发明内容
本发明涉及检测流体样品中一个或多个分析物的一个或多个检测的方法。此处所述横向流动装置提供一个经过改进的试剂湿润过程,为标记垫里的检测试剂进入横向流动元件前进行再溶解。当液体沿本发明中的最大平面流入标记垫时,本发明的装置具有避免标记垫中各种不同性质的试剂在试剂流的边缘积累。此外,本发明的设备允许标记垫中的检测试剂在液体流到横向流元件前充分溶解,通过提供一个时间差可以提高检测的可靠性。
一方面,本发明涉及用于测量流体样品中分析物的检测装置。这些检测装置包括:用于接收所述流体样品的流体样本接收区;与样品接收区流体连通的第一流体传送元件;第一流体传送元件与第一分析元件以具有回弹力的方式进行接触或依靠。分析元件包括(i)包含一个或多个检测或测试试剂的标记垫,及(ii)第二流体传送元件,它包括一个或多个检测区域,在该一个或多个检测区域上能够出现表示被分析物质是否存在或存在数量的信号。
克服回弹力能使标记垫和第二流体传送元件与第一流体传送元件流体连通,这样,使标记垫能吸引和限制液体通过第一流体传送元件。最优方式是,当回弹力被克服后,标记垫表面具有最大的平面能用于接纳来自第一流体传送元件的流体样品。在流体通过设备的过程中,首先液体从第一流体传送元件进入标记垫,再从标记垫横向地进入第二流体传送元件,液体横向地通过第二流体传送元件再进入第二流体传送元件上的一个或多个检测区域。
在某些实施例中,第一流体传送元件包括一个用于消除或延缓流体样本流动,或流体样本中的微粒物质的过滤器,一个与过滤器连通的多孔渗水材料,流体样本流经过滤器后通过多孔渗水材料进行横向流动。最优的是,过滤器被配置用于消除或延缓血流体样本的微粒组成部分,如红细胞。下面有各种使用过滤器材料的例子。
在这些实施方案,靠近标记垫有多孔渗水材料,通过压缩上述的多孔渗水材料可以限制流体通过第一流体传送元件。这种压缩,可以限制通过多孔材料流体的流动路径,从而使流体路径通过被压缩的区域而穿过标记垫。在某些实施例中,经过标记垫的流体样本到一个没有压缩区域的第一流体传送元件上。第二流体传送元件会与第一流体传送元件上的无压缩区域连通,从而接受来自以横向流动的方式穿过标记垫的流体。
被第二流体传送元件接收的流体横向流动的方式流体到一个或多个检测区域。在这些实施方案中,第二流体传送元件包括一个多孔材料来引导从标记垫和/或第一个流体传送元件通过的流体样本的横向流动。
正如本文所述,标记垫中最好有一个或多个测试试剂用于检测样本中感兴趣的被分析物存在或存在的数量。这种检测/测试试剂,可以包含一种能与被分析物结合的可检测的标记受体,和/或一种能与被分析物竞争结合的可检测的标记的受体。这些检测试剂干燥后可位于在标记垫的内部,表面,或即在表面又在内部。
同样优选的,第二流体传送元件的检测区有用于检测被分析物的存在或存在数量的一个或多个检测试剂。通过举例的方式,检测区域可能包括能与被分析物结合的受体,和/或一种能与被分析物质竞争结合的受体,这些受体被固定在在检测区域面或上。
本发明中的装置或设备中许多的材料可用于作为包括多孔材料在内的各种流体流动元件,如纸,膜,过滤器等,以及用毛细作用力促进流体运动的毛细管通道。举例说明以下合适的材料。以硝酸纤维素膜为,润湿的情况下硝酸纤维素膜会变成半透明或透明,将其放在表面附近的位置,作为反射层可提供理想的视觉效果。这可以用做装置的检测区域的材料,在检测区域上用光学来判断标记的积累可能是特别有用的。
本发明的设备可能会包括更多可选的元件,如收集流过第二流体传送元件流体样本的蓄水池,它是在横流类型的设备的一个优选的方式。
在一个优选的实施方案,本发明的检测设备包括:含有过滤器的第一流体传送元件,过滤器用来阻断或减缓流体样本流动,或消除样品中的其他微粒组分;包含与过滤器液体流通的多孔渗水材料,用于引导从过滤器流出后的横向流动,多孔渗水材料可以包括玻璃纤维;一种或多种测试试剂,这些试剂包括与被分析物结合的可检测的受体,和/或与被分析物竞争结合的可检测的受体;第二流体传送元件,它包含具有一个或多个检测区的硝酸纤维素膜,硝酸纤维素膜包含一个与表面相邻的反射层,而在检测区上或中包括与被分析物中结合的可检测受体,和/或与被分析物中竞争结合的可被检测的受体,这些受体固定在检测区的表面或内部。
在另一个方面,本发明涉及用于测量流体样本中分析物的检测设备,检测设备包括:
a.第一基质,它包括:(i)一个样品应用区,及(ii)与样品应用区流体连通的第一流体传送元件; b.第二基板,它包括:(i)标记垫,它包括一个或多个用于测试分析物的试剂,及(ii)第二流体传送元件,包括一个或多个检测区,在检测区域上可以呈现分析物存在或存在数量的检测信号;和 c.一个或多个具有回弹的弹性元件,当作用于克服弹性元件产生的回弹力力被消除后,标记垫从第一流体传送元件分开,标记垫的表面有一个最大的平面来接收来自第一流体传送元件传来的流体样本;流体样本从第一流体传送元件流出后进入标记垫,从标记垫横向流动进入第二流体传送元件,然后,进入第二流体传送元件的流体样本横向地接触一个或多个测试区域。
在某些实施例中,这样的检测设备包含一个位于标记垫和第一流体传送元件之间的水溶性胶粘层。水溶性胶粘剂层作为第一个流体传送元件和标记垫之间的时间屏障。样品液被应用到设备后,流体样本通过第一流体传送元件接触胶粘剂。胶层溶解的同时流体样本润湿标记垫, 从而使标记垫具有最大的平面与流体样本接触。
在相关方面,本发明确定流体样本中被分析物的数量的方法是通过流体样本应用到本发明的装置的样品应用区上,启动本设备,然后检测存在于测试区中被分析物的存在或存在数量的指示信号。
在某些实施例中,这些方法包括:不论什么流体样本,流体样本都可用于本发明的检测设备的样品应用区上,流体样本或包括在流体样本中的一个或多个流体组成部分(例如,如果血流体样本本需要进行过滤提供血浆)流入到第一个流体传送元件;施加第一压力克服回弹力,使标记垫与第一流体传送元件流体连通, 由此接收来自标记垫的流体样本; 去除第一压力后,第一流体传送元件与标记垫分离; 在一段时间后,施加第二压力克服回弹压力,标记垫和第二流体传送元件都与第一流体传送元件流体连通。
优选地,标记垫控制和限制第一个流体传送元件上一区域的流体样本流动的路径,从而提供了一个流体路径等,通过流体样本流动到位于标记垫下游的第一流体传送元件上的未压缩区域;和第二流体传送元件,它与第一流体传送元件的未压缩区域处于流体连通;持续保持第二压力有足够长的时间,那样,第二流体传送元件能将从第一流体传送元件接受的流体样本横向传送下去,如果流体样本中存在被分析物,在那里,流体样本中的被分析物质就能与一种或多种存在于标记垫中的试剂反应,当流体样本流过第二流体传送元件的检测区域时,检测信号也在那里产生,检测测试区域上的的信号,表示流体样本中被分析物存在及存在数量。
本发明的其他实例将从下面的详细描述,典型实施,和权利要求中得以显现。
本发明所引用的所有参考文献的全部都作为本发明的一部分。
具体实施方式的详细描述 这里描述的是执行受体结合测定的方法,设备和仪器。特别的,在把测试试剂移动到横向流动分析元件之前,本发明的装置让位于标记垫里的检测试剂具有一个为了再溶解这些试剂的初始的加湿过程。这可以有助于避免标记垫中各种检测试剂的属性差异,如这些检测试剂在试剂流的流动边缘积累,从而提高检测的可靠性。
装置的组件
1. 装置的基质
本设备最好由一个或多个基质或参与流体输送和/或检测特异性反应的各种支持元件的支架组成。如图1展示的典型的结构。
一般来说,在此结构中,第一基质(图1中的B部分)提供了一个与第一流体传送元件流体连接的具有开口形式的样品应用区。第一流体传送元件包括了一种从样品中去除颗粒物质的过滤器。多孔疏水材料与过滤器相连,并引导从过滤器流出的流体样本的横向流动。第二基质位于与第一基质相邻的弹性元件中(如,图1中的A部分为侧面图,C部分为俯视视图)。这第二基质包括了一种多孔渗水结合垫和用于流体样本横向流动的第二多孔渗水材料,其中第二基质还包括一个检测或测试区。这些不同的组件,以及可选的附加元件,如位于第二多孔渗水材料下游的试剂储存器,将在下面内容中更详细的描述。其他配置结构都对于本领域的一般技术人员是显而易见的。
此处使用的术语“具有回弹的弹性元件”,是指检测设备的两个元件,每个元件都包含一个或多个区域,在没有压力来克服回弹力的情况下,这些区域从空间上与一个或多个其它元件上的区域分离。施加必要的力量可以使位于两个元件处于空间分开的一个或多个区域进行相互接触,当再次消除力量后,又可以让位于元件上的一个或多个区域再次分离。例如,放入“弹簧”就可在两个元件之间形成具有回弹的元件,用力压下弹簧来克服弹力,使两个元件上的一个或多个区域区互相接触或联系,但去除压力后,允许弹簧可分开的两个元件。在这里所用的术语“弹簧”是指可以两个元件间任意的弹性所需要的任何元件。在下面所述典型实施例中,弹簧是两个元件之间的弹性泡沫块,如图1描绘的101。在此图中,两个元件A和B是相互分离的,在使用过程中,A最好用粘合剂粘在弹性泡沫块上。其他用于提供两个元件间弹性的结构对于本领域的技术人员而言是容易实现的。在这里所用的术语“克服弹性”,是指用必要的力量克服弹力从而使位于两个元件上的处于空间分开的区域接触。
此处使用的术语“流体传送元件”是指测试装置的一部分,她被用于流体样本穿过。该术语所指的元件包括多孔材料,如纸,膜,过滤器等,以及通过毛细管力促进流体样本流动的毛细管通道。流体传送元件通常包括亲水表面,但这种疏水表面也可能由于样品或反应混合物而变为亲水性。
最好是,本发明的装置利用一个或多个横向流动元件来传送流体样本。此处使用的术语“横向流动”是指在试剂纵向流过大面积平坦的多孔疏水材料。如果材料的厚度不超过长度和宽度的10%,这种多孔疏水材料是“大面积平坦的”。
此处所用的术语“下游区域”是指相对于设备的第一区域,指流体样本已经到达第一区域区后,流体样本流动的区域。
该设备的基质组件(例如设备的物理结构,不论指设备其他部分还是零散元件)可用如下方式进行加工并形成,例如共聚合物,共混物,层压板,金属箔,金属薄膜或金属,聚烯烃,聚酯,苯乙烯含有聚合物,聚碳酸酯,丙烯酸聚合物,含氯聚合物,聚甲醛均聚物和共聚物,纤维素及其酯,硝酸纤维素,含氟聚合物,聚酰胺,聚酰亚胺,多聚烯酸甲酯,含硫聚合物,聚氨酯,硅的聚合物,玻璃和陶瓷材料,合成橡胶,乳胶,硅芯片,聚乙烯,聚丙烯,硅弹性体,铁氟龙®,聚碳酸酯等。
可以通过多种方式形成各种基板组件的结构,例如表面加工成适当的形状或注射成型或其他成型技术。本领域的熟练技术人员都可以意识到各种方法都可以被运用来把一个疏水材料变成亲水材料,例如等离子体处理技术等。
2.
样本应用区域
此处使用的“样品应用区”是指测试设备的一部分,用于引导流体样本进入检测设备。样品应用区可以包括,例如,在外壳上形成一个开放的小室,一个吸收垫等。图1中的102所示的是样品施加区的实施案例。样品施加区可以是各种配置的端口,也就是说,圆形,椭圆形,方形和类似形状,也可以是在设备上的一个槽。
此处所用的术语“流体样本”是指在液体状的样品。首选是生物体流体样本,可以是尿液,血液,血清,血浆,泪水,唾液,脑脊液的一种或几种组成。
样品施加区的体积至少是第二设备区的体积或更大。样品施加区的体积或容量是横向流入下游区域流体样本量的1-5倍。在某些实施例中,样品施加区的体积或容量是可以选择的,那样多余的样品可以用来消除检测区域上未绑定的试剂,在试剂区域上可以产生与被分析物质相关的信号。
在检测过程中,样品施加区也可以使用一些干试剂。例如,样品附加区中干的表面活性剂在样品添加时溶解。在样品中表面活性剂将降低液体的表面张力,有助于样品和反应混合物通过设备。
3.
过滤器
如上所述,过滤器元件可以放在样品施加区的里面、上面或相邻位置,用于过滤样品中的小微粒,如去除或阻止血液中的血细胞,使血清进一步通过本设备。图1 的103描绘一个过滤器元件的典型实例。滤液进入与过滤器相连的多孔疏水材料,如图1的104所示。
血液主要是由两部分组成:(a)血浆,及(b)血细胞和悬浮在血浆中的血小板。血浆占血液总量约55%,约92%的水,蛋白质7%,不到1%的其他物质。通过血清凝血反应从血浆中去除的某些蛋白质后被称为血清。图中用过滤器消除或阻止存在于血液中的细胞物质是众所周知的技术。例如,美国专利4477575,5166051,6391265; 7125493,参考文献中包括每个专利完整内容。许多材料适宜作为过滤器,包括玻璃纤维,合成树脂纤维,过滤直径从65到15微米以外的颗粒的非对称膜过滤孔,以及这些材料的组合。此外,一个过滤器的元件可以包括一个或更多的化学物质,以促进从血浆中分离红血细胞。这种化学物质如凝血酶,凝集素,阳离子聚合物,对一个或多个红细胞表面抗原的抗体和类似物。在过滤器元件中的这些一个中多多种化学物质通过共价方式,非特异性吸收等方式帮助从血浆中分离红细胞。
4.
测试试剂
此处使用的术语“检测或测试试剂”,是指在测试中用于检测被分析物的检测试剂。这些检测试剂可以包括,例如,用于三明志或竞争的受体结合试验的一个或多个可检测标记的受体,缓冲物,酶底物,润湿剂,阻断剂受体等,用于减少非特异性或无关的结合反应。
此处使用的术语“反应混合物”是指用一种或多种检测试剂可能含有被分析物存在及存在数量的流体样本与试剂的混合液。例如,反应混合物中可能包括对应一个或多个被分析物的一个或多个的类似配体螯合物或受体结合物,和/或对应的一个或多个与被分析物的磁性结合的粒子组成的受体。此处所述的反应混合物可以包含另外的成分,例如包括缓冲剂,HAM抑制剂,洗涤剂,盐(例如,氯化物和/或硫酸钙盐,镁盐,钾盐等),蛋白质成分(例如,血清白蛋白,明胶,牛奶蛋白等)。这里所述包括但不限于以上所列的成分物质。
术语“受体”一词是指一个特定结合能力的物质(对被分析物而言称为“受体”)。受体结合试验的一个常见的类型是免疫,抗体与被分析物结合后作为被分析物的受体,检测信号与被分析物/抗体复合物的形成有关。众多的竞争性,非竞争性和三联体受体结合的检测方法是众所周知的。除了用抗体作为被分析物的受体,使用其他已经结合了的物质,包括核酸,寡核苷酸,和除一个免疫球蛋白的以外的多肽。这里所述包括但不限于以上所列清单。
关于受体和/或标记偶连,“对应被分析”是指用本方法受体和标记偶连产生一个信号,表明反应混合物中存在或存在的被分析物的量。根据执行的受体结合试验格式,标记偶连物质包含一个可检测的标记共轭结合物,它可以与结合被分析物的受体偶连(例如,抗被分析物的抗体),也可以与被分析物竞争结合受体(如被分析物质的类似物)的分子相偶连结合,或者,与受体结合作为被分析物靶标的一种结合物(例如,一个第二抗体,如羊抗鼠IgG与鼠抗被分析物质的抗体)结合。这里说述包括但不限于以上所列清单。
此处使用的术语“可检测信号”是指在检测试验中可以被检测到作为信号的一种化学基团,但本身并不能与被分析物结合。根据生物实验使用的各种方法,可检测信号可以偶联受体或竞争受体的配体,检测和定量结果的最常用的方法之一,是结合一种酶,荧光基团或其他可检测信号到一个分子(例如,一个或多个被分析物类似物),可被与分子有亲和力的受体固定便于检测。另外,与一个或多个分析物结合的受体(例如,用被分析物制作或选择的一种抗体或有结合片段)可以选择性结合一种酶,荧光基团或其他检测信号。酶联结合物是最常见的结合物。检测标记物质可以是本身就可被检测到的分子(例如,荧光基团,电化学标签,金属螯合物等),以及通过产生可检测反应产物被间接检测的分子(例如,如辣根过氧化物酶,碱性分子磷酸等),或通过与可检测到的一个特定的结合分子结合(例如,生物素,地高辛,麦芽糖,低聚糖组氨酸,2,4 -
二硝基苯苯砷酸(2,4 - dintrobenzene phenylarsenate),单链DNA,双链DNA等)。此处使用的术语“直接信号”是指一个信号从信号元件直接产生,不通过与被检测分析物/受体复合物的一个或多个组件结合的附加分子。这种直接信号的例子包括酶标签,荧光标记,电化学标签,金属螯合物,胶体金属标签,和光学检测生物传感器,如表面等离子体共振和椭偏光学检测。相反,“间接信号”是指信号产生元件不是与分析物结合,而是寓一个分子结合,这个分子本身又与被分析物结合。一个标记的二抗,例如一个可检测标记的羊抗鼠IgG结合到小鼠抗体的分析物,是一种间接信号的例子。
5.
标记垫
此处使用的术语“标记垫”是指一种多孔构件,在其中一个或多个测试试剂加入其中,用于与流体样本一起形成一个检测反应混合物。通常情况下,标记垫在检测设备的制造过程中就加入测试试剂,然后干燥。试剂分散在整个标记垫中,当使用设备的时候,标记垫被液体浸湿时,这些试剂被溶解。最好的,标记垫包括一种或多种可检测的标记试剂,如与被分析物质对应的受体结合物。
根据本发明,这些位于标记垫上的试剂在进入下游的横向流体传输元件之前,被小部分流体所湿润,例如图1中 105描述的标记垫最先是被小部分流体样本湿润;最好地,是沿其最大的平面表面的实质性整体湿润。这种湿润受瞬间克服回弹力所影响,这种回弹力让标记垫从已经接收了来自样本施加区域的流体的第一多孔渗水元件分离。在这种情况下,标记垫与第一多孔渗水元件接合,同时一流体体积的样本被传输到标记垫上。术语“结合”在本发明中是指检测设备中的两个元件最初是分开的,但他们被导致彼此物理意义上的接触。弹性回弹然后被释放到脱离(物理上分开的),从而,让标记垫从第一多孔渗水元件分离,同时,标记垫与流体样本被孵育或培养一段时间。在孵育或培养一段期间,标记垫不与下游的横向流动的多孔渗水元件处于流体连通,如图1中的106元件的描述。
最好是,通过由标记垫与第一多孔渗水元件的结合限制流体流动通过第一多孔渗水元件。术语“限制流量”是指通过一个动作来减少流体,或有选择地停止部分流体通过至少流体传输元件上的一个区域。典型实施以下描述例如,当标记垫与多孔材料结合时,通过多孔材料的流动是通过限制多孔材料的孔或压缩多孔材料而实现的。在这些例子中,这种限制是用来改变流体流动路径。
通过一段时间的克服这样让标记垫从第一多孔渗水元件分离的回弹力,从而让流体流过位于下游的横向流动的第一多孔渗水元件。在一个优选的实施方式中,流体被限制穿过多孔渗水的标记垫,其方式是标记垫与第一流体传输元件的一区域接合而产生的压力阻止流体穿过。下游的侧流多孔渗水元件被使得与第一多孔渗水元件处于流体连同,从而提供流动路径,这样流体流过标记垫并到达位于标记垫下游的第一多孔渗水元件的非压缩区域上,然后进入下游的横向流动孔渗水元件。
6.
被分析物检测区域
参照图 1,横向流动多孔元件106的被分析物的检测区域107捕获与一个或多个被分析物对应的可被检测标记的共轭。这些检测区域在图1C中为在基板上一个允许观测横向流动多孔元件106的“窗口”。在夹心法,夹心复合体包括固定在被分析物质检测区域上的第一被分析物质的受体,被分析物质和第二被分析物质的受体,该第二被分析物质的受体与可检测的标记结合(标记的共扼或偶连物)。在竞争检测中,被标记的被分析物(标记的共扼或偶连物)和样品中的待测的被分析物质竞争结合固定在被分析物质的检测区域上的被分析物质的受体并形成一个复合物,或者,固定在被分析物质的检测区域上的被分析物质与样品中被分析物质竞争结合被标记的分析物的受体(标记物)而形成复合物。在任何情况下,标记的共扼或偶连物被释放到检测区域来产生了信号。这个描述是不是对本发明的限制,和其他众所周知合适的检测格式也是可以被运用到本发明中来。在某些实施例中,可以提供一个包括多个检测区域的单一的横向流动多孔元件106。如果有必要,横向流动的多孔元件106可被一个反射层109所支持,该反射层也可以保持一个与横向流动的多孔元件106流体连通的蓄水池108。
此处使用的术语 固定”一词是指一种试剂在检测设备中不流动的。在受体结合测试过程中,受体(如抗体)经常固定在固相基质上作为亲和力支撑结构使用,或用来简化样品分析。此处使用的术语“固相”,指的是多种材料,可以是固体,半固体,凝胶,薄膜,膜,网格,毛毡类,复合材料,颗粒,试纸之类的一般能固定分子。固相可以无孔或多孔。合适的固相包括那些已经开发和/或在固相结合分析中使用的固相。例如,这些方法参见E·P·戴安,T·K·可瑞斯等编著的《免疫》第9章(E. P. Dianiandis
and T. K. Christopoulos eds., Academic Press, New York, 1996);莱昂等编著的《药物化学通信》的第8期2997页(1998)(Leon et al,
Bioorg. Med. Chem. Lett. 8, 2997 (1998));凯斯勒等,克瑞思等《国际化学通信》40章,165页(2001)(Kessler et al., Agnew. Chem. Int. Ed. 40, 165 (2001));思米思等《药物化学期刊》第一期,326页(1999)(mith et al., J. Comb. Med. 1, 326 (1999)); 沃雨等,《四面体通信》,42期,515页(2001)(Orain et al., Tetrahedron Lett. 42, 515 (2001)); 帕帕尼克丝,《美国哈杂志》,第123期,2176(2001)(Papanikos et al., J. Am. Chem. Soc. 123, 2176 (2001)); Gottschling等,《百各罗药物化学通信》,11期,2997(2001)(Gottschling et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 11, 2997
(2001)),上述每一个都在参考文献中完整列出并作为本发明的一部分。这种固相基质可以通过修饰来提供连接位点,例如,由乙酰化,盐(silation),用硝酸添加氨基链,附加中介蛋白质,树状聚合物/或星型聚合物。这并不意味着限制,并在现有技术上任何方法都可以被采用。
一旦这样一个复合体的分析物进入检测区,表示测试样品中的被分析物的存在或存在数量的信号就可以被测定。一个熟练的技术人员可以知道,各种手段可用于被分析检测区的信号检测。光学检测手段的典型例子包括,但不限于,视觉和仪器的手段,如反射,分光光度法,荧光,发光等。这种方法可以用一个光电二极管,CCD摄像机,荧光分光光度计等检测光信号。也可用其他检测手段。在检测光学标记物过程中,为了产生可用的视觉标记可以用适当波长的光源照射被分析物检测区,一个光学探测器接收被传输,反射或发出的光,这取决于检测方法的不同。
上文提到了视觉检测标记,熟悉的人可能会明白,根据标记的性质可以采用其他很多检测模式。其他适当的检测模式包括安培,电导,电位,阻导(impedimetric),声学,电化学发光(ECL)等,干涉,表面等离子体共振(SPR)等方法。这里所述不限于以上这份清单的描述。
7.
受体的偶连或共扼
经常为开发结合分析法的目的(例如,免疫)试剂,各种连接化学物质已被描述为可把被检测的标记物质与某中分子结合(可检测的标签,固相,等)。因此,分子可以通过选择不同的连接化学物质而被使用,例如为了固定固相,抗体与检测的标签共轭的准备和其他标记的蛋白质和核酸试剂,这种“连接化学物质”可以通过提供一个或多个官能团分子的肽的氨基酸侧链的配对。这些“连接化学物质试剂”可分为: 1.官能团和化学特性; 2. 长度和桥键的成分; 3.官能团是否发生化学反应或光化学反应; 4. 连接是否可以被裂解。
使用连接试剂的化学反应,可以有针对性的群体包括伯胺,硫氢[巯基]化合物(sulfhydryls),羰基化合物,碳水化合物和羧酸。此外,许多活性基团可以无选择性的配上使用光反应苯基叠氮化物的交联剂等。
化学连接试剂可提供的各种间隔臂(或“桥梁”)间距,用来间隔被分析物质与接合物质分子之间的空间距离,最主要的作用是它能处理好连接基团的空间为阻,由于空间位阻效应反映了潜在的反应位点之间的距离,不同的反可以需要不同的桥梁或连接试剂的浓度。合适的连接试剂在本领域内是众所周知的,例如由皮尔斯公司(Pierce
Biotechnology, Inc.)提供的一些市售连接试剂(Rockford, IL)。
首选检测的标记共轭物小于大约100纳米左右,更优选,小于大约70纳米的左右,更有选的,少于大约40纳米,最好的,小于大约20纳米。 “大约”一词在这种情况下使用,是指为+ / - 一个给定值的正负10%。某些首选的可被检测标记物物质包括乳胶颗粒,如在美国专利号5763189,6238931;6251687;国际公布WO95/08772描述的乳胶颗粒,这些参考文件作为本发明的一部分被使用,这些颗粒的内部或表面本身就包括可以被检测的物质。
8. 受体的选择
配体-受体对是指,能够相互认识和相互制约的化学基团的配体和配体-受体对。配体和受体可以是任何基团,能够认识和相互制约,形成一个复杂的复合体。此外,配体和受体可以通过第三中介物质相互结合互动。通常情况下,配体和受体结合分子经过一个特定的非共价键相互结合相互作用构成配体-受体对。配体和受体可以自然发生或人工产生,并可以有选择地与其他物质结合。
作为配体和/或受体的例子包括,但不仅限于,为细胞膜上的受体,毒素和毒液,病毒抗原表位,如类固醇激素,激素受体,多肽,酶类和其他催化多肽,酶底物,辅助因子的激动剂和拮抗剂包括有机小分子药物,阿片类,阿片受体,凝集素,糖,糖类包括多糖,蛋白质,包括单克隆抗体和抗体片段合成,细胞,细胞膜和基团,其中包括细胞膜上的受体和细胞器抗体药物。例子包括配体-受体对包括对凝集素糖肽细胞膜受体蛋白A的抗体;半抗原;抗半抗原的抗体,地高辛,抗地高辛的抗体;酶的辅助因子,酶 -底物和抗体抗原。由于此处使用,分析物可配体或可与配体关联。因此,如果分析物是一种抗原,抗原结合的抗体,是一种受体。
抗体的产生和选择可以由很多几种方法。例如,一种方式是纯化感兴趣的多肽或合成多肽,使用,例如,本领域公知的固相多肽合成方法。参加,例如,《蛋白质纯化指南》,P·D·穆雷等,酶学, 182卷(1990)(Guide to Protein
Purification, Murray P. Deutcher, ed., Meth. Enzymol. VoI 182 (1990));《固相多肽合成》,B·格雷等, 酶学, 289卷(1997)(Solid Phase
Peptide Synthesis, Greg B. Fields ed., Meth. Enzymol. Vol. 289 (1997);《化工制药》,木曾川等,(东京)38号,第1192(1990)(Kiso et al,
Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 38, 1192 (1990));《生物医学》,牟斯多等(Mostafavi
et al, Biomed. Pept.);《蛋白质核酸》,藤原等,1255卷, (1995)(东京)(Proteins
Nucleic Acids 1, 255 (1995));《化工制药》,44, 1326 (1996)(东京)(Fujiwara et al., Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 44, 1326
(1996))等杂志或工具书。 例如,将选定的多肽注射到小鼠或兔子,产生多克隆或单克隆抗体。本领域里一个熟练的技术人员可以认识到,在很多试验手册上可以找到产生抗体的方法,例如埃德哈洛和大卫巷等编著的《抗体试验手册》,冷泉港实验室,冷泉港,纽约,1988(Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, N.Y., 1988)。例如。本领域里一个熟练的技术人员也会了解一些类似抗体的接合片断或Fab片段可以通过基因手段进行合成(抗体工程准备:实际出发,C·伯瑞克等编著,教育署,牛津大学出版社,牛津大学,1995年;免疫学研究,149卷,3914(1992)(A Practical
Approach, Borrebaeck, C, ed., Oxford University Press, Oxford, 1995; J.
Immunol. 149, 3914 (1992))。
此外,许多出版物都报道了使用噬菌体展示技术来从多肽库中筛选结合目标物质的多肽,例如,参见克伟德等,美国《自然社会科学方法》第87期6378页,1990(Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA 87, 6378 (1990)); Devlin et al., Science 249, 404 (1990); 思克和丝米司,《科学》249期386期,1990(Scott &
Smith, Science 249, 386 (1990)); 和发明人为拉德纳等的美国专利,号码: 5,571,698。噬菌体展示方法的一个基本概念是建立一个DNA编码一个进行筛选的多肽和多肽之间的物理文库。这种物理文库提供的噬菌体颗粒,其中显示了作为一个封闭的噬菌体基因组编码的多肽衣壳的一部分多肽。一个多肽和他们的遗传物质之间的物理文库的成立可以同时大规模筛选噬菌体非常大的数字各不相同的多肽。噬菌体展示多肽与亲和力目标绑定到目标和这些噬菌体丰富亲和筛选目标。从这些噬菌体显示多肽的身份可确定从各自的基因组。使用这些方法的确定为一个理想的目标结合亲和力多肽可以再合成散装的常规手段。见,例如,美国专利号6057098的全部内容,包括所有表格,数字,并声称这是此纳入。
然后,由这些方法产生的抗体可以选择先筛选利益的纯化多肽的亲和力和特异性,如果需要的话,比较的结果,希望被排除的多肽的亲和力和特异性抗体具有约束力。甄别程序可以涉及固定微孔板独立井纯化多肽。该解决方案包含一个潜在的抗体或抗体组,然后放置到各自的酶标井,培养约30分钟到2小时。酶标井,然后洗净,添加一个标记的二抗(例如,一个抗鼠抗体结合碱性磷酸酶,如果提出的抗体鼠抗体)井,培养约30分钟,然后洗净。基板添加到井和抗体的固定化的多肽是目前一种颜色的反应将会出现 然后,可以进一步分析,以便确定该抗体在选定的实验设计的亲和力和特异性。在发展的目标蛋白的免疫,纯化目标蛋白质作为一个标准来判断的使用已选定的抗体免疫检测的灵敏度和特异性。由于各种抗体的结合亲和力可以有所不同,某些抗体对(例如,在夹心检测)可能互相干涉,空间位阻,等,检测抗体的性能可能是一个重要的衡量标准不是绝对的亲和力和特异性的抗体。
这些领域的技术将认识到,许多方法可以产生抗体或有约束力的碎片和各种多肽的亲和力和特异性的筛选和选择,但这些方法不改变本发明的范围。
9. 试剂蓄水池 参照图1,使用一个可选的试剂蓄水池108可以接收来自设备的上游地区反应混合物,其他试剂和任何多余的样品。此处使用的“蓄水池”一词是从测试区域的下游指收集流体的终端测试装置的一个元素。流体收集到这样一个蓄水池不再参与任何分析物的检测反应。所用的试剂蓄水池的储备量至少为流体样本的量或存在于装置中或被额外添加装置中的试剂。使用的试剂蓄水池可以采取多种形式,用吸水,如硝化纤维,多孔聚乙烯或聚丙烯;使用的试剂蓄水池的吸水材料,可包括一系列毛细管沟槽。在使用的试剂蓄水池沟槽的情况下,毛细管沟槽的沟槽设计可以有不同的毛细管压力,通过这些细管沟槽可以让试剂通过装置或试剂没有受到毛细管压力,同时也可以阻止些试剂向后流经试剂设备。