JPH02180899A - 免疫グロブリンの精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【産業上の利用分野】

本発明は、硫酸アンモニウム等の塩析により分画される
抗体画分からの免疫グロブリンの単離精製法に関する。 ［従来の技術］ 従来、試料中より抗体を精製する方法とじてはいくつか
知られている１例えば、トランスフェリン、アルブミン
等の夾雑タンパク質及び脂質等が混在する腹水や血清の
試料においては、硫酸アンモニウム等の塩を用いた塩析
に・よりタンパク質両分を分別沈殿し、タンパク質の溶
解度の差を利用しである程度の部分精製を行なうことが
できる６通常、５０％飽和硫酸アンモニウム水溶液によ
りほぼ１０口％の抗体が回収され、夾雑タンパク質もあ
る程度除去できる。さらに高純度の抗体を得るために、
非特異的抗体精製法や特異的抗体精製法による精製が行
なわれる。非特異的抗体精製法としては、上記の抗体画
分を低塩濃度の緩衝液に透析しジエチルアミノエチル（
以下、ＤＥＡＥと言う）基を有する親水性樹脂あるいは
プロティン八を固定した樹脂を用いて抗体をクロマトグ
ラフィーで精製する方法がある。また、特異的抗体精製
法としては、不溶性の支持体に固定化された抗原に抗体
を特異的にかつ可逆的に吸着させた後、ジオキサン等の
有機溶媒、エチレングリコール、カオトロピック・イオ
ン等で疎水的相互作用を減少させることにより、あるい
は尿素、塩酸グアニジン等の変性剤により抗体を抗原か
ら遊離させ溶出する方法がある。 後者の特異的抗体精製法は、大量に抗体を得ようとする
際に使用するにはコストの面で問題があるので、通常前
者の非特異的な精製法が用いられる。中でもプロティン
Ａによる精製では、プロティンＡ固定化カラムが高価な
ために一度に多量の抗体を処理することが龍しく、ＤＥ
ＡＥ基によるイオン交換クロマトグラフィーを用いた精
製が一般的である。しかし、このような方法は免疫グロ
ブリンＧクラスの抗体の精製には有効であるが、免疫グ
ロブリンＭ（以下、ＩｇＭと言う）のように真性グロブ
リンの性質を有するものは一般にイオン強度の低いＭ街
液では不可逆的な沈殿を生ずるので、ＤＥＡＥによるイ
オン交喚クロマトグラフィーを比較的高塩濃度のｗｉ街
液で透析した後に開始する必要があり夾雑クンバク質の
除去が困難である。また、その際に塩濃度グラジェント
をかけて溶出を行なうと、溶出されるピークがブロード
になるという欠点がある。 ［発明が解決しようとする問題点］ 従って１本発明の目的は、ＤＥＡＥ基を有する陰イオン
交換体を用いるクロマトグラフィーにおいて、効率良く
高純度に免疫グロブリンを精製する方法を提供すること
である。

【問題点を解決するための手段】

本発明者らは、ＤＥＡＥ基を有する陥イオン交換クロマ
トグラフィーによる免疫グロブリンの精製法に関して鋭
意研究の結果、特定の塩濃度を有する溶出液を段階的に
用いて免疫グロブリンを含む試料を溶出することにより
、高純度に免疫グロブリンを精製することができること
を見出し。 この発明を完成した。 すなわち１本発明はジエチルアミノエチル基を有する陰
イオン交換体を用いたクロマトグラフィーにより免疫グ
ロブリンを精製する方法において、免疫グロブリンを含
む試料を上記陰イオン交換体と接触させた後、１００腸
賛ないし　１３０　ｓ＋ＭのＮａＣｌを含む第１の＃Ｓ
Ｓ液液溶出し５次いで第１の＆１衝液よりも高濃度で、
かつ１６０禦賛以下のＮａＣｌを含む第２の緩衝液で免
疫グロブリンを溶出することを特徴とする免疫グロブリ
ンの精製方法を提供する。 ［発明の詳細な説明］ 本発明の方法に用いられるジエチルアミノエチル基（以
下ＤＥＡＥと言う）を有する陰イオン交換体は、従来よ
り免疫グロブリンの精製に用いられているいずれのＤＥ
ＡＥ−陰イオン交換体をも用いることができ、好ましい
ものの具体例として、アガロースゲルにＤＥＡＥが結合
したもの（例えばＤＥＡＥ−セファロース（ファルマシ
ア社製）及びデキストランにＤＥＡＥを結合したもの〔
例えばＤＥＡＥ−セファデックス（ファルマシア社製）
）を挙げることができる。イオン交喚容量は特に限定さ
れないが１通常、　０．１　＊ｅｑ／−トゲルないし０
．３■ｅｑ／膳ｌ・ゲル程度である。 本発明の方法では、上記したＤＥＡＥ−陰イオン交換体
と、免疫グロブリンを含む試料とを接触させる。これは
１通常、カラムクロマトグラフィーの手法、すなわち、
ＤＥＡＥ−ｍイオン交換体をカラムに詰め、試料液又は
試料希釈液をカラムに注ぐことによって行なわれる。試
料を接触させる前に陰イオン交換体を後述する第１の緩
衝液で平衡化しておくことが好ましい。 次いで、陰イオン交換体に吸着された物質を溶出する。 この溶出は、先ず、　１００　ｍＭないし１３０ｍＭの
ＮａＣｌ，好ましくは約１００　ｓ＋ＭのＮａＣｌを含
む第１の緩衝液で溶出し、Ｗｊ出ピークが終った後、第
１の＊　１７　Ｍよりも高濃度で１６０−Ｍ以下、好ま
しくは１４０−鯖ないし１６０腸賛、さらに好ましくは
約１５０　ｍＭのＮ！Ｉｃ　Ｌを含む第２のｊｉｌｌｉ
液で免疫グロブリンを溶出することによって行なう、緩
衝液は特に限定されないが、好ましいものの例として、
　２０　＊ＭＴｒｔｓ１１Ｃ１緩街液（ｐＨ８，５１を
挙げることができる。 本発明の方法では、第１の緩衝液による溶出により、免
疫グロブリンを含む試料中に夾雑するクンバク質が溶出
され、第２の１１１１液による溶出により免疫グロブリ
ンが溶出される。 本発明の方法に付される試料は、免疫グロブリンを含む
試料であれば特に限定されないが、血清や腹水等の免疫
グロブリン含有液を硫酸アンモニウム等により分画され
た抗体の部分精製品から免疫グロブリンな単離精製する
際に特に威力を発揮する。 ［発明の効果］ 本発明の方法によると、免疫グロブリンを簡便な方法で
高純度に精製することができる。後述する実施例で明ら
かになるように１本発明の方法により、免疫グロブリン
をＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一バン
ドになるまで精製することができる。しかも１本発明の
方法は、抗原を用いた特異的抗体精製法よりも作業効率
が高く、従って、免疫グロブリンを高純度にしかも比較
的大量に精製しようとする場合に特に威力を発揮する。 ［実施例］ 以下１本発明を実施例を挙げてさらに具体的に説明する
。ただし、本発明は下記実施例に限定されるものではな
い。 １五！ユ 結腸癌に対するモノクローナル抗体（ＩｇｌＪ）を産生
ずるマウス・バイプリドーマをマウスに移植した。移植
後的ｌＯ８目のマウスから免疫グロブリンを含んだ腹水
的５＋ｓｌを得た。得られた腹水５■ｌに１００％飽和
硫酸アンモニウム水溶液５ｍｌを氷上で撹拌しながら滴
下した０次に、４５００回転で２０分間遠心分雌した後
、上清を除去し沈殿物を得た。 沈殿物はｌｏＯａＭ　ＮａＣｌを含む２０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−１１ＣＩ緩衝液［ｐＨ８，５）　１Ｏｓｔｌを加え
て再び溶解した。さらに、硫酸アンモニウムを除去する
ために同緩衝液にて一晩４℃で透析した。このようにし
て得られた抗体画分の２８０ｎｓにおける吸光度は５．
４１であった。抗体画分５■ｌは、上記緩衝液で平衡化
したＤＥＡＥ−セファロース（ファルマシア社製）のカ
ラム（１，６ｃｍＸ　　ｌｓ、９ｃｓｌにアプライした
。最初に１００ｗＭ　ＮａＣｌを含む２（ｌｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐ）１８．５）で溶出を行なった
。溶出液の２８０ｎ騰における吸光度を見ながら最初の
ピーク（図：ピークｌ）が出終ったところで溶出液を１
５０＠Ｍ　ＮａＣｌを含む２０＋ｍＭ　Ｔｒｉｓ−）Ｉ
ｃＩ＆ｌ衝液１ｐＨ８，５）に損えてさらに溶出を行な
い第２のタンパク質のピークを得た（図１＝ピーク２）
、さらに１０００ｓ１００Ｏｓを含む２０ｍＭ　ＴｒＬ
ｓ−１１ｃＩ緩衝液（ｐＨ１１，ｓｌに換えて溶出し第
３のタンパク質のピークを得た（図：ピーク３）、溶出
パターンの結果を図に示した。ピークｌは夾雑タンパク
質のピーク、ピーク２は免疫グロブリンのピーク。 ピーク３はアルブミンを含む夾雑クンバク質のピークで
ある０分取した各ピークのフラクションについて５ＯＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なった。その結
果、免疫グロブリンの位置に単一バンドが現われた。

【図面の簡単な説明】

図は１本発明の方法により得られたクロマトグラムを示
す図である。 フラクションＮｏ（各３ｍｌ）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ジエチルアミノエチル基を有する陰イオン交換体を用い
   たクロマトグラフィーにより免疫グロブリンを精製する
   方法において、免疫グロブリンを含む試料を上記陰イオ
   ン交換体と接触させた後、１００ｍＭないし１３０ｍＭ
   のＮａＣｌを含む第１の緩衝液で展開し、次いで第１の
   緩衝液よりも高濃度であって、かつ１６０ｍＭ以下のＮ
   ａＣｌを含む第２の緩衝液で免疫グロブリンを溶出する
   ことを特徴とする免疫グロブリンの精製方法。