CN105457335A - 多孔性吸附介质，含有该介质的吸附装置和层析系统 - Google Patents

多孔性吸附介质，含有该介质的吸附装置和层析系统 Download PDF

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Abstract

本申请涉及多孔性吸附介质、含有该介质的吸附装置和层析系统，其中介质为表面涂布有聚合物例如聚烯丙胺的膜。得到的膜表现出与蛋白质杂质较强的结合并且比常规的基于季铵盐的配体例如三甲基铵配体更好地从生物样品中除去主题细胞蛋白质。本申请还描述了层析系统和用于纯化单克隆抗体的方法，其中阴离子吸附器放置在亲合柱(例如蛋白质A或蛋白质G亲合柱)的下游，以及任选一种或多种抛光装置，例如阳离子交换柱。阳离子交换器池(或亲合柱交换池，其中不使用阳离子交换器)极少或没有稀释对降低样品的传导性是必要的。这种吸附器甚至在高的传导和pH下也具有对生物样品中的宿主细胞蛋白质和其它杂质强力结合的良好功能。

Description

多孔性吸附介质，含有该介质的吸附装置和层析系统
本申请为一项发明专利申请的分案申请，其母案的申请日为2008年8月14日、申请号为200810171406.0、发明名称为“多孔性吸附介质，含有该介质的吸附装置和层析系统”。
本申请优先权为2007年8月14日提交的U.S.临时申请系列no.60/964653和2008年3月25日提交的U.S.临时申请系列no.61/070708，其通过参考文献并入本申请。
背景技术
本申请涉及基于聚合性伯胺的阴离子交换层析介质，包括那种介质的阴离子吸附器，以及包括这种吸附器的层析系统。吸收指的是通过渗透到吸附材料的体内吸收物质。吸附指的是分子从体相运动到吸附介质的表面上。吸附作用是包括吸附和吸收的总称。同样的，这里的吸附材料或吸附装置表示吸附器，指的是吸附或吸收、或者吸附和吸收的材料或装置。这种介质特别应用为用于流通模块的多孔性膜吸附器以及更特别的不含单独外室的模块。
强的阴离子交换器，例如那些基于季铵盐的阴离子交换器，作为抛光介质用于下游过程以捕获带负电荷的大型杂质，例如内毒素、病毒、核酸和宿主细胞蛋白质(HCP)，它们存在于流体例如生物流体，特别是人造生物治疗剂的溶液中。习惯上，阴离子交换器以小球的形式提供和使用，例如从GEHealthcareBio-sciencesAB商购获得的Q但是小球基系统的生产量限制需要大体积的柱子以便有效的捕获杂质。
在小球基的层析中，大部分可用于吸附的表面积在小球的内部。因此，由于传质速率典型的被孔隙扩散所控制，分离过程实质上很缓慢。为了使这种扩散抵抗性最小化且伴随着最大化的动态结合容量，可以使用小直径的小球。但是，小直径小球的使用在提高了价格的同时使柱压下降。因此，制备层析分离的最优化通常包括在效率/动态容量(小型小球易出现)和柱压下降(大型小球易出现)之间折衷。
相反，膜基层析系统(还称为膜吸附器)具有直接与对流膜孔隙相连的配体，由此消除了传质上内部孔隙扩散的影响。此外，与有效的流动分配器结合使用的具有致密的孔隙尺寸分布的微孔膜基质的使用可以使轴向分散最小化，并提供所有活性位点的均一利用。因此，膜吸附器介质的传质速率会比标准的小球基层析介质高一个数量级，这便允许了高的效率和高通量分离。由于单一的或甚至堆叠的膜与用小球基介质堆积的柱子相比是非常薄的，发现沿着层析床的压力降减小了，从而使得流动速率和生产率增加。通过使用具有足够内表面积的膜，生产具有非常大的直径与长度比(d/h)外形的装置来达到必要的结合容量。
设计合适的膜吸附器具有比标准预制的小球基树脂好10-100倍的层析效率。因此，为了在膜吸附器上获得相同水平的分离，可以使用打10次折以下的床高。对于膜吸附器来说，与10-30cm床高的小球基系统相比，1-5mm的床长是标准的。由于大体积的膜吸附器要求极端的柱形比例，装置的设计是关键性的。为了保持与膜吸附器相关联的内在行为的优势，要求适当的进口和出口分配器以高效地且有效地利用获得的膜体积。膜吸附器技术理想的适用于这一应用。但是现在的膜吸附器有各种各样的缺点，包括低的结合强度，在去除病毒、内毒素和核酸方面所表现出的难度。
当后者流动通过它的孔隙时，高多孔性的、介质相互连接的膜吸附器具有除去(吸附和/或吸收)一些溶液组分的能力。膜吸附器的这种性质和它在必需的应用中表现良好的能力取决于介质(骨架)的孔隙结构以及暴露于溶液中的表面的性质。典型的，首先由不溶于水或在水中溶胀的聚合物形成多孔性介质，且其具有可接受的机械性质。多孔性介质优选为通过现有技术公知的相分离方法制备的多孔性膜片。参见，例如ZemanLJ,ZydneyAL,Microfiltrationand Ultrafiltration:PrinciplesandApplications,NewYork:MarcelDekker,1996。中空纤维和管状膜也是可接受的骨架。通常要求分离处理步骤以改性形成的多孔性结构的外部或正面表面以及内部孔隙表面以便赋予其必要的吸附特性。因为膜结构经常由疏水性聚合物形成，表面改性步骤的另一个目的在于使表面成为亲水性的或水可润湿的。
这里存在着大量的改性膜的外部或正面表面以及内部孔隙表面的方法。那些本领域的技术人员将会容易的认识到具有代表性的方法，包括吸附、等离子氧化、原位自由基聚合、接枝和涂布。这些方法的大多数都导致在膜的表面上相成类似单层的结构，这在大多数时候获得了使其亲水的目标，但是却不能赋予其可接受的吸附特性，例如对于被吸附物的高容量。这一容量定义为可以被给定的介质体积保留的被吸附物的量(重量)。既然吸附发生在膜的表面，这一容量将会受到膜表面积的限制。由于它们的特性，微孔膜与层析小球相比具有较低的表面积。一种增加其表面积的方法为降低孔隙尺寸，这明显的导致失去大量的通量。例如，不考虑表面相互作用的类型，在0.65μm聚乙烯膜(EntegrisCorp,BillericaMA)上蛋白质吸附的最大值(单层)为大约20mg/ml。这远远少于例如琼脂糖层析小球，其典型的容量为大约80mg/ml。
推动吸附的表面相互作用的类型是通过其中所使用的给定的膜吸附器产品的特定应用定义的。现在，存在着从单克隆抗体(MABs)的溶液中除去病毒、核酸、内毒素和宿主细胞蛋白质(HCPs)的高容量、高亲合力吸附器的需要。这些杂质倾向于具有比MABs更低的等电点，这就意味着在某一pH值下它们将会是负电性的而MAB降是正电性的。要求用阴离子交换器，即承载正电荷并且吸引阴离子的介质除去这些杂质。许多化学成分在水溶液中都带有正电荷，包括伯、仲和叔胺以及季铵盐。这些胺在pH值低于11时都是正电性的，而季铵盐在所有pH值下都带有正电荷，因此这些基团通常分别被称为弱的或强的阴离子交换器。
阴离子交换器具有多个吸引并保留多种杂质和污染物的正电性结合位点。可以潜在除去的杂质的量是膜上这些结合位点浓度的函数，且由于配体的化学特性(以及这些配体的浓度)决定了其对不同杂质的结合强度。高强度的结合是对提高杂质，例如宿主细胞蛋白质，去除的关键性贡献。结合强度(SB)涉及洗脱结合的杂质所需要的溶液离子强度。膜吸附器的SB(用传导单元衡量，mS/cm)按照如下方法测定。首先，使少量的被吸附物的溶液通过膜吸附器以使被吸附物结合在膜吸附器上。第二，用增加梯度的无机盐，例如氯化钠，洗脱膜吸附器。记录需要将被吸附物洗脱掉的洗脱溶液的最小传导性并将其定义为膜吸附器的SB。通过增加吸附器的结合强度，可以使负电性杂质不可逆转的结合在膜吸附器上，由此显著的提高了去除的功效。这对于从抗体流中除去宿主细胞蛋白质的弱结合种群是特别重要的。
常规的流通阴离子交换器典型地含有负责吸引和结合负电性杂质，却排斥正电性产物分子的季铵盐配体。常识要求为了通过电荷的相互作用较强地与杂质结合，强的阴离子交换器即在所有pH值都具有正电荷的阴离子交换器是必要的。而本发明证明了其它的方式。本发明发现聚合性伯胺，优选为具有共价连接在聚合物主链上的伯胺的脂肪族聚合物、更优选具有通过至少一个脂肪族基团共价连接在聚合物主链上的伯胺，优选为亚甲基基团，较强的与除去电负性杂质的物质结合并且因此是优选的用于在膜吸附器的表面形成吸附性水凝胶的材料种类。
单克隆抗体作为治疗和诊断试剂持续具有重要性。用于候选mABs的筛选杂种细胞库的方法既耗时又费工。一旦表示出合适mABs的杂种细胞链建立起来，就必须发展纯化方法学以制备足够的用于进一步表征的mAB。用于纯化的传统的方法包括使用蛋白质A或蛋白质G亲合层析。使纯化的抗体除盐并在生物缓冲液中使用透析交换。如果多重mABs平行的进行评价，全部的过程典型的需要几天来完成并且特别麻烦。
U.S.专利No.6090288教导了含有用于多肽和核酸分离的层析介质的氨基基团的制备。其揭示了与强的阴离子交换配体相比，从弱阴离子交换配体中洗脱蛋白质需要更高的离子强度。公开的分离介质的重要的结构特征在于“在距离氨基氮2到3个原子处存在羟基基团或伯、仲或叔胺基团”。在这里，例如，我们指出纯聚烯丙胺聚合物的松散交联涂层并不需要任何促进与蛋白质更高强度结合的额外基团。
U.S.专利No.5304638教导了使用包含载有众多聚胺基团的水不溶性基体的分离蛋白质的方法。其中一个实施例展示了制备聚烯丙胺改性的琼脂糖层析凝胶。但是5304638发明没有认识到使用伯胺与使用仲胺和叔胺相比的重要性。没有与控制涂层厚度以最优化吸附作用相关的或与用于稳定交联涂层相关的努力或描述。他们强调优选的氮原子对之间的碳原子数不超过3个。他们介绍了一个基于聚胺基团的结构和pH计算的经验函数Q，且其具有优选的至少1.5的值。在聚烯丙胺中，相邻最近的氮原子之间有5个碳原子，且用于它的Q函数应当接近0.1。
U.S.专利No.5547576教导了制备一种具有固定聚胺涂层并且可以用于从水溶液中除去病毒的多孔性膜。涂层的制备包括首先在膜的表面接枝自由基，并且然后使自由基与聚胺化合物反应。由于内在的复杂性，接枝改性经常是不切实际的：它们对自由基接枝的特别的基质敏感，并且在制造环境中实施起来是昂贵的。这种方法还受到5304638中讨论的结构性缺点的损害。
所有这三项专利，6090288、5304638和5547576都没有认识到控制聚胺涂层的厚度或聚合物在那种涂层中的交联度的重要性。所有它们都依赖于含胺的化合物与共价固定在表面上的反应性基团的化学反应，通过接枝或直接反应。在任何这些过程的最后，实质上受到单层型含胺涂层的限制。这些膜的高吸附性容量仅仅可以通过增加表面积获得，正如用琼脂糖层析小球的情况。本发明教导了通过在膜表面建立相对厚的松散交联的聚合性层而获得高吸附性容量，一种从根本上与所有那些现有技术教导的不同的方法。
因此，期望提供介质和包括这种介质的流通阴离子交换器，它提供与病毒的强力结合并且不会受到现有技术缺点的损害。当将其放置在亲合层析柱的下游，任选在一个或多个用阳离子交换柱进行的跑过步骤之后时，这种交换器特别用于使用层析系统纯化来自细胞培养介质的单克隆抗体。
发明内容
本发明克服了现有技术中的问题，本发明提供了介质和装置，例如包括该介质的阴离子交换器，其中介质为具有表面涂布有聚合物，例如聚烯丙胺(polyallylamine)，的膜。得到的膜出人意料的提供了比常规的基于季铵盐、包括三甲基铵配体更强的结合蛋白质杂质的能力以及更突出的从生物样品中去除宿主细胞蛋白质的能力。
本发明描述了一种显著提高微孔膜的吸附容量的方法。代替在类似单层方式中改性膜的表面，用松散交联的水凝胶涂布整个外部和内部孔隙表面，这种水凝胶的湿(溶胀)厚度为大约50-100nm，这足以容纳好几层蛋白质分子。因此，微孔膜的吸附容量从大约20mg/ml增加到80-100mg/ml。推动吸附的相互作用的类型通过使用给定的膜吸附器产品的特定应用来定义的。现在存在从单克隆抗体(MABs)的溶液中除去病毒、核酸、内毒素和宿主细胞蛋白质(HCPs)的高容量、高亲合力吸附器的需要。许多化学成分在水溶液中带有正电荷，包括伯、仲和叔胺，以及季铵盐。胺在pH值低于11时是正电性的，而铵盐在所有pH值下都带有正电荷，因此这些基团分别称为弱或强阴离子交换器。本发明发现聚合性伯胺，优选具有共价连接在聚合物主链上的伯胺的脂肪族聚合物，更优选其具有通过至少一个脂肪族基团、优选为亚甲基基团共价连接在聚合物的主链上，与电负性杂质强力地结合，并且因此是优选地用于在膜吸附器的表面形成吸附性水凝胶的材料种类。
本发明还描述了一种层析系统和用于纯化单克隆抗体的方法，其中阴离子交换吸附器放置在亲合柱(例如蛋白质A或蛋白质G亲合柱)和任选一种或几种抛光装置例如阳离子交换柱或恰好是阳离子交换柱的下游。考虑到所述阴离子交换吸附器中介质的特性，极少稀释或不稀释阳离子交换池(或不使用阳离子交换器的亲合柱交换池)对于降低样品的传导率是必要的，这是因为本发明的吸附器介质可以在较高的离子强度下运行。吸附器与生物样品中的宿主细胞蛋白质和其它电负性的杂质甚至在传导率接近15mS/cm以及相对高pH值下也具有良好的强结合功能。
正如前面所讨论的，因为与小球基吸附器的扩散流动相比的膜吸附器的对流，本发明获得了相对高的装置渗透性而没有损失结合容量。
附图说明
图1A为1mm的用PAH与0.5％的PEG-DGE交联制备的膜吸附器柱的水通量和BSA容量的曲线图；
图1B为1mm的用9wt％的PAH与PEG-DGE交联制备的膜吸附器柱的水通量和BSA容量的曲线图；
图2为加速板寿命测试中不含碱形式和氨基磺酸离子形式的膜吸附器的BSA容量的曲线图。
具体实施方式
本发明涉及一种具有多孔性、在多孔上形成的聚合性涂层以及自我支撑基质的多孔性层析或吸附介质，一种包括这种介质的阴离子交换器，包括这种吸附器的纯化系统以及纯化方法。这种介质特别适合用于以整体良好的存在于下游纯化过程中的方式从人造生物治疗剂例如单克隆抗体中强有力地除去低水平的杂质。典型的杂质包括DNA、内毒素、HCP和病毒。这种介质在高盐浓度和高传导率(高亲合性)下有良好的作用，甚至在这种条件下也能有效地除去病毒。其获得了高结合容量而不损害装置的渗透性。实际上，取决于通过这里描述的方法制备的涂层的性质，获得了大于5mg/ml，或者大于25mg/ml，或者大于大约35-40mg/ml的核酸的结合容量。由于承载于吸附器介质上的高稀释样品不再是必要的，阴离子交换吸附器的量远远小于相对比的小球基方法的量。
多孔性基质具有与基质的几何或物理结构相关的两个表面。片层具有顶部和底部表面，或者是第一和第二表面。这些通常称为“侧”。在使用中，流体将会从一侧(表面)流动通过另一侧(表面)。对于中空纤维和管状膜，其具有内侧和外侧表面。流动从内侧到外侧进行，或者反之亦然，这取决于设计和用途。
两个表面之间的厚度层(thickness)的维度是多孔的。这种多孔性区域具有与孔隙相关的表面积。为了防止与“表面”“表面”或“表面积”或类似的用语混淆，在本发明中几何表面指的是如外部或正表面或侧面。与孔隙相关的表面积指的是内部或多孔表面积。
多孔性材料含有孔，其为空洞的空间，以及制成材料的物理装置的固体基体或骨架。例如，在无纺网中，任意取向的纤维制成基体并且赋予网以其自身的形式。在聚合物微孔膜中，相分离聚合物提供了基体。在这里，发明人讨论了涂刷或覆盖介质的表面。通过这一方法，发明人意在涂刷内表面和外表面，以致于不会完全堵塞孔隙，即保留了大部分用于对流的结构，特别的，对于内表面积，涂刷或覆盖意味着涂刷或覆盖基体，而留下大部分的孔隙敞开着。
吸附作用指的是通过渗透到吸附材料的体内吸收物质。吸附作用指的是分子从体相运动到吸附介质的表面上。吸附作用是包括吸附和吸收的总称。同样的，这里的吸附材料或吸附装置表示吸附器，指的是吸附或吸收、或者吸附和吸收的材料或装置。
多孔性基质充当着用于吸附性水凝胶的支撑骨架。这种基质应当服从于处理和制造成强有力的和完整的装置。孔隙结构应当提供均匀的流动分布、高通量和高表面积。基质可以是纤维、片层例如纺织织物、无纺织物、纸、毡或膜。优选地，基质为由织物或无纺织物或膜形成的片层。
纤维可以是任何长度、直径并且可以是中空的或固态的。作为基质它们并不结合在一起(虽然在应用涂刷后它们可以形成单一的结构)，而是单独离散的实体。它们可以是连续长度的形式例如不确定长度的线或单丝，或者通过切细纤维状材料例如无纺织物或纺织织物而制备形成较短的单独纤维，将连续长度的纤维切断成单独的段，通过结晶生长方法或类似的方法形成。
无纺织物是直接由分离的纤维通过使纤维或细丝采用热或化学缠绕结合在一起制成的平整的、多孔性片层。典型的，无纺织物制造者提供具有1到500微米平均流动孔隙(MFP)等级的介质。对于无纺织物，多孔性结构是缠绕的纤维，且多孔性指的是纤维之间或之中曲折的空间。优选的无纺织物为Lowell,Mass.的FreudenbergNonwovensNA，其型号为FO2463。
纺织织物通过经线纤维和纬线纤维以规则的方式或编织样式在一些相互之间预先确定的角度编织制成。典型的纬线与经线之间的角度为大约90度。其它通常使用的角度包括但不限于30、45、60和75度。织物的完整性通过由纺织过程导致的纤维机械互锁来保持。织物(织物符合复杂表面的能力)、织物的表面光洁度和稳定性主要通过编织样式控制，例如平纹、斜纹、缎纹、篮形织物、纱罗织物等。在这种情况中，基质的孔隙度为织物之间的空间且其很少有曲折的性质。
基质还可以有多种材料形成，包括玻璃、塑料、陶瓷和金属。
硼硅酸盐玻璃是合适的玻璃的一个实例。它可以形成纤维或玻璃纸。
也可以使用基于更常规的硅酸盐化学或特别的化学例如钇、锆、钛以及类似物和它们的共混物的多种陶瓷。它们可以形成纤维、纸、毡、单块或膜。
金属例如不锈钢、镍、铜、铁或其它磁性金属和合金，钯、钨、铂以及类似物可能制备成多种形式，包括纤维、烧结片和结构，例如烧结的不锈钢或镍过滤器、织物筛和无纺纸、织物和毡，例如不锈钢棉。
优选的基质由合成的或天然的聚合材料制成。热塑性塑料是用于这个用途的聚合物种类。热塑性塑料包括但不限于聚烯烃，例如聚乙烯、包括超高分子量聚乙烯，聚丙烯，包层聚乙烯/聚丙烯纤维，PVDF，聚砜，聚醚砜，聚芳基砜，聚苯基砜，聚氯乙烯，聚酯例如聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯以及类似物，聚酰胺，丙烯酸酯例如聚甲基丙烯酸酯，苯乙烯类聚合物和上述物质的混合物。其它合成材料包括纤维素、环氧化物、氨基甲酸酯和类似物。
合适的基质包括微孔滤膜，即那些具有大约0.1到大约10μm孔隙尺寸的滤膜。基质材料可以是亲水性的或疏水性的。亲水基质材料的实例包括但不限于多糖和聚酰胺，以及表面处理的亲水多孔性膜，例如(MilliporeCorporation,BillericaMA)。疏水材料的实例包括但不限于聚烯烃，聚偏二氟乙烯，聚四氟乙烯，聚砜，聚碳酸酯，聚酯，聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯。通过那些任何本领域技术人员已知的方法由基质材料形成多孔性结构，例如溶液相转变，温度诱导相分离，空气流延，痕迹蚀刻，拉伸，烧结，激光钻孔等。由于本发明通用的性质，事实上任何可利用的形成多孔性结构的方法都适用于制备用于膜吸附器的支撑骨架。已经发现由超高分子量聚乙烯制成的基质材料是有用的，这是因为它的机械性质，化学、腐蚀和γ稳定性的联合。
涂层聚合物形成吸附性水凝胶并带有负责吸引并保留杂质的化学基团(结合基团)。可选择的，涂层聚合物含有易于改性而并入结合基团的化学基团。涂层能渗透过生物分子，因此在涂层的深处能够捕获蛋白质和其它杂质，提高吸附容量。优选的涂层聚合物为聚合性伯胺。合适的聚合性伯胺的实例包括聚烯丙胺，聚乙烯胺，聚丁基胺，聚赖氨酸，它们相互之间和与其它聚合物的共聚物，以及它们相应的质子化形式。发现由聚烯丙胺(和/或它的质子化形式，例如烟酸聚烯丙胺(PAH))制成的涂层是特别有用的。PAA是商购获得的(NittoBoseki)，其数均分子量通常在1000到150000的范围内，且所有这些均可用于形成膜吸附器。PAA和PAH易于溶于水。PAA水溶液的pH值为大约10-12，而PAH的为3-5。PAA和PAH可以相互替换使用，但是必须监控最后的溶液的pH值，且如果必要的话，将pH值调节为大于10以至于非质子化的氨基基团可用于与交联剂反应。
涂层典型的由涂刷基质的总体积的至少大约3％组成，优选为基质总体积的大约5％到大约10％。在某个实施方案中，涂层基本以均一的厚度覆盖在基质上。干燥涂层合适的厚度范围为大约10nm到大约50nm。
交联剂与聚合物反应使得后者不溶于水并因此保留在支撑骨架的表面上。合适的交联剂为与涂层聚合物反应的二官能的或多官能的分子，且可溶解在选取的溶剂中，其优选为水。最值得注意的与伯胺反应的广泛种类的化学成分为环氧化物，氯、溴和碘烷，羧酸酐和卤化物，醛，α,β-不饱和酯，腈，酰胺和酮。优选的交联剂为聚乙二醇二缩水甘油醚(PEG-DGE)。它易于溶于水，提供快速且有效的交联，以及亲水性的、中性的、无毒的和易于获得的。用于涂层溶液的交联剂的量为基于聚合物和交联剂上的反应性基团的摩尔比。优选的比例在大约10到大约1000的范围内，更优选为大约20到大约200，最优选为大约30到大约100。更多的交联剂将会妨碍水凝胶溶胀的能力并且将会因此降低吸附容量，而更少的交联剂将会导致不完全的交联，即剩余一些完全可溶的聚合物分子。
表面活性剂可用于帮助使聚合物溶液均匀的分散在支撑结构的全部表面上。优选的表面活性剂为非离子的、水溶性的和碱性稳定的。氟表面活性剂具有显著的降低水表面张力的能力。这些表面活性剂有E.I.duPontdeNemous和Company以Zonyl为商品名称出售的物质，且特别合适的有例如ZonylFSN和ZonylFSH。其它可接受的表面活性剂的种类为乙氧基辛基苯酚，DowChemicalCompany以商品名称TritonX出售的物质。也可以使用那些本领域的技术人员所熟知的其它表面活性剂。用于涂层溶液中的表面活性剂的浓度通常为降低溶液的表面张力以避免反润湿所需要的最小量。反润湿定义为初始分散后液体在表面上的自发成滴。在形成膜吸附器期间反润湿是高度不期望的事情，其有时候导致不润湿的产物并降低吸附容量。所需要的表面活性剂的量可以常规的通过测量用与多孔性骨架相同的材料制成的平坦表面上制成的液滴的接触角测定。动力推进和后退接触角是特别有益的，它们分别作为加入液滴或从液滴中取回的液体而测量。如果将溶液调控到具有0°的后退接触角可以避免反润湿。
易于吸附在疏水表面的少量亲水聚合物可以任选作为分散助剂加入到溶液中。聚乙烯醇是优选的聚合物且可以以溶液总体积的大约0.05wt.％到大约5wt.％范围内的浓度使用。
当支撑的多孔性结构不能容易的用聚合物溶液润湿，例如在疏水微孔膜的情况中，可以将润湿助剂加入到溶液中。润湿助剂可以是任何与涂层聚合物溶液相容的有机溶剂，它对交联反应没有负面的影响。典型的这种溶剂为低级脂肪醇的一种，但是也可以使用丙酮，四氢呋喃，乙腈和其它与水易混溶的溶剂。加入的有机溶剂的量为用涂层溶液立刻润湿多孔性基质所需要的最小量。润湿助剂的实例包括甲醇、乙醇和异丙醇。
涂刷的方法可以通过涂层溶液改进网的润湿。涂层溶液以控制的方式强行进入网中以便均匀的浸透网并且不会剩余疏水性斑点或区域。为了使溶液通过应用挤出的压力进入网，这可以通过例如从缝隙压网或非常接近网处而将溶液挤出实现。本领域的技术人员能够确定制备均匀涂层所需要的压力、速度和几何形状的条件。
优选的用于形成涂刷的基质的方法包含的步骤为：1)制备溶液；2)将溶液应用于膜上；从基质的外表面除去过量的液体；3)干燥膜；4)固化膜；5)冲洗并干燥膜；6)任选使最后的膜韧化；以及7)任选酸处理膜。更特别的，将溶液制备成含有合适的聚合物和交联剂。这两个组分的浓度决定着沉积涂层的厚度和溶胀度，这反过来限定了通过膜的通量和它的吸附容量，如下所示。聚合物和交联剂溶解在合适的溶剂中，优选为水。溶液可以任选含有其它成分，例如润湿助剂、分散助剂和pH调节剂。如果使用疏水介质，溶液的表面张力必须低到足够润湿它。聚合物水溶液典型的不会润湿疏水微孔膜，因此必须将有机溶剂(润湿助剂)加入到溶液中。为了帮助涂层均匀的分散在疏水膜的表面上，可以将表面活性剂加入溶液中。最后，取决于交联剂的化学特性，需要升高pH值以便实现交联反应。溶液组分和典型的浓度范围列于表1中：
表1
组分 功能 范围，wt.％
聚合性伯胺 水凝胶形成的吸附聚合物 3-15
交联剂 影响水凝胶的形成 0.01-2.0
表面活性剂 用于使涂层平坦的表面活性剂 0-3.0
亲水聚合物 表面亲水化 0-1.0％
有机溶剂 用涂层溶液初始润湿疏水性膜 0-30
无机碱 升高pH值以影响交联 0-5.0
水 溶剂 平衡
将涂层溶液应用于基质上，例如通过将基质浸没在溶液中，从溶液中移走基质并机械地从基质的两侧除去多余的溶液，例如使用一对压送辊(压挤出)。然后干燥孔隙充满溶液的多孔性基质。干燥可以在室温下通过蒸发或者可以通过应用加热(大约40-110℃的温度范围)进行。涂刷后的基质干燥后，将其保持几小时到几天的一段时间以便交联剂可以充分的与聚合物反应。交联可以任选通过应用热加速进行。之后用大量的溶剂冲洗基质并再次干燥。额外任选的步骤包括在升高的温度下(60-120℃)韧化干燥的膜吸附器以调节它的流动性质并用浓度为0.1M到1M的强非离子化一价酸处理它使存在于涂层中的氨基质子化。
当聚合物是PAA时，在对膜加热处理之后将聚合物中所有的氨基基本转化为相应的铵盐将有助于保证产物的坚固性。良好的水润湿性是重要的。由于基础材料是非常疏水的且亲水性涂层是非常松散交联的并且其并不是于基体共价相连的，因此一些侧面的PAA凝胶的皱缩将会导致使膜变得不能用水润湿。另一方面，如果基本上PAA的所有氨基都转化为相应的铵盐，干燥涂层增加的体积、由反离子产生的更大的水保持力以及对于带电聚合物的水的更强的亲合力将会有助于使膜更加水可润湿。为避免PAA离子交联，为了这个目的应使用强的、无毒的、非氧化酸，优选为一价的这种酸来使PAA质子化。合适的酸包括盐酸，氢溴酸，甲磺酸，氨基磺酸，三氯乙酸和三氟乙酸。虽然氯化物可以是选择的反离子，因为它已经存在于样品蛋白质溶液中，对于连续的过程来说使用盐酸和/或它的盐是不现实的，这是因为它对钢的腐蚀性以及其所包括的职业安全问题。因此更合适的酸为氨基甲酸(H2N-SO2OH)，其优选作为PAA的质子化试剂。
合适的用于质子化PAA的方法为将膜浸没在0.1-0.5M质子酸的溶液中，优选为水中的氨基磺酸(或者是水/醇混合物以便充分渗透难以润湿的膜)，之后冲洗和干燥。得到的膜将会带有可以容易的通过使用单一条件的实验方案交换掉的氨基磺酸反离子，例如0.5M的氢氧化钠，之后是0.5M的氯化钠。
这种酸处理改进了膜的保存期限稳定性，并且还导致显著更高的结合强度。虽然本发明并不局限于任何特殊的理论，但是可以相信的是当PAA在完全质子化(酸处理的)的状态被干燥时，它表现出更大范围的、“开放”的形态，其具有更好地包封BSA的能力，并且由此在达到更高的离子强度之前不会将其释放出来。酸处理膜的进一步的益处是对于离子化辐射具有更大的稳定性，例如公知的用于筛选产物灭菌过程的γ辐射。
定义成功的膜吸附器产品有三个关键的参数。它们是：吸附容量、通量和结合强度。而结合强度很大程度上是由存在于膜吸附器表面上的基团的特性所决定的，容量和通量通常对用于形成吸附层的过程以及聚合物和交联剂的量更加敏感。经常可以观察到对于给定的支撑骨架化合物、纯化效率(由床高所决定)和膜吸附器的化学特性，更高的通量可以转化为更小的吸附容量，且反之亦然。
图1A和1B显示了观察到的根据本发明制备的膜吸附器的典型的倾向。从这些图中可以看出，通量和容量之间的平衡是明显的。可以看出PAH和交联剂对膜吸附器的这些关键性质都有着直接的影响。为了在应用中满意的运行，良好的膜吸附器应该具有高通量和高容量。膜吸附器的通量通常可以用层析单位CV/min/psi表达，其中CV为柱体积。给定柱体积的通量明显取决于通常最优化有效分离的柱高度。在阴离子交换膜吸附器的情况中，有效的柱高可以通过实现除去(LRV4.0)99.99％的电负性病毒，例如MMV所需要的最小高度定义。发现对于本发明的膜吸附器来说这一柱高为大约0.5mm。为了更加确保清除掉病毒，贯穿本发明常规使用双倍高度(1mm)的柱子。具有这一柱高的膜吸附器期望的通量应该为至少2.0CV/min/psi或更多，更优选为2.5CV/min/psi或更多。获得合适的通量与容量的结合是格外困难的。本发明人必须显著的超出常规实验或关注最优化以获得突出的膜吸附器的性质。例如，明智的将交联剂选择为高度挠性的、聚合性分子证明其对该吸附容量是非常有益的。使用中等分子量的PAA(15000)允许获得流动和容量之间的平衡。用于调节pH值的无机碱为非盐析类的，因此更高浓度的PAA可用于获得高容量。表面活性剂的选择由确认所需的非离子性的、对腐蚀稳定的化合物控制，而发现所需的表面活性剂的量在一项单独的研究中。相反，根据未审定的申请US2005/0211615制备的PAA膜吸附器对于1mm柱来说仅有0.5CV/min/psi的通量，而BSA容量仅为大约61mg/ml。
本发明另一个重要的方面为吸附器膜固化、冲洗和干燥后所使用的后处理过程。发明人发现用酸对基于聚合性伯胺的膜吸附器进行处理显著的增加了结合强度、润湿性和对于离子化辐射的稳定性。
发明人的一个非常令人惊奇的发现为酸处理显著的增加了膜吸附器的结合强度，从大约54-58mS/cm增加为78-82mS/cm。可以假设当PAA在完全质子化(酸处理的)的状态被干燥时，它表现出更大范围的能够更好的包封BSA的“开放”形态，并且由此直到较高的离子强度时才会释放它。这一益处是非计划中的和令人惊奇的，但是由于较高的SB通常转化为更易去除的痕量杂质，因此这是非常有益的。
交联的PAA膜吸附器的渗透性通过高温“固化”过程加以改进。轻度交联的PAA凝胶具有吸收大量水分的能力，这导致它的体积的数量级增加。这一结果可以导致低的渗透性。看来，凝胶的这种性质可通过使其脱水到一定程度而降低，所述程度是使溶胀降低到了可接受的水平而没有损害凝胶的结合强度和容量。事实上，对产品来说固化过程能够调整膜的渗透性是必要的。合适的固化温度为大约25-120℃，更优选为大约85-100℃，固化大约6到72小时。
γ辐射是广泛接受的用于筛选产物的灭菌过程。γ灭菌能力是期望的膜吸附器的特征。发明人观察到令人惊奇的益处为在实际中酸处理的膜吸附器具有对离子化辐射更好的稳定性。图2表明膜吸附器样品(控制，不用酸处理)和那些转化为氨基磺酸铵样品的BSA容量。所有这些样品都用25kGy的电子束照射以模拟γ灭菌条件。很明显酸处理过的样品比没有用酸处理过的样品更好的保持了它们的性质。
因此当将其防止在Mab纯化层析系统中时，形成的阴离子交换吸附器是特别有用的。例如，包括单克隆抗体的细胞培养液可以用亲合层析法纯化，例如蛋白质A或蛋白质G亲合层析，之后是一种或几种阳离子交换柱。然后来自最后的阳离子交换柱的输出物可以流动通过本发明的阴离子交换柱，通过使这些杂质在适当的条件下与介质结合而用于显著的降低流体中剩余宿主细胞蛋白质、病毒、核酸、内毒素和其它杂质的浓度，从而允许有用的、纯化的产物流动通过交换器。
重要的是，使用快速阴离子交换吸附器的阳离子交换池可以实现进一步的纯化(来自阳离子交换柱的输出物)而没有显著的阳离子交换池的稀释，为了降低盐的浓度(和降低的传导率)以使宿主细胞蛋白质有效的结合，这通常是必要的。实际上，本发明的吸附器甚至在高盐浓度和传导率下仍具有高的结合通量(例如在200mMNaCl中>60g/L的BSA结合)，并且在典型的阳离子交换池条件下允许比常规的吸附器高很多的质量承载量(例如与0.05kg/L相比的3kg/L)，参见以下实施例7。由于快速吸附器在高盐浓度下的高容量，其降低或消除阳离子交换池稀释的能力是显著的优点。
在相对高的盐浓度和相对高的pH值下，本发明的吸附器对病毒还表现出强有力的去除(7.6的pH值以及100mM和150mM的盐浓度下仍得到可接受的病毒的除去)。
本领域的技术人员还意识到，在一些应用中，通过一种或几种阳离子交换柱进行的下游抛光可能是不必要的，且快速阴离子交换吸附器可以放置在亲合柱的下游而在其间不存在中间的阳离子交换柱。类似的，对于一些应用，快速阴离子交换吸附器可以放置在阳离子交换柱的下游而不需要它之前的捕获(亲合)柱。
这里以下包括的实施例用于说明本发明的目的而并不倾向于限制本发明。
实施例1(疏水性UPE上的PAA)
制备含有20wt.％的异丙醇、9wt.％的PAH(分子量15,000)、3wt.％的一水合氢氧化锂、2wt.％的TritonX-100、0.5wt.％的PEG-DGE(分子量526)和0.2wt.％的聚乙烯醇(分子量30,000，98％的水解度)的水溶液。将孔隙尺寸等级为0.65μm的疏水性UPE膜用这一溶液完全润湿，并将过量的液体压挤掉。膜在室温下干燥24小时并用大量的水和甲醇冲洗并且再次干燥。膜很容易地被水润湿并且增加大约25％的重量。用这种膜制造的八层型注射装置具有3.5cm2表面积和1mm柱高。这种装置具有4.3CV/min/psi的流动速率、90mg/ml的BSA容量和54mS/cm的结合强度。
对比实施例1(疏水性UPE上的PAA-GTMAC)
来自实施例1的改性膜通过在pH值13时将其浸没在50wt.％的缩水甘油基三甲基氯化铵(GTMAC)中24小时、用水冲洗并干燥而进一步改性。用这种膜制造的八层型注射装置具有3.5cm2表面积。这种装置具有0.7CV/min/psi的流动速率、80mg/ml的BSA容量和19mS/cm的结合强度。
对比实施例2(氨基磺酸处理)
来自实施例1的改性膜通过将其浸没在0.5M的氨基磺酸水溶液中10分钟、用去离子水冲洗并干燥而进一步改性。用这种膜制造的八层型注射装置具有3.5cm2表面积。这种装置具有4.3CV/min/psi的流动速率、80mg/ml的BSA容量和80mS/cm的结合强度。
对比实施例3
制备含有11.6wt.％的PAH(分子量75,000)、18.6wt.％的1.0N的氢氧化钠溶液、11.6wt.％的氯化钠、23.2wt.％的17％的表氯醇改性的聚乙烯胺水溶液的水溶液。将孔隙尺寸等级为0.65μm的疏水性UPE膜用甲醇预润湿并直接与该溶液接触5分钟。将湿膜放置在聚乙烯膜袋中并将膜袋放置在85℃的烘箱中7分钟，小心不要使膜干透以便引发交联反应。然后将湿膜从袋中移出并允许在室温下干燥。之后将干燥的膜放置在100℃的烘箱中4小时以完成交联反应。然后用水、甲醇和盐酸(1.0N)彻底洗涤膜并允许在室温下干燥。膜并不用水润湿。用这种膜制造的八层型注射装置具有3.5cm2表面积。这种装置具有0.5CV/min/psi的流动速率、61mg/ml的BSA容量和81mS/cm的结合强度。
实施例2(亲水性UPE上的PAA)
制备含有10wt.％的PAA(分子量15,000)和0.5wt.％的PEG-DGE(分子量526)的水溶液。将孔隙尺寸等级为0.65μm的亲水性UPE膜用这一溶液完全润湿，并将过量的液体压挤掉。膜在室温下干燥24小时，用大量的水冲洗并且再次干燥。八层装置具有4.3CV/min/psi的流动速率、80mg/ml的BSA容量和49mS/cm的结合强度。
实施例3(亲水性UPE上的聚乙烯基胺)
制备含有20wt.％的异丙醇、7wt.％的聚乙烯基胺(Lupamin9095，BASFCorp.,MountOlive,NJ)和0.5wt.％的PEG-DGE(分子量526)的水溶液。将孔隙尺寸等级为0.65μm的亲水性UPE膜用这一溶液完全润湿，并将过量的液体压挤掉。膜在室温下干燥24小时并用大量的水和甲醇冲洗并且再次干燥。用这种膜制造的八层装置具有3.5cm2表面积。这种装置具有3.1CV/min/psi的流动速率、87mg/ml的BSA容量和32mS/cm的结合强度。
实施例4(疏水性UPE上的聚赖氨酸)
制备含有20wt.％的异丙醇、4wt.％的聚赖氨酸氢溴化物(分子量30,000-50,000)、4wt.％的一水合氢氧化锂、1wt.％的TritonX-100、0.25wt.％的PEG-DGE(分子量526)和0.1wt.％的聚乙烯醇(分子量30000，98％的水解度)的水溶液。将孔隙尺寸等级为0.65μm的疏水性UPE膜用这一溶液完全润湿，并将过量的液体压挤掉。膜在室温下干燥24小时并用大量的水和甲醇冲洗并且再次干燥。膜并没有用水润湿并且具有大约9％的重量增加。用这种膜制造的八层装置具有3.5cm2表面积。这种装置具有7.1CV/min/psi的流动速率、34mg/ml的BSA容量和32mS/cm的结合强度。
实施例5(活性琼脂糖小球上的PAA)
用PAA改性琼脂糖层析小球。将2g的环氧琼脂糖6B(GEHealthcare)悬浮在8ml的Milli-Q水中，向其中加入10ml10％的PAA(分子量3,000)溶液。用氢氧化钠将pH值调节为11。将小球轻轻的振荡24小时，用水小心的冲洗并在使用前在冰箱中湿态储存。用改性的小球堆积层析柱(柱高5.5cm，柱体积1.88mL)并测试。其具有20.6mg/ml的BSA容量和83mS/cm的BS。
对比实施例4(活性琼脂糖小球上的PAA-GTMAC)
将来自实施例5的PAA改性的琼脂糖小球与2％的GTMAC溶液在pH值11下反应过夜而进一步改性。用水小心的冲洗小球并在使用前在冰箱中湿态储存。用改性的小球堆积层析柱(柱高4.7cm，柱体积1.61mL)并测试。其具有87.3mg/ml的BSA容量和25.4mS/cm的BS。
实施例6
将来自实施例1的具有锚定的PAA的膜密封在8层注射装置中并测试病毒保留率。以下表2中的数据表明增加盐浓度对MMV和MuLV保留率的影响。如表所示，PallMustang膜(20mS/cm的结合强度)的MMV数据表明LRV随着传导率的升高而降低，而对于本发明的膜(即高结合强度)甚至在升高的盐浓度下仍可以观察到完全的除去。
此外，PAA膜的HCP除去能力显著的优于季铵盐化学(PAA-GTMAC，根据对比实施例1制造)，参见表3。对于表3中的数据，控制因素为GEAmersham出售的具有中等结合强度(即大约30mS/cm)的CaptoQ。值得注意的是由于单克隆抗体对功能化膜(即有效的抵抗来自膜表面产物的阴离子交换性质)的非特异性结合，这些LRV的获得没有明显的产物损失。
表2A作为盐浓度参数的病毒的去除(X-MuLV)
表2B作为盐浓度和pH参数的病毒的去除(MMV)
表3从三种不同的单克隆抗体中去除HCP
实施例7
在控制涂刷机器上用9％的PAA和0.5％的PEG-DGE涂刷0.65μm的UPE膜。对膜进行萃取，并在85℃下在对流烘箱中干燥10分钟。将一个样品在85℃下放置12小时，另一个样品在室温下储存。然后用5％的氨基磺酸在5％的异丙醇中处理膜以稳定涂层。然后用通量测试仪测量膜的渗透性。在这个测试中，在真空下(27.0"Hg)测量500ml的水通过膜样品(交叉部分面积9.6sq.cm)所花费的时间。制造表1所列出的膜组，以证明作为固化步骤结果的渗透性的改进。从表4看出，“未固化的”膜比“固化的”膜具有值得注意的更高的流动时间(表明降低了渗透性)。
从表5中可以看出，固化步骤可用于按照期望控制膜的渗透性和容量。所有的膜都具有在60-75mS之间的BSA结合强度。
表4：固化的和未固化的膜流动时间对比
表5：用于膜吸附器的处理条件
实施例8
在控制涂刷机器上用9％的PAA和0.35％的PEG-DGE涂刷0.65μm的UPE膜辊。用水和甲醇对膜进行萃取，并在热空气冲击干燥器中于120℃下干燥。然后使辊子在如下表所示的不同温度和时间下固化。然后用5％的氨基磺酸在5％的异丙醇中处理膜以稳定涂层。然后用通量测试仪根据前面的实施例描述的方法测量膜的渗透性。
如下表所示，50s级别上的流动时间可以通过将膜在大大高于90℃的温度下加热12小时或更长的时间而获得。在期望的具有较低渗透性(在100s级别上的较高的流动时间)的膜的情况中，可以将温度限制到低于85℃并缩短加热时间(<10h)。

Claims (27)

1.一种多孔性吸附介质，其含有具有第一外侧和第二外侧，所述两侧均为多孔的，以及二者之间的多孔厚度层的基质，所述基质具有基本覆盖于基质的固体基体和所述第一和第二外侧表面上的吸附材料，所述吸附材料含有与伯胺基团相连的交联聚合物。
2.权利要求1的多孔性吸附介质，其中所述交联聚合物以能够有效地通过所述介质的1mm层高产生至少2.0CV/min/psi的流动、在200mM的NaCl中大约60g/L的BSA结合的结合容量的量存在。
3.权利要求2的多孔性吸附介质，其中所述交联聚合物以能够有效地通过所述介质产生至少2.5CV/min/psi的流动的量存在。
4.权利要求1的多孔性介质，其中所述基质含有微孔膜。
5.权利要求4的多孔性介质，其中所述膜含有聚烯烃。
6.权利要求5的多孔性介质，其中所述聚烯烃为聚乙烯。
7.权利要求1的多孔性介质，其中所述基质为超高分子量聚乙烯膜。
8.权利要求1的多孔性介质，其中所述交联聚合物含有聚烯丙胺或质子化的聚烯丙胺。
9.权利要求1的多孔性介质，其中所述交联聚合物包含含有聚烯丙胺或质子化的聚烯丙胺的共聚物或嵌段共聚物。
10.权利要求1的多孔性介质，其具有高于5mg/ml的核酸结合能力。
11.权利要求10的多孔性介质，其中所述核酸为DNA。
12.一种阴离子交换器，其包含含有用于吸附的多孔性涂布介质的外罩，所述介质含有具有第一外侧和第二外侧，所述两侧均为多孔的，以及二者之间的多孔厚度层的基质，所述基质具有基本覆盖于基质的固体基体和所述第一和第二外侧表面上的吸附材料，所述吸附材料含有与伯胺基团相连的交联聚合物。
13.权利要求12的阴离子交换器，其中所述基质为UPE膜。
14.权利要求12的阴离子交换器，其中所述交联聚合性伯胺聚合物含有聚烯丙胺或质子化的聚烯丙胺。
15.一种用于纯化生物溶液的系统，其包含亲合层析分离器，至少一个阳离子交换器和所述阳离子交换器下游的阴离子交换器，所述阴离子交换器含有包含多孔性基质和在所述多孔性基质表面上的多孔性涂层的多孔性涂布介质，所述涂层含有一种或多种交联聚合性伯胺或它们的共聚物。
16.权利要求15的系统，其中所述介质是带正电的。
17.权利要求15的系统，其中所述亲合层析分离器含有蛋白质A亲合柱。
18.一种纯化含有抗体和杂质的生物样品的方法，所述方法包括：通过使所述样品经受亲合层析而纯化所述生物样品；之后通过使所述样品承载于含有包含多孔性基质和在所述多孔性基质表面上的多孔性涂层的多孔性涂布介质的阴离子交换介质上进一步纯化所述样品，所述涂层含有一种或多种交联聚合性伯胺或它们的共聚物；以及收集进一步纯化的样品。
19.一种纯化含有抗体和杂质的生物样品的方法，所述方法包括：通过使所述样品经受阳离子交换层析而纯化所述生物样品；之后通过使所述样品承载于含有包含多孔性基质和在所述多孔性基质表面上的多孔性涂层的多孔性涂布介质的阴离子交换介质上进一步纯化所述样品，所述涂层含有一种或多种交联聚合性伯胺或它们的共聚物；以及收集进一步纯化的样品。
20.权利要求18的方法，进一步包括在所述亲合层析步骤之后并将所述样品承载于所述阴离子交换介质之上进行阳离子交换。
21.权利要求18的方法，其中所述生物样品为细胞培养基。
22.权利要求18的方法，其中所述进一步纯化的样品收集在所述阴离子交换器的溢流道(flow-through)中。
23.一种制造吸附器膜的方法，包括提供一种具有第一外侧和第二外层，所述两侧均为多孔的，以及二者之间的多孔厚度层的基质，所述基质和所述第一和第二外侧的表面覆盖有含有与伯胺基团相连的交联聚合物的吸附材料；将得到的基质加热到大约25℃到大约120℃的温度。
24.权利要求23的方法，其中所述温度为大约85℃到大约100℃。
25.权利要求23的方法，进一步包括用酸处理得到的膜，并使酸处理的膜经受γ射线。
26.权利要求25的方法，其中所述酸选自由盐酸、氢溴酸、氨基磺酸、甲磺酸、三氯乙酸和三氟乙酸组成的组。
27.权利要求25的方法，其中所述酸为氨基磺酸。
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