예도 얼마든지 이용가능하며, 본 발명의 범위를 벗어남이 없이, 구조적 및 논리적 변경이 가능함을 이해하여야 한다. 그러므로, 다음의 상세한 설명은 제한적인 의미로 해석되어서는 아니되며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해 정의된다.
상세한 설명
[0021] 단어 "a" 또는 "an"은 청구범위 및/또는 명세서에서 "포함하는/포함하다(comprising)"이라는 표현과 함께 사용될 경우, "하나"를 의미할 수 있지만, "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 하나를 초과하는"의 의미로도 사용된다.
[0022] 청구범위에 사용된 "또는"이라는 용어는, 개시 내용이 오직 어느 하나 만을 가리키거나 "및/또는"을 가리키는 정의를 뒷받침하기는 하나, 명백히 어느 하나만을 가리키거나 또는 상호 배타적인 의미가 아닌 한, "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다.
[0023] 본 명세서(상기 및 하기) 및 청구범위에서, "포함하는/포함하다(comprising)"라는 표현 (및 이의 파생어 포함), "갖는/가지다(having)"라는 표현 (및 이의 파생어 포함), "비롯한/비롯하다(including)"라는 표현 (및 이의 파생어 포함) 또는 "함유하는/함유하다(containing)"라는 표현 (및 이의 파생어 포함)은 포괄적이거나 개방형이며, 추가로 언급되지 않은 임의의 요소나 방법 단계를 배제하지 않는다.
[0024] 본 명세서(상기 및 하기) 및 청구범위에서, "다공성 매트릭스"라는 용어는 일반적으로 불활성이고 용매, 예컨대 완충 용매에서 안정성인 개공성(open-porous) 고체 물질을 포함하는 일반적으로 불규칙한 구조를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
[0025] 본 명세서(상기 및 하기) 및 청구범위에서, "메조포러스 무기 물질"이라는 용어는 일반적으로 메조포어를 포함하는 고체 바디를 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 메조포어는 평균 포어 직경이 2 nm 내지 50 nm이다. 이들 무기 물질의 평균 포어 직경을 측정하는 잘 확립된 방법은 질소 수착 다공도 측정법(nitrogen sorption porosimetry), 예컨대 주사 전자현미경 또는 투과 전자현미경과 같은 전자현미경법이다.
[0026] 본 명세서(상기 및 하기) 및 청구범위에서, "메조포러스 감지 물질"이라는 용어에는 상업적으로 입수가능하거나 실험실-제작되고 예컨대 MCM-41, HMS, MSU-n, MSU-V, FSM-16, KSW-2, SBA-n (n = 1, 2, 3, 8, 11-16), FDU-n (12, 14, 15, 16), UVM-7, UVM-8, M-UVM-7 또는 M-UVM-8, Al2O3-타입 MCM-41로 알려진 물질로부터 선택되는 무기 메조포러스 물질이 포함된다. 일반적으로, 무기 메조포러스 물질은 실리카, 즉 SiO2 또는 알루미나, 즉 Al2O3를 포함한다. 메조포러스 무기 물질은 또한 TiO2, 탄소, 탄질화물, 탄화규소, 옥시탄화규소, 탄질화규소, 질화규소, 옥시질화규소, 질화규소 알루미늄, 또는 실리코보론도 포함할 수 있다. 상기 무기 물질의 메조포어는 리포터를 함유한다. 상기 메조포어로부터 상기 리포터의 방출은 포어 폐쇄 물질(pore closing material)에 의해 차단된다. 포어 폐쇄 물질은 화학적으로 관능화될 수 있으며, 즉 에컨대, 아미노기 또는 카르복실기와 같은 관능기와 함게 제공될 수 있다. 이러한 관능기를 지니는 유기 소분자에 의한 무기 물질의 개질은 잘 알려져 있으므로 더 이상 더 상세히 설명할 필요는 없다.
[0027] 본 명세서(상기 및 하기)와 청구범위에서 "샘플"이라는 용어는 미지 농도의 검체를 함유하는 액체로서 이해된다. 일반적으로, 검체는 샘플에 용해된 형태로 존재한다. 이 경우, 샘플은 용질도 포함한다. 샘플에 함유된 용질은 샘플 적용 구간과 리포터 방출 구간 사이에 유체 연결(fluid connection)을 생성하는 액체상으로서 사용될 수 있다. 샘플에 함유된 용질에 더해, 샘플 적용 후에 순수한 용매를 샘플 적용 구간에 적용할 수 있다. 이 용매는 리포터 방출 구간과 검출 구간 사이에 유체 연결을 생성하거나 유지하는데 이용될 수 있다. 그러나, 샘플은 샘플 적용 구간에서 건조될 수도 있다. 이 경우, 리포터 방출 구간과의 유체 연결을 생성하기 위해 동일 유형 또는 다른 유형의 순수한 용매를 샘플 적용 구간에 적용할 수 있다. 마지막으로, 유체 연결은 리포터 방출 구간과 검출 구간 사이에 생성된다.
[0028] 본 명세서(상기 및 하기) 및 청구범위에서, "리포터"라는 용어는 "표시자(indicator)"와 동의어로 사용된다. 이것은 상기 및 하기에서 설명되는 바와 같이 감지 물질을 생성하기 위해 메조포러스 물질의 포어 내에 포획(entrapped)될 수 있는 것을 포함한다. 리포터는 예컨대 그의 형광, 인광 또는 발광에 의해 여기 후, 직접(예컨대 그의 색상에 의해) 또는 가접적으로 검출될 수 있다.
[0029] 본 명세서(상기 및 하기) 및 청구범위에서, "형광 측정(flurescence measurement)", "형광 염료", 및 이와 관련된 용어는 예컨대 여기 파장, 방출 바장, 형광 강도, 형광 양자 수율(fluorescence quantum yield), 형광 수명 또는 붕괴, 및/또는 형광 비 등, 또는 그의 검출과 같은 광학 특성 또는 그의 검출을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
[0030] 감지 물질의 포어 폐쇄 물질은 방출가능하다. 특히, 포어 폐쇄 물질은 일반적으로 유기 물질이고 탈착가능하게(즉 비-공유적으로) 무기 메조포러스 물질에 결합한다. 특히, 포어-폐쇄 물질은 다공성 물질에 고정된(anchored) 화합물에 의해 메조포러스 물질에 비공유적으로 결합된다. 포어-폐쇄 물질은 검체에 특이적으로 결합하도록 선택된다. 리포터 물질는 포어-폐쇄 물질이 검체와 결합할 때 포어로부터 방출된다. 검체는 일반적으로 리포터 저장소(reservoir), 즉 리포터 방출 구간을 적시는 액체 샘플에 함유된다(또는 함유되지 않음). 달리 설명하면, 메조포러스 물질 표면에 존재하는 모든 포어들은 포어 폐쇄 물질에 의해 캡핑되어 폐쇄된다. 따라서, 포어 내부에 저장된 리포터는 검체가 포어-폐쇄 물질에 의해 특이적으로 결합되지 않는 한 그리고 포어-폐쇄 물질이 다공성 무기 물질로부터 방출되지 않는 한, 주변 액체로 방출되지 못 한다. 만일 검체를 함유하는 액체가 리포터 방출 구간에서 리포터 저장소와 접촉하게 되면, 비-공유 결합을 탈착시켜 포어-폐쇄 물질과 검체 사이에 특이적인 결합(들)을 형성시킴으로써, 포어-폐쇄 물질과 메조포러스 물질 또는 그에 고정된 임의의 화합물 간의 비-공유 결합의 재-형성을 방지한다. 습윤 액체가 검체를 함유하지 않으면, 무기 다공성 물질에 대한 캡핑 물질의 비-공유 결합은 포어 폐쇄 물질을 포어 근방에 유지하기에 충분히 강할 것이다. 따라서, 메조포어가 막히고 이에 따라 리포터는 메조포어로부터 빠져나가는 것이 실질적으로 방지되므로, 아무런 신호도 생성되지 못한다.
[0031] 달리 설명해서, 무기 다공성 물질의 포어들은 포어 폐쇄 물질과 연관되는, 예컨대 합텐-유사 물질 등의 유기 분자를 포함하는 것에 의해 폐쇄된다. 포어 폐쇄 물질은 메조포러스 물질 표면에 단단히 고정된 유기 분자(화합물이라 칭해짐)에 비-공유적으로 결합된다. 리포터 - 포어 내에 초기 배치되는 -는 포어-폐쇄 물질이 액체 샘플에 존재하는 특정 검체 - 즉, 특이적인 리포터에 할당된 것 - 에 결합할 때 포어 개구부로부터 포어 폐쇄 물질을 탈착시킴으로써, 포어로부터 방출가능하다. 검체에 결합 후, 포어 폐쇄 물질은 메조포러스 물질에 포어에 근접하게 고정된 화합물(예컨대, 합텐-유사 물질)에 재결합하는 것이 방해되므로 해서 포어-폐쇄 물질이 탈착된다.
[0032] 포어 폐쇄 물질은 항체, an 항체 단편, 수용체 단백질, an 올리고뉴클레오타이드, 및 an 압타머를 포함하는 군으로부터 선택된다. 압타머는 올리고-압타머 및 펩타이드 압타머로부터 선택될 수 있다. 항체, 수용체 단백질, 올리고뉴클레오타이드 및 압타머는 검체에 특이적으로 결합가능하다. 또한, 포어 폐쇄 물질은 예컨대, 금, 은 또는 철 산화물을 포함하는 무기 나노입자; 예컨대, 금 또는 은을 포함하는 금속 클러스터; 예컨대, 카드뮴 설파이드 또는 다른 반도체 재료를 포함하는 나노결정; 또는 탄소 나노닷(nanodot) 또는 나노다이아몬드를 포함할 수 있다. 전술한 무기 나노입자, 금속 클러스터 또는 나노결정의 크기는 최대 50 nm, 전형적으로 최대 30 nm이다. 전형적인 구현예에서, 그 표면은 유기 분자 또는 항체 또는 항체 단편에 의해 개질된다.
[0033] 포어 폐쇄 물질이 항체 또는 항체 단편을 포함하는 경우, 제안된 리포터 저장소, 즉 감지 물질의 기본 메카니즘, 및 대응하는 리포터 방출의 기본 메카니즘에 관한 다음의 간략한 설명을 참조한다.
[0034] 항체와 합텐 간의 결합(들) 또는 항체와 화합물(예컨대 합텐 유도체와 유사한 유기 분자)와의 결합(들)은 비-공유적이다. 따라서, 적절한 용매 내의 포어 폐쇄 캡 (예컨대 항체)은 항상 회합 및 해리된다. 그 결과 시스템은 동적이다. 이러한 동적인 시스템에서 회합은 매우 빠르게 일어나는 반면, 해리는 다소 더디게 진행되므로, 리포터 저장소의 포어로부터의, 즉 리포터 방출 구간으로부터의 리포터 침출은 오직 미미하게만 일어난다. 리포터 저장소, 즉 리포터 방출 구간이 건조하고 용매에 의해 습윤되지 않은 경우, 침출은 전혀 일어나지 않는다.
[0035] 또한, 항체에 대한 검체의 친화도는 항체에 대한 합텐(화합물)의 친화도보다 훨씬 높다. 따라서, 항체(캡)의 결합 부위는 검체의 존재시 효과적으로 차단된다. 따라서, 합텐(화합물)에 대한 항체의 임의의 빠른 재결합이 방지된다. 이로 인해, 항체는 그의 결합 부위가 차단되는 동안 포어 개구부로부터 충분히 멀리 떨어질 수 있다.
[0036] 따라서, 검체와 항체 간의 복합체 - 동적 시스템도 포함함 - 가 해리되는 경우에조차, 포어(들)의 재-봉합은 일어나지 않을 수 있다.
[0037] 전술한 친화도와 관련하여, 검체에 대한 항체의 친화도는 합텐에 대한 항체의 친화도보다 훨씬 높다.
[0038] 설명된 구현예의 기술적 목적은 측방 유동 장치 또는 검사 스트립 상에서 무표지 및 잠재적으로 멀티플렉스화된 검출을 생성할 목적으로, 측방 유동 장치의 검출 구간에 고정된 여러 거대분자 또는 물질을 이용하는 것이다. 이들 거대분자 또는 포획 물질은 샘플 주입 구간(여기서 감지 물질은 검출하고자 하는 검체와의 특이적인 상호작용에 대해 감지 물질이 책임이 있음) 내 또는 구간 상에 배치된 메조포러스 감지 물질로부터 방출되는 리포터 분자, 즉 리포터와 선택적으로 상호작용하도록 적합화, 즉 선택된다.
[0039] 제안된 구현예의 장점은 감지 물질의 포어로부터 방출되는 리포터가 스트립 상에 잘 정의된 위치, 즉 검출 구간이나 검출 구간들 중 적어도 하나에서만 전용적으로 포획된다는 점이다.
[0040] 특히, 도 1A는 제1 구현예에 의해 제안된 검사 스트립의 작동 원리를 도시한다. 검사 스트립 i)은 샘플 적용 구간 1이라 칭해지는 샘플 주입 구간, 리포터 방출 구간 2, 및 구간 2로부터 방출되는 광학 리포터 분자와 상호작용가능한 포획 물질을 포함하는 검출 구간 3을 포함한다. 스트립을 따라 일어나는 용매의 유동 ii) 동안, 리포터 방출 구간 2에 침착된 감지 물질 내에 초기 캡슐화되어 있는 광학 리포터 분자, 즉 리포터는, 샘플(스트립 b)에 각 검체가 존재할 때에만 방출되고 이어서 모세관력에 의한 유동에 의해 검출 구간 3을 향해 이동한다. 검출 구간에서 리포터는 검출을 위해 유지된다. 샘플(스트립 a) 내에 검체가 부재할 경우, 방출은 기록되지 않으므로, 검출 구간에서 리포터가 검출되지 못한다. 리포터 방출 구간은 전형적으로 리포터 분자들로 채워진 메조포러스 물질 입자들을 포함할 수 있는데, 상기 메조포러스 물질은 리포터를 즉각 방출함으로써 검체와 상호작용할 수 있다.
[0041] 도 1B는 복수의 검체를 검출하는데 적합화된 제1 구현예에 따른 검사 스트립의 작동 원리를 나타낸다. 검사 스트립은 샘플 주입 구간 1, 리포터 방출 구간 2 및 검출 구간 3을 포함한다. 이들 3종의 상이한 유형의 감지 물질은 매트릭스 상에 침착되어 리포터 방출 구간 2를 형성한다. 상기 3종의 감지 물질은 메조포러스 물질 내부에 갇힌 리포터(리포터 분자들)와, 대응하는 포어 폐쇄 캡의 검체-특이성 두 가지 모두가 다르다. 따라서, 포어 폐쇄 캡의 특이성은 주어진 검체를 특이적으로 인식하고 일단 검체와 캡이 상호 결합되면 메조포어로부터 리포터를 방출시키도록 적합화된다. 상이한 리포터들이 캡의 상이한 특이성, 즉 상이한 검체에 할당됨에 따라, 리포터가 특정 검출 구간에 축적되면, 상응하는 검체의 존재 여부가 쉽게 검출될 수 있다.
[0042] 달리 말해, 각각 상이한 리포터 분자를 함유하고 3종의 상이한 검체 중 하나와 각각 상호작용가능한, 예컨대 3종의 하이브리드 감지 입자의 혼합물이, 리포터 방출 구간 2를 포함한다. 이와 조합적으로, 구조화된 검출 구간 3이 제공된다. 달리 말해서, 3종의 서로 다른 검출 구간이 제공된다. 3종의 상이한 검출 구간 각각은 3종의 검체 각각을 심지어 이들의 혼합물 중에서도 특이적으로 인식하도록 적합화된, 선택적 포획 물질을 포함한다. 유동 ii) 동안, 감지 물질에 캡슐화된 대응하는 광학 리포터 분자들은 대응하는 검체가 샘플에 존재할 때에만 방출되고 (스트립 b) 내지 e) 참조) 이어서 검체-민감성 캡에 의해 "인식"된다. 모세관력에 의해 구동되는, 방출된 광학 리포터는, 다공성 매트릭스 내의 용매 유동에 의해 포획 구간 3을 향해 움직인다. 액체상 (예컨대 용매)의 흐름이 스트립 말단을 향해 이동하는 반면, 리포터는 리포터가 검출될 수 있는 지정된 구간 내에 특이적으로 유지된다. 샘플에 검체가 부재할 경우 (스트립 a) 참조), 리포터 방출은 기록되지 않는다. 예컨대 샘플 주입(적용) 구간 반대쪽의 검사 스트립 말단에 흡수 패드를 제공함으로써 스트리밍 액체상의 지속적인 흐름을 유지할 수 있다.
[0043] 일 구현예에 따라 광학 리포터가 감지 물질의 포어 내에 함유되어 있는 검사 스트립이 제안되며, 여기서 감지 물질의 포어는 포어-폐쇄 물질에 의해 폐쇄되어 있고, 상기 포어-폐쇄 물질은 검체에 특이적으로 결합하도록 선택되어, 검체가 포어-폐쇄 물질에 특이적으로 결합할 경우 포어로부터 광학 리포터를 방출시킨다.
[0044] A): 리포터 분자를 방출할 수 있는 하이브리드 나노입자가, 샘플 적용 구간에 초기 게이트되었다는 것 및; B): 검출 구간에 고정된 특이적인 포획 물질로서, 상기 포획 물질은 게이트된 하이브리드 나노입자로부터 방출된 리포터 분자와 선택적으로 상호작용하도록 적합화된 것이라는 조합은, 신규한 측방 유동 장치 설계를 위한 강력한 도구라는 점에서 유리하다. 한편으로, 포어 개구부에서의 별도 단계와 관계없이, 게이트된 센서 물질은 검체의 특이적인 인식이 일어난 후에만 리포터 분자를 방출함으로써 대량 신호 증폭을 생성할 수 있다. 다른 한편, 방출된 리포터 분자와의 선택적인 상호작용을 위해 맞춤된 포획 물질을 사용함으로써, 리포터 분자를 보다 효과적으로 검출할 수 있도록 집중, 즉 포커싱하고, 선택적인 멀티-스폿 검출 구간을 생성할 수 있다. 이에 따라 다양한 검체의 멀티플렉스화된 검출시 동시에 여러 리포터 분자를 동시에 검출하는 것이 가능하다. 동시 멀티플렉싱은 이론적으로는 가능하지만, 검사 스트립 상 또는 측방 유동 장치에서의 상이한 검체 및/또는 표시자 분자의 분리가 어렵기 때문에, 실무적으로 아직까지 실현되지 않았다. 전형적인 구현예에 따라, 리포터는 염료, 형광 물질, 형광 이온, 희토류 금속 이온, 또는 이의 임의의 조합을 포함하나 이는 일부만 거론한 것이다. 리포터는 적어도 포획 물질에 의해 포획된 후에는 직접 또는 간접적으로 광학적으로 검출가능하도록 선택된다.
[0045] 일 구현예에서 포어-폐쇄 물질이 감지 물질에 비-공유적으로 결합되고 검체에 의해 결합될 경우 감지 물질로부터 탈착되는, 검사 스트립이 제안된다.
[0046] 메조포러스 무기 물질에 대한 포어 폐쇄 물질의 비-공유 결합은 포어 내부로부터 용매 스트림으로 리포터의 간섭되지 않은 확산을 용이하게 해주므로 유리하다. 다른 한편으로, 포어 폐쇄 물질, 즉 "게이트(gate)" 자체는 어떠한 입체 장애 없이 쉽게 확산가능하므로 검체의 특이적 결합이 용이하다. 공유결합된 게이트에 비해, 검체-결합 프로세스는 더 빠르고 그의 특이성도 보존된다.
[0047] 일 구현예에서 광학 리포터가 형광 염료, 유색 염료 또는 예컨대 유로퓸 이온과 같은 희토류 원소의 발광 무기 형광 이온을, 일반적으로 유기 감광제 리간드와의 복합체 형태로서 포함하는, 검사 스트립이 제안된다.
[0048] 형광 염료는 특출한 감도와 선택적인 광학 검출을 가능케 하므로 유리하다. 유기 리간드, 희토류 원소, 예컨대 비제한적인 예로서 유로퓸, 테르븀, 이테르븀, 이트륨, 또는 가돌리늄의 이온과의 복합체 형태로 사용될 경우, 특징적이고도 좁은 원자 방출선이 나타나며 이에 따라 상당히 선택적이면서도 고감도로 검출가능하다.
[0049] 일 구현예에서, 리포터가 로다민, 플루오레신, 스티릴, 시아닌 및 폴리메틴, 피리디늄, 피릴륨, 티오피릴륨, 루테늄, 오스뮴 또는 이리듐 복합체, 희토류 원소 (유로퓸 또는 테르븀 등)의 발광 복합체 및 스쿠아릴륨 유도체를 포함하는, 검사 스트립이 제안된다. 이에 더해, 쿠마린, 디파이로메텐 또는 BODIPY, 파이로메텐, 벤조퓨란, 피리딘, 나프탈이미드, 벤족사졸, 벤족사디아졸, 벤진돌, DAPI, 스틸벤, 옥사진, 페릴렌, 아줄렌, 스티릴 염기, 피코에리트린, 스쿠아라인, 포르피린 및 프탈로시아닌 염료의 모든 중성, 양이온 및 음이온 유도체.
[0050] 유리하게도, 이들 형광 및 발광 물질 및 화합물의 대다수는 상업적으로 입수가능하므로, 이들의 검출을 위한 적절한 광학 및 분광학적 장비도 입수가능하다.
[0051] 일 구현예에서, 포획 물질이 분자 각인된 폴리머, 폴리이온 액체, 고분자전해질(polyelectrolyte) 또는 화학적으로 관능화된 메조포러스 물질로부터 선택되고 티올, 이소시아네이트, 아미노기, 히드록실기, 에폭시기 또는 카르복실산기로부터 선택되는 관능기를 표면에 포함하는 검사 스트립이 제안된다.
[0052] 포획 물질이 리포터에 특이적으로 결합되도록 적합화되므로 유리하다. 리포터에 대한 포획 물질의 친화성은, 예컨대 정전기적 상호작용, 선택적 친화성 결합, 소수성 상호작용, 비특이적 이화학적 흡수 또는 혼합-모드 메카니즘에 기인할 수 있다.메조포러스 물질을 개질하기 위한 관능기들은, 예컨대, 히드록실-, 카르복실-, 에폭시-, 아미노-, 설프히드릴기 또는 4급 암모늄기와 같은 하전된 관능기로부터 선택될 수 있다.
[0053] 일 구현예에서, 포획 물질이 분자 각인된 폴리머로부터 선택되는 검사 스트립이 선택되되, 여기서 상기 분자 각인된 폴리머는: 아크릴아미드, 비닐 피리딘, N-이소프로필아크릴아미드, 2-히드록시에틸 메타크릴레이트, 메틸 메타크릴레이트, 벤질 메타크릴레이트, 메타크릴레이트, 메타크릴아미드, N,N'-디메틸 메타크릴아미드, 비닐알코올, 비닐이미다졸로부터 선택된 1종 이상의 유형의 모노머를 가교제와의 가교에 의해 중합시킴으로써 생성되며; 상기 가교제는: 에틸렌 디메타크릴레이트, 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트, 폴리(아크릴산), 비스(b-히드록시에틸) 설폰, 트리메틸올프로판 트리메타크릴레이트 또는, 예컨대, 펜타에리트리톨 트리아크릴레이트로부터 선택된다.
[0054] 이들 폴리머는 예컨대 로다민 또는 플루오레신 등의 염료로 각인될 수 있고, 임의의 유의한 배경 신호를 일으킴이 없이 리포터와 꽤 강하게 결합할 수 있으므로 유리하다. 양하전된 염료도 각인에 이용가능하다.
[0055] 일 구현예에서, 포획 물질이 폴리이온 액체(PIL) 또는 고분자전해질로부터 선택되는 검사 스트립이 제공되며, 여기서 상기 고분자전해질은 전형적으로 다가양이온(polycations) 또는 다가음이온(polyanions) 예컨대 폴리(디알릴디메틸암모늄 클로라이드), 폴리(알릴아민) 염산염, 폴리아크릴산, 폴리(비닐피롤리돈) (PVP), 폴리(소듐 스티렌 설포네이트) (PSS), 시클로덱스트란 또는 폴리덱스트란을 포함한다.
[0056] 이들 고분자전해질은 완충된 용액에서 조차 리포터의 강력한 결합을 보증하므로(고농도 고분자전해질 사용) 유리하다. 다가양이온 또는 다가음이온 거대분자들은 검출 구간 조립을 위해 매트릭스에 쉽게 적용될 수 있다. 또 다른 장점은 고분자전해질이 음이온 또는 양이온 염료와 선택적으로 상호작용할 수 있다는 것이다.
[0057] 일 구현예에서, 검사 스트립이, 검출 구간 하류에 배치되어 용매를 흡수하도록 적합화된 흡수 구간을 더 포함하는 것인 검사 스트립이 제안된다.
0058] 안정적으로 유동하는 용매 스트림을 얻을 수 있어 유리하다. 리포터 방출 구간에서 방출된 리포터는 검출 구간에 도달하거나, 또는 검출 구간들 각각에 도달할 수 있다.
[0059] 일 구현예에서, 적어도 하나 또는 그 이상의 검출 구간을 포함하는 검사 스트립 영역이 장벽에 의해 둘러싸인 검사 스트립이 제안된다. 장벽은 다공성 매트릭스의 포어를 국지적으로 밀폐시키거나 및/또는 용매에 대한 다공성 매트릭스의 습윤성을 국지적으로 개질시킨다. 그러므로 장벽은 다공성 매트릭스 내에 터널을 형성한다. 이 구현예의 일 변형예에서, 조립된 채널은 샘플 적용 구간, 리포터 방출 구간, 및 검출 구간을 연결할 수 있다. 샘플 적용 구간, 리포터 방출 구간 및 검출 구간(들)은 용매의 유동 방향에서 서로 뒤에 배치될 수 있다.
[0060] 다공성 매트릭스 내에 형성된 채널은 액체상 또는 용매의 직접 스트림을 용이하게 하므로 유리하다. 이러한 채널의 표준화된 형상은 이동상으로서 사용되는 용매의 표준화된 스트리밍 조건을 허용하여 상이한 측방 유동 스트립들을 비교하는 것이 가능하고, 이에 따라, 표준화된 분석을 가능한다.
[0061] 일 구현예에서, 장벽이 왁스를 포함하는 검사 스트립이 제안된다. 별법으로, 다공성 매트릭스에 결합된 예컨대 실란에 의해 제공되는 관능기는 매트릭스의 습윤성을 변경 또는 제한할 수 있으므로 다공성 매트릭스 내에 채널-유사 구조 또는 패턴을 만들 수 있다.
[0062] 셀룰로스 및 유리 섬유 페이퍼 뿐만 아니라 다른 다공성 매트릭스 물질에서도 언급된 물질을 이용하여 효과적으로 채널을 조립할 수 있으므로 유리하다.
[0063] 일 구현예에서, 감지 물질이 메조포러스 무기 물질을 포함하는, 검사 스트립이 제안된다
[0064] 수많은 메조포러스 무기 물질이 접근가능하고 심지어 상업적으로 구입가능하므로 유리하다. 상기 메조포러스 물질은 리포터 물질, 예컨대 형광 염료 또는 이온으로 쉽게 충전가능하다.
[0065] 일 구현예에서, 메조포러스 무기 물질이 실리카, 알루미나, TiO2, 탄소, 탄질화물, 탄화규소, 옥시탄화규소, 탄질화규소, 질화규소, 옥시질화규소, 질화규소 알루미늄, 또는 실리코보론 탄질화물을 포함하는 것인 검사 스트립이 제안된다.
[0066] 이들 물질은 화학적으로 불활성이어서, 리포터 분자, 예컨대 염료와 함께 쉽게 로딩가능하고, 적절한 캡핑 물질에 의해 쉽게 개질되어 검체-적합화된 감지 물질을 생성할 수 있으므로 유리하다.
[0067] 일 구현예에서, 다공성 매트릭스가 페이퍼, 펠트, 부직포, 섬유, 압축 또는 소결된 분말, 천, 또는 조직으로부터 선택되고, 여기서, 페이퍼, 펠트, 부직포, 섬유, 압축 또는 소결된 분말, 천, 및 조직은 예컨대 코튼 또는 셀룰로스, 유리, 세라믹, 탄소, 그래핀, 미네랄 또는 금속과 같은 폴리머를 적어도 1종 포함하는 것인 검사 스트립이 제공된다.
[0068] 적절한 물질은 분석하고자 하는 샘플의 실제 용매 또는 액체상에 의해 습윤가능하도록 선택될 수 있으므로 유리하다.
[0069] 일 구현예에서, 검사 스트립이 하나의 리포터 방출 구간 및 2 내지 7개의 검출 구간을 포함하는 것인 검사 스트립이 제안된다. 이러한 복수의 검출 구간은 본 명세서에서 구조화된(structured) 검출 구간이라고도 칭해진다.
[0070] 수 개의 검출 구간은 패턴 인식 원리를 적용하여 자동화된 샘플 분석 및 멀티플렉싱을 가능케하므로 유리하다. 멀티플렉스 분석은 분석 화학, 임상 화학 및 생화학에서 복수의 검체를 일회/일 사이클의 분석법으로 동시에 측정하는데 사용되는 분석 유형이다. 이것은 한번에 하나의 검체를 측정하는 공정과 구별된다. 수 개 검출 구간을 사용하는데 따른 장점은 단일 채널로 멀티플렉싱 분석이 가능하다는 점이다. 이들 검출 구간이 부재할 경우, 멀티플렉싱을 생성하기 위해서는 상이한 여러 채널이 요구된다.
[0071] 일 구현예에서, 적어도 리포터 방출 구간에서 및/또는 검출 구간에서 검사 스트립이 적어도 2개의 매트릭스 층을 갖는 것인 검사 스트립이 제안된다
[0072] 검사 스트립은 특정 구간들을 커버 및 포함하는 2개의 비개질 매트릭스 층들 사이에 상기 특정 구간(예컨대 검출 구간)을 포함하는 매트릭스 층들을 샌드위치시킴으로써 검사 스트립을 쉽게 제조할 수 있으므로 유리하다. 스트립들은 또한 유동을 가능케 하고 상이한 구간들을 통한 리포터 확산을 가능케 하는 모세관력을 이용하여, 적층을 통해 제조할 수도 있다.
[0073] 일 구현예에서, 검사 스트립의 형상은 비-정사각형 직사각형(non-square rectangle)에서 벗어나 정사각형 직사각형 또는 임의의 다른 형상을 포함한다. 예를 들어, 검사 스트립은 적어도 원형 또는 삼각형의 섹션을 포함할 수 있다.
[0074] 직사각형(oblong shape)의 검사 스트립이 측방 유동 분석에서 가장 널리 이용되는 포맷인만큼 바람직하지만, 사용된 리포터(들)을 검출 구간(들)로 운반하는 스트리밍 액체 상의 배향된 흐름을 생성하기 위해, 다른 형상의 다공성 기질도 이용가능하다. 스트립 내에서의 적절한 용매 유동을 생성하기 위해 여러 패턴을 조합하여 사용할 수 있다.
[0075] 일 구현예에서, 샘플 적용 구간이 리포터 방출 구간의 최상부에 배치된다. 이것은 리포터 방출 구간의 최상부에 직접 배치되리 수도 있고 또는 중간 매트릭스 층과 함께 적층체를 형성할 수도 있다.
[0076] 상이한 다공성 매트릭스 물질이 상이한 구간에 선택될 수 있으므로 유리하다. 이 개질에 따라, 표시된 구간, 즉 샘플 적용 구간, 리포터 방출 구간 및 적어도 하나의 검출 구간은 리포터(들)을 검출 구간(들)으로 운반하는 용매의 흐름을 따라 배치된다.
[0077] 일 구현예에서, 검체를 검출하는 방법이 제안되며, 이 방법은:
- 전술한 임의의 구현예에 따른 검사 스트립을 제공하는 단계;
- 샘플을 검사 스트립의 샘플 적용 구간에 적용하는 단계
- 적어도 하나의 검출 구간 내의 광학 리포터의 존재 여부 및/또는 양 및/또는 농도를 검출하는 단계;
- 샘플 내 검체의 존재 여부 및/또는 농도를 탐지하는 단계
를 포함한다.
[0078] 이 방법은 멀티플렉스 분석 포맷에 적합하므로 유리하다.
[0079] 일 구현예에서, 제안된 방법은 샘플 적용 구간에서 리포터 방출 구간으로, 그리고 리포터 방출 구간에서 적어도 하나의 검출 구간으로 연속 또는 불연속적 유체 스트림을 생성하기 위해 유체를 제공하는 단계를 더 포함한다. 액체는 검체를 위한 용매로부터 선택될 수 있다.
[0080] The 액체는 샘플의 액체 상, 예컨대 용매에 의해 제공될 수 있다. 별법으로, 액체, 예컨대 검체용 용매는 별도 단계에서, 샘플이 적용된 후에 첨가될 수 있다. 일반적으로, 액체는 검체를 샘플 적용 구간으로부터 적어도 리포터 방출 구간으로 운반하는 흐름(액체 스트림)을 생성한다. 또한, 리포터 방출 구간으로부터 검출 구간을 향하는 흐름(액체 스트림)이 생성된다. 액체의 양에 따라, 샘플 적용 구간으로부터 리포터 방출 구간을 통해 검출 구간에 이르는 연속적인 액체 스트림이 존재할 수 있다. 그러나, 샘플 적용 구간으로부터 리포터 방출 구간으로 향하고, 중력에 의해 및/또는 모세관력에 의해 구동될 수 있는 제1 스트림 및, 제2 스트림을 갖는 것도 가능하다. 상기 제2 스트림은 일반적으로 모세관력에 의해 구동되며 리포터 방출 구간으로부터 검출 구간을 향하고 심지어 그 하류에 위치하는 흡수 패드에 도달할 수도 있다. 상이한 여러 용매의 조합은 검체 현탁액의 검출을 가능케 하므로 유리하다.
[0081] 일 구현예에서 광학 리포터가 형광 염료이고 핸드 헬드 장치, 즉 휴대용 장치에 의한 형광 측정에 의해 검출이 달성되는, 검체의 검출 방법이 제안된다.
[0082] 상기 검출 방법은 인프라 구조가 없거나 최소한도인 세팅에서도 정교한 장비 없이, 현장에, 스폿에 적용가능하므로 유리하다.
[0083] 또 다른 구현예에서, 스마트폰, 태블릿, 또는 이동통신수단 및 컴퓨팅 장치와 같은 휴대용 장치를 이용하여 예컨대 광발광(photoluminescence)과 같은 광학 신호를 수집하고 선택된 검출 구간 내의 광발광이 특정 검체의 존재를 가리키는 것인지 알아낼 수 있다.
[0084] 어떤 스마트폰 모델에는 사용자 및/또는 프로그래머가 카메라의 노출 및 셔터 속도에 접근 및 이를 제어할 수 있도록 하는 수단을 장착할 수 있다. 예를 들어 카메라 획득으로부터 적절한 미가공 이미지, 예컨대 자동-노출 보정 알고리듬이없는 이미지를 얻는 것이 유리할 수 있다. 스마트폰 하드웨어 또는 소프트웨어에 통합될 수 있는 이러한 알고리듬은 최종 사용자에 있어 취미 사진가로서 편리할 수 있지만, 스마트폰을 화학 분석 및 화학 기술에 사용할 경우 문제를 일으킬 수 있다. 예를 들어, CMOS 또는 CCD와 같은 카메라의 검출기에 의해 수신된 lux 양은 소정의 특정 lux 기준에 일치하도록 자동으로 조정될 수 있다. 적절하게 보정되고 수정된 값 대신 이러한 값을 사용하면 오해의 소지가 있고 잘못된 결과가 발생할 수 있다.
[0085] 따라서, 또 다른 구현예에서, 상기 제안된 방법은 검출 구간 내의 광발광을 예컨대 보정값과 비교하는 단계; 예를 들어 발광 등의 신호를 레퍼런스와 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다. 레퍼런스는 예를 들어 저장된 데이터이거나 또는 검사 스트립 상의 레퍼런스 스폿일 수 있다.
[0086] 뿐만 아니라, 검출 구간에서 생성된 신호 강도 대 리포터 방출 구간에서 생성된 신호 강도의 비(ratio)를 검체의 반-정량적 검출에 이용할 수 있다. 특히, 검출 구간에서의 형광 강도를 검출 구간에서의 형광 강도와 리포터 방출 구역에서의 형광 강도의 합으로 나눈 몫, 즉 방출된 리포터를 리포터의 총량으로 나눈 비와 동등한 값을 검체의 반-정량적 검출에 이용할 수 있다. 또한 상이한 여기 또는 방출 파장에서 얻어진 형광 값의 비도 이용가능하다. 전형적인 구현예에서, 스트립 또는 적어도 검출 구간의 디지털 이미지는 디지털 카메라로 수득가능하다. 디지털 이미지 또는 그 섹션은 오픈 소스 이미지 처리 프로그램 ImageJ (https://imagej.net/)를 사용하여 처리될 수 있다. 이러한 처리는 내부 참조 및 반-정량적 검출 모두에 사용될 수 있다.
[0087] 전술한 각 구현예는 달리 명확하게 지시되지 않는 한 임의의 다른 구현예 또는 구현예들과 조합될 수 있다.
[0088] 제안된 구현예들은 측방 유동 분석 (도 1 참조)에 적합화되고 다음을 포함하는 검사 스트립 또는 딥 스틱의 설계를 포함한다: 첫째, 샘플 도입 섹션(즉 샘플 적용 구간); 둘째, 검체와 특이적으로 상호작용가능한 메조포러스 하이브리드 감지 물질을 함유하는 섹션 또는 세그먼트 (즉 리포터 방출 구간); 및 셋째, 감지 물질로부터 방출된 광학 리포터 분자와 특이적으로 상호작용할 수 있는 포획 물질을 함유하는 섹션 또는 세그먼트(즉 검출 구간). 이 섹션은 감지 물질들의 혼합물이 사용될 경우, 리포터 분자로서 상이한 여러 리포터들(예컨대 비제한적인 예로서 염료, 형광 물질, 형광 이온, 희토류 원소의 이온, 또는 이들의 조합물)을 유지할 목적에서 두 가지 이상의 포획 물질을 함유할 수 있다.
[0089] 일단 유동이 측방 유동 또는 딥-스틱 분석 포맷에 대해 개시되면, 용매는 검체를 구간 1에서 구간 2로 수송할 수 있으며, 여기서 감지 물질이 침착되는데, 대응하는 검체가 존재할 경우에만, 감지 물질로부터의 리포터 분자의 방출이 일어나게 된다. 그런 다음 리포터는 구간 2에서 각 검출 구간 3으로 이동한다. 리포터(들)은 그의(그들의) 특이적인 화학 성질에 따라 리포터에 상보적으로 선택된 다양한 거대분자 또는 포획 물질을 이용함으로써 유지된다. 리포터와 포획 물질의 상호작용으로 인해 리포터는 일반적으로 검출 구간에 고정된다.
[0090] 이들 구현예의 기술적 목적은 측면 유동 장치에 무표지, 잠재적으로 멀티플렉스화된 검출을 제공할 목적으로, 검사 스트립의 검출 구간에 고정된 여러 포획 물질을 사용하는 것이다. 이들 고정된 거대분자 또는 포획 물질은 광학 리포터와 선택적으로 상호작용할 수 있을 것이다. 광학 리포터는 샘플 주입 구간(즉, 샘플 적용 구간)으로부터 검출 구간(들)을 향해 이동하는 검체에 의해 감지 물질로부터 이미 선택적으로 방출된다. 이 방법의 장점은 성공적인 검출 이벤트가 일어나는 동안 게이트된 물질의 포어로부터 방출된 리포터가 스트립 상의 잘 정의된 위치에서만, 즉 검출 구간 또는 다양한 검출 구간 중 하나에서만 전용적으로 포획된다는 것이다. 이것은 잘-정의되고 한정된 영역에서 리포터를 포커싱하기 때문에 선택성을 향상시킬 뿐만 아니라 감도도 향상시켜준다.
[0091] 다공성 매트릭스 물질은 다음을 포함할 수 있다:
a) 셀룰로스, 코튼, 천, 그래핀, 탄소 나노튜브 (CNT); 유리 섬유 페이퍼, 유리 또는 광학 리포터와 특이적으로 상호작용할 수 있는 특정 유기기에 의해 개질된 폴리머.
b) 복수의 유기실란을 이용하여 특정 유기기(예컨대, 3-아미노프로필트리에톡시실란 (APTES)를 이용한 아미노기 또는 무수 숙신산과 아미노기의 개환 링커 연장 반응에 의한 카르복실산기)에 의해 개질된 실리카 또는 알루미나 메조포러스 물질 (예컨대, SiO2-타입 MCM-41, HMS, MSU-n, MSU-V, FSM-16, KSW-2, SBA-n (n = 1, 2, 3, 8, 11-16), FDU-n (12, 14, 15, 16), UVM-7, UVM-8, M-UVM-7 또는 M-UVM-8, Al2O3-타입 MCM-41), 광학 리포터, 양이온성 또는 음이온성 고분자전해질의 특이적인 검출을 위한, 특정한 분자적으로 각인된 폴리머(MIP: molecularly imprinted polymers) 또는 각인된 젤.
[0092] 설명된 구현예들은 의료, 환경, 안전 및 식품 진단 산업에 있어서 소분자 검출을 위한 다양한 응용 분야를 갖는다. 제안된 구현예들의 가능성을 입증하기 위해, 사용된 실험실 방법 및 재료를 설명하는 일부 실시예들이 이하에 제공된다.
실시예
[0093] 전술한 공정에 따라 MCM-41 및 SBA-15 타입 메조포러스 물질의 합성을 수행하였다. MCM-41의 경우, 먼저 n-세틸트리메틸암모늄 브로마이드 (CTAB, 1.00 g, 2.74 mmol)를 480 mL의 milliQ 워터에 용해시켰다. 이어서, 3.5 mL의 NaOH (milliQ 워터 중 2.00 M)를 CTAB 용액에 첨가한 다음 용액의 온도를 80℃로 조정하였다. 이어서 TEOS (5.00 mL, 2.57·10- 2 mol)를 계면활성제 용액에 적가하였다. 혼합물을 2 시간 교반하여 백색 침전물을 얻었다. 마지막으로, 고체 생성물을 원심분리하고, milliQ 워터 및 에탄올로 세척한 다음, 60℃에서 건조하였다. 계면활성제를 제거하기 위해, 샘플을 560℃에서 8 시간 소성시켰다.
[0094] 구조 지시제로서 트리블록 폴리(에틸렌 옥사이드)-폴리(프로필렌 옥사이드)-폴리(에틸렌 옥사이드) (EO 20 -PO 70 -EO 20 , P123) 코폴리머 및 실리카 공급원으로서 테트라에틸오르토실리케이트 (TEOS)를 이용하여 SBA-15를 합성하였다. 전형적인 합성법에서, 4.0 g (0.69 mmol)의 P123을 120 mL의 물 및 19.41 mL의 HCl에 용해시킨 다음 폴리머를 용해시키기 위해 35℃에서 1 시간 교반하였다. 이어서, 35℃에서 24 시간 동안 교반하면서 9.15 mL의 TEOS (41 mmol)를 균질한 용액에 적가하였다. 얻어진 젤을 추가로 24 시간 동안 교반함이 없이 테플론 플라스크에서 100℃에서 숙성시켰다. 얻어진 백색 고체를 여과하고, 증류수로 세척한 다음, 진공 하 70℃에서 12 시간 동안 공기-건조시켰다. 마지막으로, 560℃에서 8 시간 동안 소성시킴으로서 주형을 제거하였다.
[0095] 다음에, 염료(리포터)의 검출을 위한 물질, 특히 APTES-MCM 및 APTES-SBA 물질의 합성에 관해 설명한다. 보고된 공정에 따라 물질들을 개질시켰다. 과량의 3-아미노프로필트리에톡시실란 (APTES; 186.3 μL, 8 mmol g- 1SiO2) 및 2.5 mL의 아세토니트릴 (MeCN) 중 100 mg의 MCM-41 또는 SBA-15의 현탁액을 아르곤 분위기 하 실온에서 5.5 시간 동안 교반하였다. 이어서, 물질들을 대략 10,000 rpm으로 5분간 원심분리한 다음 1.5 mL의 MeCN으로 2회 세척하였다. 마지막으로, 물질을 40℃에서 2 시간 동안 진공 건조시켜, 결과적인 물질 APTES-MCM 및 APTES-SBA을 수득하였다.
[0096] 다음에, COOH-MCM의 합성에 대해 설명한다. 보고된 공정에 따라, MCM-41를 카르복실산기로 개질하기 위해, 50 mg APTES-MCM 물질을 1.5 mL의 EtOH에 현탁시켰다. 250 μL의 무수 숙신산 (100 mg mL-1) 용액을 제조된 각 현탁액에 첨가하고 현탁액들을 40℃에서 밤새 방치 교반하였다. 이어서, 물질들을 약 10,000 rpm으로 5 분간 원심분리한 다음, 1.5 mL의 EtOH로 2회 세척하였다. 마지막으로, 물질들을 40℃에서 2 시간 진공건조시켜 결과적인 물질 COOH-MCM을 수득하였다.
[0097] 다음에, PA-COOH-MCM 및 PVP-APTES-MCM의 합성에 대해 설명한다. 폴리(비피롤리돈) 40 (PVP-40) 및 폴리(디알릴디메틸암모늄 클로라이드) (PDDAC)를 각각 APTES-MCM 및 COOH-MCM의 표면에 화학적으로 흡착시켰다. PVP-APTES-MCM의 합성을 위해, 20 mg의 APTES-MCM을 H2O (1 mL) 중 25 mg mL-1의 PVP-40 용액에 2시간 동안 현탁시켰다. 20 mg의 COOH-MCM을 물에 35% PDDAC 용액 50 μL을 함유하는 1 mL의 H2O에서 2 시간 동안 현탁시켜 PA-COOH-MCM을 제조하였다. 2 시간 후, 두 가지 현탁액을 모두 약 10,000 rpm으로 4분간 원심분리한 다음 1.5 mL의 H2O로 2회 세척하였다. 마지막으로, 물질을 40℃에서 2 시간 진공 건조시켜, 결과적인 물질 PVP-APTES-MCM 및 PA-COOH-MCM을 수득하였다.
[0098] 다음에, APTES-셀룰로스 페이퍼 (APTES-C) 및 APTES-유리 섬유 페이퍼 (APTES-GF)의 합성에 대해 설명한다. 셀룰로스 페이퍼 및 유리 섬유 페이퍼를 3-아미노프로필트리에톡시실란 (APTES)을 이용하여 아미노기로 개질시켰다. 이를 위해, 대응하는 페이퍼(2 Х 0.5 cm) 20 조각을 7 mL의 톨루엔 및 100 μL의 APTES에 현탁시켰다. 샘플을 16시간 동안 80℃에서 교반하였다. 결과적인 아미노-개질된 페이퍼들을 수집한 다음 톨루엔으로 2회, EtOH로 1회 세척하고 진공 하에 3 시간 건조시켜 대응하는 APTES-C 및 APTES-GF 페이퍼를 수득하였다.
[0099] 다음에, COOH-셀룰로스 페이퍼 (COOH-C) 및 COOH-유리 섬유 페이퍼 (COOH-GF)의 합성에 대해 설명한다. 카르복실산기에 의한 APTES-C 및 APTES-GF 페이퍼의 개질을 위해, 보고된 공정에 따라 각 페이퍼 5 조각을 1.5 mL의 EtOH와 혼합하였다. 250 μL의 무수 숙신산 (100 mg mL-1) 용액을 제조된 각 혼합물에 첨가하고, 40℃에서 밤새 방치 교반하였다. 이어서, 페이퍼들을 제거하고 1.5 mL의 EtOH로 2회 세척하였다. 마지막으로, 페이퍼들을 40℃에서 2 시간 진공 건조하여, 결과적인 페이퍼 COOH-MCM 및 COOH-SBA를 수득하였다.
[00100] 다음에, 메타크릴레이트-유리 섬유 페이퍼 (M-GF)의 합성에 대해 설명한다. APTES 대신 3-(트리메톡시실릴)프로필 메타크릴레이트를 사용한 것을 제외하고, APTES-GF에 대해 설명된 것과 동일한 공정에 따라 유리 섬유 페이퍼를 메타크릴레이트기로 개질시켜, 페이퍼 M-GF를 수득하였다.
[00101] 다음에, 선택적인 폴리머 젤 및 염료 검출을 위한 페이퍼 상의 폴리머 젤의 합성에 대해 설명한다. 특히, FLU-M-GF, SURB-M-GF, SURG-M-GF, R6G-M-GF 및 RuBipy-M-GF의 합성에 대해 설명한다.페이퍼 상에 각인된 펭퍼 젤들을 문헌에 기재된 공정에 따라 수성 침전 중합법을 이용하여 제조하였다. 일반적으로, 10 조각의 M-GF (2 x 0.5 cm)를, 아크릴아미드 (AAm; 29.1 mg, 0.41 mmol) 및 N-이소프로필아크릴아미드 (NIPAAm; 46.4 mg, 0.41 mmol)를 함유하는 6 mL의 PBS 용액 (20 mM; pH 7.2)과 혼합하였다. 5 mM의 대응하는 주형 분자 2,7-디클로로플루오레신 (FLU), 설포로다민 B (SURB), 설포로다민 G (SURG), 로다민 6G (R6G) 또는 루테늄 바이피리딘 (RuBipy)의 150 μL의 용액을 상기 용액에 첨가하고 혼합물을 25℃에서 30분간 서서히 교반하면서 인큐베이션하여 복합체를 형성하였다. 그 후, 가교제 N,N'-에틸렌 비스(아크릴아미드) (EBAAm; 25.2 mg; 0.15 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 N2로 1 시간 정화한 후, 암모늄 퍼설페이트(APS; 6 mg) 및 N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민 (TEMED; 3 μL)을 첨가함으로써 중합을 개시하였다. N2 분위기 하, 25℃에서 1 시간 동안 반응을 지속시키자, 10분 후 젤이 형성되는 것으로 관찰되었다. 반응 1 시간 후, 결과적인 각인된 페이퍼 젤을, 이들을 젤로부터 제거함으로서 수집한 다음, 미반응 모노머 및 주형들이 완전히 제거될 때까지 NaCl 용액 (1 M)으로 집중 세척하였다. 마지막으로, 대응하는 페이퍼들을 진공에서 2 시간 건조시켜, 대응하는 FLU-M-GF, SURB-M-GF, SURG-M-GF, R6G-M-GF 및 RuBipy-M-GF 페이퍼 젤을 수득하였다. 이와 함께, 젤 FLU-MIG, SURB-MIG, SURG-MIG, R6G-MIG 및 RuBipy-MIG를 진공에서 밤새 건조시켰다. 중합 중에 주형을 첨가하지 않은 것을 제외하고, 비-각인된 젤 및 페이퍼 젤 (NIG 및 NIG-M-GF)을 동일한 방식으로 제조하였다.
[00102] 또한 이하에, 상호작용 구간의 염료 침착 만을 이용하는 연구 결과에 대해 설명한다.
[00103] 검출 구간(들) 3으로서 준비된 물질의 효율성을 초기에 점검하기 위한 첫 번째 시도에서, 단지 다양한 염료 용액들을, 보다 복잡한 메조포러스 하이브리드 감지 물질을 포함시키지 않고, 스트립의 상호작용 구간 2에 스폿팅하였다. 여기서, 유리 섬유 및 니트로셀룰로스 막 두 가지 모두를 이용하여, 구간 3에서 준비된 선택된 고분자전해질 및 메조포러스 포획 물질을 이용하여 예시적인 연구를 수행하였다.
[00104] 다음에, 포획 물질로서 적용된 고분자전해질에 대한 연구, 즉 검출 구간 형성에 대한 연구에 대해 설명한다. PDDAC 용액 (17%)을 이용하여 제1 검출 구간과 유사하게 막 바닥으로부터 4 cm, 유리 섬유 막 상에 0.5 cm 두께(1 μL 짜리 3 스폿)의 라인을 생성하였다(도 2a). 1 μL의 설포로다민 B 용액 (SURB; H2O 중 10 mg mL- 1)을 바닥으로부터 2 cm 위치에 상호작용 구간에 스폿팅하고, 샘플 및 흡수 패드로서 코튼 페이퍼를 이용하여, LF 카세트(측방 유동 카세트) 내로 스트립을 넣었다. 100 μL의 H2O (도 2b) 및 PBS 완충액(도 1c; 0.8 mM, pH 7.5)을 피펫팅함으로써 유동을 생성하였다. UV 광 (λex 254 nm) 하에 사진을 찍음으로써 유동을 모니터링하였다. H2O의 경우에만, 1시간 후에도 구간에서 염료가 효율적으로 유지될 수 있었다 (도 2b/1 및 3). 그러나, 완충액이 사용된 경우 염료의 유지는 최초 5분간 동안에만 효율적인 것으로 관찰되었고 (도 2b/2); 그 후에는 염료를 함유하는 고분자전해질 라인 역시 스트립 말단으로 유동과 함께 이동하기 시작하여 염료가 스며들었다 (도 2b/4).
[00105] 추가 실험에서, 보다 진한 PDDAC (35%) 용액을 이용하여 PBS (0.8 mM, pH 7.5)에 대한 "면역"을 향상시키려 시도하였다; PBS 완충액은 매우 흔히 사용되는 용매로서 바이오거대분자의 분석시 성공적인 수행을 위해 종종 필요하다. 이 목적으로, 보다 얇은 3 mm의 폴리머 라인을 페이퍼상에 스폿팅하고 1 μL의 SURB (H2O 중 10 mg mL- 1)를 사용하였다. 이 경우, 염료가 흘러 작은 면적으로 유지되는 것으로 관찰되었다. 그러나, 이 경우에도, 유지는 오직 3 분간만 유효할 뿐이었다(도 2c/1). 그 후, 염료는 유동을 따라 지속적으로 이동하였다 (도 2c/2).
[00106] 추가 실험에서, 본 발명자들은 35% PDDAC (35%)의 용액의 보다 두꺼운 라인 (약 6 mm)을 준비하였다. 여기서, 본 발명자들은 라인 시작점에서 예비-농축 SURB, 폴리머 라인 영역에 유동이 일단 도착하면 유동이 정지됨을 관찰하였다 (도 2d). 이러한 실험 수행 결과에 따라 본 발명자들은 포획물질로서 고분자전해질을 사용하는 것이 비-완충된 용매에 효과적이고 5분 미만으로 분석을 수행할 경우 완충액을 사용하는 것이 효과적이라고 결론지을 수 있다. 이것은 완충액 사용시 오직 초기 몇 분간만 효과적이고, 그 후에는 더 이상 체류가 효과적이지 않음을 의미한다. 모든 경우에 있어서 유동은 실제로 빠른 속도로 일어나, 대략 1분 이내에 스트립이 완전히 젖었고 염료는 폴리머 라인 상에 축적되기 시작한다.
[00107] 다음에, 포획 물질로서 메조포러스 물질을 이용한 연구에 대해 설명한다. 첫 번째 실험에서, 포획 물질 제조에 사용된 메조포러스 스캐폴더의 효과를 검토하였다. 이 시도를 위해, 2,7-디클로로플루오레신을 리포터 염료로서 사용하였다. 소수성 왁스 패턴을 함유하는 수 개의 니트로셀룰로스 스트립들을 준비하고, 스트립 상에 수 개의 구간을 설정하였다. 4.5 Х 0.5 cm의 니트로셀룰로스 스트립을 인쇄하고, 왁스가 페이퍼 내로 확실히 침투하도록 105ehTL 오븐에서 1분간 가열하여, 페이퍼-두께의 장벽을 막 내에 얻었다 (도 3a). 2,7-디클로로플루오레신 (FLU; 10 mg mL- 1)의 용액 1 μL를 리포터 방출 구간 2)에 침착시킨 한편, 대응하는 APTES-MCM 및 APTES-SBA 물질 10 mg mL-1의 수성 현탁액 2.5 μL를 검출 구간 3)에 현탁시켰다. 구간 3)에 침착된 포획 물질의 효율을 샘플 적용 구간 1)에 15 μL의 PBS 용액 (80 mM; pH 7.5)을 첨가하여 검사하였다.
[00108] 스트립을 따라 염료 용액이 흐르는 동안, 음하전된 염료인 FLU의 포획이 검출 구간 3) 내 아미노-개질된 물질에서 일어날 것으로 예상되었는데, 이는, 이들 기가 중성 pH에서 대체로 양성자화되어 정전기력으로 인해 음성 종들을 포획할 수 있기 때문이다. 2분 후, 여기소스로서 2개의 LED(λexc 470 nm 및 505 nm) 및 필터(532 nm 컷-오프 및 550 nm 롱-패스)가 장착된 집에서 만든 3D-프린트된 램프 아래 놓고 사진을 몇장 WLrdj 검출 구간 3)에서의 물질의 포획 효율을 관찰하였다. 도 3b는 구간 3에서 APTES-MCM을 함유하는 스트립을 도시하고 도 3c는 APTES-SBA를 함유하는 스트립을 나타낸다. 도시된 바와 같이, MCM-41 스캐폴드는 SBA-15에 비해 훨씬 더 많은 염료를 유지할 수 있다.
[00109] MCM-41이 훨씬 더 효율적임을 감안하여, 검출 구간 3)에서 APTES-MCM 대신 COOH-MCM을 이용하여 유사한 실험을 수행하였다. 대응하는 유동 후, 검출 구간 3에서 FLU가 전혀 유지되지 않았는데, 이는, 음하전된 물질과 사용된 음이온성 염료 간의 정전기적 척력에 기인하는 듯하다 (도 3d).
[00110] 양이온성 염료 사용시 니트로셀룰로서 막 상에 염료가 체류하는 것을 방지하기 위해, 유리 섬유 막도 시험하였다. 페이퍼의 더 높은 친수성으로 인해, 물질의 스폿은 더 진했고 적당한 라인을 형성하기 위해 10 mg mL-1의 APTES-MCM 현탁액 10 μL를 2회 스폿팅하여야 했다. 도 4a는 방출 구간 2에 1 μL의 SURB 또는 FLU를 함유하는, 스트립들의 유동 후 APTES-MCM 라인의 효율을 보여준다. 염료의 체류는 수 시간 후에도 유효하였다.
[00111] 두 번째 실험에서 발견된 결과를 감안하여, 검출 구간에 2개의 라인을 생성하기 위해, 즉, 2 개의 별도 검출 구간을 만들어 하나의 음이온 염료로부터 양이온 염료를 분리할 목적으로, 본 발명자들은 COOH-MCM 및 APTES-MCM을 사용하였다. 2종의 서로 다른 염료, 음하전된 염료 (FLU) 및 양하전된 염료 (R6G; 1μL 1 ppm)의 혼합물을 상호작용 구간에 스폿팅하였다. 바닥으로부터 약 3 cm 떨어진 거리의 라인에 COOH-MCM를 스폿팅하고(L1) 바닥으로부터 4 cm 떨어진 거리에 APTES-MCM을 스폿팅하였다(L2). 유동 후, L1에서 R6G에만 상응하고 L2에서 FLU에만 상응하는 선택적 형광이 관찰되었다 (도 4b).
[00112] 마지막으로, 본 발명자들은 COOH-MCM 및 APTES-MCM에 대해 수행된 연구와 유사한 방식으로, 염료 로다민 6G 및 2,7-디클로로플루오레신의 체류에 대해 물질 PVP-APTES-MCM 및 PA-COOH-MCM을 시험하였다. 이 목적을 위해, PVP-APTES-MCM을 이용하여 L1을 생성한 한편, PA-COOH-MCM을 이용하여 L2를 생성하였다. 도 4c에 도시된 바와 같이, 이전 실험과 유사한 결과가 얻어졌다.
[00113] 다음에, 다공성 매트릭스로서 개질된 셀룰로스 및 유리 섬유 페이퍼를 이용한 연구에 대해 설명한다. 첫 번째 실험에서, 사용된 페이퍼의 성질이 미치는 영향을 시험하였다. 이들 실험에서, 모델 염료로서 FLU를 이용하였다. 이를 위해, 0.5 Х 0.5 cm의 APTES-C 및 APTES-GF 페이퍼 조각들을 GF 페이퍼의 2개의 막 사이에 고정시켜, 검출 구간 3을 나타내고, 스트립 총 길이는 3.5 cm였다. 1 μL의 FLU 용액 (10 mg mL- 1)을 바닥으로부터 약 1 cm 떨어지게 스폿팅하여(도 5a), 리포터 방출 구간 2를 시뮬레이션하였다. 스트립들을 LF 카세트에 방치하였다. 100 μL의 PBS (80 mM, pH 7.5) 첨가 후, 스트립을 따라 흐르는 유동을, 전술한 것과 유사한 공정에 의해 UV 광 하에서 모니터링하였다. 두 가지 경우 모두에서, 시간에 따른 FLU의 체류가(도 5b 및 5c/1 및 5c/2), APTES-GF에 비해 APTES-C 상에서 더 긴 것으로 관찰되었다. 페이퍼의 선택성을 조사하기 위해, 동일한 실험을 COOH-GF 조각에 대해 수행하였다 (도 5b 및 5c/3). 이 경우, 막을 따라 일어나는 빠른 FLU 유동이 관찰되었으며; 체류는 없었다.
[00114] 체류된 형광 염료의 양을 정량하기 위해, 검출 구간 영역의 일체화된 형광을 ImageJ 소프트웨어를 이용하여 시간에 대한 함수로서 평가하였다. 결과를 도 5c에 나타내었다.
[00115] 다음에, 페이퍼 상의 폴리머 젤에 대한 연구에 대해 설명한다. 각인된 젤을 이용하여 제조된 페이퍼로부터, 본 발명자들은 실험 수행을 위해 FLU-M-GF를 선택하고, 레퍼런스로는 NIG-M-GF를 사용하였다. GF 페이퍼의 2개의 막 사이에 포획 구간으로서 0.5 Х 0.5 cm의 NIG-M-GF 또는 FLU-M-GF 조각을 고정시켜 총 길이 3.5 cm의 스트립을 만들었다. 1 μL의 FLU 용액 (10 mg mL- 1)을 바닥으로부터 약 1 cm 떨어뜨려 스폿팅하였다 (상호작용 구간; 도 6a). 다른 염료에 대한 FLU-M-GF의 선택성을 점검하기 위해, 검출 구간에 FLU-M-GF를 함유하는 또 다른 스트립을 준비하고 FLU 대신 SURB 용액 (10 mg mL-1) 1 μL를 리포터 방출 구간에 스폿팅하였다.
[00116] 스트립들을 LF 카세트에 방치하고 100 μL의 PBS 첨가 후, 전술한 것과 유사한 공정에 의해, UV 광 하에서 스트립을 따라 일어나는 유동 전개를 모니터링하였다. 도 6b는 1) NIG-M-GF 및 2) 염료로서 FLU를 이용하는 FLU-M-GF, 및 3) 염료로서 SURB를 이용하는 FLU-M-GF에 대해, 3가지 스트립의 대응하는 유동을 시간에 대한 함수로서 나타낸 도면이다. 도시된 바와 같이, FLU의 체류는 FLU-M-GF를 이용한 경우에만 유효한 반면, SURB는 FLU-M-GF에 의해 체류되지 않았다. NIG-M-GF 및 FLU-M-GF 상에 체류된 형광의 양도 ImageJ 소프트웨어를 이용하여 시간에 대한 함수로서 정량하였다. 이러한 결과는 UV-램프 하에 관찰된 형광과 일치하였다 (도 6c).
[00117] 두 번째 실험에서, 본 발명자들은 2개의 검출 구간, 즉, SURB-M-GF이 있는 제1 구간 및 FLU-M-GF 각인된 겔이 있는 제2 구간을 함유하는 스트립을 도 7a에 도시된 바와 같이 준비하였다. 스트립 중 하나에서, 1 mM (합량)의 FLU 및 SURB의 혼합물을 함유하는 용액 1 μL를 바닥으로부터 약 1 cm 떨어진 곳에 스폿팅하고, 다른 스트립에는 용매만을 스폿팅하여, 형광에 미치는 용매 단독의 영향을 평가하였다. 스트립들을 측방 유동 카세트에 방치하고 시작과 끝에 유리 섬유 페이퍼 조각을 첨가하여 샘플과 흡수 패드를 가졌다. 200 μL의 PBS를 샘플 패드에 도입하고 전술한 바와 같이 가정에서 만든 형광 램프를 이용하여 유동을 모니터링하였다. 도 7b) 및 7c)는 시간에 대한 함수(6c) 및 실험 말기(6b)에서 대응하는 구간에서 관찰된 색산 및 형광을 나타낸다. 도시된 바와 같이, SURB는 오직 SURB-M-GF 구간 (S)에서 유지된 반면, FLU는 오직 FLU-M-GF 구간 (F)에서 유지되었다. 도 7d는 ImageJ에 의해 정량된 바와 같은, 스트립 상에서의 시간에 대한 함수로서 체류된 형광의 양을 나타낸다. 도시된 바와 같이, 염료 부재시에는 FLU-M-GF 스트립에서 배경 변화가 관찰되지 않은 반면 (2F), 젤의 상태가 건조에서 습윤 상태로 전이됨에 따라 SURB-M-GF에서는 배경의 작은 감소가 관찰되었다(2S). 염료 혼합물의 존재 하에서, 제1 구간에서 SURB-M-GF (1S)에 기인하는 형광의 증가가 첫 번째로 관찰된 한편, 2분 후, FLU의 체류로 인해, 제2 FLU-M-GF 구간에서도 형광 증가가 관찰되었다(2S).
[00118] 다음에, 상호작용 구간, 즉 감지 구간에서 게이트된 감지 물질을 이용한 연구에 대해 설명한다. 모델 연구에서 형광 염료를 이용하여 발견된 연구 결과에 힘입어, 본 발명자들은 스트립 상에서 게이트된 감지 물질도 사용하기로 결정하였다. 이를 위해, 다공성 매트릭스로서 유리 섬유 페이퍼를 이용하였다. 본 발명자들은 펜타에리트리톨 테트라니트레이트 (PETN)를 특이적으로 탐지할 수 있고 포어 내부에 SURB를 함유하는, 5 mg mL-1 감지 물질 현탁액 2 μL를 스폿팅하였다.
[00119] 첫 번째 실험에서 17% 및 35%의 PDDAC 용액을 이용하여 상이한 스트립들을 준비하였다. 본 발명자들은 검출 구간으로서 PDDAC (17%)의 6 mm 라인을 함유하는 스트립과 검출 구간으로서 35%-용액의 3 mm 또는 6 mm 라인을 함유하는 또 다른 스트립들을 준비하였다. 이들 스트립을, 25 ppm PETN로 스파이크되거나 또는 검체를 함유하지 않는 160 μL PBS (80 mM, 2.5% MeOH 함유)를 유동시킴으로써 전개시켰다. 도 8은 PETN의 존재 하에서만, 포획 구간 (라인 1, 도 8)에서 상당량의 염료가 검출되었음을 보여준다. 또한, 희석된 폴리머 라인 (17%, 도 8a)의 경우, 35% PDDAC 라인에 비해(도 8b의 3 mm 밴드 및 도 8c의 6 mm 밴드), 염료가 덜 노축되었다. 밝혀진 결과에도 불구하고, a) 및 b)의 경우의 염료의 체류는 처음 4분 까지만 효과적이었고 그 후에는 염료가 전혀 체류되지 않았다. 유효한 체류는 오직 35%-용액 및 넓은 6 mm 밴드에서만 관찰되었는데, 이는 폴리머 라인에 걸쳐 염료의 유동을 중단시켰다. 이러한 셋업은 염료를 30분 이상 유지시켰다.
[00120] 제공된 실시예 및 구현예와 대조적으로, 공지의 측방 유동 분석은 전통적인 리포터 접근법에 기초하고 신호 증폭이 일어나지 않는다. 전통적인 측방 유동 검사의 "검사 라인" 및 "대조군 라인" 상의 신호는 검체(이전 단계에서 유색 또는 형광 입자와 커플링된 대응하는 항체와 반응할 수 있음)와 스트립 상에 공유결합된 대응하는 항체와의, 1:1의 화학양론적 직접 반응에 의해 생성된다. 본원에 설명된 구현예에서는, 첫째, 리포터 방출 구간에 존재하는 감지 물질을 적용함으로써, 그리고 둘째, 검출 구간에서 선택적으로 방출된 리포터를 포획 및 포커싱함으로써, 대량의 신호 증폭이 얻어질 수 있다.
[00121] 이전에 알려진 대부분의 측방 유동 분석에서 검체를 검출하기 위해서는 리포터로서 제2 결합제의 존재가 요구되는 반면, 본 발명의 구현예는 무표지이다. 본 발명의 하나 이상의 구현예에서, 채널 당 두 개 이상의 검체들이 검출 및 정량될 수 있다. 특이적인 포획 구간에서 방출된 리포터 분자들에 대한 제어된 포커싱 또는 집중은 이제까지 입증된 바 없다.
[00122] 본원에 제시된 구현예에서, 측방 유동 스트립의 다공성 매트릭스는 다음을 포함할 수 있다:
[00123] a) 광학 리포터와 특이적으로 상호작용할 수 있는 특정 유기기에 의해 개질된 폴리머, 유리 섬유 페이퍼 또는 유리; 셀룰로스, 코튼, 천, 그래핀, 탄소 나노튜브 (CNT),
[00124] 복수의 유기실란을 이용하여 특정 유기기(예컨대, 3-아미노프로필트리에톡시실란 (APTES)를 이용한 아미노기 또는 무수 숙신산과 아미노기의 개환 링커 연장 반응에 의한 카르복실산기)에 의해 개질된 실리카 또는 알루미나 메조포러스 물질 (예컨대, SiO2-타입 MCM-41, HMS, MSU-n, M5U-V, F5M-16, KSW-2, SBA-n (n = 1, 2, 3, 8, 11-16), FDU-n (12, 14, 15, 16), UVM-7, UVM-8, M-UVM-7 또는 M-UVM-8, Al2O3-타입 MCM-41), 광학 리포터, 양이온성 또는 음이온성 고분자전해질의 특이적인 검출을 위한, 특정한 분자적으로 각인된 폴리머(MIP: molecularly imprinted polymers) 또는 각인된 젤.
[00125] 상이한 여러 광학 리포터 분자들과 선택적으로 상호작용할 수 있는 물질들을 사용함으로써, 검출 구간 내 수 개의 영역을 생성할 수 있어, 리포터 분자들의 공간 농도가 감도를 향상시킬 수 있게 하고 하나의 단일 스트립에서 여러 물질을 동시에 검출할 수 있게 해준다.
[00126] 보고된 신호는 감지 물질과 검체의 상호작용으로부터 공가적으로 분리된 영역에서 생성된다. 보고된 신호는 따라서 감지 물질과 검체와의 상호작용 후에 방출된 광학 리포터 분자의 포획에만 기초한다. 정의된 영역에서 신호를 생성하기 위해 표지도, 제2의 결합제도 필요하지 않다.
[00127] 광학 리포터 분자는 샘플에 함유되지 않고, 포획 구간의 관능기들은 항상 리포터 분자에 비해 훨씬 과량으로 존재하므로, 정전기적, 결합, H-결합, 공유 결합 (예컨대 붕산과 당의 검출을 위해), 배위 결합, π-π 적층 또는 소수성 상호작용과 같은 비교적 간단한 힘에 의해, 포획 구간 내 리포터 분자의 완전한 체류가 쉽게 달성될 수 있다.
[00128] 뿐만 아니라, 상이한 광학 리포터 분자들을 포함하는 게이트된 물질들의 혼합물에 대해 검출 구간에서 포획 물질의 패턴을 이용하여, 하나의 검사 스트립 또는 스틱으로 수 개의 검체들을 동시에 검출할 수 있다.
[00129] 전형적인 구현예는 지정된 구간에서 검체 또는 표지된 경쟁자와 상호작용하지 않지만, 검체보다 훨씬 높은 농도로, 전적으로 상이한 여러 광학 리포터 분자들을 취하여 화학적으로 유지할 수 있는 포획 물질을 사용하는 것을 포함한다. 이것은 검체의 포커싱된 증폭된 검출 및 이의 반-정량적 분석을 가능케 한다.
[00130] 멀티플렉스화된 광학 검출을 위해 측방 유동 스트립, 평판형 기질 또는 스틱 상의 복수개 또는 구조화된 검출 구간이 생성될 수 있어 유리하다.
[00131] 유리하게도, 본원에 설명된 구현예 또는 구현예들의 조합에 따라 검체의 검출은 무표지이다.
[00132] 또한, 사용된 감지 물질에 의해 생성된, 설명된 신호 증폭 뿐만 아니라, 방출된 리포터 분자의 독점적인(dedicated) 포획 및 농축으로 인해, 감도 증가가 달성된다.
[00133] 이제가지 설명된 본원 구현예의 일부 태양은 다음과 같이 요약될 수 있다.
[00134] 1. 본원에 따라 측방 유동 분석에 적합화된 검사 스트립 또는 딥 스틱의 디자인이 제안되며 (도 1 참조) 이것은 다음을 포함한다:
a) 샘플 도입을 위한 섹션 또는 세그먼트; b) 검체와 특이적으로 상호작용할 수 있는 메조포러스 하이브리드 감지 물질을 함유하는 섹션 또는 세그먼트; 및 c) 메조포러스 하이브리드 감지 물질로부터 방출되는 광학 리포터 분자(들), 리포터 분자(들)과 상호작용할 수 있는 포획 물질을 함유하는 섹션 또는 세그먼트.
[00135] 2. 태양 1에 있어서, 감지 물질은, 포어 및 다공성 지지체 물질의 포어에 함유된 광학 리포터 분자를 갖는 다공성 지지체 물질을 포함하고, 여기서 상기 다공성 지지체 물질의 포어는 포어-폐쇄 물질에 의해 폐쇄되어 다공성 지지체 물질과 비-공유 결합을 형성하며, 여기서 상기 포어-폐쇄 물질은 액체 샘플에서 검체와 특이적으로 결합하도록 선택되고, 광학 리포터 분자는 검체가 포어 폐쇄 물질과 특이적으로 결합할 때, 폐쇄되지 않은 포어로부터 방출되는 것인 검사 스트립.
[00136] 3. 태양 1에 있어서, 광학 리포터 분자와 상호작용할 수 있는 물질은 상기 리포터와 상호작용할 수 있는 특정 유기기에 의해 개질된 셀룰로스 또는 유리 섬유 페이퍼인 검사 스트립. 상기 유기기는 예컨대 아미노기 또는 카르복실산기로부터 선택된다.
[00137] 4. 태양 1에 있어서, 광학 리포터 분자와 상호작용할 수 있는 물질은 상기 리포터와 상호작용할 수 있는 특정한 유기기에 의해 개질된 메조포러스 물질인 검사 스트립. 유기기는 표면에 흡착되거나 공유결합될 수 있다.
[00138] 5. 태양 1에 있어서, 광학 리포터 분자와 상호작용할 수 있는 물질은 상기 리포터에 대해 생성되고 그것과 특이적으로 상호작용할 수 있는 분자 각인된 폴리머인 검사 스트립.
[00139] 6. 태양 1에 있어서, 광학 리포터 분자와 상호작용할 수 있는 물질은 상기 리포터와 특이적으로 상호작용할 수 있는 각인된 젤인 검사 스트립.
[00140] 7. 태양 1에 있어서, 광학 리포터 분자와 상호작용할 수 있는 물질은 직접적으로 그래프트된 분자적으로 각인된 폴리머 또는 상기 리포터와 특이적으로 상호작용할 수 있는 각인된 젤을 함유하는 니트로셀룰로스 또는 유리 섬유 페이퍼인 검사 스트립.
[00141] 8. 태양 1에 있어서, 메조포러스 감지 물질을 함유하는 섹션 또는 세그먼트는 상이한 여러 메조포러스 감지 물질의 패턴을 포함하는 검사 스트립(도 4 참조).
[00142] 9. 태양 1에 있어서, 태양 3-7에 설명된 물질을 함유하는 섹션은, 두 개 이상의 검체의 동시 존재를 검출할 목적으로, 태양 3-7에 설명된 물질의 질서정연한 패턴 또는 배치를 함유하는 검사 스트립 (도 4 참조).
[00143] 10. 태양 2에 있어서, 광학 리포트는 다음 표 1에 설명된 것인 검사 스트립.
[00144] 11. 태양 1에 있어서, 포획 물질과 광학 리포터 분자의 조합은 다음 표 2에 설명된 것인 검사 스트립.
약어
MCM-41, HMS, MSU-n, MSU-V, FSM-16, KSW-2, SBA-n (n = 1, 2, 3, 8, 11-16), UVM-7, FDU-n (12, 14, 15, 16), UVM-8, M-UVM-7 또는 M-UVM-8, Al2O3-타입 MCM-41 = 메조포러스 물질
AAm = 아크릴아미드
APS = 암모늄퍼설페이트
APTES = 3-아미노프로필트리에톡시실란
APTES-C = APTES-개질된 셀룰로스 페이퍼
APTES-GF = APTES-개질된 유리 섬유 페이퍼
APTES-MCM = APTES-개질된 MCM-41
APTES-SBA = APTES-개질된 SBA-15
CTAB = n-세틸트리메틸암모늄 브로마이드
COOH-MCM = COOH-개질된 MCM-41
COOH-C = COOH-개질된 셀룰로스 페이퍼
COOH-GF = COOH-개질된 유리 섬유 페이퍼
COOH-SBA = COOH-개질된 SBA-15
EBAAm = N,N'-에틸렌 비스(아크릴아미드
FLU = 2,7-디클로로플루오레신
FLU-M-GF = 2,7-디클로로플루오레신 개질된 M-GF
FLU-MIG =2,7-디클로르플루오레신 개질된 분자 각인된 젤
M = 3-(트리메톡시실릴)프로필 메타크릴레이트
M-GF = 3-(트리메톡시실릴)프로필 메타크릴레이트 개질된 유리 섬유 페이퍼
= 메타크릴레이트-유리 섬유 페이퍼
MCM = 메조포러스 물질, MCM-41
MeCN = 아세토니트릴
MeOH = 메탄올
MIG = 분자 각인된 젤
NIG = 각인되지 않은 젤
NIG-M-GF = 각인되지 않은 젤 - 개질된 M-GF
NIPAAm = N-이소프로필아크릴아미드
P123 = EO20-PO70-EO20 = 트리블록 폴리(에틸렌 옥사이드)-폴리(프로필 렌 옥사이드)- 폴리(에틸렌 옥사이드)
PA-COOH-MCM = PDDAC-개질된COOH-MCM-41
PBS = 인산염 완충 염수
PDDAC = 폴리(디알릴디메틸암모늄 클로라이드)
PETN = 펜타에리트리톨 테트라니트레이트
PVP = 폴리(비닐피롤리돈)
PVP-APTES-MCM = PVP-개질된 APTES-MCM-41
R6G = 로다민 6G
R6G-M-GF = 로다민 6G 유리 섬유 페이퍼 상에 각인된 폴리머
R6G-MIG = 로다민 6G 분자 각인된 젤
RuBipy = 루테늄 바이피리딘
RuBipy-M-GF= 루비듐 바이피리딘 유리 섬유 페이퍼 상에 각인된 젤
RuBipy-MIG = 루비듐 바이피리딘 각인된 젤
SBA-15 = 메조포러스 실리카 물질 (Santa Barbara Amorphous),
SURB = 설포로다민 B
SURB-M-GF = 설포로다민 B 개질된 M-GF
SURB-MIG = 설포로다민 B 개질된 분자 각인된 젤
SURG = 설포로다민 G
SURG-M-GF = 설포로다민 G 개질된 M-GF
SURG-MIG = 설포로다민 G 개질된 MIG
TEMED = N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민
TEOS = 테트라에틸오르토실리케이트;
[00145] 이상 다양한 구현예와 실시예를 참조로 본 발명을 설명하였다. 이들 구현예와 실시예는 본 발명의 범위를 한정하려는 의도로 제공된 것이 아니며 본 발명의 범위는 어디가지나 첨부된 청구범위와 그 균등물에 의해 규정된다. 통상의 기술자에게 자명한 바와 같이, 본원에 제공된 구현예들은 본 발명의 범위를 벗어남이 없이 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 구현예에 설명된 다양한 특성, 태양 및 기능들은 다른 구현예와 조합될 수 있다.
Claims (21)
- 다공성 매트릭스를 포함하는 검사 스트립으로서, 상기 검사 스트립은:
- 검체를 포함하는 액체 샘플을 적용하기 위한 샘플 적용 구간;
- 감지 물질을 포함하는 리포터 방출 구간으로서, 상기 감지 물질은 광학 리포터를 방출함으로써 검체와 선택적으로 상호반응하도록 적합화되고, 상기 리포터 방출 구간은 샘플 적용 구간의 하류에 배치된 것인 리포터 방출 구간;
- 포획 물질을 포함하는 검출 구간으로서, 상기 포획 물질은 광학 리포터에 선택적으로 결합하도록 적합화되고 리포터 방출 구간의 하류에 배치된 것인 검출 구간을 포함하되,
상기 광학 리포터는 감지 물질의 포어에 함유되고, 감지 물질의 포어는 포어-폐쇄 물질에 의해 폐쇄되며, 상기 포어-폐쇄 물질은 검체에 특이적으로 결합하도록 선택되어, 검체가 포어-폐쇄 물질에 특이적으로 결합할 경우 포어로부터 광학 리포터를 방출시키는 것인 검사 스트립. - 제1항에 있어서, 포어-폐쇄 물질은 감지 물질에 비-공유적으로 결합되며, 검체에 의해 결합될 경우 감지 물질로부터 탈착되고, 광학 리포터는 형광 염료, 유색 염료 또는 희토류 원소의 발광 무기 형광 이온을 포함하는 검사 스트립.
- 제2항에 있어서, 형광 염료는 로다민; 플루오레신; 스티릴; 시아닌 또는 폴리메틴; 피리디늄; 피릴륨; 티오피릴륨; 루테늄 복합체; 오스뮴 복합체, 이리듐 복합체; 희토류 원소의 발광 복합체; 스쿠아릴륨 유도체; 쿠마린의 또는 디피로메텐의 중성, 양이온성 또는 음이온성 유도체 또는 BODIPY, 피로메텐의, 벤조퓨란의, 피리딘의, 나프탈이미드의, 벤족사졸의, 벤족사디아졸의, 벤진돌의, DAPI의, 스틸벤의, 옥사진의, 페릴렌의, 아줄렌의, 스티릴 염기의, 피코에리트린의, 스쿠아라인의, 포르피린의, 또는 프탈로시아닌 염료의 중성, 양이온성 또는 음이온성 유도체 중 적어도 1종을 포함하는 검사 스트립.
- 제1항에 있어서, 포획 물질은 분자 각인된 폴리머, 고분자전해질 또는 관능화된 메조포러스 물질로서 다음, 즉 티올, 이소시아네이트, 아미노기, 히드록시기, 에폭시기 또는 카르복실산기 또는 4급 암모늄기 등의 하전된 관능기 중 적어도 1종을 포함하는 관능화된 메조포러스 물질로부터 선택되는 검사 스트립.
- 제1항에 있어서, 적어도 하나 이상의 검출 구간을 포함하는 검사 스트립의 한 영역은 장벽으로 둘러싸이고, 상기 장벽은 다공성 매트릭스의 포어를 폐쇄하거나 및/또는 용매에 대한 다공성 매트릭스의 습윤성을 개질하여 다공성 매트릭스에서 채널을 형성하는 검사 스트립.
- 제5항에 있어서, 장벽은 왁스에 의해 형성되는 검사 스트립.
- 제1항에 있어서, 감지 물질은 메조포러스 무기 물질을 포함하고, 상기 메조포러스 무기 물질은 실리카, 알루미나, TiO2, 탄소, 탄질화물, 탄화규소, 옥시탄화규소, 탄질화규소, 질화규소, 옥시질화규소, 질화규소 알루미늄, 또는 실리코보론 탄질화물을 포함하는 것인 검사 스트립.
- 제1항에 있어서, 다공성 매트릭스는 페이퍼, 펠트, 부직포, 섬유, 압축 또는 소결된 분말, 천, 또는 조직으로부터 선택되고, 여기서, 페이퍼, 펠트, 부직포, 섬유, 압축 또는 소결된 분말, 천, 및 조직은 폴리머, 유리, 세라믹, 탄소, 그래핀, 미네랄 또는 금속 중 적어도 1종을 포함하는 것인 검사 스트립.
- 제1항에 있어서, 검사 스트립은 하나의 리포터 방출 구간과 2 내지 7개의 검출 구간을 포함하는 것인 검사 스트립.
- 제1항에 있어서, 검사 스트립은 적어도 리포터 방출 구간에서 및/또는 검출 구간에서 적어도 두 개의 매트릭스 층을 포함하는 검사 스트립.
- 제1항에 있어서, 스트립의 형상은 비-정사각형 직사각형에서 벗어나서, 적어도 원형 또는 삼각형의 섹션을 포함하는 검사 스트립.
- 제1항에 있어서, 샘플 적용 구간은 리포터 방출 구간의 위에 배치되는 검사 스트립.
- 검체를 검출하기 위한 방법으로서, 상기 방법은:
- 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 따른 검사 스트립을 제공하는 단계;
- 검사 스트립의 샘플 적용 구간에 샘플을 적용하는 단계;
- 적어도 하나의 검출 구간에서 광학 리포터의 존재 여부 및/또는 양 및/또는 농도를 검출하는 단계;
- 샘플 내 검체의 존재 여부 및/또는 농도를 결정하는 단계
를 포함하는 방법. - 제13항에 있어서, 샘플 적용 구간으로부터 리포터 방출 구간으로 및/또는 리포터 방출 구간으로부터 적어도 하나의 검출 구간으로 연속 또는 비연속적인 유체 스트림을 생성하기 위한 액체를 제공하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제14항에 있어서, 광학 리포터는 형광 염료이고 검출은 핸드-헬드 장치를 이용한 형광 측정에 의해 수행되는 방법.
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