CN105026417A - 用于降低蛋白质制剂中的聚集物含量的方法 - Google Patents

用于降低蛋白质制剂中的聚集物含量的方法 Download PDF

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Abstract

降低包含期望蛋白质的蛋白质制剂中的聚集物和产物-污染物复合体含量的方法包括(i)使所述蛋白质制剂与包含至少一种能够结合金属的表面结合配体的至少一个固体表面接触，所述能够结合金属的表面结合配体最初基本上不含金属，操作条件被选择为基本上防止所述期望蛋白质与所述至少一个固体表面的结合，和(ii)使所述蛋白质制剂与所述表面结合配体分离，使得当存在超过一种的表面结合配体时，每一表面结合配体均独立地具有相同的净电荷或为电荷中性。

Description

用于降低蛋白质制剂中的聚集物含量的方法
相关申请的声明
本申请要求于2013年2月6日提交的美国临时申请号61/761,646的优先权，并且其全部内容以引用方式并入本文中。
背景技术
本文所公开的实施方案涉及用于纯化包括抗体的蛋白质的方法和材料。具体地说，实施方案涉及用于降低聚集物含量的方法以及将这些能力与其它纯化方法整合以实现蛋白质的目标纯化水平。
已表明源于宿主细胞的污染物与通过体外细胞培养方法产生的重组蛋白之间自发地形成非天然的异质聚集物(Shukla等，Biotechnol.Progr.(2008)24：1115-1121；Luhrs等，J.Chromatogr.B(2009)877：1543-1552；Mechetner等，J.Chromatogr.B(2011)879：2583-2594；Gagnon等，J.Chromatogr.A，(2011)1218：2405-2412；Gagnon,Bioprocessing J.(2010)9(4)：14-24)。这些异质聚集物在两个方面可被认为是非天然的：1)组成性污染物通常是非人来源的，由活的非人宿主细胞分泌，或在非人宿主细胞死亡后裂解时释放到培养基中。在活的人体中，不存在此类非人的污染物；以及2)相比于其中死细胞组分被快速清除的人体内系统，组成性污染物累积到高浓度。因此，重组产物暴露于在生命系统中通常不会出现的浓度的高水平的强相互作用性污染物。同时，高表达水平的重组蛋白使它们成为与这些非人的污染物非特异性缔合的适合底物，有利于形成不同组成的非期望异质聚集物。
与抗体形成稳定缔合物的污染物的具体来源并非总是已知的(参见例如Shukla等，见上文)。一些努力专注于DNA污染物，而很少注意到其它可能的污染物的具体来源(Gagnon等和Gagnon，见上文)。一些表明宿主污染物与抗体制剂中的聚集物的关联性的努力特定地关注包含染色质分解代谢产物的污染物(Luhrs等和Mechetner等，见上文)。在这些示例中，聚集可直接通过抗体对染色质分解代谢产物(例如组蛋白和DNA)的免疫特异性来介导。已表明染色质分解代谢产物还能够通过非特异性相互作用与抗体形成稳定复合体。因此，对不包含染色质分解代谢产物的抗原具有已知免疫特异性的单克隆抗体，可与源于死的宿主细胞的细胞核的核小体、组蛋白和DNA形成具有不同类型的高度稳定的聚集物(Gan等，J.Chromatogr.A 1291(2013)33-40)。特别地，已表明染色质分解代谢产物在高分子量(HMW)聚集物中有高度代表性。HMW聚集物特别值得关注，因为它们疑似参与促进治疗中和性抗体的形成。HMW聚集物通常被定义为大小高于小倍数目标抗体的聚集物。
用预期可使异质聚集物解离的试剂处理抗体制剂已被证明是无效的。例如，采用高浓度的尿素、盐或两者的组合不会使IgM-污染物异质聚集物大量解离(Gagnon等，见上文)。许多此类聚集物已被证明甚至在例如4M胍的强离液剂下也是稳定的。
进行与色谱柱结合的蛋白质的预洗脱洗涤支持一些改善。已表明有尿素、醇和表面活性剂的预洗脱洗涤的蛋白A亲和色谱比无洗涤更有效地降低异质聚集物水平(Shukla等，见上文)，这与组合了尿素、盐和EDTA与蛋白G亲和色谱的预洗脱洗涤一样(Mechetner等，见上文)。已表明有尿素的预洗脱洗涤的阴离子交换色谱比无尿素洗涤更有效地降低异质聚集物(Gagnon等，见上文)。也已表明有预洗脱EDTA洗涤的阳离子交换色谱比无所述洗涤更有效地降低异质聚集物(Gagnon等，见上文)。最后，有尿素和/或盐的预洗脱洗涤的羟基磷灰石也比无此类洗涤更有效地降低异质聚集物(Gagnon，见上文)。虽然存在这些观察结果，但一般来说，在与色谱柱结合的抗体的预洗脱洗涤中使用解离剂仅获得了适度成功。
也已表明有机多价阳离子用于使酸性蛋白质沉淀(Farhner等，美国专利申请号20080193981；Ma等，J.Chromatogr.B(2010)878：798-806；Peram等，Biotechnol.Progr.，(2010)26：1322-1326；Glynn，inU.Gottschalk(编辑)，Process Scale Purification of Antibodies，J.T.Wiley&Sons，(2009)Hoboken，309-324)以及用于使DNA和内毒素沉淀(Glynn，见上文；Cordes等，Biotechnol.Progr.，(1990)6：283-285；Dissing等，Bioseparation，(1999)7221：9-11)和使病毒失活(Bernhardt，美国专利5,559,250)。还表明多价金属阳离子从一些蛋白质制剂去除DNA和内毒素(Akcasu等，Nature，(1960)187：323-324；Matsuzawa等，Nucl.Acids Res.，(2003)3(3)：163-164；Christensen等，Prot.Expr.Purif.，(2004)37：468-471；Kejnovsky等，Nucl.Acids Res.，(1997)25：1870-1871；Ongkudon等，Anal.Chem.，(2011)83391：13-17)。
固定化TREN(三(2-氨乙基)胺)是已知的并且可商业获得用于进行固定化金属亲和色谱(IMAC)的目的，其中首先用金属离子加载所述固定化TREN，并且通过与缔合TREN的金属离子接触来捕获生物分子，然后通过使靶生物分子从金属离子解离来回收所述生物分子。除TREN以外的IMAC配体(例如亚氨基二乙酸(IDA)和次氮基乙酸(NTA))也是已知的并且可商业获得用于进行IMAC的目的，其中首先用金属离子加载所述配体，并且通过与缔合配体的金属离子接触来捕获生物分子，然后通过使靶生物分子从金属离子解离来回收所述生物分子。
发明内容
在一些方面，本文所公开的实施方案涉及降低包含期望蛋白质的蛋白质制剂中的聚集物和产物-污染物复合体含量的方法，所述方法包括(i)使所述蛋白质制剂与包含至少一种能够结合金属的表面结合配体的至少一个固体表面接触，其中所述能够结合金属的表面结合配体最初基本上不含金属，其中操作条件被选择为基本上防止所述期望蛋白质与所述至少一个固体表面的结合，和(ii)使所述蛋白质制剂与所述至少一种表面结合配体分离，其中当存在超过一种的表面结合配体时，每一种表面结合配体均独立地具有相同的净电荷或为电荷中性。
具体实施方式
已惊讶地发现，在某些实施方案中，下述方法可有效地降低蛋白质制剂中的高分子量(HMW)聚集物和异质聚集物的含量，所述方法采用包含至少一个固体表面的物质组合物，所述固体表面包含至少一种能够结合金属的表面结合配体，其中所述能够结合金属的表面结合配体最初基本上不含金属。在某些实施方案中，所述方法和组合物特别地降低包含染色质残余物(例如核小体和/或组蛋白和/或DNA)的聚集物的含量。在某些实施方案中，本文所公开的方法具有去除例如可能已被添加到蛋白质制剂中的多价离子和抗病毒化合物的试剂的额外能力。已惊讶地发现，在某些实施方案中，表面结合金属亲和配体的使用降低了聚集物水平，而可溶性螯合剂则不会。不归因于任何特定的理论，这表明所述效应可能不是通过金属介导，而是通过能够结合金属的配体中所体现的尚未被鉴别的化学官能性介导；或可选地或另外地通过来自样品的所结合的金属介导。又一出乎意料的发现是一些实施方案除了能去除蛋白质聚集物以外还能去除蛋白质片段的能力，这是尤其难以理解的，因为一些实施方案在去除聚集物之外，还去除来自IgG制剂的重链和轻链污染物。
在本文所公开的每个实施方案中，为了实现降低的聚集物水平，操作条件被选择为基本上防止期望蛋白质与所有固体表面上的每一表面结合配体的结合。在一些实施方案中，防止期望蛋白质的结合可包括调节蛋白质制剂的电导率。在一些实施方案中，防止期望蛋白质的结合可包括调节盐浓度。本领域技术人员将认识到，调节盐浓度与调节电导率相关联。在一些实施方案中，防止期望蛋白质的结合可包括包含离液盐。在一些实施方案中，防止期望蛋白质的结合可包括调节pH。在一些实施方案中，防止结合可包括包含有机改性剂，例如有机溶剂、表面活性剂、离液剂或其它有机改性剂。在一些实施方案中，防止期望蛋白质与表面结合配体的大量结合可通过复合方法介导，例如pH与盐浓度的组合、或盐浓度与有机溶剂的组合、或盐浓度与离液剂的组合、或任何其它组合。因此，本领域技术人员将了解，上述操作参数的任何组合均可经调节以提供用于给定的期望蛋白质的最佳操作条件。
在某些实施方案中，本文所公开的方法的另一令人惊讶的特征是聚集物水平被大幅度降低或清除，尽管存在以下事实：样品的电导率可高于避免期望蛋白质与表面结合配体的结合所必需的电导率。在某些此类实施方案中，样品的电导率比防止期望蛋白质与表面结合配体的大量结合所需的水平大5％。在某些此类实施方案中，样品的电导率比防止期望蛋白质与表面结合配体的大量结合所需的水平大10％、20％、50％、100％、200％或300％。
在某些实施方案中，本文所公开的方法的另一令人惊讶的特征是样品的pH可高于或低于避免期望蛋白质与表面结合配体的结合所必需的pH。在一个此类涉及带负电荷的配体的实施方案中，pH可比避免期望蛋白质与表面结合配体的结合所必需的pH高0.5pH单位。在一个此类实施方案中，pH可比防止期望蛋白质与表面结合配体的结合所必需的pH高1单位、或2单位、或3单位或更高。在一个此类涉及带正电荷的配体的实施方案中，pH可比避免期望蛋白质与表面结合配体的结合所必需的pH低0.5pH单位。在一个此类实施方案中，pH可比防止期望蛋白质与表面结合配体的结合所必需的pH低1单位、或2单位、或3单位或更高。
在某些实施方案中，本文所公开的方法可涉及使含有期望抗体的样品与至少两种表面结合配体同时接触，一种具有对金属或金属离子具有亲和性的表面结合配体，另一种具有不对金属或金属离子特别具有亲和性的其它官能性。任一配体均可体现化学官能性，所述化学官能性尤其包括疏水相互作用、π-π键合相互作用、氢键合相互作用或静电相互作用。在另一配体具有静电性质时，所述配体上的净电荷是中性的或与金属亲和配体上的净电荷相同。在某些实施方案中，超过一种的配体可提供不同程度的效用，潜在地表明它们个别地偏向于与不同亚组的外来物质相互作用。在某些实施方案中，不同配体可分布于不同表面上。
已惊讶地发现，在某些实施方案中，蛋白质制剂中的聚集物水平可通过向此类制剂中组合添加具有混合的化学特性的可溶性多价离子并且随后添加具有混合的化学特性的不溶性颗粒或其它基底来大幅降低。实验结果表明此处理允许比用盐和/或离液剂进行液相处理、单机制固相方法或固相方法与预定的聚集物解离性洗涤的组合显著更大地降低高分子量(HMW)聚集物含量和解离异质聚集物。此方法的有价值的益处是一种或多种可溶性试剂本身从蛋白质制剂被去除，从而获得基本上不含聚集物、还基本上不含添加剂的蛋白质制剂。这可以令人惊讶地发生在1小时或更少的时间内，即使在多价离子以极低量(例如分别约0.02％至约0.025％和约0.025％至约0.5％)存在时。实验证据进一步证实，在某些实施方案中，预先用有机多价离子处理样品可增强实现的结果。
在本文所公开的每个实施方案中，在包含可溶性多价离子时，操作条件被设定为基本上防止期望蛋白质的沉淀。调节操作条件以基本上防止期望蛋白质的沉淀可通过例如调节蛋白质制剂的电导率、pH或通过包含有机改性剂(例如有机溶剂、有机聚合物、表面活性剂和离液剂)来实现。本领域技术人员将了解，上述操作参数的任何组合均可经调节以提供用于给定的期望蛋白质的最佳操作条件。
本文所公开的实施方案提供了降低包含期望蛋白质的蛋白质制剂中的聚集物和产物-污染物复合体含量的方法，所述方法包括(i)使所述蛋白质制剂与包含至少一种能够结合金属的表面结合配体的至少一个固体表面接触，其中所述能够结合金属的表面结合配体最初基本上不含金属，其中操作条件被选择为基本上防止所述期望蛋白质与所述至少一个固体表面的结合，和(ii)使所述蛋白质制剂与所述至少一种表面结合配体分离；其中当存在超过一种的表面结合配体时，每一表面结合配体均独立地具有相同的电荷或为电荷中性。
在一些此类实施方案中，能够结合金属的表面结合配体提供了选自由静电相互作用、疏水相互作用、π-π相互作用、氢键合和其组合组成的组的其它化学官能性。
在前述实施方案的一个或多个中，接触步骤进一步包括使蛋白质制剂与至少一种提供不包括结合金属的化学官能性的表面结合配体接触。
在前述实施方案的一个或多个中，至少一种提供不包括结合金属的化学官能性的表面结合配体与所述至少一种能够结合金属的表面结合配体位于同一固体表面上。
在前述实施方案的一个或多个中，至少一种提供不包括结合金属的化学官能性的表面结合配体与所述至少一种能够结合金属的表面结合配体位于不同的固体表面上。
在前述实施方案的一个或多个中，不包括结合金属的化学官能性提供了选自由静电相互作用、疏水相互作用、π-π键合、氢键合和其组合组成的组的化学官能性。
在前述实施方案的一个或多个中，能够结合金属的表面结合配体上的净电荷为正。
在前述实施方案的一个或多个中，能够结合金属的表面结合配体包括选自由以下组成的组中的一种：三(2-氨乙基)胺(TREN)、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、聚丙烯亚胺四胺、去铁胺、组氨酸、组胺、精氨酸、赖氨酸、聚组氨酸、聚精氨酸、聚赖氨酸和其组合。
在前述实施方案的一个或多个中，能够结合金属的表面结合配体上的净电荷为负。
在前述实施方案的一个或多个中，能够结合金属的表面结合配体包括选自由以下组成的组中的一种：亚氨基二乙酸(2-(羧甲基氨基)乙酸)、乙二醇(氨乙基醚)二乙酸、二乙胺三胺五乙酸(diethyleaminetriaminepentaaceticacid)、次氮基乙酸(2,2',2”-次氮基三乙酸)、天冬氨酸、谷氨酸、聚天冬氨酸和其组合。
在前述实施方案的一个或多个中，方法可进一步包括使蛋白质制剂与有机添加剂接触以降低蛋白质制剂中的聚集物污染的程度。
在前述实施方案的一个或多个中，有机添加剂为酰脲。
在前述实施方案的一个或多个中，酰脲为尿囊素或尿素。
在前述实施方案的一个或多个中，尿囊素是基本上可溶的，并且以高达约0.6％的非零量存在。
在前述实施方案的一个或多个中，尿囊素是基本上不溶的，并且以约1％到约2％的范围存在。
在前述实施方案的一个或多个中，尿囊素是基本上不溶的，并且以约1％到约10％的范围存在。
在前述实施方案的一个或多个中，尿囊素是基本上不溶的，并且以约1％到约20％、或约1％到约30％、或约1％到约40％、或约1％到约50％的范围存在。
在前述实施方案的一个或多个中，尿素以约0.5M到约8M的范围存在。
在前述实施方案的一个或多个中，尿素以约1M到约4M的范围存在。
在前述实施方案的一个或多个中，尿素以约1M到约2M的范围存在。
在前述实施方案的一个或多个中，有机添加剂为有机溶剂。
在前述实施方案的一个或多个中，有机溶剂包括选自由以下组成的组中的一种：乙二醇、丙二醇、二甲亚砜、乙醇、异丙醇、苯氧乙醇和其组合。
在前述实施方案的一个或多个中，有机溶剂包括选自由乙二醇、丙二醇、二甲亚砜和其组合组成的组中的一种，每种均独立地以约1％体积/体积到约50％体积/体积的范围存在，其中任何组合的总聚集物量在约1％体积/体积到约50％体积/体积的范围。
在前述实施方案的一个或多个中，有机溶剂包括选自由乙二醇、丙二醇、二甲亚砜和其组合组成的组中的一种，每种均独立地在约1％体积/体积到约25％体积/体积的范围，其中任何组合的总聚集物量在约1％体积/体积到约25％体积/体积的范围。
在前述实施方案的一个或多个中，有机溶剂包括选自由二甲亚砜、乙醇、异丙醇、苯氧乙醇和其组合组成的组中的一种，每种均独立地在约0.05体积/体积到约5％体积/体积的范围，其中任何组合的总聚集物量在约0.05％体积/体积到约5％体积/体积的范围。
在前述实施方案的一个或多个中，有机添加剂包括表面活性剂。
在前述实施方案的一个或多个中，方法可进一步包括非离子型或两性离子型表面活性剂。
在前述实施方案的一个或多个中，非离子型或两性离子型表面活性剂包括选自由吐温(Tween)、Triton、Brij、CHAPS、CHAPSO和辛基葡糖苷组成的组中的一种。
在前述实施方案的一个或多个中，表面活性剂浓度包括约0.001％到约1％的范围。
在前述实施方案的一个或多个中，表面活性剂浓度包括约0.01％到约0.1％的范围。
在前述实施方案的一个或多个中，蛋白质制剂的电导率包括约0.1mS/cm到约40mS/cm的范围。
在前述实施方案的一个或多个中，蛋白质制剂的电导率包括约40mS/cm到约200mS/cm的范围。
在前述实施方案的一个或多个中，附加的固体表面基本上不与期望蛋白质相互作用。
在前述实施方案的一个或多个中，被选择为基本上防止期望蛋白质与至少一个固体表面的结合的操作条件包括选择蛋白质制剂的足够高的、以防止期望蛋白质与至少一种表面结合配体中的每一种的大量结合的电导率。
在前述实施方案的一个或多个中，被选择为基本上防止期望蛋白质与至少一个固体表面的结合的操作条件包括选择蛋白质制剂的比防止期望蛋白质与至少一种表面结合配体中的每一种的大量结合所需的值高至少约0.01％、约0.1％、约1％或约10％的电导率。
在前述实施方案的一个或多个中，被选择为基本上防止期望蛋白质与至少一个固体表面的结合的操作条件包括选择蛋白质制剂的如下电导率：比防止期望蛋白质与至少一种表面结合配体中的每一种的大量结合所需的值高至少10％。
在前述实施方案的一个或多个中，被选择为基本上防止期望蛋白质与至少一个固体表面的结合的操作条件包括选择蛋白质制剂的如下电导率：比防止期望蛋白质与至少一种表面结合配体中的每一种的大量结合所需的值高至少20％。
在前述实施方案的一个或多个中，被选择为基本上防止期望蛋白质与至少一个固体表面的结合的操作条件包括选择蛋白质制剂的如下电导率：比防止期望蛋白质与至少一种表面结合配体中的每一种的大量结合所需的值高至少50％。
在前述实施方案的一个或多个中，被选择为基本上防止期望蛋白质与至少一个固体表面的结合的操作条件包括选择蛋白质制剂的如下电导率：比防止期望蛋白质与至少一种表面结合配体中的每一种的大量结合所需的值高至少100％。
在前述实施方案的一个或多个中，被选择为基本上防止期望蛋白质与至少一个固体表面的结合的操作条件包括选择蛋白质制剂的如下电导率：比防止期望蛋白质与至少一种表面结合配体中的每一种的大量结合所需的值高至少200％。
在前述实施方案的一个或多个中，被选择为基本上防止期望蛋白质与至少一个固体表面的结合的操作条件包括选择蛋白质制剂的如下电导率：比防止期望蛋白质与至少一种表面结合配体中的每一种的大量结合所需的值高至少400％。
在前述实施方案的一个或多个中，被选择为基本上防止期望蛋白质与至少一个固体表面的结合的操作条件包括选择比防止期望蛋白质的结合所必需的pH高超过约0.5单位到约超过4单位的pH。
在前述实施方案的一个或多个中，被选择为基本上防止期望蛋白质与至少一个固体表面的结合的操作条件包括选择比防止期望蛋白质的结合所必需的pH低超过约0.5单位到约超过4单位的pH。
在前述实施方案的一个或多个中，蛋白质制剂的pH包括约5到约9的范围。
在前述实施方案的一个或多个中，至少一个固体表面包括颗粒或颗粒复合物。
在前述实施方案的一个或多个中，至少一个固体表面包括纤维或纤维复合物。
在前述实施方案的一个或多个中，至少一个固体表面包括膜或膜复合物。
在前述实施方案的一个或多个中，至少一个固体表面包括整块材料或整块材料复合物。
在前述实施方案的一个或多个中，不同的表面结合配体存在于与包含至少一种能够结合金属的表面结合配体的至少一个固体表面在结构上类似但不同的固体表面上。
在前述实施方案的一个或多个中，不同的表面结合配体存在于与包含至少一种能够结合金属的表面结合配体的至少一个固体表面在结构上不同的固体表面上。
在前述实施方案的一个或多个中，蛋白质制剂包括细胞培养收获物。
在前述实施方案的一个或多个中，蛋白质制剂包括澄清的细胞培养收获物。
在前述实施方案的一个或多个中，蛋白质制剂包含重组蛋白。
在前述实施方案的一个或多个中，蛋白质制剂包含抗体。
在前述实施方案的一个或多个中，蛋白质制剂包含大于约20％的期望蛋白质的聚集物。
在前述实施方案的一个或多个中，蛋白质制剂包含大于约10％的期望蛋白质的聚集物。
在前述实施方案的一个或多个中，蛋白质制剂包含大于约5％的期望蛋白质的聚集物。
在前述实施方案的一个或多个中，蛋白质制剂包含大于约1％的期望蛋白质的聚集物。
可提供用于方便实施前述实施方案的任一方法的试剂盒。
在某些实施方案中，提供用于降低重组蛋白制剂的聚集物含量的方法，所述重组蛋白制剂特别包括抗体、凝血因子(例如因子VIII)和重组蛋白。不受任何具体理论的束缚，已出乎意料地发现，聚集物通过与外来物质的相互作用被稳定。使抗体制剂与对外来物质的亲和性高于对抗体的亲和性的多官能性表面接触具有置换外来物质的作用，所述外来物质然后可通过简单地去除它们所结合的多官能性表面来去除。在某些实施方案中，聚集物水平被大幅降低，并且抗体回收率有时增加至超过据信存在的量，表明所述方法使聚集物解离并且将解离的抗体恢复至可纯化的产物群体的能力。在某些实施方案中，所述方法还可使单一抗体与污染物的复合体解离。除产生具有较低的聚集物群体的抗体制剂之外，在某些实施方案中，处理的抗体还展示了较低的宿主蛋白质、DNA、内毒素和病毒的污染。
在某些实施方案中，所述表面可包括如下的多孔或无孔的颗粒：其分散于整个蛋白质制剂中，或填充于柱中，或最初分散且然后填充于柱、或膜、或整块材料、或纤维、或复合结构中。
在某些实施方案中，可通过单独的或与其它试剂组合的可溶性有机多价离子预处理样品来增强聚集物去除，在此情况下，所述方法具有去除有机多价离子以及潜在去除其它试剂的另外效用。在其它情况下，所述方法的效用可通过包含单独的或在多价离子存在下的抗病毒剂来增强。
在一些实施方案中，提供了降低包含期望蛋白质的蛋白质制剂中的聚集物和产物-污染物复合体含量的方法，所述方法包括(i)使所述蛋白质制剂与包含至少一种能够结合金属的表面结合配体的至少一个固体表面接触，其中所述能够结合金属的表面结合配体最初基本上不含金属，其中操作条件被选择为基本上防止所述期望蛋白质与所述至少一个固体表面的结合，和(ii)使所述蛋白质制剂与所述至少一种表面结合配体分离；其中当存在超过一种的表面结合配体时，每一表面结合配体均独立地具有相同的电荷或为电荷中性。
在一些实施方案中，能够结合金属的表面结合配体提供了选自由静电相互作用、疏水相互作用、π-π相互作用、氢键合、范德瓦尔斯(van der Waals)相互作用和其组合组成的组的其它化学官能性。
在前述实施方案的一个或多个中，接触步骤进一步包括使蛋白质制剂与至少一种提供不包含结合金属的化学官能性的表面结合配体接触。
在前述实施方案的一个或多个中，至少一种提供不包括结合金属的化学官能性的表面结合配体与所述至少一种能够结合金属的表面结合配体位于同一固体表面上。
在前述实施方案的一个或多个中，至少一种提供不包括结合金属的化学官能性的表面结合配体与所述至少一种能够结合金属的表面结合配体位于不同的固体表面上。
在前述实施方案的一个或多个中，不包括结合金属的化学官能性提供了选自由静电相互作用、疏水相互作用、π-π键合、氢键合和其组合组成的组的化学官能性。
在前述实施方案的一个或多个中，能够结合金属的表面结合配体上的净电荷为正。
在前述实施方案的一个或多个中，能够结合金属的表面结合配体包括选自由以下组成的组的一种：三(2-氨乙基)胺(TREN)、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、聚丙烯亚胺四胺、去铁胺、组氨酸、组胺、聚组氨酸和其组合。
在前述实施方案的一个或多个中，能够结合金属的表面结合配体上的净电荷为负。
在前述实施方案的一个或多个中，能够结合金属的表面结合配体包括选自由以下组成的组中的一种：亚氨基二乙酸(2-(羧甲基氨基)乙酸)、乙二醇(氨乙基醚)二乙酸、二乙胺三胺五乙酸、次氮基乙酸(2,2',2”-次氮基三乙酸)、天冬氨酸、谷氨酸、聚天冬氨酸和其组合。
在前述实施方案的一个或多个中，方法可进一步包括使蛋白质制剂与有机添加剂接触以降低蛋白质制剂中的聚集物污染物的程度。
在前述实施方案的一个或多个中，有机添加剂为酰脲。
在前述实施方案的一个或多个中，酰脲为尿囊素或尿素。
在前述实施方案的一个或多个中，尿囊素是基本上可溶的，并且以高达约0.6％的非零量存在。
在前述实施方案的一个或多个中，尿囊素是基本上不溶的，并且以约1％到约2％的范围存在。
在前述实施方案的一个或多个中，尿囊素是基本上不溶的，并且以约1％到约10％的范围存在。
在前述实施方案的一个或多个中，尿囊素是基本上不溶的，并且以约1％到约20％的范围存在。
在前述实施方案的一个或多个中，尿素以约0.5M到约8M的范围存在。
在前述实施方案的一个或多个中，尿素以约1M到约4M的范围存在。
在前述实施方案的一个或多个中，尿素以约1M到约2M的范围存在。
在前述实施方案的一个或多个中，有机添加剂为有机溶剂。
在前述实施方案的一个或多个中，有机溶剂包括选自由以下组成的组中的一种：乙二醇、丙二醇、二甲亚砜、乙醇、异丙醇、苯氧乙醇和其组合。
在前述实施方案的一个或多个中，有机溶剂包括选自由乙二醇、丙二醇、二甲亚砜和其组合组成的组中的一种，每种均独立地在约1％到约50％的范围。
在前述实施方案的一个或多个中，有机溶剂包括选自由乙二醇、丙二醇、二甲亚砜和其组合组成的组中的一种，每种均独立地在约1％到约25％的范围并且共同地在不大于约50％的范围。
在前述实施方案的一个或多个中，有机溶剂包括选自由二甲亚砜、乙醇、异丙醇、苯氧乙醇和其组合组成的组中的一种，每种均独立地在约0.05到约5％的范围并且共同地在不大于约50％的范围。
在前述实施方案的一个或多个中，有机添加剂包括表面活性剂。
在前述实施方案的一个或多个中，方法可包括使用非离子型或两性离子型表面活性剂。
在前述实施方案的一个或多个中，非离子型或两性离子型表面活性剂包括选自由吐温、Triton、Brij、CHAPS、CHAPSO和辛基葡糖苷组成的组中的一种。
在前述实施方案的一个或多个中，表面活性剂浓度包括约0.001％到约1％的范围。
在前述实施方案的一个或多个中，表面活性剂浓度包括约0.01％到约0.1％的范围。
在前述实施方案的一个或多个中，蛋白质制剂的电导率包括约0.1mS/cm到约50mS/cm的范围。
在前述实施方案的一个或多个中，附加的固体表面基本上不与期望蛋白质相互作用。
在前述实施方案的一个或多个中，被选择为基本上防止期望蛋白质与至少一个固体表面的结合的操作条件包括选择蛋白质制剂的足够高的、以防止期望蛋白质与至少一种表面结合配体中的每一种的大量结合的电导率。
在前述实施方案的一个或多个中，被选择为基本上防止期望蛋白质与至少一个固体表面的结合的操作条件包括选择蛋白质制剂的如下电导率：比防止期望蛋白质与至少一种表面结合配体中的每一种的大量结合所需的值高至少约0.01％、或约0.1％、或约1％或约5％。
在前述实施方案的一个或多个中，被选择为基本上防止期望蛋白质与至少一个固体表面的结合的操作条件包括选择蛋白质制剂的如下电导率：比防止期望蛋白质与至少一种表面结合配体中的每一种的大量结合所需的值高至少10％。
在前述实施方案的一个或多个中，被选择为基本上防止期望蛋白质与至少一个固体表面的结合的操作条件包括选择蛋白质制剂的如下电导率：比防止期望蛋白质与至少一种表面结合配体中的每一种的大量结合所需的值高至少20％。
在前述实施方案的一个或多个中，被选择为基本上防止期望蛋白质与至少一个固体表面的结合的操作条件包括选择蛋白质制剂的如下电导率：比防止期望蛋白质与至少一种表面结合配体中的每一种的大量结合所需的值高至少50％。
在前述实施方案的一个或多个中，被选择为基本上防止期望蛋白质与至少一个固体表面的结合的操作条件包括选择蛋白质制剂的如下电导率：比防止期望蛋白质与至少一种表面结合配体中的每一种的大量结合所需的值高至少100％。
在前述实施方案的一个或多个中，被选择为基本上防止期望蛋白质与至少一个固体表面的结合的操作条件包括选择蛋白质制剂的比防止期望蛋白质与至少一种表面结合配体中的每一种的大量结合所需的值高至少200％。
在前述实施方案的一个或多个中，被选择为基本上防止期望蛋白质与至少一个固体表面的结合的操作条件包括选择蛋白质制剂的如下电导率：比防止期望蛋白质与至少一种表面结合配体中的每一种的大量结合所需的值高至少400％。
在前述实施方案的一个或多个中，被选择为基本上防止期望蛋白质与至少一个固体表面的结合的操作条件包括选择pH。
在前述实施方案的一个或多个中，被选择为基本上防止期望蛋白质与至少一个固体表面的结合的操作条件包括提供有机改性剂。
在前述实施方案的一个或多个中，蛋白质制剂的pH包括约5到约9的范围。
在前述实施方案的一个或多个中，至少一个固体表面包括颗粒或颗粒复合物。
在前述实施方案的一个或多个中，至少一个固体表面包括纤维或纤维复合物。
在前述实施方案的一个或多个中，至少一个固体表面包括膜或膜复合物。
在前述实施方案的一个或多个中，至少一个固体表面包括整块材料或整块材料复合物。
在前述实施方案的一个或多个中，不同的表面结合配体存在于与包含至少一种能够结合金属的表面结合配体的至少一个固体表面在结构上类似但不同的固体表面上。
在前述实施方案的一个或多个中，不同的表面结合配体存在于与包含至少一种能够结合金属的表面结合配体的至少一个固体表面在结构上不同的固体表面上。
在前述实施方案的一个或多个中，蛋白质制剂包括细胞培养收获物。
在前述实施方案的一个或多个中，蛋白质制剂包括澄清的细胞培养收获物。
在前述实施方案的一个或多个中，蛋白质制剂是部分纯化的。
在前述实施方案的一个或多个中，蛋白质制剂包含重组蛋白。
在前述实施方案的一个或多个中，蛋白质制剂包含抗体。
在前述实施方案的一个或多个中，蛋白质制剂包含IgG抗体。
在前述实施方案的一个或多个中，蛋白质制剂包含单克隆IgG抗体。
在前述实施方案的一个或多个中，蛋白质制剂包含大于约20％的期望蛋白质的聚集物。
在前述实施方案的一个或多个中，蛋白质制剂包含大于约10％的期望蛋白质的聚集物。
在前述实施方案的一个或多个中，蛋白质制剂包含大于约5％的期望蛋白质的聚集物。
在前述实施方案的一个或多个中，蛋白质制剂包含大于约1％的期望蛋白质的聚集物。
在前述实施方案的一个或多个中，蛋白质制剂包含大于约0.1％的期望蛋白质的聚集物。
在前述实施方案的一个或多个中，蛋白质制剂包含大于约0.01％的期望蛋白质的聚集物。
在前述实施方案的一个或多个中，在进行本文所公开的方法后，剩余的聚集物含量可小于约5％、或小于约2％、或小于约1％。
可提供用于方便实施本文所公开的任一实施方案的试剂盒。此类试剂盒可提供用于实施期望蛋白质的纯化的所有试剂和说明书。
在某些实施方案中，提供用于降低包含期望蛋白质的蛋白质样品的聚集物含量的方法；某些方法包括以下步骤：(i)提供包含至少一种能够结合金属的表面结合配体的第一固体表面，其中所述能够结合金属的表面结合配体最初基本上不含金属，(ii)提供包含至少一种缺乏结合金属的能力的表面结合配体的第二固体表面，(iii)使样品与所述第一固体表面和所述第二固体表面接触，其中所述第一固体表面和所述第二固体表面被配置成使得所述样品可同时与两个表面接触，其中操作条件基本上防止期望蛋白质与所述第一固体表面和所述第二固体表面的结合，和(iv)使所述第一固体表面和所述第二固体表面与具有降低的聚集物含量的含有期望蛋白质的蛋白质样品分离。
在一些实施方案中，可提供第三固体表面并且蛋白质样品同时与第一固体表面、第二固体表面和第三固体表面接触。在一些实施方案中，可提供第四固体表面并且蛋白质样品同时与第一固体表面、第二固体表面、第三固体表面和第四固体表面接触。本领域技术人员将了解，可提供任何数目的固体表面，各自具有潜在不同的官能性或类似官能性的变化，以增强任何数目的相互作用，例如静电吸引、π-π键合、氢键合、范德瓦尔斯吸引等，前提是所述固体表面均不具有与金属亲和配体相反的净电荷。
在一些此类实施方案中，第一固体表面和第二固体表面均为正电性。在其它实施方案中，第一固体表面和第二固体表面均为负电性。在其它实施方案中，第一固体表面可为正电性，并且第二固体表面为电荷中性。在其它实施方案中，第一固体表面可为负电性，并且第二固体表面为电荷中性。在其它实施方案中，第一固体表面可为电荷中性，并且第二固体表面为正电性。在其它实施方案中，第一固体表面可为电荷中性，并且第二固体表面为负电性。在其它实施方案中，第一固体表面和第二固体表面均可为电荷中性。
在某些实施方案中，在使样品与第一固体表面和第二固体表面接触之前，将具有混合的化学特性的有机多价离子与样品组合。在某些实施方案中，在接触蛋白质制剂之前，将第一固体表面和第二固体表面组合。在某些实施方案中，在使样品与第一固体表面和第二固体表面接触之前，将样品与具有混合的化学特性的有机多价离子孵育适当时间段。在某些实施方案中，将样品与第一固体表面和第二固体表面孵育适当时间段。在某些实施方案中，在具有混合的化学特性的有机多价离子与具有第一固体表面或第二固体表面的基底缔合的程度上，在使第一固体表面和第二固体表面与具有降低的聚集物含量的蛋白质样品分离的步骤中，从所述样品去除具有混合的化学特性的有机多价离子。
在某些实施方案中，第一固体表面为微粒。在某些实施方案中，第二固体表面为微粒。微粒固体表面可各自提供为多个颗粒。在某些实施方案中，第一固体表面颗粒和第二固体表面颗粒中的任一种或两种可为无孔的或多孔的。此类多孔颗粒具有的平均孔径可足够大，从而允许蛋白质制剂中的蛋白质进入，或过小，从而不允许蛋白质制剂中的蛋白质进入，或为约10nm到约100nm。在其中固体表面为颗粒的某些实施方案中，所述颗粒可被夹在多孔的膜或整块材料之间。在某些实施方案中，所述颗粒可被夹在织造的纤维过滤器或无定形纤维过滤器之间。在某些实施方案中，所述颗粒可被夹在晶体熔块之间。在某些实施方案中，所述颗粒可被包埋在网状聚合物网络中。
在某些实施方案中，样品的电导率处于足够高的水平，从而当接触第一固体表面和第二固体表面时，基本上避免期望蛋白质从样品沉淀。在某些实施方案中，样品的电导率大于20mS/cm。在其它实施方案中，样品大于30mS/cm、大于约40mS/cm或大于约100mS/cm。在某些实施方案中，相比于在使所述样品与所述第一固体表面和所述第二固体表面接触的步骤之前，当接触具有混合的化学特性的有机多价阳离子时足以基本上避免期望蛋白质从样品沉淀的电导率，所述样品的电导率要高出至少5％、10％、20％、50％、100％或200％。
在一些实施方案中，电导率范围的上限高于约3倍的生理电导率，但小于约4倍的生理电导率。表示为其中生理电导率为约15mS/cm的电导率值，本文所公开的方法可随着电导率增加到高达约40mS/cm而变得更加有效，且之后可下降，直到在电导率达到约60mS/cm时，其变得实质上不太有效。本领域技术人员将了解，这些值可根据具体期望目标蛋白质的特征向上或向下移动。
在某些实施方案中，聚集物包括期望蛋白质的均质聚集物。在某些此类实施方案中，基本上清除期望蛋白质的均质聚集物的存在。在某些实施方案中，聚集物包括期望蛋白质与一种污染物或多种污染物的异质聚集物。在某些此类实施方案中，异质聚集物与期望蛋白质具有基本上相同的流体动力学尺寸。在某些实施方案中，污染物为核酸、核苷酸、内毒素、金属离子、蛋白质、脂质或细胞培养基组分。在某些此类实施方案中，基本上清除期望蛋白质与污染物的异质聚集物的存在。在某些实施方案中，样品中的聚集物包括均质聚集物与异质聚集物两者。在某些实施方案中，期望蛋白质为抗体或抗体片段。在某些此类实施方案中，样品为蛋白质制剂，例如细胞培养收获物、细胞培养物上清液、源于细胞培养物的含有抗体的溶液或来自蛋白质纯化先前阶段的含有抗体的溶液。在某些此类实施方案中，蛋白质制剂为来自蛋白质纯化先前阶段的含有抗体的溶液。在某些此类实施方案中，蛋白质制剂为来自色谱柱的洗脱液。
在某些实施方案中，蛋白质制剂可为未纯化的、处于中等纯度水平、或高度纯度的。在一些实施方案中，样品的中等纯度水平可在约40％到约90％纯度的范围。在一些实施方案中，样品的高纯度水平可在约90％或更大的范围。
在某些实施方案中，通过使所述蛋白质制剂流过第一固体表面和第二固体表面来使所述制剂与第一固体表面和第二固体表面接触。
在某些实施方案中，通过使固体悬浮于蛋白质制剂中来使蛋白质制剂与第一固体表面接触。
在某些实施方案中，通过使固体悬浮于蛋白质制剂中来使蛋白质制剂与第一和固体表面接触。
在某些实施方案中，第一固体表面或第二固体表面的表面电荷通过如下物质赋予：体现超过一种化学官能性的一种或多种复合化学部分，或在所述表面上混合的单种化学基团和复合化学基团的组合，或具有不同化学组分的表面的组合。在某些实施方案中，第一固体表面或第二固体表面的表面电荷部分地由来自由以下组成的组的部分赋予：亚氨基二乙酸、乙二醇(氨乙基醚)二乙酸、次氮基乙酸、天冬氨酸、谷氨酸、羧酸、亚硫酸、磺酸盐或磷酸。在某些实施方案中，第一固体表面或第二固体表面的表面电荷通过如下物质赋予：体现超过一种化学官能性的一种或多种复合化学基团，或在所述表面上混合的单种化学基团和复合化学基团的组合，或具有不同化学组分的表面的组合。在某些此类实施方案中，第一固体表面或第二固体表面的表面电荷部分地由选自由以下组成的组的部分赋予：三(2-氨乙基)胺、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、聚丙烯亚胺四胺、PAMAM树状物(乙二胺核)、去铁胺、伯氨基、仲氨基、叔氨基和季氨基。在某些实施方案中，第一固体表面或第二固体表面的表面电荷部分地由亚氨基二乙酸赋予，并且第二组件的表面的正电性部分地由来自由三(2-氨乙基)胺(TREN)组成的组的部分赋予。在某些实施方案中，第一固体表面具有表面结合的化学部分，所述化学部分具有金属亲和官能性，并且第二固体表面为具有与第一固体表面相同的带电荷表面的第二基底。在某些实施方案中，第二固体表面为具有带电荷表面的第二基底，并且第一固体表面包括具有金属亲和官能性的表面结合的化学部分。在某些此类实施方案中，除具有金属亲和官能性的表面结合的化学部分之外，所述基底中的至少一个还具有一种或多种化学部分，其中此类另外的化学部分增强所述组件中的一个或多个参与与蛋白质制剂的蛋白质的氢键合、疏水相互作用或π-π键合的能力。在某些实施方案中，具有金属亲和官能性的表面结合的化学部分为多配位基金属螯合部分。
在某些实施方案中，在暴露于第一组件和第二组件的表面之前，用具有混合的化学特性的有机多价阳离子处理蛋白质样品。此类有机多价阳离子可包括依沙吖啶(ethacridine)、9-氨基吖啶(氨吖啶)、3,6吖啶二胺(原黄素)、吖啶琐辛(acrisorcin)、吖啶氯(acrizane)(苯艾克坦(phenacridane))、吖啶橙、奎吖因(quinacrine)、乐杀螨(acricide)、吖啶酮、吖啶-9-羧酸、氯甲氧吖胺(1-[(6-氯-2-甲氧基-9-吖啶基)氨基]-3-(二乙基氨基)-2-丙醇二盐酸盐)、亚甲蓝(methylene blue)、酚藏花红、吩嗪、吩噻嗪、吖啶黄(3,6-二氨基-10-甲基氯化吖啶盐和3,6-吖啶二胺)、聚乙烯亚胺、氯己定或聚氨基酸。在某些实施方案中，具有混合的化学特性的有机多价阳离子为依沙吖啶、亚甲蓝、聚乙烯亚胺或氯己定或其盐。在某些实施方案中，具有混合的化学特性的有机多价阳离子为依沙吖啶或亚甲蓝或鲸蜡基三甲基铵或其盐。在某些此类实施方案中，具有混合的化学特性的有机多价阳离子以约0.01％到约0.05％的量存在。在某些实施方案中，具有混合的化学特性的有机多价阳离子以小于约0.01％的量存在。在某些实施方案中，具有混合的化学特性的有机多价阳离子以小于约0.005％的量存在。在某些实施方案中，具有混合的化学特性的有机多价阳离子以小于约0.001％的量存在。在某些实施方案中，具有混合的化学特性的有机多价阳离子以约0.020％到约0.025％的量存在。
在某些实施方案中，在使样品与第一组件和第二组件接触的步骤之前，用一种或多种有机多价阳离子(例如聚乙烯亚胺、聚烯丙胺、依沙吖啶、亚甲蓝或氯己定或鲸蜡基三甲基铵和其盐)处理所述样品。在某些此类实施方案中，用于在使所述样品与第一组件和第二组件接触的步骤之前处理所述样品的有机多价阳离子以小于1％的浓度提供。在某些实施方案中，用于在使所述样品与第一组件和第二组件接触的步骤之前处理所述样品的有机多价阳离子以如下浓度提供：约0.01％到约0.05％的浓度、或小于约0.01％的浓度、或小于约0.005％的浓度、或小于约0.001％的浓度、或约0.020％到约0.025％的浓度。
在某些实施方案中，用一种或多种有机多价阴离子处理所述样品，所述有机多价阴离子例如脂肪酸或聚阴离子，其中脂肪酸的示例可包括0.05％到5％浓度的庚酸、辛酸、辛烯酸、壬酸、壬烯酸和癸酸；并且聚阴离子的示例可包括聚天冬氨酸、聚谷氨酸或其它带负电荷的聚合物、或从不同亚基合成的带负电荷的杂聚物。
在某些实施方案中，使蛋白质样品与选自由非离子型有机聚合物、有机溶剂、表面活性剂和酰脲组成的组的可溶性有机调节剂另外地接触，其中使所述样品与可溶性有机调节剂接触的此类步骤发生在使所述样品与第一组件和第二组件接触的步骤之前。
在某些实施方案中，使所述样品与抗病毒剂另外接触，其中使所述样品与抗病毒剂接触的此类步骤发生在使所述样品与第一组件和第二组件接触的步骤之前。在某些此类实施方案中，抗病毒剂为非多价有机阳离子，例如苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、亚甲蓝、氯己定或三(正丁基)磷酸盐。在某些此类实施方案中，抗病毒剂以小于约1％(w/v)的量或以小于约0.1％(w/v)的量或以小于约0.01％(w/v)的量或以小于约0.001％(w/v)的量存在。
在某些实施方案中，方法提供如下另外的步骤：使所述样品与足以使酰脲在蛋白质制剂中为过饱和的量的酰脲接触，和使含有期望蛋白质的上清液与所述蛋白质制剂的部分分离，其中使所述样品与此类酰脲接触的此类步骤在使所述样品发生与第一固体表面和第二固体表面接触的步骤之前。在某些此类实施方案中，酰脲为尿素、尿酸、乙内酰脲、尿囊素、尿囊素氯羟铝、尿囊素铝、hemocane(尿囊素)、脲基乙内酰脲、5-脲基乙内酰脲、乙醛酰基酰脲、乙醛酸二酰脲、2,5-二氧代-4-咪唑烷基脲、咪唑烷基脲、二咪唑烷基脲或嘌呤。在某些此类实施方案中，酰脲为尿囊素。在其它实施方案中，酰脲为尿酸。在某些实施方案中，尿囊素以大于0.5％(w/v)的量或以大于约1％(w/v)的量存在。在某些实施方案中，尿酸以大于0.0025％(w/v)的量或以大于约0.01％(w/v)的量或以大于约0.1％(w/v)的量或以大于约1％(w/v)的量存在。
在某些实施方案中，有机调节剂为选自由聚乙二醇、聚丙二醇和聚丁二醇组成的组的非离子型有机聚合物。在某些实施方案中，非离子型有机聚合物具有约500D或更小的平均分子量。在某些实施方案中，有机调节剂为有机溶剂，例如乙二醇、丙二醇、丁二醇、二甲亚砜、乙醇或苯氧乙醇。在某些实施方案中，有机调节剂以约1％(w/v)或更大的浓度提供。在某些实施方案中，有机调节剂为选自由以下组成的组的表面活性剂：吐温、triton、CHAPS、CHAPSO和辛基葡糖苷。在某些此类实施方案中，表面活性剂以约1％(w/v)或更小的浓度或以约0.1％(w/v)或更小的浓度提供。在某些实施方案中，有机调节剂为以亚饱和量提供的酰脲。在某些此类实施方案中，酰脲选自由尿素、乙内酰脲和尿囊素组成的组。
在某些实施方案中，提供了用于方便实施方法实施方案的试剂盒，其包含进行所述方法所需的一些或所有材料，通常以便于进行本文所公开的方法的量和浓度。
对术语进行了定义，使得可以更容易地理解实施方案。另外的定义在整个具体实施方式中有陈述。
“聚集物”是指在生理条件下稳定并且可在较广的pH范围和导电率条件下保持稳定的两个或更多个分子的缔合物。聚集物通常包含至少一生物分子(例如蛋白质、核酸或脂质)和另一分子或金属离子。缔合可通过任何类型的化学相互作用或其任何组合发生。抗体的聚集物可分为两类：“均质聚集物”是指两个或更多个抗体分子的稳定缔合物；“异质聚集物”是指一个或多个抗体分子与一个或多个非抗体分子的稳定缔合物。所述非抗体组分可由来自由以下组成的组的一种或多种实体组成：核苷酸、内毒素、金属离子、蛋白质、脂质或细胞培养基组分。
"抗体"是指免疫球蛋白、其复合形式或片段形式。该术语可包括但不限于源于人或其它哺乳动物细胞系的IgA、IgD、IgE、IgG和IgM类别的多克隆或单克隆抗体，包括天然形式或遗传修饰形式，例如人源化抗体、人抗体、单链抗体、嵌合抗体、合成抗体、重组抗体、杂合抗体、突变抗体、移植抗体和体外产生的抗体。“抗体”还可包括复合形式，包括但不限于含有免疫球蛋白部分的融合蛋白。"抗体"还可包括抗体片段，例如Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb、Fc和其它组分，不论它们是否保留抗原结合功能。
“正电性表面”是指主要带正电荷的基底或固体材料的表面。表面的正电性可由包括但不限于如下的化学基团赋予：弱阴离子交换基团，如氨基、亚乙基二氨基、二乙基氨乙基、聚烯丙胺基、聚乙烯亚胺基；强阴离子交换基团，例如季氨基；组合的弱-强交换剂，例如聚赖氨酸、聚精氨酸或三(2-氨乙基)胺、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、聚丙烯亚胺四胺、PAMAM树状物(乙二胺核)；去铁胺；或上述基团的任何组合。在带正电荷表面上产生混合的化学特性的第二官能性可由带负电荷基团或带正电荷基团、疏水基团、π-π键合基团、氢键合基团或金属螯合基团组成。所述第二官能性可作为借以合成颗粒的制造材料或制造工艺的偶然副产物存在于正电性表面上，或它们可通过有意的设计而存在。第二官能性的浓度可在小于每毫升颗粒1毫当量到超过每毫升100毫当量的范围。
“负电性表面”是指主要带负电荷的基底或固体材料的表面。表面的负电性可由包括但不限于如下的化学基团赋予：被称为的弱阳离子交换剂，例如羧基、氨基羧基(亚氨基二乙酸基或次氮基乙酸基)或磷酰基；或强交换剂，例如磺基或硫酸根部分SO3-。在带负电荷表面上产生混合的化学特性的第二官能性可由带负电荷或带正电荷的基团、疏水基团、π-π键合基团、氢键合基团或金属螯合基团组成。第二官能性可作为借以合成颗粒的制造工艺的偶然副产物存在于负电性表面上，或它们可通过有意的设计而存在。第二官能性的浓度可在小于每毫升颗粒1毫当量到超过每毫升100毫当量的范围。
“内毒素”是指存在于革兰氏阴性(gram-negative)细菌的外膜中的、裂解后从细胞释放的有毒的、热稳定性的脂多糖物质。内毒素可由于它们的高含量的磷酸盐和羧基残基而通常为酸性的，并且可由于脂质-A区域的脂肪酸含量而为高度疏水的。内毒素可为氢键合提供大量机会。
“配体”或“表面结合配体”是指由结合其他化学实体的一种或多种化学部分或官能性组成的组装物。在本发明实施方案中，将配体固定于表面上，意在结合促使聚集物形成或稳定化的样品(蛋白质制剂)组分。配体在例如负电荷、正电荷或疏水基团的组成上可相当简单，或其可具有较复杂的结构，包括两种或更多种不同的组分，所述组分使配体具有通过所述组分单个地均不能够实现的相互作用结合化学实体。另外，给定的配体可体现通过除其主要机制或主导机制以外的机制与其它实体相互作用的能力。例如，金属亲和配体亚氨基二乙酸含有在多数操作条件下带负电荷的两个羧基和在低pH下可带正电荷的氮基团。除体现金属亲和性之外，其还可通过静电相互作用和氢键合与其它化学实体相互作用。当固定于表面上时，金属亲和配体TREN包括2种伯胺、1种仲胺和1种叔胺。TREN作为整体可与溶解于水溶液中的金属形成强缔合，而单个胺可参与静电和/或氢键。
“金属亲和官能性”是指可固定于表面上的化学部分例如以1∶1形式结合金属离子的能力。此类部分可具有与金属离子形成配位键的能力，并且某些此类部分可在特性上为二配位基或多配位基。具有此能力的负电性部分的非限制性示例包括亚氨基二乙酸(2-(羧甲基氨基)乙酸)和次氮基乙酸(2,2',2”-次氮基三乙酸)。具有这种能力的正电性化合物的示例包括但不限于三(2-氨乙基)胺或二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、聚丙烯亚胺四胺和去铁胺。
“非离子型有机聚合物”是指由连接的缺少带电荷基团的重复有机亚基构成的天然存在的或合成的碳氢化合物。其可为线性、主要为线性，且具有一些分枝，或者主要为分枝的。适于实施本文所公开的方法的示例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。PEG具有结构式HO-(CH2-CH2-O)n-H。示例包括但不限于平均聚合物分子量范围为小于100道尔顿到超过1000道尔顿的组合物。
“有机多价离子”是指天然或合成来源的有机分子、离子或者天然或合成来源的盐，其包含至少一个电荷和至少一种另外的化学官能性，从而使得其为多价的。在某些实施方案中，有机多价离子至少一种另外的化学官能性为另外的电荷，使得所述有机多价阳离子具有两个或更多个相同或不同的电荷。有机多价离子可具有净正电荷、净负电荷或净中性电荷。当有机多价离子为净正的时，其可与例如以下的阴离子一起提供：氯化物、溴化物、硫酸盐、有机酸、乳酸盐、葡糖酸盐，以及不会与所述方法不相容的任何其它阴离子。在某些实施方案中，有机多价离子的某些正电荷由胺、亚胺或其它含氮部分提供。有机多价离子可另外具有混合的化学特性，并且包括疏水残基、其它官能部分，和/或其可具有参与其它类型的化学相互作用的能力，包括例如参与氢键、疏水相互作用、π-π键合、金属配位和插入的能力。在某些实施方案中，带正电荷的有机多价离子的示例包括但不限于二氨基酸，二聚、三聚或更大的同聚肽(homopeptide)或异聚肽(hetero-peptide)，例如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚组氨酸、聚鸟氨酸；聚乙烯亚胺；聚烯丙胺；聚苄菊酯(polydimethrine)、聚甲基丙烯酰胺基丙基三甲基氨；聚二烯丙基二甲基氨；聚乙烯基苄基三甲基氨；聚乙烯基胍；聚(N-乙基-4-乙烯基吡啶；DEAE-葡聚糖；DEAE-纤维素；依沙吖啶(CAS编号442-16-0；7-乙氧基吖啶-3,9-二胺)；三(2-氨乙基)胺；胍；氯己定；阿来西定(alexidine)；citricidal(适翠达)、鱼精蛋白；精胺；亚精胺；鲑精蛋白；壳聚糖；以及上述物质的变体和衍生物。例如，依沙吖啶的变体和衍生物被理解为包括9-氨基吖啶(氨吖啶)、3,6吖啶二胺(原黄素)、吖啶琐辛、吖啶氯(苯艾克坦)、吖啶橙、奎吖因、乐杀螨、吖啶酮、吖啶-9-羧酸、氯甲氧吖胺(1-[(6-氯-2-甲氧基-9-吖啶基)氨基]-3-(二乙基氨基)-2-丙醇二盐酸盐)、酚藏花红、吩嗪、吩噻嗪、吖啶黄(3,6-二氨基-10-甲基氯化吖啶盐和3,6-吖啶二胺)和其盐(例如氯化物、溴化物、硫酸盐、乳酸盐、葡糖酸盐，例如鲸蜡基三甲基溴化铵)。当有机多价离子为净负的时，其可与例如以下的阳离子一起提供：钠或钾，或不会与所述方法不相容的任何其它阳离子。在某些实施方案中，有机多价离子的某些负电荷由羧基、二氧磷基或磺基部分来提供。有机多价离子可另外具有混合的化学特性，并且包括疏水残基、其它官能部分，和/或其可具有参与其它类型的化学相互作用的能力，包括例如参与氢键、疏水相互作用、π-π键合、金属配位和插入的能力。在某些实施方案中，带正电荷的有机多价离子的示例包括但不限于脂肪酸，例如庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、阴离子型聚合物和其盐(例如氯化物、溴化物、硫酸盐、乳酸盐、葡糖酸盐)。可包括特定净电荷的有机多价离子可包括带相反电荷的部分。例如，具有净正电荷的有机多价离子可包括一个或多个负电荷，或具有净负电荷的物质可包括一个或多个正电荷。
“有机溶剂”是指以液体状态存在的天然存在的或合成的有机化合物。适于实施本文所公开的方法的示例包括但不限于乙二醇、丙二醇、二甲亚砜、乙醇和苯氧乙醇。
“生理电导率”是指约15mS/cm的值，其大致对应于约150mM的氯化钠浓度。不同盐和不同组成的离子可个别地赋予不同于氯化钠的电导率水平。在原始生物溶液中，电导率值可通过多种盐赋予。在实验溶液中，电导率可通过单种盐或主要通过单种盐赋予。使用电导率作为总体盐浓度的功能指标由此在不同组成的溶液之间提供明确的等同表示。
“多核苷酸”是指由链中共价键结的多个核苷酸单体构成的生物聚合物。DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)是多核苷酸的示例。多核苷酸可具有形成氢键的高倾向性。
“蛋白质”是指含有碳、氢、氧、氮且通常含有硫并且主要由一条或多条通过肽键连接的氨基酸链构成的复杂有机大分子群中的任一种。蛋白质可为天然或重组来源的。可用非氨基酸部分对蛋白质进行修饰，例如通过糖基化、聚乙二醇化或与其它化学部分缀合来修饰。蛋白质的示例包括但不限于抗体、凝血因子、酶和肽激素。“蛋白质制剂”是指任何含有目标蛋白质的水性或主要为水性的溶液，例如含有细胞的细胞培养收获物、(基本上)无细胞的细胞培养物上清液或含有来自纯化阶段的目标蛋白质的溶液。
“基底”或“固体材料”是指性质上可为微粒的、晶体的、聚合的、纤维的、多孔中空纤维的、整块的或膜状的不溶性有机固体。其可由无孔或多孔的颗粒、多孔的膜、多孔的过滤器或多孔的整块材料组成。如果为微粒，则所述颗粒可为大致球形或非球形的，并且可具有小于100nm到超过100微米范围的尺寸。多孔颗粒的平均孔径可在小于10nm(微孔的)到超过100nm(大孔的)的范围。膜的平均孔径可在小于100nm到超过1微米的范围。膜或整块材料中的平均通道尺寸可在小于1微米到超过10微米的范围。固体材料可进一步由复合结构组成，例如其中颗粒包埋在网状基质中，被夹在膜之间，或两者均有。
“过饱和酰脲”是指在特定蛋白质制剂通常所用的条件下，含有超过其最大溶解度的量的酰脲的溶液。在某些实施方案中，方法提供了这样的具有酰脲的样品，在该样品的条件下，酰脲存在的量大于该酰脲在该样品中的溶解度，使得该酰脲的一些部分在该样品中以非溶解形式存在。
“表面活性剂”包括例如通常包含疏水部分和亲水部分、使得它们被称为两亲性的的一类有机分子的“表面活性的试剂”。在水溶液中足够浓度下，表面活性剂可自缔合成簇，其疏水部分集中于中心以将与水的接触最小化，并且其亲水部分向外辐射以将与水的接触最大化。在生物制剂、特别是含有具疏水特性或具疏水特性区域的材料的那些生物制剂的存在下，表面活性剂的疏水部分倾向于与疏水物质的一些部分自发缔合，并通过表面活性剂的亲水部分的影响增加它们的溶解度。它们还可用于调节均溶解于水性溶剂中的不同疏水材料之间发生的疏水相互作用。适于实施某些实施方案的表面活性剂的示例包括但不限于非离子型表面活性剂，例如聚山梨醇酯表面活性剂(例如，Tween 20、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯和Tween 80、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)和Triton(例如，聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚)；以及两性离子型表面活性剂，例如CHAPS(3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸盐)、CHAPSO(3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-2-羟基-1-丙磺酸盐)和辛基葡糖苷(例如，(2R,3S,4S,5R,6R)-2-(羟甲基)-6-辛氧基环氧乙烷-3,4,5-三醇)。
“酰脲”是指包含一个或多个尿素部分的天然或合成来源的环状或无环有机分子或其衍生物。在某些实施方案中，方法提供了酰脲，例如尿素、尿酸、乙内酰脲、尿囊素(CAS编号97-59-6；尿囊素氯羟铝、尿囊素铝、hemocane(尿囊素)、脲基乙内酰脲、5-脲基乙内酰脲、乙醛酰基酰脲、乙醛酸二酰脲、2,5-二氧代-4-咪唑烷基脲)、嘌呤和其衍生物。在某些实施方案中，方法提供了式R-CO-NH-CO-NH2或R-CO-NH-CO-NH-CO-R'或R'R”NH-CO-NR”'R””的有机分子，其中相关“R基团”可为H或任何有机部分。
“病毒”或“病毒颗粒”是指仅在主要为细菌、植物和动物的活宿主的细胞内复制的超显微的(直径大约为20nm到300nm)、代谢惰性的感染原：其由RNA或DNA核、蛋白质外壳和在更复杂的类型中，围绕的包膜(surrounding envelope)构成。
用于实施本文所公开的方法的固体材料可包括天然或合成来源的不溶性颗粒，例如但不限于常用于实施色谱的多孔微颗粒。此类颗粒可包含允许蛋白质(例如但不限于抗体)扩散进入的大孔；或它们可包含允许小化学物质(例如盐、糖和异质聚集物解离剂)扩散进入、但过小而不允许蛋白质(例如抗体)进入的小孔。
或者，固体材料可包括无孔的颗粒、膜或整块材料、纤维(包括多孔壁的中空纤维)、多孔的膜和/或采用上述元件的组合的复合结构。
用于实施某些实施方案的、具有混合的化学特性的颗粒特别地包括不溶性有机颗粒。此类颗粒可为无孔的或多孔的。如果为多孔的，则它们可包含允许蛋白质(例如但不限于抗体)扩散进入的大孔；或它们可包含允许小化学物质(例如盐、糖和异质聚集物解离剂)扩散进入、但过小而不允许蛋白质(例如抗体)进入的小孔。此类颗粒所体现的化学特性的混合可包括清除具有混合的化学特性的可溶性多价阳离子试剂的负电性官能性，并且可进一步包括可增强它们降低聚集物含量和/或促进可溶性试剂清除的能力的一种或多种化学官能性，包括但不限于正电性、氢键合、疏水相互作用、π-π键合和金属配位。当给定的配体包含超过一种的电荷时，应当理解，所述电荷或者是平衡的，从而产生电中性条件，或者所述电荷以一种或另一种电荷为主，使得其净电荷与具有金属亲和官能性的固体表面相同。
正电性基团可包括被称为的强阴离子交换基团和/或被称为的弱阴离子交换基团。混合的强-弱阴离子交换的正电性基团可能因为它们能够实现更高的聚集物降低度而有益。此类具有升高的去除聚集物的能力的混合的弱-强阴离子交换基团的非限制性示例为三(2-氨乙基)胺(TREN)。混合的化学特性可存在于单类表面上的、不同表面上的单个复合化学基团、具有不同特性的不同化学基团，或上述的任一组合。弱离子交换基团(包括与强离子交换基团组合)还可能因为它们相比强离子交换基团形成氢键的能力升高而有用。
负电性基团可包括被称为的强阳离子交换基团、被称为的弱阳离子交换基团或混合的强-弱阳离子交换基团的负电性基团。此类基团可能因为它们能够参与与溶解金属离子的配位相互作用而是有用的，产生从所应用的生物样品去除污染性金属离子的所需结果。阳离子交换基团的非限制性示例包括磺基、羧基、磷酰基、亚氨基二乙酸(IDA)基团和次氮基乙酸(NTA)基团。弱离子交换基团(包括与强离子交换基团组合)还可能因为它们相比强离子交换基团形成氢键的能力升高而有用。
在某些实施方案中，正电性或负电性材料的表面还可包含具有脂肪族和/或芳香族特性的疏水基团，其中后者可能因为它们参与被称为π-π键合的能力而有益。混合的化学特性可存在于单类表面上的、不同表面上的单个复合化学基团、具有不同特性的不同化学基团，或上述的任一组合。
具有不同的单个特性的化学官能性可以针对特定样品组成的需求定制的不同比率采用。例如，意在用于处理澄清的细胞培养物上清液的组合可包含过量的正电性表面，而意在用于处理已用正电性异质聚集物解离剂(例如依沙吖啶或亚甲蓝)处理的上清液的组合可包含过量的负电性表面。
用于实施某些实施方案的、具有混合的化学特性的可溶性多价阳离子可包含具有至少一个正电荷和赋予混合的化学特性的另外特征的有机分子，例如提供参与氢键合、疏水相互作用、π-π键合、金属配位和插入的能力的部分。体现这些特性的多价阳离子的示例包括聚乙烯亚胺、依沙吖啶、亚甲蓝、鲸蜡基三甲基溴化铵、氯己定和许多其它。此类试剂可以0.001％到1.0％的范围的浓度施加，但通常会在以0.01％到0.10％且特别是0.02％到0.06％或0.02％到0.05％的范围的浓度使用时提供聚集物降低和蛋白质产物回收的平衡。
用于实施某些实施方案的、具有混合的化学特性的可溶性多价阴离子可包含具有至少一个负电荷和赋予混合的化学特性的另外特征的有机分子，例如提供参与氢键合、疏水相互作用、π-π键合、金属配位和插入的能力的部分。体现这些特性的多价阴离子的示例包括庚酸、辛酸、辛烯酸、壬酸、壬烯酸、癸酸、聚天冬氨酸和许多其它有机酸。此类试剂可以约0.005％到约5％的范围的浓度施加，但通常会在以约0.05％到约1％且特别是约0.2％到约0.5％的范围的浓度使用时提供聚集物降低和蛋白质产物回收的有益平衡。
在某些实施方案中，可通过共添加独立地缺少足以实现与其它实施方案相同水平的聚集物降低的化学影响的可溶性有机试剂，来增强所述方法降低聚集物的性能和/或期望蛋白质的回收。此类另外的试剂的示例可包括但不限于非离子型或两性离子型表面活性剂，例如Tween、Triton、Brij、CHAPS、CHAPSO和辛基葡糖苷；有机聚合物，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇和聚乙烯吡咯烷酮，且通常具有小于1000道尔顿的分子量；有机溶剂，例如乙二醇、丙二醇、二甲亚砜、乙醇、丙醇、异丙醇、苯氧乙醇；碳水化合物；和酰脲，包括尿素、乙内酰脲和尿囊素。示例还可包括出于另一目的(例如但不限于病毒失活)添加的可溶性非多价阳离子试剂，包括苯扎氯铵、亚甲基蓝和三(正丁基)磷酸盐等。在某些实施方案中，示例包括过饱和量的酰脲，例如大于0.0025％的量的尿酸和大于0.56％的量的尿囊素。
在某些实施方案中，具有混合的化学特性的多价离子和颗粒必须一起存在足以实现聚集物降低的时间段。它们可以一起添加，或提前不确定的时间添加可溶性试剂。在一些实施方案中，提前添加多价离子可产生较好的结果，但其它形式会产生对许多应用足够的结果。实施本文所公开的方法所需的时间将直接取决于所述多价阳离子的浓度、颗粒的比例，以及在较小程度上取决于蛋白质制剂的聚集物含量。
在某些实施方案中，方法提供了准备所述样品以添加所述第一组件和第二组件的具有混合的化学特性的可溶性的和固体的试剂的方法步骤。条件应当具有防止目标蛋白质通过与多价离子或颗粒的相互作用而大量损失的性质。此类条件将包括足够高以中止目标蛋白质与多价离子或颗粒之间的强电荷相互作用的电导率值，并且可包括调节其它类型的化学相互作用的其它添加剂。
在某些实施方案中，本文所公开的方法出乎意料地提供了在大幅提高的电导率(盐浓度)下的有效的聚集物降低和可溶性试剂去除。周知带电荷的颗粒的性能依赖于具有低电导率(通常低于10mS/cm，且最经常低于5mS/cm)的水性环境。这些值大致分别相当于100mM NaCl和50mM NaCl。在某些实施方案中，本文所公开的方法支持在20-30mS，通常高达40mS/cm，并且有时高达l00mS/cm或更高值的电导率下的有效聚集物降低和可溶性试剂去除。在某些实施方案中，在较高的盐浓度下，异质聚集物的解离增加。
在某些实施方案中，方法提供去除可能会堵塞用于随后的纯化方法中的色谱柱的样品组分。例如，IgG抗体经常通过使用固定化蛋白A的亲和色谱进行纯化。尽管有效，但用于实施该方法的色谱介质极其昂贵，并且其有用的循环周期可被施加粗样品显著降低。在某些实施方案中，通过本文所公开的方法处理的样品在光学上澄清，并且没有可能损害蛋白A或其它色谱介质的功能的悬浮碎片。在某些实施方案中，根据本文所公开的方法纯化样品将提高蛋白A的IgG结合能力10％或更多，并提供对其它捕获或随后的色谱方法的类似有益的效果。在某些实施方案中，本文所公开的方法的使用会允许蛋白A将污染性宿主蛋白质含量降低10到100倍或更多。
在某些实施方案中，提供了可使得能够进行随后的纯化方法的方法，所述纯化方法否则会受到样品组分的损害，甚至达到不能实施最初的从未纯化来源捕获抗体的程度。例如，宿主细胞DNA比IgG或IgM抗体更强烈地结合阴离子交换剂和羟磷灰石介质。这降低了它们的抗体结合能力和纯化性能，并且损害了它们作为最初的捕获方法的适用性。在某些实施方案中，本文所公开的方法促进了在将样品施加于这些随后的方法前去除大多数的DNA，使得阴离子交换剂和羟磷灰石介质均成为用于最初的抗体捕获/纯化的实用工具。
在某些实施方案中，在准备使用本文所公开的方法中，建议评估待处理的样品的组成。第一主要变量是样品的聚集物含量。这可使用通过尺寸排阻色谱且特别是通过在254-260nm和280nm的波长处同时监测来监测分级的分析容易地测定。该方法也便于检测包含抗体-DNA复合体的异质聚集物，甚至当它们的流体动力学尺寸非常接近被纯化的抗体时也是如此。含有高聚集物水平、或含有显示0.5或更大的254/280比率的聚集物、或含有254/280比率升高的抗体-DNA异质聚集物的样品，是用具有混合的化学特性的可溶性试剂(例如但不限于依沙吖啶和/或亚甲蓝)处理样品的有利候选物，以促进在将所述样品暴露于具有混合的化学特性的表面之前聚集物的解离。术语“高聚集物水平”应理解为相对的，因为其将取决于总体纯化过程中样品的来源。细胞培养物上清液中的“高”聚集物水平相比于所述抗体可高达50％或更高，而初始纯化后的“高”聚集物水平可包括超过5％的任何水平或甚至更低。
在某些实施方案中，还将建议评估待纯化的蛋白质的天然化学特性。IgG抗体倾向于具有电荷中性至碱性特性，具有弱的或没有结合正电性表面的倾向，但具有轻微至中等的结合负电性表面的倾向。IgM抗体特性范围为碱性到酸性，通常具有强的结合正电性表面的倾向，并且具有轻微至中等的结合负电性表面的倾向。抗体表面特性的实际测定可通过一对简单的实验完成，其中将所述抗体于pH 7.0下施加于阳离子交换剂，并用线性盐梯度洗脱，并且在相同的条件下施加于阴离子交换剂并从中洗脱。将抗体从每种交换剂洗脱的盐浓度提供了抗体结合负电性或正电性表面的相对趋势的方便指数，以及控制此类相互作用所需的盐浓度的方便指数。此类表征可在多个PH下进行，以获得对特定目标蛋白质的电荷特性更完全的理解。
在某些实施方案中，期望的是选择一种或多种具有混合的化学特性的多价阳离子。实验数据揭示，在一般情况下，多价阳离子疏水性越小，目标蛋白质的回收率越高。另外，疏水性越小，在不显著损失期望蛋白质的情况下，可以施加的多价阳离子的浓度范围越广且越高。因此，相比疏水性更高的依沙吖啶，或疏水性高得多的氯己定，疏水性较弱的PEI可被认为是更好的候选物。然而，除了产物回收率之外，还可能需要考虑其它问题。PEI体现熟知的细胞毒性性质，并且难以以足够的灵敏度进行检测以便容易地验证其通过纯化处理过程从样品的去除。依沙吖啶可能因为其在血浆蛋白质分级的领域中和作为抗病毒剂的历史较长而是有用的。另外，其亮黄色的颜色和固有荧光有助于灵敏地测量其在给定样品中的含量，从而有助于记录其在实施所述方法后的去除。除此之外，不同的多价阳离子可体现不同的第二化学官能性，所述第二化学官能性与它们介导所需效应的能力有关。PEI例如被理解为主要通过静电相互作用和氢键合来结合DNA。依沙吖啶提供了针对两种相互作用的较少机会，但已知能够插入DNA。实验结果证实其通常还支持更有效的聚集物降低。
在某些实施方案中，例如依沙吖啶、亚甲蓝、氯已定和聚乙烯亚胺的试剂可以小于0.001％到1％的范围的浓度有效施加，这取决于抗体的特性和样品的组成。最低有效浓度在多数情况下可能是有益的，因为高浓度可增加去除可溶性试剂所需的、具有混合的化学特性的负电性固体的量。实验数据揭示0.01％到0.1％的浓度且特别是0.02％到0.06％或0.02％到0.05％的范围的浓度满足该设想。可针对每种具体情况确定和定制最有效的试剂和工作浓度。对本领域技术人员将显而易见的是，某些上述试剂因其使病毒失活的能力而为人所知，并且将具有增大DNA和内毒素去除的另外的益处。可采用超过一种的多价阳离子。在一些实施方案中，用多价阳离子预处理样品可增加本文所公开的方法实现低聚集物水平的能力。
在某些实施方案中，可建议评估具有不同特性的正电性和/或负电性固体基底，以适应期望蛋白质和其所位于的进料流的特性。例如，在一些情况下，具有季胺官能团的正电性材料可能具有较低的降低聚集物和/或其它污染物的能力，但支持期望蛋白质的较高回收率，而呈TREN形式的正电性材料可能支持相反的结果。在一些情况下，对于一种期望蛋白质有用的正电性表面可能被评定为不如另一种。例如，TREN对于IgG抗体可能有用，而季胺可能对于IgM较好。基底上的配体的密度也可例如通过样品组分与化学表面之间的次级相互作用来影响某些实施方案的性能。例如，实验数据记录了在某些实施方案中，具有高密度的TREN的基底可胜过具有低密度的TREN的基底。
在某些实施方案中，以固体与样品的组合体积比为5％的、具有混合的化学特性的颗粒的同等平衡的混合物开始可能是方便的。通过优化系统以适应特定样品需求的过程，可降低固体与样品体积的比率以确定该特定样品/处理系统的有效性阈值。负电性官能性与正电性官能性的比率还可发生改变，如同所述表面上包含的第二化学官能性的选择可发生改变那样。评估这些变化的实验工作量可通过应用基于统计学的实验设计(所谓的DoE)来大幅度降低。具有混合的化学特性的方便的颗粒可包括商业化的阴离子交换剂和阳离子交换剂、螯合树脂、疏水性树脂以及进行被称为混合模式的色谱的市售产品。
在某些实施方案中，用于评估的初始条件应当在防止抗体通过结合不同表面而损失的pH和电导率值下进行，但除此之外，实验应当具体地评估较高的电导率水平，因为它们可支持增强的聚集物和/或抗体-污染物复合体的解离。为方便起见，使用IgG抗体的初始实验可在6.5-7.5的pH和约10mS/cm到约15mS/cm的电导率下进行。使用IgM抗体的初始实验可在相同的pH但在20-30mS/cm的电导率下进行。采用每一种的随后实验中可以更高的或更低的电导率和/或更高的或更低的pH值进行，以确定支持聚集物降低和抗体回收的互补组合的条件。尽管本文所公开的方法的主要目标不是降低宿主细胞蛋白质污染物的水平，但其在此方面、特别是与高碱性和/或高酸性宿主污染物含量相关的方面可提供显著贡献。
在某些实施方案中，具有混合的化学特性的可溶性的和固体试剂应当存在的时间可通过简单的实验来确定，其中，在一定时程里，例如在一小时内每10分钟，或者来自如下所述的实施例的数据所示的其它增量和持续时间内，通过SEC对样品进行分析。
对本领域技术人员将显而易见的是，除降低均质聚集物和异质聚集物的含量之外，某些实施方案还可大幅度降低宿主细胞蛋白质、宿主细胞DNA、内毒素和病毒的含量。
在某些实施方案中，第一组件和第二组件的固体材料可在使用后进行清洁和再循环。在其它实施方案中，它们可在使用后丢弃。
在某些实施方案中，本文所公开的方法可在其它色谱步骤之前实施，其中该实施具有保护色谱介质免受细胞培养基组分污染和借助于将靶标产物置于比其在未处理样品中更均质的状态而改善纯化质量的双重益处。
在某些实施方案中，方法可为带静电的颗粒和/或静电中性颗粒做准备，所述带静电的颗粒和/或静电中性颗粒与中性材料混合并被其包裹、被包埋于中性材料中或被包裹或包埋于与带静电的颗粒具有相同电荷的材料中。在某些实施方案中，负电性和/或正电性表面可包含另外的化学官能性，包括但不限于参与疏水相互作用、π-π键合、氢键合和金属亲和的能力。
在某些实施方案中，通过所公开的方法处理的蛋白质制剂可被进一步处理以降低聚集物含量。
本文所公开的方法的另外的目标和优势部分地将陈述于随后的描述中，并且部分地将根据所述描述显而易见，或者可通过实施所述方法获知。本文所公开的方法的目标和优势将借助于权利要求中明确的要素和组合来实现和获得。
应当理解，如所声明的，上述的一般描述和下文的详细描述均仅为示例性的和说明性的，且不限制所述方法。
实施例
以下实施例说明证实某些实施方案的功效的原型。
实施例1.用1％尿囊素处理含有约1g/L对HER2抗原具有特异性的IgG单克隆抗体的1L细胞培养收获物。电导率为约13mS/cm且pH为约6.8。添加剂具有加速沉降的作用。通过过滤去除固体材料，留下起泡的(sparking)澄清的含抗体滤液。抗体回收率为99％。将20mL BioWorks TRENhi-sub(基于琼脂糖多孔颗粒的正电性金属亲和材料)填充于柱(1.6×10cm)中并且以50mM Hepes、150mM NaCl(pH7.0)平衡。使澄清的滤液以200cm/hr的线性流速通过所述柱。原始收获物含有超过20％的聚集物，具体地含有至少10％的被称为的高分子量聚集物。经处理的样品含有小于0.05％的高分子量聚集物和小于4％的总聚集物。如通过荧光染料测定测量的DNA降低了大于98％，但qPCR表明降低实际上大于99.999％。组蛋白降低了至少98％，并且如通过Cygnus ELISA测量的总宿主蛋白质水平降低了62％。抗体回收率为99％。
实施例2.重复实施例1的程序，除了将TREN替换为TREN与DowexAG1x2的1∶1混合物(疏水正电性颗粒材料)。所有结果在标称上相同，除了抗体回收率降低到95％且分析型尺寸排阻色谱显示实施例1后明显出现的两种强疏水污染物被清除。
实施例3.重复实施例2的程序，除了用0.05％辛酸以及1％尿囊素处理含细胞收获物。宿主蛋白质污染降低了超过70％，并且抗体回收率降低到90％。在经处理的样品中检测不到辛酸，看来表明其与固体材料结合。聚集物降低到小于3％。DNA和组蛋白含量降低了99％。
实施例4.用IgM单克隆抗体重复实施例2的程序，除了将NaCl添加到含细胞收获物中至产生20mS/cm电导率的浓度并且将pH调节到6.0。未处理的收获物的聚集物含量大于30％。以50mM MES、200mM NaCl(pH6.0)使柱平衡。去除了99％的DNA和组蛋白，以及所有的高分子量聚集物。总聚集物含量降低到约2％。抗体回收率为84％。总宿主蛋白质降低了67％。自始至终以25mS/cm的电导率重复所述实验，所述25mS/cm的电导率对应于在被添加以实现20mS/cm的电导率的浓度上添加50mM增量的氯化钠。抗体回收率增加到98％并且所有其它指标均保持相同。以40mS/cm的电导率重复所述实验。宿主蛋白质降低减小到约47％，但所有其它性能指标均保持不变。
实施例5.重复实施例3的程序，除了以0.025％依沙吖啶替换辛酸，并且使用填充有带有金属亲和配体亚氨基二乙酸(Profinity,Bio-Rad)的基于丙烯酸酯的多孔颗粒和苯乙烯二乙烯基苯颗粒(Chelex 100,Bio-Rad)的1：1混合物的柱。经处理的样品没有黄色，而色谱介质为深黄色，表明去除了依沙吖啶。DNA、组蛋白和核小体降低了99％，而抗体回收率为99％。高分子量聚集物被完全清除，而总聚集物降低到小于2％。分析型SEC也证实去除了强疏水污染物。总宿主蛋白质污染降低了63％。
实施例6.重复实施例5的形式，除了包括与Profinity和Chelex以1∶1∶1比率混合的带负电荷的疏水相互作用颗粒(Macroprep T-butyl，Bio-Rad)。经处理的样品没有黄色，而色谱介质为深黄色，表明去除了依沙吖啶。DNA、组蛋白和核小体降低了99％，而抗体回收率为99％。高分子量聚集物被完全清除，而总聚集物降低到小于2％。分析型SEC也证实去除了强疏水污染物。总宿主蛋白质污染降低了64％。
实施例7.在固定化蛋白A(rAF protein A Toyopearl 650M，Tosoh)上进行动态结合实验，比较通过离心和微滤被澄清的收获物与实施例2的处理。微滤材料上的动态结合能力为28mg/mL。来自实施例3的材料上的动态结合能力为35mg/mL。蛋白A纯化后的微滤材料的宿主蛋白质含量为每百万792份。经实施例3处理材料的宿主蛋白质含量小于每百万1份。因此，实施所公开的方法将IgG结合能力增加了约20％并且将IgG纯度增加了近800倍。
实施例8.重复实施例2的程序，除了将操作pH增加到8.0并且通过用2份数水稀释样品将细胞培养物上清液的电导率降低到4.7且将缓冲液重新配制为含有50mM Tris、50mM NaCl(pH 8.0)。性能在标称上与实施例2相同，除了总宿主蛋白质去除为83％。
实施例9.重复实施例2的程序，除了将颗粒的总体比例从2％增加到5％。结果在标称上不变，除了抗体回收率降低到84％。在其中总颗粒的比例为2％并且由Dowex AG1x2表示的比例分别降低到TREN含量的25％和12.5％的随后实验中，抗体回收率分别增加到97％和98％。在降低的Dowex水平下，疏水污染物的去除仍然有效。所有其它结果在标称上均等同于实施例2。
实施例10.重复实施例1的形式，除了通过用2份水稀释将样品的电导率降低到约5。所有尺寸的聚集物的比例均大致加倍。
实施例11.重复实施例2的程序，除了用UNOsphere Q替换DowexAG1x2。UNOsphere Q更有效地去除残余的依沙吖啶。结果在其它方面类似。
实施例12.重复实施例3的程序，除了将辛酸增加到0.4％，将操作pH降低到5.2并且孵育2小时，然后添加TREN颗粒，然后孵育4小时，然后去除固体。聚集物含量降低到小于0.1％。宿主蛋白质降低了99.9％。
实施例13.除了5.6的操作pH外，将实施例12的材料和条件应用于含有IgM单克隆抗体的细胞培养收获物。相比于非聚集抗体，聚集物从初始的22％降低到小于0.1％。宿主蛋白质降低了超过98％。
实施例14.通过添加1％尿囊素、0.4％辛酸(pH 5.2)来调节含有259,218ppm宿主蛋白质污染物和21％聚集物的含IgG的细胞培养收获物；孵育2小时，此后以4％的量添加正电性金属亲和颗粒(TREN 40high，Bio-Works)，并且混合孵育另外的4小时，然后通过正电性深度过滤器(Sartorius PC1)去除固体。宿主蛋白质降低到308ppm并且聚集物降低到小于0.05％。
实施例15.通过添加1％尿囊素、0.4％辛酸(pH 5.2)来调节含有243,997ppm宿主蛋白质污染物和24％聚集物的含IgG的细胞培养收获物；孵育2小时，此后以4％的量添加正电性金属亲和颗粒(TREN 40high，Bio-Works)，并且混合孵育另外的4小时，然后通过正电性深度过滤器(Sartorius PC1)去除固体。宿主蛋白质降低到305ppm并且聚集物降低到小于0.05％。
实施例16.通过添加1％尿囊素、0.4％辛酸(pH 5.6)来调节含有243,997ppm宿主蛋白质污染物和24％聚集物的含IgG的细胞培养收获物；孵育2小时，此后以4％的量添加正电性金属亲和颗粒(TREN 40high，Bio-Works)，并且混合孵育另外的4小时，然后通过正电性深度过滤器(Sartorius PC1)去除固体。宿主蛋白质降低到3,551ppm并且聚集物降低到小于0.5％。
实施例17.通过添加1％尿囊素、0.4％辛酸(pH 5.2)来调节含有319,230ppm宿主蛋白质污染物和22％聚集物的含IgG的细胞培养收获物；孵育2小时，此后以4％的量添加正电性金属亲和颗粒(TREN 40high，Bio-Works)，并且混合孵育另外的4小时，然后通过正电性深度过滤器(Sartorius PC1)去除固体。宿主蛋白质降低到237ppm并且聚集物降低到小于0.01％。将样品加载到pH 7.0下的多模式疏水性阳离子交换器(Millipore，HCX)上，并且以增加的NaCl梯度洗脱。宿主蛋白质污染降低到37ppm。将样品加载到1M NaCl下的多模式疏水性阴离子交换器(Capto adhere，GE Healthcare)上并且以降低的NaCl梯度洗脱，将宿主蛋白质污染降低到1ppm。或者，将HCX后样品加载到以50mM Tris(pH 8.0)平衡、以空隙排阻模式操作的UNOsphere Q柱(Bio-Rad laboratories)上，将宿主蛋白质污染降低到不可检测的水平。
实施例18.通过添加1％尿囊素、0.4％辛酸(pH 5.2)来调节含有287,621ppm宿主蛋白质污染物和19％聚集物的含IgG的细胞培养收获物；孵育2小时，此后以4％的量添加正电性金属亲和颗粒(TREN 40high，Bio-Works)，并且混合孵育另外的4小时，然后通过正电性深度过滤器(Sartorius PC1)去除固体。宿主蛋白质降低到510ppm并且聚集物降低到小于0.1％。将经过调节的收获物加载到阳离子交换器(UNOsphere HRS)上并且以增加的NaCl梯度洗脱。宿主蛋白质污染降低到小于1ppm，但聚集物增加到略大于0.2％。随后在羟磷灰石柱(CHT I型，40微米)上对样品进行分级，以磷酸盐梯度洗脱，将聚集物降低到小于0.01％，并且将宿主蛋白质降低到不可检测的水平。
实施例19.将含有206,994ppm宿主蛋白质污染物和18％聚集物的含IgG的细胞培养收获物加载到蛋白A柱(TosoBioScience)上，用50mM磷酸钠、150mMNaCl(pH 7.2)洗涤，然后用100mM乙酸洗脱。宿主蛋白质降低到1,917ppm，并且聚集物降低到1.8％。在除了用50mM磷酸盐、1.0M NaCl(pH 7.2)洗涤柱外所有细节均相同的平行实验中，宿主蛋白质降低到527ppm，并且聚集物降低到1.6％。将含有287,661ppm宿主蛋白质污染物和19％聚集物的另一含IgG的细胞培养收获物加载到蛋白A柱(TosoBioScience)上，用50mM磷酸钠、150mMNaCl(pH 7.2)洗涤，然后用100mM乙酸洗脱，将宿主蛋白质污染降低到1,337ppm，并且将聚集物降低到2.1％。
实施例20.将含有287,621ppm宿主蛋白质污染物和19％聚集物的含IgG的细胞培养收获物分成两部分。通过添加1％尿囊素、0.4％辛酸(pH 5.2)来调节第一部分；孵育2小时，此后以4％的量添加正电性金属亲和颗粒(TREN 40high，Bio-Works)，并且混合孵育另外的4小时，然后通过正电性深度过滤器(Sartorius PC1)去除固体。宿主蛋白质降低到167ppm并且聚集物降低到小于0.01％。将经过调节的收获物加载到蛋白A柱(TosoBioScience)上，用50mM磷酸钠、150mMNaCl(pH 7.2)洗涤，然后用100mM乙酸洗脱。宿主蛋白质降低到不可检测的水平。在除了用50mM磷酸盐、1.0M NaCl(pH 7.2)洗涤柱外所有细节均相同的平行实验中，宿主蛋白质也降低到不可检测的水平。通过添加1％尿囊素和0.025％依沙吖啶来调节第二部分；孵育2小时，此后以4％的量添加正电性金属亲和颗粒(TREN 40high，Bio-Works)，并且混合孵育另外的4小时，然后通过正电性深度过滤器(Sartorius PC1)去除固体。宿主蛋白质降低到2,985ppm并且聚集物降低到小于0.1％。将经过调节的收获物加载到蛋白A柱(TosoBioScience)上，用50mM磷酸钠、150mMNaCl(pH 7.2)洗涤，然后用100mM乙酸洗脱。宿主蛋白质降低到1ppm。在除了用50mM磷酸盐、1.0M NaCl(pH 7.2)洗涤柱外所有细节均相同的平行实验中，宿主蛋白质也降低到1ppm。
实施例21.通过添加1％尿囊素、0.4％辛酸(pH 5.2)来调节含有251,852ppm宿主蛋白质污染物和18％聚集物的含IgG的细胞培养收获物；孵育2小时，此后以4％的量添加正电性金属亲和颗粒(TREN 40high，Bio-Works)，并且混合孵育另外的4小时，然后通过正电性深度过滤器(Sartorius PC1)去除固体。宿主蛋白质降低到131ppm并且聚集物降低到小于0.01％。将样品施加到Capto adhere将宿主蛋白质降低到3ppm。将样品施加到Captoadhere ImpRes将宿主蛋白质降低到1pm。
实施例22.通过添加1％尿囊素、0.4％辛酸(pH 5.2)来调节含有191,180ppm宿主蛋白质污染物和16％聚集物的含IgG的细胞培养收获物；孵育2小时，此后以4％的量添加正电性金属亲和颗粒(TREN 40high，Bio-Works)，并且混合孵育另外的4小时，然后通过在0.45微米膜上进行微滤来去除固体，将宿主蛋白质降低到2,063ppm，并且将聚集物降低到1.2％。然后使样品通过正电性深度过滤器(Sartorius PC1)，将宿主蛋白质降低到196ppm并且聚集物降低到小于0.01％。将样品施加到以空隙排阻模式操作的UNOsphere Q柱将宿主蛋白质降低到1ppm。或者，将样品施加到以空隙排阻模式操作的Nuvia Q柱将宿主蛋白质降低到1ppm。在除了用0.2％癸酸替换0.4％辛酸外所有细节均相同的平行系列实验中，在膜过滤后将宿主蛋白质降低到1,920ppm，在深度过滤后降低到132ppm，并且在该两个阴离子交换步骤后均降低到小于1ppm。
实施例23.通过添加1％尿囊素、0.4％辛酸(pH 5.2)来调节含有176,244ppm宿主蛋白质污染物和14％聚集物的含IgG的细胞培养收获物；孵育2小时，此后以4％的量添加正电性金属亲和颗粒(TREN 40high，Bio-Works)，并且混合孵育另外的4小时，然后通过在0.45微米膜上进行微滤来去除固体，将宿主蛋白质降低到2,063ppm，并且将聚集物降低到1.2％。然后使样品通过正电性深度过滤器(Sartorius PC1)，将宿主蛋白质降低到196ppm并且聚集物降低到小于0.01％。将样品施加到以空隙排阻模式操作的UNOsphere Q柱将宿主蛋白质降低到1ppm。或者，将样品施加到以空隙排阻模式操作的Nuvia Q柱将宿主蛋白质降低到1ppm。在除了用0.2％癸酸替换0.4％辛酸外所有细节均相同的平行系列实验中，在膜过滤后将宿主蛋白质降低到1,920ppm，在深度过滤后降低到132ppm，并且在该两个阴离子交换步骤后均降低到小于1ppm。
实施例24.通过添加1％尿囊素、0.4％辛酸(pH 5.6)来调节含有243,997ppm宿主蛋白质污染物和24％聚集物的含IgG的细胞培养收获物；孵育2小时，此后以4％的量添加正电性金属亲和颗粒(TREN 40high，Bio-Works)，并且混合孵育另外的4小时，然后通过正电性深度过滤器(Sartorius PC1)去除固体。宿主蛋白质降低到3,551ppm并且聚集物降低到小于0.5％。硫酸铵沉淀将宿主蛋白质含量降低到1,423ppm并且将聚集物降低到小于0.1％。在QA整块材料上的随后的阴离子交换色谱步骤将宿主蛋白质降低到2ppm。对通过离心和微滤被澄清的收获物进行的硫酸铵沉淀将宿主蛋白质降低到30,114ppm。阴离子交换将其进一步降低到411ppm。这些结果显示染色质去除的益处也适用于沉淀方法，并且还显示所述益处在第一步骤到随后的色谱步骤均存在。
实施例25.通过添加正电性金属亲和颗粒(TREN 40high，Bio-Works)来调节含有256,482ppm宿主蛋白质污染物和21％聚集物的含IgG的细胞培养收获物，以4％的量添加，并且混合孵育4小时，然后通过正电性深度过滤器(Sartorius PC1)去除固体。宿主蛋白质降低到1,183ppm并且聚集物降低到小于0.4％。将样品施加到Capto adhere将宿主蛋白质降低到147ppm并且将聚集物降低到小于0.05％。在以空隙排阻模式操作的UNOsphere Q上进行后续阴离子交换色谱步骤将宿主蛋白质降低到3ppm。
对本领域技术人员将显而易见的是，考虑到细胞、细胞培养物制剂、产物特性和表达水平以及收获时的相对细胞死亡率的广泛差异，为了适应任何给定的细胞培养基中产生的和特定细胞死亡率范围内收获的任何给定蛋白质，将需要在个别的基础上经实验研发特定类型的颗粒、它们的相对体积和具体条件。将进一步显而易见的是，基于本文提供的示例和指导，可能存在一些反复试验以确定材料和条件的最佳组合，在本领域技术人员的能力范围内。
在使用后，所有固体材料均可任选地被丢弃或根据本领域技术人员已知的标准技术再生。
本发明实施方案可与各种纯化方法组合以实现所需纯化水平。示例包括但不限于常用于纯化抗体的其它方法，例如蛋白A和其它形式的亲和色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、疏水相互作用色谱、固定化金属亲和色谱和另外的混合模式的色谱方法。研发用于各种方法的适当条件并且将它们与本文的方法整合以实现特定抗体的必要纯化，在本领域技术人员的能力范围内。
本文所引用的所有参考文献均以引用方式整体并入，且出于所有目的，其并入程度就如同每个单独的出版物或专利或专利申请被明确地且个别地指明出于所有目的以引用方式整体并入一样。当以引用方式并入的出版物和专利或专利申请与本说明书中所含的公开内容相冲突时，本说明书意在替代和/或优先于任何此类相冲突的材料。
用于本说明书和权利要求中的所有表示成分的量、色谱条件等的数字均应当理解为在所有情况下被术语"约"修饰。因此，除非另有相反指明，否则本说明书和所附权利要求书中陈述的数字参数为近似值，其可根据本发明实施方案试图获得的所需性能而改变。
如对本领域技术人员将显而易见的，可对本文所公开的方法进行许多修改和变化，而不脱离其精神和范围。本文所述的具体实施方案仅以举例方式提供，且不意在以任何方式进行限制。本说明书和实施例意在被认为仅仅是示例性的，所述方法的真正范围和精神由所附权利要求书指明。

Claims (31)

1.一种降低包含期望蛋白质的蛋白质制剂中的聚集物和产物-污染物复合体含量的方法，所述方法包括(i)使所述蛋白质制剂与包含至少一种能够结合金属的表面结合配体的至少一个固体表面接触，其中所述能够结合金属的表面结合配体最初基本上不含金属，其中操作条件被选择为基本上防止所述期望蛋白质与所述至少一个固体表面的结合，和(ii)分离所述蛋白质制剂与所述至少一种表面结合配体；其中当存在超过一种的表面结合配体时，每一表面结合配体均独立地具有相同的净电荷或为电荷中性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述能够结合金属的表面结合配体提供选自由静电相互作用、疏水相互作用、π-π相互作用、氢键合和其组合组成的组的其它化学官能性。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述接触步骤进一步包括使所述蛋白质制剂与至少一种提供不包括结合金属的化学官能性的表面结合配体接触。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述至少一种提供不包括结合金属的化学官能性的表面结合配体与所述至少一种能够结合金属的表面结合配体位于同一固体表面上。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述至少一种提供不包括结合金属的化学官能性的表面结合配体与所述至少一种能够结合金属的表面结合配体位于不同的固体表面上。
6.根据权利要求3－5中任一项所述的方法，其中所述不包括结合金属的化学官能性提供选自由金属亲和性、静电相互作用、疏水相互作用、π-π键合、氢键合和其组合组成的组的化学官能性。
7.根据权利要求1－6中任一项所述的方法，其中所述能够结合金属的表面结合配体上的净电荷为正。
8.根据权利要求7所述的方法，其中能够结合金属的表面结合配体包括选自由以下组成的组中的一种：三(2-氨乙基)胺(TREN)、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、聚丙烯亚胺四胺、去铁胺、组氨酸、组胺、聚组氨酸、精氨酸、聚精氨酸、赖氨酸、聚赖氨酸、聚烯丙胺和其组合。
9.根据权利要求1－6中任一项所述的方法，其中所述能够结合金属的表面结合配体上的净电荷为负。
10.根据权利要求9所述的方法，其中能够结合金属的表面结合配体包括选自由以下组成的组中的一种：亚氨基二乙酸(2-(羧甲基氨基)乙酸)、乙二醇(氨乙基醚)二乙酸、二乙胺三胺五乙酸、次氮基乙酸(2,2',2”-次氮基三乙酸)、天冬氨酸、谷氨酸、聚天冬氨酸和其组合。
11.根据权利要求1－10中任一项所述的方法，其中所述蛋白质制剂与选自由以下组成的组的过饱和浓度的尿囊素接触：(a)约0.6％到约1％；(b)约1％到约2％；(c)约2％到约5％；(d)约5％到约10％；(e)约10％到约25％；和(f)约25％到约50％。
12.根据权利要求1－11中任一项所述的方法，其中所述蛋白质制剂的电导率包含约0.1mS/cm到约40mS/cm的范围。
13.根据权利要求1－11中任一项所述的方法，其中所述蛋白质制剂的电导率包含约40mS/cm到约200mS/cm的范围。
14.根据权利要求1－13中任一项所述的方法，其中附加的固体表面基本上不与所述期望蛋白质相互作用。
15.根据权利要求1－14中任一项所述的方法，其中被选择为基本上防止所述期望蛋白质与所述至少一个固体表面的结合的所述操作条件包括选择所述蛋白质制剂的足够高的、以防止所述期望蛋白质与所述至少一种表面结合配体中的每一种的大量结合的电导率。
16.根据权利要求1－14中任一项所述的方法，其中被选择为基本上防止所述期望蛋白质与所述至少一个固体表面的结合的所述操作条件包括选择所述蛋白质制剂的如下电导率：比防止所述期望蛋白质与所述至少一种表面结合配体中的每一种的大量结合所需的值高约0.001％到约400％。
17.根据权利要求1－16中任一项所述的方法，其中pH操作条件被选择为基本上防止所述期望蛋白质与所述至少一个固体表面的结合。
18.根据权利要求1－17中任一项所述的方法，其中所述至少一个固体表面包含颗粒或颗粒复合物。
19.根据权利要求1－17中任一项所述的方法，其中所述至少一个固体表面包含纤维或纤维复合物。
20.根据权利要求1－17中任一项所述的方法，其中所述至少一个固体表面包含膜或膜复合物。
21.根据权利要求1－17中任一项所述的方法，其中所述至少一个固体表面包含整块材料或整块材料复合物。
22.根据权利要求1－21中任一项所述的方法，其中不同的表面结合配体存在于与包含所述至少一种能够结合金属的表面结合配体的所述至少一个固体表面在结构上类似但不同的固体表面上。
23.根据权利要求1－21中任一项所述的方法，其中不同的表面结合配体存在于与包含所述至少一种能够结合金属的表面结合配体的所述至少一个固体表面在结构上不同的固体表面上。
24.根据权利要求1－23中任一项所述的方法，其中所述蛋白质制剂包括细胞培养收获物。
25.根据权利要求1－23中任一项所述的方法，其中所述蛋白质制剂包括澄清的细胞培养收获物。
26.根据权利要求1－23中任一项所述的方法，其中所述蛋白质制剂包含重组蛋白。
27.根据权利要求1－23中任一项所述的方法，其中所述蛋白质制剂包含抗体。
28.根据权利要求1－27中任一项所述的方法，其中在所述方法后，所述蛋白质制剂具有降低的聚集物含量。
29.根据权利要求28所述的方法，其中聚集物含量降低了选自由以下组成的组的范围的量：(a)约50％到约99％；(b)约25％到约50％；(c)约10％到约25％；(d)约5％到约10％；(e)约1％到约5％；和(f)约0.1％到约1％。
30.根据权利要求1－29中任一项所述的方法，其进一步包括使所述蛋白质制剂与至少一种有机添加剂接触以降低所述制剂中的聚集物污染物，其中所述有机添加剂选自由酰脲、正电性离子、负电性离子、有机溶剂、有机聚合物和表面活性剂组成的组。
31.一种为方便实施权利要求1－30中任一项而提供的试剂盒。
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