CN105026418A - 蛋白质纯化方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于从蛋白质制剂纯化期望蛋白质的方法，其包括：通过用可溶性有机多价离子、固定化有机多价离子或两者处理，任选地在过饱和尿囊素的存在下处理，由此来调节蛋白质制剂，从而移除至少90％的染色质，然后(1)在大于生理浓度的非蛋白质沉淀盐的存在下用非离子性有机聚合物沉淀期望蛋白质以提供期望蛋白质的沉淀物；或(2)在不存在大于生理浓度的非沉淀盐的情况下用非离子性有机聚合物沉淀期望蛋白质以提供沉淀物，随后在大于生理浓度的非蛋白质沉淀盐的存在下用非离子性有机聚合物洗涤沉淀物。

Description

蛋白质纯化方法
相关申请的声明
本申请要求2013年2月6日提交的美国临时申请号61/761,646、2013年2月14日提交的61/764,966、2013年6月4日提交的61/831,099、2013年7月29日提交的61/859,772和2013年11月22日提交的61/907,877的优先权，其各自以全文引用的方式并入本文中。
背景技术
重组蛋白的纯化通常从净化步骤开始，其中移除细胞和碎片，使得可以用原本会因细胞和碎片的存在而受阻碍或变得无效的方法处理剩余上清液。所述移除通常涉及物理方法，例如离心和微滤。有时涉及使用具有阴离子交换能力的薄膜或深层过滤器，或直接向含抗体的采集物中加入阴离子交换聚合物或粒子(Gagnon,P.,Purification Tools for Monoclonal Antibodies,Validated Biosystems,Tucson,1996；Kuczewski,M.等人,Biopharm Int.23(3)(2010)20-25；Kuczewski,M.等人,Biotechnol.J.,6(2011)56-65)。Gan等人(J.Chromatography A 191(2013)33-40)最近指出，用可溶形式和不可溶形式的多价有机离子针对性地移除染色质分解代谢产物特别支持对细胞培养采集物的有效调节。物理净化方法通常无法实现显著的染色质减少。向采集物中加入阴离子交换粒子典型地移除大约一半的DNA。Gan等人(上文)所描述的一些方法移除99％的染色质，并且可以精确地被认为是针对染色质的净化方法。
已经描述了通过用聚乙二醇(PEG)沉淀来纯化蛋白质。其典型地作为水相技术来执行，其中PEG溶于水性蛋白质制剂中并且引起蛋白质从该溶液中沉淀出来。PEG的尺寸和浓度是已知的工艺参数，pH也是一样(Gagnon1996上文；D.Atha,K.等人J.Biol Chem.,256(1981)12108-12117；美国专利申请公开号2008/0214795，其各自以引用的方式并入本文中)。操作pH越接近抗体的等电点，实现沉淀所需的PEG浓度就越低。已指出非蛋白沉淀盐如氯化钠(NaCl)的浓度对选择性几乎没有显著影响(Atha等人,上文)，但是所述技术已经在高达约1.7M浓度(10％)的NaCl的存在下执行(Gervais等人,美国专利申请公开号2010/0204455)。也已经证实了当PEG与高浓度的NaCl组合时，由PEG介导的空间排阻色谱实现更高的IgG回收率和更低的污染物含量，并且进一步注意到其在很大程度上抵消了pH的影响(P.Gagnon等人,J.Chromatogr,A 1324(2014)171-180)。也已经描述了将PEG与蛋白质沉淀盐磷酸钠组合(Gervais,上文；美国专利号4,379,086和4,515,776)。
在使沉淀物再溶解之后移除残余PEG对于所述技术来说是一项重大挑战。Kuczewski等人(上文)通过在其中IgG结合于阳离子交换柱而在PEG流过的条件下进行阳离子交换色谱来移除残余PEG。PEG的移除原本是复杂的，因为其占据与其被用于沉淀的蛋白质相同的尺寸范围(作为流体动力学半径或直径测量)。这导致尺寸排阻色谱、透析和渗滤的标准方法无法用于PEG移除。针对IgG单克隆抗体广泛实施的在流过模式下的阴离子交换色谱也不适合，因为PEG与抗体一起流过。
发明内容
在一些方面，本文中公开的实施方案涉及用于从蛋白质制剂纯化期望蛋白质的方法，其包括：通过用可溶性有机多价离子、固定化有机多价离子或两者处理，任选地在过饱和尿囊素的存在下处理，由此来调节(condition)所述蛋白质制剂，从而移除至少90％的染色质，然后(1)在大于生理浓度的非蛋白质沉淀盐的存在下用非离子性有机聚合物沉淀期望蛋白质以提供期望蛋白质的沉淀物，或(2)在不存在大于生理浓度的非沉淀盐的情况下用非离子性有机聚合物沉淀期望蛋白质以提供沉淀物，随后在大于生理浓度的非蛋白质沉淀盐的存在下用非离子性有机聚合物洗涤沉淀物，其中沉淀或洗涤步骤任选地在大体上不存在蛋白质沉淀盐的情况下和任选地在没有将期望蛋白质的pH调节到期望蛋白质的等电点的0.5个pH单位以内的值的情况下进行；和任选地在不存在非离子性有机聚合物的情况下用蛋白质沉淀盐洗涤沉淀物，其中沉淀盐以足够保持期望蛋白质处于沉淀状态的浓度存在。
具体实施方式
已经发现，通过在其中90％或更多的染色质和染色质代谢分解产物被移除但是抗体保持溶解的条件下，使包含抗体的蛋白质制剂接触可溶性有机多价离子和/或固定在固体表面上的有机多价离子来调节所述包含抗体的蛋白质制剂，这以出乎意料的高程度提高了PEG沉淀法进行分级分离的能力。例如，在调节步骤使来自宿主蛋白质的污染减少30-70％时，其惊人地导致随后的PEG沉淀步骤进一步减少宿主蛋白质污染的能力增加400-500％或更高，尤其当沉淀配方还含有过量的非沉淀盐时。这突出了以下要点，即针对染色质的净化方法并不是仅仅是通过减少总体污染物负荷、而是通过移除会干扰随后的纯化步骤的污染物来帮助随后纯化的。还观察到，在沉淀期间存在浓度高于正常生理水平的盐会显著降低并且在一些情况下实际上消除了将操作pH调节到或使操作pH接近于期望蛋白质的等电点的需求。用包含浓度足以使蛋白质发生沉淀的蛋白质沉淀盐但不含PEG的最终洗涤液洗涤所沉淀的期望蛋白质提供了在使期望蛋白质再溶解之前移除PEG的额外优势。这些特征的各种组合明显地导致调节步骤与沉淀步骤的组合能够将宿主细胞污染降低到低于通过高性能方法如生物亲和色谱所实现的水平。于是，这允许所公开的方法在抗体再溶解之后仅经过单个另外的分级分离步骤即可实现足以支持被纯化的期望蛋白质的体内使用的纯化水平。实验数据证明该集成方法广泛适用于IgG和IgM抗体。其有效地纯化IgM抗体的能力表明其适用于纯化非抗体蛋白质。本文中所公开的方法的多个方面与国际专利申请号WO 2013180650、WO 2013180649和WO 2013180655中所公开的方法结合使用，所述申请各自以全文引用的方式并入本文中。在一个或多个实施方案中，用有机多价离子调节蛋白质制剂包括使样品与正电性有机添加剂接触。在一些所述实施方案中，正电性有机添加剂包括选自由依沙吖啶(ethacridine)、亚甲蓝、十六烷基三甲基溴化铵组成的群组的至少一种。在一些所述实施方案中，此类物质的浓度或物质组合的总计浓度在0.001％到1％、或0.01％到0.1％、或0.02％到0.05％的范围。在一些所述实施方案中，制剂的pH可被调高到不会引起期望蛋白质的回收率明显降低的碱性值。在其中期望蛋白质是IgG单克隆抗体的一个所述实施方案中，pH可以被调节到比抗体等电点低半个pH单位的pH值，或者当实验结果表明抗体回收率可接受时被调节到更高，但是所述调节不是必需的。如果在升高的盐浓度的存在下进行任何pH调节，那么在蛋白质等电点的约0.5到约1.0个pH单位以内、或约1.5个pH单位以内、或约2.0个pH单位以内的pH值将是足够的。
在一个或多个前述实施方案中，用有机多价离子调节蛋白质制剂包括使样品与负电性有机添加剂接触。在一些所述实施方案中，负电性有机添加剂包括选自由庚酸、辛酸、辛烯酸、壬酸、壬烯酸、癸酸、甲基蓝组成的群组的至少一种。在一些所述实施方案中，此类物质的浓度或物质组合的总浓度在0.001％到10％、或0.01％到1％、或0.1％到0.5％的范围。在一些所述实施方案中，制剂的pH可被调节降低到不会引起期望蛋白质的回收率明显降低的酸性值。在一些所述实施方案中，制剂的pH可被调节到3.5到6.5、4.0到6.0、4.5到5.5、5.0到5.3、5.15到5.25的范围，或调节到5.2或另一个中间值。
在一个或多个前述实施方案中，正电性多价有机离子和负电性多价有机离子可被用于调节制剂。在一些所述实施方案中，正电性多价有机离子在负电性多价有机离子之前接触制剂。在一些所述实施方案中，正电性多价有机离子是约0.01％浓度的十六烷基三甲基铵，负电性多价有机多价离子是约0.4％浓度的壬酸。在一些所述实施方案中，可以在调节的任何阶段存在约1％到约2％的尿囊素。在一些所述实施方案中，经过调节的制剂的聚集体含量是其中首先加入负电性多价有机离子的制剂中的聚集体含量的大约三分之一到四分之一。
在一个或多个前述实施方案中，用有机多价离子调节蛋白质制剂包括使样品与不溶解的尿囊素接触。在一些所述实施方案中，存在于蛋白质制剂中的经加入的尿囊素可以合计为约0.6％到50％、或0.7％到20％、或0.8％到10％、或0.9％到5％、或1％到2％、或中间值。
在一个或多个前述实施方案中，用有机多价离子调节蛋白质制剂包括使样品与浓度低于临界胶束浓度的非离子性或两性离子表面活性剂接触。
在一个或多个前述实施方案中，用有机多价离子调节蛋白质制剂包括：(i)提供第一组分，其是具有负电性表面的第一固体基质；(ii)使蛋白质制剂与第一组分接触，其中操作条件大体上防止期望蛋白质结合到第一组分上；和(iii)使具有降低的染色质含量的期望蛋白质与第一组分分离。在一些所述实施方案中，第一负电性表面可以伴随有第二负电性表面。
在一个或多个前述实施方案中，用有机多价离子调节蛋白质制剂包括：(i)提供第一组分，其是具有正电性表面的第一固体基质；(ii)使蛋白质制剂与第一组分接触，其中操作条件大体上防止期望蛋白质结合到第一组分上；和(iii)使具有降低的染色质含量的期望蛋白质与第一组分分离。在一些所述实施方案中，第一正电性表面携带有2(氨乙基)胺的残基。在一些所述实施方案中，第一正电性表面可以伴随有第二正电性表面。
在一个或多个前述实施方案中，用有机多价离子调节蛋白质制剂包括：(i)提供第一组分，其是具有正电性表面的第一固体基质；(ii)提供第二组分，其是具有负电性表面的第二固体基质；(iii)使蛋白质制剂与第一组分和第二组分接触，其中第一组分和第二组分被配置成使得蛋白质制剂可以同时接触这两种组分，其中操作条件大体上防止期望蛋白质结合到第一组分或第二组分上；和(iv)使具有降低的染色质含量的期望蛋白质与第一组分和第二组分分离。在一些所述实施方案中，第一正电性表面携带有2(氨乙基)胺的残基。
在一个或多个前述实施方案中，用有机多价离子调节蛋白质制剂包括：(i)使蛋白质制剂与包含至少一种结合在表面上的能够结合金属的配体的至少一种固体表面接触，其中结合在表面上的能够结合金属的配体起初大体上不含金属，其中选择操作条件以大体上防止期望蛋白质结合到所述至少一种固体表面上，和(ii)使蛋白质制剂与至少一种结合在表面上的配体分离。
在一个或多个前述实施方案中，已经用可溶性的正电性或负电性有机添加剂和/或携带有负电性、正电性或金属亲合性配体的固体表面处理的蛋白质制剂可以随后流过某种装置，该装置的流体接触表面包含正电荷。
在一个说明针对染色质的净化方法的应用的实施方案中，以1％(v/v)的量将尿囊素加入到细胞培养采集物中。细胞培养物可以包含细胞，或者细胞可以预先已经被移除。加入亚甲蓝，使其浓度为0.025％(w/v)。或者，可以加入依沙吖啶，使其浓度为0.025％。或者，可以加入十六烷基三甲基溴化铵，使其浓度为0.025％。或者，可以使用0.025％组合浓度的这些或其它正电性有机添加剂的组合。然后将混合物在搅拌下孵育2小时。以2-5％v:v的量加入携带有正电性金属亲合性配体2(氨乙基)胺(TREN)的粒子。将混合物在搅拌下孵育4小时，然后通过任何方便的手段移除固体。包含期望蛋白质的剩余溶液可以任选地流过深层过滤器，所述深层过滤器在其流体接触表面上携带有正电荷。
在另一个说明针对染色质的净化方法的应用的实施方案中，以1％(v/v)的量将尿囊素加入到细胞培养采集物中。细胞培养物可以包含细胞，或者细胞可以预先已经被移除。加入0.6％庚酸。或者加入0.4％辛酸。或者加入0.3％壬酸。或者加入0.2％癸酸。或者加入0.5％甲基蓝。或者，可以使用这些或其它负电性有机添加剂的组合。然后将混合物在搅拌下孵育2小时。以2-5％v:v的量加入携带有正电性金属亲合性配体2(氨乙基)胺(TREN)的粒子。将混合物在混合下孵育4小时，然后通过任何方便的方法移除固体。包含期望蛋白质的剩余溶液可以任选地流过深层过滤器，所述深层过滤器在其流体接触表面上携带有正电荷。
在一个或多个前述实施方案中，可以将盐加入到净化混合物中以防止期望蛋白质通过与可溶性或不可溶的多价有机离子发生过度的相互作用而损失。在一些所述实施方案中，可以加入NaCl以将电导率增加到对应于约200mM的水平，得到等于约20mS/cm的粗略电导率，目的是防止IgM抗体或非抗体蛋白质结合于针对染色质的净化系统的组分。在其它所述实施方案中，可将NaCl浓度升高到更大或更小的程度以适应特定重组蛋白。用于适应任何特定蛋白质的适当盐浓度可以通过以下步骤迅速地并且容易地评估：将期望蛋白质的样品施加于阳离子交换器或阴离子交换器，用增加的盐梯度洗脱，测定期望蛋白质峰的中心处的电导率，然后将所述电导率值用于净化过程。
在一个或多个前述实施方案中，用于沉淀期望蛋白质的非离子性有机聚合物包含聚乙二醇。
在一个或多个前述实施方案中，PEG可以具有8kDa或6kDa或4kDa或3kDa或2kDa或中间尺寸的平均尺寸。所属领域的技术人员将理解，PEG越小，实现与较大聚合物相同的效果所需要的浓度就越高。
在一个或多个前述实施方案中，用于调节沉淀的非离子性有机聚合物可以是除PEG以外的物质，例如聚丙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、右旋糖酐、纤维素或其它聚合物。
在一个或多个前述实施方案中，与非离子性有机聚合物组合的非蛋白质沉淀盐是氯化钠，其电导率在选自由以下各项组成的群组的范围：(i)约50mS/cm到约100mS/cm；(ii)约16mS/cm到约200mS/cm；(iii)大于160mS/cm的电导率。对于NaCl水溶液来说，16mS/cm对应于约160mM的NaCl浓度，50mS/cm大致对应于600mM，160mS/cm大致对应于约2M NaCl的浓度，并且200mS/cm大致对应于约2.5M NaCl。所公开的方法可以在最高达到饱和的NaCl浓度下实施，所述饱和在略微高于5M时发生，而有利的工作范围通常可以为约0.5到1.5M。精确的电导率测量会因为非离子性有机聚合物的存在而变得复杂，所述非离子性有机聚合物在增加聚合物浓度和聚合物尺寸的同时降低表观电导率值。精确的电导率测量可能因为一些电导率监视设备的较差线性而进一步变得复杂。因此，如果要将电导率用作盐浓度的指数，建议的电导率值被理解成代表不含非离子性有机聚合物的水溶液，并且可以通过支持线性精度的装置来测量。
在一个或多个前述实施方案中，方法使用特征为具有在约16mS/cm到约200mS/cm的范围的盐电导率的非蛋白质沉淀盐。作为参考，生理溶液的电导率为约12-15mS/cm，因此16-160的指标打算表示大于正常生理水平的电导率和对应盐浓度。
在一个或多个前述实施方案中，非离子性有机聚合物沉淀法使用特征为具有在约20到140mS/cm的范围的盐电导率的非沉淀盐。
在一个或多个前述实施方案中，非离子性有机聚合物沉淀法使用特征为具有在约50到120mS/cm的范围的盐电导率的非沉淀盐。
在一个或多个前述实施方案中，非离子性有机聚合物沉淀法使用特征为具有在约60到100mS/cm的范围的盐电导率的非沉淀盐。
在一个或多个前述实施方案中，非离子性有机聚合物沉淀法使用特征为具有在约80到120mS/cm的范围的盐电导率的非沉淀盐。
在一个或多个前述实施方案中，非蛋白质沉淀盐选自由氯化钠、氯化钾、乙酸钠、乙酸钾、硫氰酸钠、硫氰酸钾和盐酸胍、和其组合组成的群组。
在一个或多个前述实施方案中，可以存在超过一种的非蛋白质沉淀盐，并且经组合的非蛋白质沉淀盐的总计电导率可以在约16mS/cm到约200mS/cm的范围。
在一个或多个前述实施方案中，非蛋白质沉淀盐的浓度在沉淀和洗涤步骤期间是标称地恒定的。
在一个或多个前述实施方案中，在沉淀之后，用包含浓度和pH与其中最初沉淀期望蛋白质的溶液标称相同的非离子性有机聚合物和非沉淀盐的溶液洗涤沉淀物。
在一个或多个前述实施方案中，在沉淀之后，用包含浓度足以维持期望产物处于沉淀状态的沉淀盐的溶液洗涤沉淀物，并且溶液标称地不含非离子性有机聚合物。在一个相关实施方案中，可以用包含浓度足以维持沉淀物处于沉淀状态的沉淀盐的溶液再次洗涤沉淀物，并且溶液标称地不含非离子性有机聚合物。在一个相关实施方案中，在沉淀之后并且在已经用包含非离子性有机聚合物和非沉淀盐的溶液洗涤沉淀物之后，进一步用包含浓度足以维持期望产物处于沉淀状态的沉淀盐的溶液洗涤沉淀物，并且溶液标称地不含非离子性有机聚合物。在一个相关实施方案中，沉淀物可以额外洗涤多次。
在一个或多个前述实施方案中，在用非离子性有机聚合物连同非蛋白质沉淀盐进行沉淀之后，用浓度足以维持期望蛋白质处于沉淀状态的蛋白质沉淀盐洗涤。
在一个或多个前述实施方案中，用非离子性有机聚合物连同非蛋白质沉淀盐进行沉淀之后，用非离子性有机聚合物和非蛋白质沉淀盐洗涤，随后用浓度足以维持期望蛋白质处于沉淀状态的蛋白质沉淀盐洗涤。
在一个或多个前述实施方案中，方法进一步包括在后续色谱步骤中的处理。
在一个或多个前述实施方案中，在标称不存在非离子性有机聚合物的情况下用沉淀盐洗涤之后并且在再溶解之后，期望蛋白质可以不经过样品平衡就通过空隙排阻模式下的阴离子交换色谱方法进一步纯化(Nian等人,J.Chromatogr.A 1282(2013)127-132)。
在一个或多个前述实施方案中，在再溶解之后的期望蛋白质可以通过磷灰石色谱法在色谱介质上进一步纯化，所述色谱介质由羟磷灰石、或氟磷灰石、或混合磷灰石、或衍生自次生钙的磷灰石(secondarily calcium-derived apatite)、或衍生自其它金属的磷灰石(例如锌磷灰石、或铜磷灰石、或铁磷灰石、或衍生自另一种金属的磷灰石)组成。
在一个或多个前述实施方案中，在再溶解之后的期望蛋白质可以通过利用疏水性的正电性介质的多元色谱法进一步纯化。在一个所述实施方案中，正电性疏水性色谱介质还包含可以调节氢键合的残基。在一个所述实施方案中，色谱介质可以是Capto adhere。
在一个整合所公开方法的许多方面的示例性实施方案中，在pH为7.0的600mM NaCl和20-50mM Hepes或磷酸盐缓冲液的存在下利用19％PEG-6000使通过针对染色质的方法净化的含IgG的细胞培养采集物发生沉淀。沉降沉淀物并且移除上清液，然后在pH为7.0的600mM NaCl和20-50mM Hepes或磷酸盐缓冲液的存在下利用19％PEG-6000洗涤沉淀物。丢弃上清液，并且将沉淀物在50mM Tris、1M NaCl(pH 8.0)下再溶解并施加于填充有Capto adhere的柱上。残余的PEG流过该柱并且因此被清除。抗体被保留，并且随后通过将NaCl浓度降低到300mM来洗脱抗体，这具有移除大部分聚集体的效果。
在一个整合所公开方法的许多方面的示例性实施方案中，在pH为7.0的600mM NaCl和20-50mM Hepes或磷酸盐缓冲液的存在下利用19％PEG-6000使通过针对染色质的方法净化的含IgG的细胞培养采集物发生沉淀。沉降沉淀物并且移除上清液，然后用在20-50mM Hepes或磷酸盐缓冲液中的1.5M硫酸铵(pH7.0)洗涤沉淀物。沉降沉淀物并且移除上清液，然后在pH 7.0下用1.5M硫酸铵在Hepes或磷酸盐缓冲液中的20-50mM溶液再次洗涤沉淀物。将沉淀物在pH为7.0的Hepes或磷酸盐缓冲液中再溶解，并且施加于填充有用20mM Tris(pH 8.0)平衡的UNOsphere Q的柱上，该柱在空隙排阻模式下工作。
在一个或多个前述实施方案中，蛋白质沉淀盐包括选自由以下各项组成的群组的一项：磷酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐和其组合，包括具体实例如硫酸钠、硫酸钾、硫酸铵、磷酸钾、柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸铵。
在一个或多个前述实施方案中，在大体上不存在非离子性有机聚合物的情况下将蛋白质沉淀盐与非蛋白质沉淀盐组合。
在一个或多个前述实施方案中，大体上不存在蛋白质沉淀盐包括仅存在可调节pH控制的适当量，其中所述适当量在约5mM到约100mM的范围。在一个或多个前述实施方案中，大体上不存在蛋白质沉淀盐包括完全不存在沉淀盐。在一个或多个前述实施方案中，大体上不存在沉淀盐包括中间浓度的一种或多种沉淀盐。这突出了以下要点，即将特定盐称作蛋白质沉淀盐并不意味着其必需在足以沉淀期望蛋白质的浓度下存在。沉淀盐被理解为是指所谓的溶致性(lyotropic)或离液序列低的(kosmotropic)盐，这是根据其在离液序列高的和溶致性离子的霍夫迈斯特序列中的位置。术语非蛋白质沉淀盐被理解成是指在任何浓度下通常都不使蛋白质沉淀的盐。所述盐包括在霍夫迈斯特序列中处于离液序列高的位置的离子，或者处于所述序列的中间范围内的离子，但是所述盐通常不被归类为溶致性或离液序列低的盐。
在一个或多个前述实施方案中，沉淀步骤期间的pH为约7，或者在选自由以下各项组成的群组的范围：(i)约6.5到约7.5，(ii)约5.5到约8.5，和(iii)约4.0到约9.0。
在一个或多个前述实施方案中，沉淀步骤期间的pH未被调节。在一个相关实施方案中，沉淀步骤期间的pH未被调节到期望蛋白质的等电点的1个pH单位以内。在一个相关实施方案中，沉淀步骤期间的pH未被调节到期望蛋白质的等电点的0.5个pH单位以内。
在一个或多个前述实施方案中，沉淀步骤期间的pH可以被调节到期望蛋白质的等电点的0.6个单位以内，或者0.7个单位、或0.8个单位、或0.9个单位、或1个单位、或1.1个单位、或1.2个单位、或1.3个单位、或1.4个单位、或1.5个pH单位、或2.0个pH单位以内，或者与期望蛋白质的等电点相差更大的区间以内。
在一个或多个前述实施方案中，工艺的不同阶段可以利用不同的pH值。在一个实施方案中，高盐条件下的pH值可以范围很广，因为盐会抑制静电相互作用。这突出了以下要点，即没有必要将pH调节到期望蛋白质的等电点。
在一个或多个前述实施方案中，执行方法的特定阶段时所处的pH可以根据其增强污染物移除的能力来选择。
在一个或多个前述实施方案中，执行方法的特定阶段时所处的pH可以根据其增强系统中的正电性材料结合污染物的能力的能力来选择。
在一个或多个前述实施方案中，期望蛋白质是IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、IgE、Fc融合蛋白、非抗体蛋白、凝血蛋白、凝血蛋白与辅因子的复合物。
在一个或多个前述实施方案中，期望蛋白质被部分纯化。
在一个或多个前述实施方案中，抗体是IgG。在一个所述实施方案中，抗体是单克隆IgG。在一个紧密相关的实施方案中，期望蛋白质包括IgG片段，例如作为所谓的Fc融合蛋白的组成部分的Fc片段。
在一个或多个前述实施方案中，使用所述方法纯化非IgG抗体。在一个所述实施方案中，抗体是IgM。
在一些实施方案中，期望蛋白质可以是抗体。在一些所述实施方案中，纯化抗体的方法可以进一步包括：使包含至少一种抗体的细胞培养采集物或蛋白质制剂与至少一种具有7到10个碳原子的脂肪酸接触以形成混合物，任选地使混合物与尿囊素接触，使混合物与一种或多种官能化固体和/或可溶性基质接触以形成混合物，其中所述一种或多种官能化基质包含阳离子官能团、金属结合官能团或两者，其中金属结合官能团包含选自由以下各项组成的群组的含氮部分：(1)多胺、(2)亚胺、(3)N-杂环，(4)氨基酸、(5)N-羟基酰胺、(6)芳胺和其组合，以及在将混合物与所述一种或多种固体接触之后分离固体材料以提供包含IgG抗体的溶液。
在一些所述实施方案中，方法可以进一步包括将细胞培养采集物与尿囊素接触。
在一个或多个前述实施方案中，尿囊素存在的浓度可以在选自由以下各项组成的群组的范围：(a)约0.6到约30％，(b)约1到约10％，和(c)约1到约2％。
在一个或多个前述实施方案中，尿囊素在从非零量到约0.6％的范围。
在一个或多个前述实施方案中，所述一种或多种官能化基质的总量为约0.01％、0.05％、0.1％、0.25％、0.5％、1％、2％、5％、10％、20％或其间的中间值，其是占总体积的体积比。
在一个或多个前述实施方案中，所述至少一种脂肪酸和所述一种或多种官能化基质被布置在单个容器中。
在一个或多个前述实施方案中，所述一种或多种官能化基质被布置在允许流体通过同时阻止固体材料通过的装置中。
在一个或多个前述实施方案中，所述方法进一步包括使溶液与布置在装置中的官能化固体接触。
在一个或多个前述实施方案中，允许流体通过同时阻止固体通过的装置包括选自由以下各项组成的群组的多孔材料：膜、块体(monolith)、编织材料、结晶材料、凝胶状材料、填充有粒子的柱和其组合。
在一个或多个前述实施方案中，通过沉降或离心后沉降来移除使细胞培养采集物与所述至少一种脂肪酸接触之后的或在分离步骤中存在的固体材料。
在一个或多个前述实施方案中，通过过滤来移除使细胞培养采集物与所述至少一种脂肪酸接触之后的或在分离步骤中存在的固体材料。
在一个或多个前述实施方案中，过滤包括膜过滤或深层过滤。
在一个或多个前述实施方案中，膜过滤或深层过滤包括经过官能化的接触表面。
在一个或多个前述实施方案中，在第一接触步骤之前先部分纯化IgG抗体。
在一个或多个前述实施方案中，细胞培养采集物或蛋白质制剂包含细胞，并且任选地存在于生物反应器中，在所述生物反应器内进行细胞培养物生产。
在一个或多个前述实施方案中，细胞培养采集物或蛋白质制剂不含细胞。
在一个或多个前述实施方案中，蛋白质制剂是天然存在的生物流体。
在一个或多个前述实施方案中，所述至少一种脂肪酸包括CH3(CH2)nCOOH的结构通式。
在一个或多个前述实施方案中，所述至少一种脂肪酸包括庚酸、辛酸、辛烯酸、壬酸、壬烯酸或癸酸。
在一个或多个前述实施方案中，所述至少一种脂肪酸是壬酸。
在一个或多个前述实施方案中，所述至少一种脂肪酸存在的浓度在选自由以下各项组成的群组的范围：(a)约0.05到约5％，(b)约0.1到约1.0％，(c)约0.2到约0.4％，和(d)约0.1到0.2％。
在一个或多个前述实施方案中，混合物可以包含表面活性剂。
在一个或多个前述实施方案中，包含在混合物中的表面活性剂可以是非离子性、或两性离子性、或阳离子性的。
在一个或多个前述实施方案中，包含在混合物中的阳离子表面活性剂可以是十六烷基三甲基溴化铵。
在一个或多个前述实施方案中，十六烷基三甲基溴化铵存在的浓度可以在约0.001％到0.05％、或约0.005％到0.025％、或约0.0075％到约0.01％的范围。
在一个或多个前述实施方案中，所述一种或多种官能化基质包括至少一种选自由阴离子性、阳离子性或两性离子性组成的群组的电荷配置。
在一个或多个前述实施方案中，所述一种或多种官能化基质包括一种具有金属结合官能团的基质和为阳离子性的不同基质。
在一个或多个前述实施方案中，金属结合官能团是阳离子性的。
在一个或多个前述实施方案中，金属结合官能团选自由以下各项组成的群组：三(2-氨乙基)胺、二亚乙基三胺、三亚乙基三胺、四亚乙基五胺、聚丙烯亚胺四胺、聚(酰胺基胺)(PAMAM)树枝状聚合物、去铁胺、精氨酸、组氨酸、组胺、咪唑和其组合。
在一个或多个前述实施方案中，金属结合官能团是式I的化合物：
其中每个R独立地为氢或C1-C4烷基，条件是至少一个R为与固体载体连接的连接位点，任选地经由连接基团连接；并且X、Y和Z中的每一个独立地为(CH2)n，其中n为2到6的整数，其中CH2基团任选地被O或NH取代。
在一个或多个前述实施方案中，阳离子性螯合剂是三(2-氨乙基)胺。
在一个或多个前述实施方案中，所述一种或多种官能化固体或可溶性基质包括一种具有金属结合官能团的基质和为阴离子性的不同基质。
在一个或多个前述实施方案中，金属结合官能团是阴离子性的。
在一个或多个前述实施方案中，金属结合官能团选自由以下各项组成的群组：亚氨基二乙酸、氮川乙酸(nitriloacetic acid)、谷氨酸、天冬氨酸、氨基苯基磷酸和其组合。
在一个或多个前述实施方案中，阴离子性螯合剂是亚氨基二乙酸。
在一个或多个前述实施方案中，所述一种或多种官能化固体或可溶性基质包含一种阳离子性基质和为阴离子性的不同基质。
在一个或多个前述实施方案中，抗体是IgG或IgM抗体。
在一些实施方案中，提供了用于纯化抗体的方法，其包括将细胞培养采集物或蛋白质制剂与至少一种具有8到10个碳原子的脂肪酸接触以形成混合物，将混合物与尿囊素接触，和在将混合物与尿囊素接触之后分离固体材料以提供包含抗体的溶液。在一些所述实施方案中，所述方法进一步包括将溶液与至少一种经过化学官能化的固体或可溶性基质接触。
在一些所述实施方案中，所述至少一种经过化学官能化的固体包含三(2-氨乙基)胺。
在一个或多个前述实施方案中，尿囊素存在的浓度在选自由以下各项组成的群组的范围：(a)约0.6到约30％，(b)约1到约10％，(c)约1到约5％，和(d)约1到约2％。
在一个或多个前述实施方案中，尿囊素在从非零量到约0.6％的范围。
在一些实施方案中，提供了用于从蛋白质制剂纯化期望蛋白质的方法，其包括：通过用可溶性有机多价离子、固定化有机多价离子或两者处理，任选地在过饱和尿囊素的存在下处理，由此来调节蛋白质制剂，从而移除至少90％的染色质，然后(1)在大于生理浓度的非蛋白质沉淀盐存在的情况下用非离子性有机聚合物沉淀期望蛋白质以提供期望蛋白质的沉淀物，或(2)在不存在大于生理浓度的非沉淀盐的情况下用非离子性有机聚合物沉淀期望蛋白质以提供沉淀物，随后在大于生理浓度的非蛋白质沉淀盐的存在下用非离子性有机聚合物洗涤沉淀物，其中沉淀或洗涤步骤任选地在大体上不存在蛋白质沉淀盐的情况下和任选地在没有将期望蛋白质的pH调节到期望蛋白质的等电点的0.5个pH单位以内的值的情况下进行，和任选地在不存在非离子性有机聚合物的情况下用蛋白质沉淀盐洗涤沉淀物，其中沉淀盐以足够保持期望蛋白质处于沉淀状态的浓度存在。
“生理盐”包括主要为氯化钠和氯化钾、同时还有较低含量的许多其它盐的混合物。通常应理解“生理盐”的量被估计为对应于约0.15M NaCl的等效总盐浓度。因此，如本文中所使用，“大于生理浓度”的非蛋白质沉淀盐的量包括大于约0.15M、或大于约0.2M、或大于约0.3M、或大于约0.5M等等的盐浓度，包括其间的任何量和其一部分。也就是说，该量可以是大于生理条件下的典型量的任何量。在一些实施方案中，浓度可以在约0.2M到约2.0M的范围，包括其间的任何量和其一部分。
因此，举例来说，本文中所公开的方法可以包括以下步骤：(1)在浓度大于约0.2M的非蛋白质沉淀盐的存在下用非离子性有机聚合物沉淀期望蛋白质以提供期望蛋白质的沉淀物；或(2)在不存在浓度大于约0.2M的非沉淀盐的情况下用非离子性有机聚合物沉淀期望蛋白质以提供沉淀物，并且随后在浓度大于约0.2M的非蛋白质沉淀盐的存在下用非离子性有机聚合物洗涤沉淀物，其中沉淀或洗涤步骤任选地在大体上不存在蛋白质沉淀盐的情况下和任选地在没有将期望蛋白质的pH调节到期望蛋白质的等电点的约0.5个pH单位以内的值的情况下进行，和任选地在不存在非离子性有机聚合物的情况下用蛋白质沉淀盐洗涤沉淀物，其中沉淀盐的浓度足够保持期望蛋白质处于沉淀状态。
在一些实施方案中，用有机多价离子调节蛋白质制剂包括将样品与正电性有机添加剂接触。在一些所述实施方案中，正电性有机添加剂是选自由以下各项组成的可溶性阳离子群组的一种或多种：亚甲蓝、依沙吖啶、氯己定(chlorhexidine)、苯扎氯铵、十六浣基三甲基溴化铵。
在一些实施方案中，正电性有机添加剂是选自由因固定在固体表面上而不可溶的阳离子组成的群组的一种或多种，所述阳离子包括伯氨基、仲氨基、叔氨基、季氨基、含有超过一个由一种或多种类型的氨基所赋予的正电荷的配阳离子。
在一些实施方案中，正电性有机添加剂是固定在固体上的2(氨乙基)胺(TREN)。
在一些实施方案中，用有机多价阳离子调节蛋白质制剂包括将样品与负电性有机添加剂接触。
在一些实施方案中，负电性有机添加剂是选自由庚酸、辛酸、辛烯酸、壬酸、壬烯酸、癸酸、甲基蓝组成的可溶性阴离子群组的一种或多种。
在一些实施方案中，负电性有机添加剂是选自由因固定在固体表面上而不可溶的阴离子组成的群组的一种或多种，所述阴离子包括二氧磷基(phospho)、羧基、磺基、含有超过一个由一种或多种类型的带负电基团所赋予的负电荷的配阴离子。
在一些实施方案中，负电性有机添加剂是亚氨基二乙酸、氮川乙酸或两者的组合。
在一些实施方案中，负电性有机添加剂或正电性有机添加剂对金属离子的亲合性为1:1。
在一些实施方案中，如果包含尿囊素，则其以过饱和浓度存在，所述过饱和浓度在选自由0.6到50％、0.7到20％、0.8到10％、0.9到5％、1到2％或中间值组成的群组的范围。
在一些实施方案中，非离子性有机聚合物是聚乙二醇(PEG)。
在一些实施方案中，聚合物尺寸在选自由1000到12,000道尔顿(D)、2000到8,000D、3000到6000D或中间尺寸组成的群组的范围，所述中间尺寸例如为选自由1500D、3500D、4000D、6000D组成的群组的尺寸。
在一些实施方案中，非蛋白质沉淀盐可以包括选自由以下各项组成的群组的一项：乙酸钠、乙酸钾、氯化钠、氯化钾和其组合。
在一些实施方案中，可以将量足以使加入非离子性有机聚合物之后的盐浓度比生理浓度高出在至少0.05M到约2.0M范围的增量的一种或多种非蛋白质沉淀盐加入到经过调节的细胞培养采集物中。因此，所述增量可以大于至少约0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0、1.5和2.0M或甚至更高，包括其间的任何值和其一部分。在一些实施方案中，浓度可以在约0.5到约1.5M的范围。
在一些实施方案中，在加入所述非离子性有机聚合物的同时，将非蛋白质沉淀盐的单个盐或非蛋白质沉淀盐的组合加入到细胞培养采集物中以将总盐浓度升到高于正常的生理盐含量，并且维持过量的非蛋白质沉淀盐。在一些实施方案中，浓度可以大于在约1.2M到约1.8M的范围的增量。在一些实施方案中，所述增量为约1.2M、1.3M、1.4M、1.5M、1.6M、1.7M或约1.8M。在一些实施方案中，浓度可以在约0.5到约1.5M的范围。
在一些实施方案中，可以在加入所述非离子性有机聚合物的同时，将一种或多种非蛋白质沉淀盐加入到蛋白质制剂中，使得最终盐浓度比正常生理浓度高出至少0.05M的增量。在一些实施方案中，浓度可以大于在约1.2M到约1.8M的范围的增量。在一些实施方案中，所述增量为约1.2M、1.3M、1.4M、1.5M、1.6M、1.7M或约1.8M。在一些实施方案中，浓度可以在约0.5到约1.5M的范围。
在一些实施方案中，可以加入一种或多种非蛋白质沉淀盐以使得蛋白质制剂的净盐浓度高于正常生理值，在选自由200mM到2M、300mM到1.5M、400mM到1M、500mM到800mM或中间值组成的群组的范围。
在一些实施方案中，在洗涤溶液中包含至少0.2M浓度的非沉淀盐以维持在沉淀物中已经存在的过量。
在一些实施方案中，当初始沉淀步骤中不存在非沉淀盐时，其被包含在至少一个洗涤步骤中。
在一些实施方案中，可以用一种或多种浓度足以维持期望蛋白质处于沉淀状态的沉淀盐洗涤沉淀物。在一些所述实施方案中，沉淀盐在不存在或大体上不存在非离子性有机聚合物如PEG的情况下使用。所属领域的技术人员将意识到，在足够高的浓度下，这两种试剂可能不相容，因为PEG可以作为单独的有机层分离。然而，仍存在可行性条件，其中可以将低浓度的一种试剂加入到较高浓度的另一种试剂中。
在一些实施方案中，一种或多种沉淀盐可选自由以下各项组成的群组：硫酸钠、硫酸钾、硫酸铵、磷酸钠、磷酸钾、磷酸铵、柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸铵和其组合。
在一些实施方案中，期望蛋白质是天然存在的蛋白质、重组蛋白、抗体、单克隆抗体、IgG抗体或IgM抗体。
在一些实施方案中，制剂是体液、奶、血浆、血清或细胞培养采集物。
对术语进行定义以便可以更容易地理解实施方案。在具体实施方式中阐明另外的定义。
“PEG沉淀”是指一种纯化方法，其中期望蛋白质在临界浓度的PEG的存在下变得不可溶，并且形成固体沉淀物，所述固体沉淀物可以通过过滤或离心从溶液中移除，在剩余液体(上清液)中留下大部分污染物。上清液传统地通过过滤或先离心再倾析来移除。大多数情况下，通过用含有PEG的缓冲液再悬浮沉淀物一次或多次来洗涤沉淀物，以稀释出存在于沉淀物间隙中的污染物，特别是在离心之后。洗涤步骤传统上重复一次或多次，通常利用不同组成的缓冲液，但通常是利用充足的PEG保持期望蛋白质被沉淀。沉淀蛋白质最终在低PEG或无PEG的缓冲液中再溶解。传统上，期望蛋白质可以再沉淀和再溶解一次或多次以进一步增加期望蛋白质的纯度。
“蛋白质”是指含有碳、氢、氧、氮且通常含有硫并且主要由一条或多条通过肽键连接的氨基酸链构成的一群复杂有机大分子中的任一种。蛋白质可以是天然或重组来源的。蛋白质可以用非氨基酸部分修饰，例如通过糖基化作用、聚乙二醇化作用或与其它化学部分结合。蛋白质的实例包括但不限于抗体、凝血因子、酶和肽激素。
“宿主污染物”或“宿主细胞污染物”是指由其中生长目的产物的细胞所产生的生物分子。所述术语可以包括各种类别的宿主污染物，例如宿主蛋白和宿主DNA。
“宿主蛋白”或“宿主细胞蛋白”或“HCP”是指由其中生长目的产物的细胞所产生的蛋白质。所述蛋白质代表必须从目的产物中移除的一类污染物。
“抗体”是指衍生自人或其它哺乳动物细胞系的IgG、IgM、IgA、IgD或IgE类的免疫球蛋白，包括天然形式或基因改造的形式，例如人源化抗体、人抗体、单链抗体、嵌合抗体、合成抗体、重组抗体、杂合抗体、突变的抗体、移植的抗体和体外产生的抗体。“抗体”还可以包括复合形式，包括但不限于含有免疫球蛋白部分的融合蛋白，或通过IgG与另一种功能部分的合成连接而产生的免疫结合物，所述另一种功能部分包括另一种抗体、酶、荧光团或其它产生信号的部分、生物素、药物或其它功能部分。
“非离子性有机聚合物”是指由相连接的不含带电基团的重复有机亚单元构成的天然存在的烃或合成烃。其可以是线性的、具有少量分支的高程度线性的或高程度分支的。适合于实施所述方法的实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等。PEG具有结构式HO-(CH2-CH2-O)n-H。实例包括但不限于平均聚合物分子量在小于100到大于10,000道尔顿的范围的组成。
“阴离子交换粒子”或“正电性粒子”是指表面上主要是正电荷的多孔或无孔粒子。粒子尺寸可以在小于50nm到大于200微米的范围。粒子可以包括聚合结构、结晶结构或陶瓷结构，所述结构中还可并入允许粒子通过不影响或干扰其实施本文中公开的方法的能力的手段被隔离、但是可提供一些总体改进的特征。实例包括但不限于赋予低密度以实现漂浮、赋予高密度以促进快速沉降和/或赋予磁性以实现在磁场中收集的特征。正电性可以通过包括但不限于以下各项的化学基团赋予：弱阴离子交换基团，如氨基、乙二氨基、二乙氨基乙基、聚烯丙基胺、聚乙烯亚胺；强阴离子交换基团，例如季氨基；组合型弱-强交换剂，例如聚赖氨酸、聚精氨酸或三(2-氨乙基)胺、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、聚丙烯亚胺四胺、PAMAM树枝状聚合物(乙二胺核心)或前述基团的任何组合。在带正电的膜上产生混合化学性质的次要官能团可以由带负电或带正电的基团、疏水基团、π-π键合基团、氢键合基团或金属螯合基团组成。次要官能团可以作为用于合成粒子的制造材料或工艺的意外副产物存在于膜表面上，或者其可以通过故意的设计而存在。次要官能团的浓度可以在每毫升粒子中小于1毫当量到每毫升中大于100毫当量的范围。
“有机多价离子”是指天然或合成来源的有机分子、离子或盐，其具有至少一个电荷和至少一个额外的化学官能团从而赋予其多价性。在某些实施方案中，有机多价离子，至少一个额外的化学官能团是额外的电荷，使得有机多价阳离子携带有两个或更多个相同或不同的电荷。有机多价离子可以带有净正电荷、净负电荷或净中性电荷。在有机多价离子是净正电性的情况下，其可以与例如氯离子、溴离子、硫酸根、有机酸、乳酸根、葡糖酸根和不与所述方法不相容的任何其它阴离子等阴离子一起提供。在某些实施方案中，有机多价离子的正电荷中的一些由胺、亚胺或其它氮部分供应。有机多价离子可以另外具有混合化学特性，并且包括疏水性残基、其它功能部分和/或其可以具有参与其它类型的化学相互作用的能力，所述化学相互作用包括(例如)参与氢键、疏水性相互作用、π-π键合、金属配位和插入的能力。在某些实施方案中的带正电的有机多价离子的实例包括但不限于：二氨基酸、二-、三-或更大的均肽(homopeptide)或杂肽(heteropeptide)，例如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚组氨酸、聚鸟氨酸；聚乙烯亚胺；聚烯丙基胺；聚苄菊酯(polydimethrine)、聚甲基丙烯基酰胺基丙基三甲铵；聚二烯丙基二甲铵；聚乙烯基苯甲基三甲铵；聚乙烯基胍；聚(N-乙基-4-乙烯基吡啶；DEAE-右旋糖酐；DEAE-纤维素；依沙吖啶(CAS编号442-16-0；7-乙氧基吖啶-3、9-二胺)；三(2-氨乙基)胺；胍；氯己定；阿来西定(alexidine)；citricidal、鱼精蛋白；精胺；亚精胺；鲑精蛋白(salmine)；壳聚糖；和前述物质的变异体和衍生物。举例来说，依沙吖啶的变异体和衍生物应被理解成包括9-氨基吖啶(氨吖啶(aminacrine))、3,6-吖啶二胺(原黄素(proflavin))、吖啶琐辛(acrisorcin)、吖啶氯(acrizane)(苯艾克坦(phenacridane))、吖啶橙、阿的平(quinacrine)、乐杀螨(acricide)、吖啶酮(acridone)、吖啶-9-甲酸、氯甲氧吖胺(acranil)(1-[(6-氯-2-甲氧基-9-吖啶基)氨基]-3-(二乙氨基)-2-丙醇二盐酸盐)、酚藏花红(phenosafranin)、吩噁嗪、吩噻嗪、吖啶黄(acriflavine)(3,6-二氨基-10-甲基吖啶(盐酸盐)和3,6-吖啶二胺)和其盐(例如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、乳酸盐、葡糖酸盐)；以及噻嗪，例如亚甲蓝(也称为碱性蓝9)、其类似物和变异体，包括亚甲绿(也称为碱性绿5)、劳氏紫(Lauth’s violet)(也称为硫堇)、亚甲天蓝A、亚甲天蓝B和亚甲天蓝C。在有机多价离子是净负电性的情况下，其可以与例如钠或钾或任何其它不与所述方法不相容的阳离子等阳离子一起提供。在某些实施方案中，有机多价离子的负电荷中的一些由羧基、二氧磷基或磺基部分供应。有机多价离子可以另外具有混合化学特性，包括疏水性残基、其它功能部分和/或其可以具有参与其它类型的化学相互作用的能力，所述化学相互作用包括(例如)参与氢键、疏水性相互作用、π-π键合、金属配位和插入的能力。某些实施方案中的带负电的有机多价离子的实例包括但不限于脂肪酸(例如辛酸、辛烯酸、壬酸、壬烯酸)、负电性聚合物和其盐(例如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、乳酸盐、葡糖酸盐)，和芳基化合物例如甲基蓝。
“蛋白质沉淀盐”或“抗体沉淀盐”或“IgG沉淀盐”是指具有调节期望蛋白质的沉淀的能力的盐。常见实例包括硫酸钠或硫酸铵、柠檬酸钠或柠檬酸钾、磷酸钠或磷酸钾。所述盐通常被称为离液序列低的盐。
“非蛋白质沉淀盐”或“非抗体沉淀盐”或“非IgG沉淀盐”是指不具有调节期望蛋白质的沉淀的能力并且可以具有增加期望蛋白质的溶解度的能力的盐。常见实例包括但不限于氯化钠或氯化钾、乙酸钠或乙酸钾、硫氰酸钠或硫氰酸钾或氯化胍。一些所述盐通常被认为是离液序列高(chaotropic)的盐，而其它盐则既不被认为是离液序列高的，也不被认为是离液序列低的。
“多核苷酸”是指由在一条链中共价结合的多个核苷酸单体构成的生物聚合物。DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)是多核苷酸的实例。多核苷酸可以具有较高的形成氢键的倾向。
“蛋白质制剂”是指含有目的蛋白质的任何水溶液或大体上为水性的溶液，例如含细胞的细胞培养采集物、(大体上)不含细胞的细胞培养上清液或来自纯化阶段的含有目的蛋白质的溶液。
IgG纯化工艺的开发充当用于说明针对特定期望蛋白质定制化所公开方法的步骤的可用实例。开发始于选择用于移除细胞培养采集物中的90％或更多的染色质的净化方法。一个有用的起始点是将尿囊素以1％w/v的量加入到采集物中，随后以0.4％w/v的量加入辛酸。将混合物的pH调节到5.2并且在室温下混合2小时。将带正电的金属亲合性粒子(例如Bio Works TREN high)平衡到pH5.2，然后以5％v/v的量加入到混合物中并且在搅拌下孵育4小时。然后通过任何便捷的方法移除固体。在所述方法之后将上清液通过深层过滤器，所述深层过滤器的流体接触表面携带有正电性配体。必要时可以随后精调反应物的电导率、pH和浓度。经过净化的IgG制剂现在大体上不含染色质和染色质代谢分解产物，通过加入PEG-6000达到19％的最终浓度使IgG制剂沉淀。还加入600mM的量的NaCl，使净盐浓度(样品+加入的NaCl)达到约750mM的假定浓度。pH为约7(6.8到7.2)，由20-50mM Hepes或磷酸钠或磷酸钾(pH 7)赋予和控制。必要时可以进一步精调这些条件，包括用其它缓冲物质替代。通过离心或过滤收集沉淀物，并且丢弃上清液。将沉淀物再悬浮在19％PEG-6000、750mMNaCl、20-50mM Hepes或磷酸盐(pH 7)中，然后再收集沉淀物并且丢弃上清液。此时的一个选择是用浓度维持IgG处在沉淀状态的沉淀盐再次洗涤沉淀物。这具有移除残余PEG的效果。沉淀物然后可以再溶解并且在必要时通过一种或多种另外的分级分离方法进一步纯化。一个选择是将样品施加于在空隙排阻模式下工作的UNOsphere Q柱，其中所述柱被平衡到50mM Tris(pH 8.2)。替代的色谱方法是已知的，并且所属领域的普通技术人员有能力选择一种或多种合适的方法并且设计出用于操作所述方法的条件。
一种用于开发IgG纯化的不同方法说明了可以考虑的一些替代方案。和在先前通用实例中一样，开发始于选择用于移除细胞培养采集物中的90％或更多的染色质的净化方法。一个有用的起始点是将尿囊素以1％w/v的量加入到采集物中，随后以0.025％w/v的量加入依沙吖啶酸。将混合物的pH调节到7.5并且在室温下混合2小时。将带正电的金属亲合性粒子(例如BioWorks TREN high)平衡到pH 7.5，然后以4％v/v的量加入到混合物中，同时以1％v/v的量加入带负电的疏水性粒子(例如Bio-Rad MacroPrep feutyl)并且在搅拌下孵育4小时。然后通过任何便捷的方法移除固体。在所述方法之后将上清液通过深层过滤器，所述深层过滤器的流体接触表面携带有正电性配体。必要时可以随后精调反应物的电导率、pH和浓度。经过净化的IgG制剂现在大体上不含染色质和染色质代谢分解产物，通过加入PEG-6000达到19％的最终浓度使IgG制剂沉淀。还加入约850mM的量的NaCl，使净盐浓度(样品+加入的NaCl)达到约1M的假定浓度。pH为约7(6.8到7.2)，由20-50mM Hepes或磷酸钠或磷酸钾(pH 7)赋予和控制。必要时可以进一步精调这些条件。通过离心或过滤收集沉淀物，并且丢弃上清液。将沉淀物悬浮在19％PEG-6000、1mM NaCl、20-50mM Hepes或磷酸盐(pH 7)中，然后再沉降沉淀物并且丢弃上清液。然后可以将沉淀物再溶解，例如利用50mM磷酸盐、1M NaCl(pH 7.2)，并且在必要时通过施加于被平衡到相同条件的Capto adhere柱来进一步纯化。然后可以通过将NaCl浓度降低到300mM来洗脱经过纯化的IgG。替代的色谱方法是已知的，并且所属领域的普通技术人员有能力选择一种或多种合适的方法并且设计出用于操作所述方法的条件。
可以考虑以上工艺的许多变化，包括省略某些组分例如尿囊素的简化操作，或者改变某些组分，例如用Dowex AG1X2或其它替代TREN粒子，例如用Chelex-100或其它替代MacroPrep t-butyl，将混合物与柱形式而不是以上所述的分批形式的这些粒子接触，或者其中正电性和/或正电性有机离子存在于其它固体(例如膜、纤维、水凝胶或其它物理载体)的表面上。所述变化和更多变化的实例在附录A-D中论述。
所公开方法的修改将通常涉及在净化期间加入盐或其它添加剂以防止期望产物通过与可溶性或不可溶的正电性或负电性有机离子的强烈相互作用而发生损失。
因为使用本文中所公开的方法获得的结果随化学工艺而变，所以应理解，虽然所有的物理形式都能够实现类似结果，但可能以不同程度的效率、不同的流体体积和不同的时间间隔来实现。普通技术人员有能力确定如何有效地针对特定应用配置所述方法。
实施例
实施例1.用于执行沉淀的NaCl浓度的选择。通过离心和膜过滤净化含有1.2g/L单克隆抗HER2 IgG的1L细胞培养上清液。这种抗体的等电点为约8.6。加入1％尿囊素，随后加入0.025％最终浓度的依沙吖啶。通过过滤移除固体。组合相等比例的带正电的金属亲合性粒子(BioWorks TREN hi-sub)、带负电的金属亲合性粒子(Chelex-100)和带正电的疏水性粒子(Dowex AG 1x2400目)。将20mL粒子混合物装填入被平衡到大致生理条件的1.6x 10cm柱中，并且样品以300cm/hr的线性流速流过所述柱。经过处理的HER2包含165,663ppm宿主细胞蛋白质污染。其在pH 7下在18％PEG-6000溶液中沉淀。通过经由平均0.22微米孔径的不带电膜过滤来移除上清液。沉淀物再悬浮在50mM Hepes、18％PEG(pH 7.0)中，并且通过在相同的膜上过滤来移除上清液。抗体然后在50mM Hepes(pH 7.0)中溶解。在平行实验中，将NaCl加入到原始样品中以产生等于200mM的盐浓度。还将200mM NaCl加入到再悬浮缓冲液中。在另外的平行实验中，将NaCl浓度升高到400、800和1000mM NaCl。测量来自每个实验的再溶解抗体中的污染性宿主细胞蛋白质的浓度。水平如下：未加入NaCl，16,544ppm；200mM NaCl，1,984ppm；400mM NaCl，605mM NaCl；800mM NaCl，50ppm；1000mM NaCl，32ppm。
实施例2.除了不向原始样品中加入盐之外，在800mM NaCl下重复实施例1的实验。再溶解的抗体含有155ppm宿主细胞蛋白质。在其中长时间或重复接触再悬浮缓冲液的后续实验中，污染性宿主蛋白质的浓度降低到约70ppm。这突出了以下要点，即当初始沉淀步骤在较高的盐浓度下执行时，性能得到提高。
实施例3.实施例2的基本形式，其中不向原始样品中加入盐，但是包括在洗涤再悬浮沉淀物的过程中长时间接触800mM NaCl。随后用50mM Tris、18％PEG(pH 8.0)洗涤沉淀出的IgG，然后将抗体溶解在50mM Tris(pH 8.0)中。宿主蛋白质污染被降低到88ppm；仍然劣于当在高盐浓度下执行初始沉淀时获得的结果。
实施例4.除了以包含细胞的细胞培养采集物开始之外，重复实施例3的实验。结果基本上没有改变，证明了所述调节方法的优势适用于含细胞的蛋白质制剂和不含细胞的蛋白质制剂两者。
实施例5.重复实施例3的基本形式，例外是用1M NaCl、50mM Hepes(pH7.0)再溶解IgG，然后将IgG施加于10mL的被平衡到相同条件的疏水性阴离子交换剂Capto adhere的柱，然后用下降梯度的50mM Hepes(pH 7.0)洗脱。在样品施加后，残余的PEG流过该柱并且因此被清除。在梯度下洗脱IgG。洗脱出的IgG中的宿主蛋白质污染小于1ppm。这个实施例突出了本文中所公开的方法能够在仅仅两个分级分离步骤中实现对被调节IgG的异常高程度的抗体纯化。将理解本文中所公开的方法实现所述低水平的宿主蛋白质污染的能力使得许多所述2步程序可行。
实施例6.除了在IgG即将再溶解之前以2％的体积比引入Dowex AGlx2形式的疏水性的正电性多孔粒子之外，重复实施例3的基本形式。宿主蛋白质污染被降低到21ppm。抗体回收率为90％。在平行实验中，用UNOsphere Q替代Dowex粒子。宿主蛋白质的减少是相同的，但抗体回收率为95％。
实施例7.除了将被净化的细胞上清液的盐浓度升高至1M NaCl之外，重复实施例6的基本形式。以4％v/v的比例加入UNOsphere Q形式的阴离子交换粒子。使50mM Tris、1M NaCl中的PEG-6000至19％PEG的最终浓度以沉淀抗体。通过经由0.22微米非离子性膜过滤来移除上清液。将沉淀物和粒子再悬浮于19％PEG-6000、1M NaCl、50mM Tris(pH 8.0)中，并且再次通过过滤移除上清液。沉淀物和粒子然后再悬浮于19％PEG、50mM Tris(pH 8.0)中，在搅拌下孵育15分钟，然后通过经由相同的过滤器过滤来移除上清液。重复这个洗涤，然后用50mM Tris(pH 8.0)溶解抗体。将再溶解的抗体和正电性粒子轻轻地混合30分钟以提供酸性宿主蛋白质结合到粒子上的机会，然后经由膜过滤抗体溶液，留下粒子。抗体的宿主蛋白质浓度为18ppm。抗体回收率为93％。
实施例8.执行一系列实验，其中在2维矩阵中评估IgG纯化和回收率，所述2维矩阵评估16％、18％、20％和22％的PEG-6000浓度对比0.0、0.5、1.0、1.5和2.0M的NaCl浓度。原材料是通过微滤专门地净化的含IgG的上清液。IgG回收率、纯度和可复现性以及PEG浓度之间的变异在约1M NaCl是最佳的。1.5M NaCl下的纯度是大致相同的，但是回收率下降。0.5M NaCl下的回收率略微更好，但是纯度低于1.0M NaCl下的纯度。在不存在NaCl的情况下和2.0M NaCl下，纯度和回收率都严重下降。
实施例9.纯化IgM的集成方法.通过离心和膜过滤净化含有120mg/L单克隆IgM克隆529的1L细胞培养上清液。这种抗体的等电点为约6.0。加入固体氯化钠以实现25mS/cm的最终电导率。加入1％尿囊素，随后加入0.025％最终浓度的依沙吖啶。通过过滤移除固体。组合相等比例的强阴离子交换粒子(Macroprep High-Q)、带负电的金属亲合性粒子(Chelex-100)和强阳离子交换带电粒子(Macroprep High-S)。将20mL粒子混合物装填入被平衡到大致生理条件的1.6x 10cm柱中，并且样品以200cm/hr的线性流速流过所述柱。经过处理的HER2包含165,663ppm宿主细胞蛋白质污染。在对照实验中，通过用13％PEG-6000沉淀和在25mS/cm的电导率下洗涤来纯化抗体。剩余的宿主蛋白质污染为1383ppm。在平行实验中，通过相同方法但在47mS/cm的电导率下纯化抗体。剩余的宿主蛋白质污染为69ppm。随后用阴离子交换和阳离子交换色谱纯化，这将宿主蛋白质浓度降低到小于3ppm。
实施例10.通过加入1％尿囊素然后加入0.025％依沙吖啶来调节包含275,357ppm宿主细胞蛋白质、5283ppm DNA和13.96％聚集体的含IgG的细胞培养采集物，然后混合15分钟。MacroPrep High Q、MacroPrep High S、MacropreptButyl和Chelex-100(Bio-Rad Laboratories)的均等混合物预先通过用50mMHEPES、100mM NaCl(pH 7.0)洗涤来平衡。将经平衡的混合粒子以2％(V：V)的量加入不纯的IgG制剂，然后在4-8℃过夜混合。通过微滤移除固体。将1.25mg包被有淀粉的200nm磁性粒子加入到20mL被调节的不纯的IgG制剂中。在涡旋混合器上在500rpm下混合的同时，逐渐加入20ml的36％PEG-6000于1.6M NaCl、50mM HEPES(pH 7.0)中的溶液，以产生18％PEG-6000和0.8M NaCl的最终浓度。涡旋混合继续30分钟，然后用磁性方式收集负载有IgG的粒子。用新鲜的50mM HEPES、0.8M NaCl(pH 7.0)洗涤负载有IgG的粒子，并且移除洗涤溶液。移除洗涤缓冲液并且以相同方式再次洗涤粒子。移除洗涤缓冲液，并且将抗体再溶解于50mM HEPES、1M NaCl(pH 7)中。1mL柱装填有正电性疏水性色谱介质(Gapto adhere，GE Healthcare)并且被平衡到相同条件。将溶解的IgG施加于柱上，其中结合的IgG和一些污染物被认为已经结合，同时残余PEG也结合。然后施加含有平衡缓冲液的5倍柱体积的洗涤溶液以更彻底地从系统上移除未结合的组分。用以50 mM HEPES、300 mM NaCl(pH 7.0)结束的10倍柱体积的线性梯度洗脱IgG。以下表格说明纯化性能，其中post-con表示调节后，post-NP表示纳米粒子后，并且post-CA表示Captoadhere后。回收率中左侧的值表示该步骤的回收率，而右侧的值表示先前步骤加该步骤的累积回收率。bld表示检测极限以下。更多细节请参考Gagnon等人,2014,上述：
实施例11.通过加入1％尿囊素、4％正电性金属亲合性粒子(TREN 40 high,Bio-Works)调节含有176,244 ppm宿主蛋白质污染物和19％聚集体的含IgG的细胞培养采集物，在室温下混合4小时。被移除的用于分析的样品显示宿主蛋白质被减少到90,259ppm并且聚集体被减少到1.2％。将pH降低到5.2，加入0.5％辛酸，并且将混合物孵育2小时。被移除的用于分析的样品显示宿主蛋白质为1,758ppm并且聚集体为约0.4％。经由正电性深层过滤器(Sartorius PCI)移除固体。宿主蛋白质被减少到135ppm并且聚集体被减少到小于0.05％。通过在pH 7.0的18％PEG-6000中沉淀来纯化抗体。然后用1.8M硫酸铵洗涤沉淀物以移除PEG，然后将抗体再溶解于50mM Hepes(pH 7.0)中。宿主蛋白质被减少到32ppm。在50mM Tris(pH 8.0)下在施加于以空隙排阻模式工作的阴离子交换色谱柱(UNOsphere Q,Bio-Rad)之后，宿主蛋白质被减少到小于1ppm。不同之处仅在于PEG沉淀在800mM NaCl的存在下进行的平行实验将宿主蛋白质减少到小于1ppm。阴离子交换步骤将宿主蛋白质和聚集体减少到无法检测的水平。R.Nian等人(J.Chromatogr.A 1282(2013)127-132)描述了空隙排阻模式下的阴离子交换色谱法。
实施例12.通过加入1％尿囊素和0.025％依沙吖啶调节含有286,010ppm宿主蛋白质污染物和23％聚集体的含IgG的细胞培养采集物，并且在室温搅拌下孵育1小时。混合1:1:1粒子混合物(Chelex-100、MacroPrep tButyl、MacroprepHigh Q，Bio-Rad)，将其平衡到生理条件，并且将沉降的混合粒子以5％的合并量加入到采集物中，然后在室温下混合2小时。宿主蛋白质被减少到43,058ppm并且聚集体被减少到3.4％。在以pH 8.0执行的一系列实验中，通过在独立实验中用PEG-6000沉淀来分级分离样品，在所述独立实验中的浓度为600mM、800mM、900mM和1000mM(1M)。随后在PEG、50mM Tris(pH 8.0)中洗涤沉淀物，此后将抗体再溶解于50mM Tris(pH 8.0)中。该系列中的宿主蛋白质被分别减少到51、55、45和41ppm。以5％v/v的量将Dowex AG 1X2(Bio-Rad)形式的阴离子交换粒子加入到每个样品中，并且混合60分钟。该系列中的宿主蛋白质被减少到16、17、15和13ppm。执行另一系列的实验，除了初始PEG沉淀在pH 7.0下进行之外，所有其它细节都相同。PEG步骤之后的宿主蛋白质在600mM NaCl浓度下为44ppm，在800mM浓度下为43ppm，在900mM浓度下为29ppm，并且在1000mM浓度下为31ppm。在Dowex处理之后，宿主蛋白质分别被减少到20、17、12和16ppm。
实施例13.通过加入1％尿囊素和0.025％依沙吖啶调节含有286,010ppm宿主蛋白质污染物和23％聚集体的含IgG的细胞培养采集物，并且在室温搅拌下孵育1小时。混合粒子的1:1:1：1混合物(Chelex-100，MacroPrep tButyl，MacroPrepHigh Q，购自Bio-Rad)与正电性金属亲合性粒子(TREN 40high，购自Bio-Works)，将其平衡到生理条件，并且将沉降的混合粒子以5％的合并量加入到采集物中，然后在室温下混合2小时。宿主蛋白质被减少到38,061ppm并且聚集体被减少到1.4％。在以pH 8.0执行的一系列实验中，通过在独立实验中用PEG-6000沉淀来分级分离样品，在所述独立实验中NaCl的浓度为600mM、800mM、900mM和1000mM(1M)。随后在PEG、50mM Tris(pH 8.0)中洗涤沉淀物，此后将抗体再溶解于50mM Tris(pH 8.0)中。宿主蛋白质分别被减少到79、69、56和57ppm。以5％v/v的量将Dowex AG1X2(Bio-Rad)形式的阴离子交换粒子加入到每个样品中，并且混合60分钟。该系列中的宿主蛋白质被减少到18、17、16和13ppm。执行另一系列的实验，除了初始PEG沉淀在pH 7.0下进行之外，所有其它细节都相同。PEG步骤之后的宿主蛋白质在600mM NaCl浓度下为94ppm，在800mM浓度下为62ppm，在900mM浓度下为67ppm，并且在1000mM浓度下为46ppm。在Dowex处理之后，宿主蛋白质分别被减少到28、9、23和17ppm。
实施例14.通过加入1％尿囊素、0.025％依沙吖啶和产生25mS/cm的电导率的NaCl调节含有321,483ppm宿主蛋白质和26％聚集体的含IgM的细胞培养采集物。将混合物孵育1小时，通过离心移除固体，并且使液体流过填充有相等比例的MacroPrep Tbutyl、Macroprep High Q、Macroprep High S和Chelex 100的柱，其中柱与采集物的体积比为5％。宿主蛋白质被减少到73,663ppm并且聚集体被减少到0.8％。在平行但独立的实验中分级分离样品，这两个独立实验使用pH 7的13％PEG-6000，但一个实验使用100mM NaCl，另一个实验使用800mM NaCl。然后用13％PEG、50mM Hepes(pH 7.0)洗涤沉淀物以移除过量的盐，然后将IgM再溶解于50mM Hepes(pH 7.0)中。100mM NaCl下的宿主蛋白质被减少到7,411ppm。800mM NaCl下的宿主蛋白质被减少到417ppm。聚集体含量增加到1.1％。将样品施加到处于pH 7.0下的阴离子交换块体(CIM QA，BIA Separations)并且用氯化钠梯度洗脱。对应于100mM NaCl下的PEG沉淀的样品中的宿主蛋白质被减少到1,424ppm。对应于800mM NaCl下的PEG沉淀的样品中的宿主蛋白质被减少到63ppm。两种制剂中的聚集体都小于0.01％。
实施例15.通过辛酸沉淀结合用功能化粒子处理以及随后在800mM NaCl下的PEG沉淀来移除污染物。将不同量的辛酸加入到通过离心净化的细胞培养采集物中，分别达到0.1％、0.2％、0.3％、0.4％和0.5％的最终浓度。将尿囊素加入到每个样品中达到1％的最终浓度。既不调节pH也不调节盐浓度。0.4％辛酸下的最终pH为5.4。搅拌混合物2小时。通过使样品穿过0.22μm微量过滤器移除固体。然后使滤液通过含有多孔粒子的等比例混合物的柱，所述多孔粒子携带有TREN、亚氨基二乙酸和丁基配体(分别是购自BioWorks的WORKBEADSTMTREN 40High、购自Bio-Rad的Chelex-100和购自Bio-Rad的Macro-Prep T-butyl)，其中粒子的合并体积为所施加的样品体积的5％。宿主细胞蛋白质被从采集物中最初的IgG的242,888ppm减少到0.1％辛酸下的233,318ppm；0.2％下的193,400ppm；0.3％下的57,519ppm；0.4％下的38,602ppm；和0.5％下的42,666ppm。包括游离的轻链和轻链二聚体的IgG片段被从采集物中的12.2％减少到0.3％辛酸下的5.3％；0.4％下的3.4％；和0.5％辛酸下的3.6％。在0.1和0.2％辛酸下没有片段减少。聚集体被从采集物中的1.28％减少到0.1％辛酸下的1.22％、0.2％辛酸下的0.87％、0.3％辛酸下的0.31％，并且在0.4和0.5％辛酸下无法检测到(小于0.05％)。辛酸浓度下的IgG回收率为在0.1％辛酸下的99％、0.2％下的99％、0.3％下的95％、0.4％下的99％和0.5％下的95％。在用多孔粒子的混合物处理之后，在用0.4％辛酸处理的样品中的宿主蛋白质被减少到4205ppm，表示减少了98％，并且得到纯度大于99％的抗体，其含有1％片段和无法测量到的聚集体，总体IgG回收率为99％。通过用聚乙二醇(PEG-6000)沉淀来进一步纯化抗体，所述沉淀在20.5％PEG、800mM NaCl、50mM Hepes(pH 7.0)下进行。在用0.4％辛酸处理的采集物经过PEG沉淀之后，宿主蛋白质被减少到11ppm，聚集体被减少到0.09％，并且轻链片段无法检测到。在用0.5％辛酸处理的采集物经过PEG沉淀之后，宿主蛋白质被减少到13ppm，聚集体被减少到0.1％，并且轻链片段无法检测到。这两个结果都对应于99.9995％的宿主蛋白质减少。在其中没有用本发明的方法处理采集物的平行对照实验中，PEG沉淀将宿主蛋白质减少到67,687ppm。由所公开的方法提供的超过6,000倍的改良说明了两个独特的优点。明显的优点是通过本发明的方法减少宿主蛋白质污染允许后续方法实现宿主蛋白质污染的更多减少。其还突出了以下优点，即所公开的方法尤其移除干扰纯化方法自身实现其最佳结果的能力的污染物。
本发明的实施方案可以与其它纯化方法组合以实现更高程度的纯化。所述其它纯化方法的实例包括但不限于通常用于纯化IgG的其它方法，例如蛋白质A和其它形式的亲和性色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、疏水性相互作用色谱、固定化金属亲和性色谱和另外的混合模式色谱方法，以及沉淀、结晶和液液萃取的方法。所属领域的普通技术人员有能力设计用于各种方法的适当条件并且将它们与本文中所公开的方法整合以实现对特定抗体的必需纯化。
本文中引用的所有参考文献都以全文引用的方式并入以用于所有目的，其引用的程度就如同每个单独公开案或专利或专利申请具体地和单独地被指示成以全文引用的方式并入以用于所有目的一般。如果通过引用并入的公开案和专利或专利申请与本说明书中包括的公开内容相矛盾，那么本说明书应当代替和/或优先于任何所述矛盾的内容。
在本说明书和权利要求中使用的表示成分数量、色谱条件等的所有数字都被理解为在所有情况下都由术语“约”修饰。因此，除非相反地指示，否则在本说明书和随附权利要求中阐述的数字参数是约数，其可以根据想要通过本文中所公开的方法获得的期望性能而变化。
本文中所公开的方法可以作出许多修改和变化而不会脱离其精神和范围，这对于所属领域的技术人员将是显而易见的。本文中所描述的具体实施方案是仅仅以实例的方式提供的并且不打算以任何方式构成限制。本说明书和实例应该被理解成仅仅是示例性的，其中所公开的实施方案的真实范围和精神由下列权利要求指定。

Claims (24)

1.一种用于从蛋白质制剂纯化期望蛋白质的方法，其包括：
通过用可溶性有机多价离子、固定化有机多价离子或两者处理，任选地在过饱和尿囊素的存在下处理，由此来调节所述蛋白质制剂，从而移除至少90％的染色质，然后
(1)在大于生理浓度的非蛋白质沉淀盐的存在下用非离子性有机聚合物沉淀所述期望蛋白质以提供所述期望蛋白质的沉淀物；或
(2)在不存在大于生理浓度的非沉淀盐的情况下用非离子性有机聚合物沉淀所述期望蛋白质以提供沉淀物，随后在大于生理浓度的非蛋白质沉淀盐的存在下用非离子性有机聚合物洗涤所述沉淀物；
其中所述沉淀或洗涤步骤任选地在大体上不存在蛋白质沉淀盐的情况下和任选地在没有将所述期望蛋白质的pH调节到所述期望蛋白质的等电点的0.5个pH单位以内的值的情况下进行；和
任选地在不存在非离子性有机聚合物的情况下用蛋白质沉淀盐洗涤所述沉淀物，其中所述沉淀盐以足够保持所述期望蛋白质处于沉淀状态的浓度存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其中用有机多价离子调节所述蛋白质制剂包括使样品与正电性有机添加剂接触。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述正电性有机添加剂是选自由以下各项组成的可溶性阳离子群组中的一种或多种：亚甲蓝、依沙吖啶、氯己定、苯扎氯铵、十六浣基三甲基溴化铵。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述正电性有机添加剂是选自由因固定在固体表面上而不可溶的阳离子组成的群组中的一种或多种，所述阳离子包括伯氨基、仲氨基、叔氨基、季氨基、含有超过一个由一种或多种类型的氨基所赋予的正电荷的配阳离子。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述正电性有机添加剂是固定在固体上的2(氨乙基)胺(TREN)。
6.根据权利要求1所述的方法，其中用有机多价阳离子调节所述蛋白质制剂包括使样品与负电性有机添加剂接触。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述负电性有机添加剂是选自由庚酸、辛酸、辛烯酸、壬酸、壬烯酸、癸酸、甲基蓝组成的可溶性阴离子群组中的一种或多种。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述负电性有机添加剂是选自由因固定在固体表面上而不可溶的阴离子组成的群组中的一种或多种，所述阴离子包括二氧磷基、羧基、磺基、含有超过一个由一种或多种类型的带负电基团所赋予的负电荷的配阴离子。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述负电性有机添加剂是亚氨基二乙酸、氮川乙酸或两者的组合。
10.根据权利要求2或6所述的方法，其中负电性有机添加剂或正电性有机添加剂对金属离子具有1:1亲合性。
11.根据权利要求1所述的方法，其中如果包含尿囊素，则尿囊素以过饱和浓度存在，所述过饱和浓度在选自由0.6到50％、0.7到20％、0.8到10％、0.9到5％、1到2％或中间值组成的群组的范围。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述非离子性有机聚合物是聚乙二醇(PEG)。
13.根据权利要求1所述的方法，其中聚合物尺寸在选自由1000到12,000道尔顿(D)、2000到8,000D、3000到6000D或中间尺寸组成的群组的范围，所述中间尺寸例如为选自由1500D、3500D、4000D、6000D组成的群组的一个尺寸。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述非蛋白质沉淀盐包括选自由以下各项组成的群组的一项：乙酸钠、乙酸钾、氯化钠、氯化钾和其组合。
15.根据权利要求1所述的方法，其中将量足以使加入所述非离子性有机聚合物之后的盐浓度比生理浓度高出在约至少0.05M到约2.0M范围的增量的所述非蛋白质沉淀盐加入到经过调节的细胞培养采集物中。
16.根据权利要求1所述的方法，其中在加入所述非离子性有机聚合物的同时，将非蛋白质沉淀盐的单个盐或非蛋白质沉淀盐的组合加入到细胞培养采集物中以将总盐浓度升到高于正常的生理盐含量，并且维持过量的非蛋白质沉淀盐。
17.根据权利要求1所述的方法，其中在加入所述非离子性有机聚合物的同时，将所述非蛋白质沉淀盐加入到蛋白质制剂中，使得最终盐浓度比正常生理浓度高出至少0.05M的增量。
18.根据权利要求1所述的方法，其中加入所述非蛋白质沉淀盐以使得所述蛋白质制剂的净盐浓度高于正常生理值，在选自由200mM到2M、300mM到1.5M、400mM到1M、500mM到800mM或中间值组成的群组的范围。
19.根据权利要求1所述的方法，其中在洗涤溶液中包含至少0.2M浓度的所述非沉淀盐以维持在所述沉淀物中已经存在的过量。
20.根据权利要求1所述的方法，其中当初始沉淀步骤中不存在所述非沉淀盐时，其被包括在至少一个洗涤步骤中。
21.根据权利要求1所述的方法，其中可以用一种或多种浓度足以维持所述期望蛋白质处于沉淀状态的沉淀盐洗涤沉淀物。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述沉淀盐选自由以下各项组成的群组：硫酸钠、硫酸钾、硫酸铵、磷酸钠、磷酸钾、磷酸铵、柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸铵和其组合。
23.根据权利要求1所述的方法，其中所述期望蛋白质是天然存在的蛋白质、重组蛋白、抗体、单克隆抗体、IgG抗体或IgM抗体。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述制剂是体液、奶、血浆、血清或细胞培养采集物。
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