CN114574457A - 一种快速分离纯化蛋白质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种快速分离纯化蛋白质的方法，包括以下步骤：分别配置聚电解质a溶液、聚电解质b溶液和氯化钠溶液；向待分离蛋白质溶液中依次加入氯化钠溶液、聚电解质a溶液，振荡混合，稳定平衡后进行离心处理，使得溶液分离成两相，获得的上清液包含与聚电解质a带相同电荷的蛋白质A，获得的凝聚层包括聚电解质a以及与聚电解质a带有相反电荷的蛋白质B；向S2中获得的凝聚层中加入氯化钠溶液，之后加入聚电解质b溶液，与溶液中的聚电解质a形成沉淀，离心处理后，得到的上清液为澄清透明的包含蛋白质B的溶液。与现有技术相比，本发明能够高效的从蛋白质混合液中，得到纯净的蛋白质溶液，并且该方法成本较低，有利于工业化使用。

Description

一种快速分离纯化蛋白质的方法
技术领域
本发明涉及蛋白质的分离纯化技术领域，尤其是涉及一种快速分离纯化蛋白质的方法。
背景技术
蛋白质作为一种几乎参与了生命的所有过程的有机大分子，在生命活动中起着至关重要的作用。近年来，蛋白质在食品，生物工程和医药领域都有着广泛的应用。但是，生物发酵液中蛋白质往往以混合物的方式存在。因此，需要在不影响蛋白质的结构和活性的条件下分离和纯化蛋白质，这成为蛋白质应用的很大挑战以及前提。
现有蛋白质分离纯化技术主要包括：沉淀法，膜分离，色谱法等。但是，这些蛋白质分离方法在工业化应用时存在一系列问题，比如沉淀法效率低，膜分离法以及色谱法成本高，耗时长。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种快速分离纯化蛋白质的方法，能够实现大规模、低成本、高选择性的蛋白质分离，有望代替膜分离等现有的方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明的目的是保护一种快速分离纯化蛋白质的方法，包括以下步骤：
S1：分别配置聚电解质a溶液、聚电解质b溶液和氯化钠溶液；
S2：向待分离蛋白质溶液中依次加入氯化钠溶液、聚电解质a溶液，振荡混合，稳定平衡后进行离心处理，使得溶液分离成两相，获得的上清液包含与聚电解质a带相同电荷的蛋白质A，获得的凝聚层包括聚电解质a以及与聚电解质a带有相反电荷的蛋白质B；
S3：向S2中获得的凝聚层中加入氯化钠溶液，得到澄清透明的均相溶液，之后加入聚电解质b溶液，与溶液中的聚电解质a形成沉淀，离心处理后，得到的上清液为澄清透明的包含蛋白质B的溶液。
进一步地，所述蛋白质A和蛋白质B的等电点不同。即所述的蛋白质混合溶液中为具有不同等电点的蛋白质，包括但不局限于辣根过氧化物酶(HRP)，溶菌酶(lysozyme)，细胞色素c(cytc)和牛血清白蛋白(BSA)。
进一步地，所述聚电解质a为阳离子型聚电解质。
进一步地，所述聚电解质a为聚乙烯亚胺(PEI)、聚甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯(PDMEMA)、聚酰胺-胺树状大分子(PAMAM)中的一种。
进一步地，S2中，所述聚电解质a与待分离蛋白质溶液中蛋白质B的摩尔比为0.05～0.5。
进一步地，所述聚电解质b为阴离子型聚电解质。
进一步地，所述聚电解质b为聚丙烯酸(PAA)、聚苯乙烯磺酸(PSS)中的一种。
进一步地，所述聚电解质b与所述凝聚层中蛋白质的摩尔比为0.05～1。
进一步地，所述氯化钠溶液的浓度为50～500mmol/L。
进一步地，S3中澄清透明的均相溶液的pH值为5.0～7.0。
与现有技术相比，本发明具有以下技术优势：
本发明使用聚电解质依靠电荷作用分离蛋白质，使用具有不同电荷的聚电解质来实施具体分离。通过第一级分离，使得具有不同电荷的蛋白质分别处于凝聚层和上清液中，通过第二级分离可以除去凝聚层中残余的聚电解质a，可实现凝聚层中蛋白质的提纯，通过两级的处理过程，能够从混合蛋白质溶液中分别得到纯净的蛋白质溶液，能够实现大规模、低成本、高选择性的分离，有望代替膜分离等现有的方法实现工业化使用。
附图说明
图1为本技术方案中快速分离纯化蛋白质的方法的流程示意图；
图2为实施例1中第一级分离处理中离心后的分相实物图片；
图3为实施例3中第二级分离处理中离心后的分相实物图片。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本技术方案中如未明确说明的制备手段、材料、结构或组成配比等特征，均视为现有技术中公开的常见技术特征。
如图1所示，为本发明处理过程的全部操作。如图所示，首先往蛋白质混合物中加入聚电解质a溶液。混合均匀，平衡后离心处理，样品分层后取出其上清液为所得的与聚电解质a带有相同电荷的蛋白质溶液，往凝聚层中加入氯化钠溶液，混合均匀后，往其中加入聚电解质b溶液。涡旋混合，离心处理，取出上清液，则为所需的聚电解质a带有相反电荷的蛋白质溶液。
以下实例中所使用的实验材料，如蛋白质，聚电解质，如无特别说明，均为常规可市售获得的产品。
蛋白质A和蛋白质B的等电点不同。即所述的蛋白质混合溶液中为具有不同等电点的蛋白质，包括但不局限于辣根过氧化物酶(HRP)，溶菌酶(lysozyme)，细胞色素c(cytc)和牛血清白蛋白(BSA)。聚电解质a为阳离子型聚电解质。聚电解质a为聚乙烯亚胺(PEI)、聚甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯(PDMEMA)、聚酰胺-胺树状大分子(PAMAM)中的一种。聚电解质a与待分离蛋白质溶液中蛋白质B的摩尔比为0.05～0.5。聚电解质b为阴离子型聚电解质。聚电解质b为聚丙烯酸(PAA)、聚苯乙烯磺酸(PSS)中的一种。聚电解质b与所述凝聚层中蛋白质的摩尔比为0.05～1。氯化钠溶液的浓度为50～500mmol/L。
实施例1
取0.1g牛血清白蛋白BSA(PI＝4.7)使用去离子水定容至5mL，取0.02g辣根过氧化物酶HRP(PI＝7.2)使用去离子水定容至5mL。将上述两种溶液搅拌2h以上，分别对上述两种溶液进行过滤，除去溶液中的不溶性杂质，得到澄清透明的溶液，使用调节两种蛋白质溶液的pH值为6，使用Pierce BCA蛋白定量分析试剂盒测定溶液中的蛋白质浓度，测定结果为BSA溶液浓度为16g/L，摩尔浓度为0.2mM；HRP溶液浓度为3.5g/L，摩尔浓度为0.1mM。
取0.02g PEI样品使用去离子水定容至5mL，制备出PEI浓度为3.8g/L，摩尔浓度为0.2mM，调节PEI溶液的pH为6。配制500mM氯化钠溶液，调节溶液pH为6。
取一个空的离心管，依次向离心管中加入去离子水，氯化钠溶液，BSA溶液，HRP溶液，PEI溶液。其中，NaCl浓度为10mM，PEI/BSA摩尔比为0.05。振荡至液体混合均匀，将其放置至少8小时，平衡稳定后，将其置于离心机上室温条件下离心35min。取出上清液，向凝聚层中加入等量500mM的氯化钠溶液，振荡至澄清透明的均相溶液。分别进行对两种溶液的BSA，HRP，PEI浓度测定。结果得出95％的HRP存在于上清液中；32％的BSA以及68％的PEI存在于凝聚相中。图2为实施例1中第一级分离处理中离心后的分相实物图片。
实施例2
使用实施例1中的方法制备的BSA，HRP，PEI，NaCl溶液。
依次加入去离子水，氯化钠溶液，BSA溶液，HRP溶液，PEI溶液。其中NaCl浓度为50mM，PEI/BSA摩尔比为0.5。振荡至液体混合均匀，将其放置至少8小时，平衡稳定后，将其置于离心机上室温条件下离心35min。取出上清液，向凝聚层中加入等量500mM的氯化钠溶液，振荡至澄清透明的均相溶液。分别进行对两种溶液的BSA，HRP，PEI浓度测定。结果得出95％的HRP存在于上清液中；45％的BSA以及69％的PEI存在于凝聚相中。
实施例3
制备三份PAA溶液，质量浓度为1.5g/L，摩尔浓度为0.1mM，分别调节pH为5，6，7。
在一个新的离心管中加入实施例2中得到的凝聚层加入NaCl后的溶液，调节pH为5，加入pH＝5的PAA溶液。根据之前测定的BSA浓度可以得出该条件下，PAA/BSA的摩尔比为0.2。振荡至液体混合均匀，平衡稳定后，将其离心35min，离心管底部有少许沉淀。取出上清液为BSA溶液，测定其浓度。结果得出89％的BSA存在于上清液中。图3为实施例3中第二级分离处理中离心后的分相实物图片。
实施例4
使用实施例3中制备的PAA溶液。在一个新的离心管中加入实施例2中得到的凝聚层加入NaCl后的溶液，调节pH为7，加入等pH的PAA溶液。根据之前测定的BSA浓度可以得出该条件下，PAA/BSA的摩尔比为1。振荡至液体混合均匀，平衡稳定后，将其离心35min，离心管底部有少许沉淀。取出上清液为BSA溶液，测定其浓度。结果得出99％的BSA存在于上清液中。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种快速分离纯化蛋白质的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：分别配置聚电解质a溶液、聚电解质b溶液和氯化钠溶液；
S2：向待分离蛋白质溶液中依次加入氯化钠溶液、聚电解质a溶液，振荡混合，稳定平衡后进行离心处理，使得溶液分离成两相，获得的上清液包含与聚电解质a带相同电荷的蛋白质A，获得的凝聚层包括聚电解质a以及与聚电解质a带有相反电荷的蛋白质B；
S3：向S2中获得的凝聚层中加入氯化钠溶液，得到澄清透明的均相溶液，之后加入聚电解质b溶液，与溶液中的聚电解质a形成沉淀，离心处理后，得到的上清液为澄清透明的包含蛋白质B的溶液。
2.根据权利要求1所述的一种快速分离纯化蛋白质的方法，其特征在于，所述蛋白质A和蛋白质B的等电点不同。
3.根据权利要求1所述的一种快速分离纯化蛋白质的方法，其特征在于，所述聚电解质a为阳离子型聚电解质。
4.根据权利要求3所述的一种快速分离纯化蛋白质的方法，其特征在于，所述聚电解质a为聚乙烯亚胺、聚甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯、聚酰胺-胺树状大分子中的一种。
5.根据权利要求1所述的一种快速分离纯化蛋白质的方法，其特征在于，S2中，所述聚电解质a与待分离蛋白质溶液中蛋白质B的摩尔比为0.05～0.5。
6.根据权利要求1所述的一种快速分离纯化蛋白质的方法，其特征在于，所述聚电解质b为阴离子型聚电解质。
7.根据权利要求6所述的一种快速分离纯化蛋白质的方法，其特征在于，所述聚电解质b为聚丙烯酸、聚苯乙烯磺酸中的一种。
8.根据权利要求1所述的一种快速分离纯化蛋白质的方法，其特征在于，所述聚电解质b与所述凝聚层中蛋白质的摩尔比为0.05～1。
9.根据权利要求1所述的一种快速分离纯化蛋白质的方法，其特征在于，所述氯化钠溶液的浓度为50～500mmol/L。
10.根据权利要求1所述的一种快速分离纯化蛋白质的方法，其特征在于，S3中澄清透明的均相溶液的pH值为5.0～7.0。
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