CN109078505A - 一种含有吸附介质的复合层析过滤膜及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含有吸附介质的复合层析过滤膜及其制备方法和应用，涉及膜层析分离领域，该复合层析过滤膜包括多孔支撑层和复合在多孔支撑层上的过滤膜，多孔支撑层的外侧交联有一层由层析介质构成的功能层，得到的复合层析过滤膜表现比传统的层析介质更快的流速、更高的结合效率、更好的动态载量，优异的再现性，使用方面、成本低、缓冲液用量少。开放式膜孔结构避免了填料的扩散局限性，可以使生物分子通过流体作用直接传送到各个结合点，这意味着在一系列广泛的流速范围和分子范围内，都可以实现高动态结合载量，并形成陡峭的洗脱峰形，该性能是在采用高流速捕获或除去大分子，结合了填料和过滤膜的优点，相比传统层析填料具有显著优势。

Description

一种含有吸附介质的复合层析过滤膜及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物制品分离纯化技术领域，尤其涉及一种含有吸附介质的复合层析过滤膜及其制备方法和应用。

背景技术

大规模、经济的蛋白质纯化日益成为生物技术产业的重要问题，一般而言，通过细胞培养来生产蛋白质，使用通过插入含有感兴趣蛋白质的基因的重组质粒而改装生成的该蛋白质的真核或原核细胞系，由于通常所使用的细胞是活的有机体，因此必须给他们进料含有糖、氨基酸和生产因子的复合生长培养基，将期望的蛋白质与进料给细胞的化合物混合物及与细胞自身的副产物分开至足以用作人治疗经济的纯度提出了艰难的挑战。

用于自细胞碎屑纯化蛋白质的规程首先取决于蛋白质的表达部位，一些蛋白质能自细胞直接分泌。

生物分子，例如包括抗体、核酸、生长因子、激素、多肽及细胞培养基、疫苗、血液制品等生物制品及相关产品，如何经济高效的大规模进行分离纯化生产出合格的产品，对于生物技术和生物制药工业已是越来越重要，一般来说，分离纯化工艺较为复杂，且成本昂贵，同时包含了多种不同的步骤。

现在生物制药在制药领域的地位越来越重要，其通常利用哺乳细胞细胞扩增培养来进行生产单抗隆抗体，一般来说，靶蛋白表达之后，其与一种或多种杂质如宿主细胞蛋白、培养基组分和核酸的分离与纯化提出了艰巨的挑战，如何高效快速地分离用于治疗人的抗体、人和动物疫苗显得尤为重要。

目前使用基于层析介质的珠粒分离纯化各种医用的生物分子，例如单克隆抗体的商业规模纯化，单克隆抗体作为治疗重大疾病和诊断试剂日益受到重视，传统的纯化分离方法包括使用凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、疏水层析等，纯化的抗体被脱盐并使用渗析交换进入生物缓冲剂中，整个过程通常需要若干天来完成，并且如果同时评价多个mAB，耗时将非常长。

层析介质目前制备各种配体结构，其能够以亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析等进行分离纯化，其具有较高孔隙率和较大表面积，提供具有足以用于以生产规模成批处理生物分子的吸附容量的能力，层析介质通常以球形结构出售，使得有效的柱填充剂能够具有最小流量不均匀性，颗粒之间的间隙空间为对流输送通过层析柱提供流道，这样使层析柱能够在高线速率和最小压降下以大的层析柱的形式进行，这些因素的组合使层析树脂能够呈现所需的效率、高渗透性和生物分子大规模纯化所需的充足结合容量，在基于颗粒的层析中，大部分可用的吸附表面积在颗粒内部，因此，由于质量输送速率通常由孔隙扩散控制，所以分离过程固有地缓慢，为将这种扩散阻力减到最小和附带地使动态结合容量最佳化，可以使用小直径的颗粒，但是，使用小直径颗粒往往需要更大的压力来保证流速，这对层析粒料的耐压性提出更高要求，同时增加运行成本，因此，层析分离的优化经常涉及效率/动态容量和压力降之间的折中。

层析介质通常需要非常高的成本，现在市售价格进口的层析填料约需10000元/L，且在大规模生产时需直径很大的层析柱及多套层析装置；为了降低成本，制药生产商通常将层析介质循环使用数百次，这些再生循环每次需要消耗大量的缓冲液，并且各个步骤都需要验证，给制药企业造成严重的经济负担和时间成本。

发明内容

针对上述不足，本发明提供一种含有吸附介质的复合层析过滤膜及其制备方法和应用，解决了层析填料分离速度慢，动态载量低，成本高昂，占地面积大；接枝率低，产品种类少，等问题。这种复合层析过滤膜特别适合用于生物制药下游纯化过程，例如单克隆抗体纯化分离过程中有效去除低含量及成分复杂的杂质，典型的杂质包括DNA、内毒素、HCP和病毒，这种复合吸附膜在高盐浓度和高传导率下都具有良好的表现，同时也能有效地除去病毒，其具有高动态载量且有高效的流速，复合层析膜功能层涂覆于不同层析介质及层析介质的单位含量，制备出的涂层即具有不同的性质，这主要取决于具体的实际应用需求，获得了35mg/ml，或者大于大约50-95mg/ml的动态载量，制备的复合层析过滤膜可以单层多层联合使用，也可以做成例如卷式、折叠式过滤器等组件使用。

本发明所采用的技术方案如下：一种含有吸附介质的复合层析过滤膜，包括多孔支撑层和复合在多孔支撑层上的过滤膜，多孔支撑层的外侧交联有一层由层析介质构成的功能层，所述层析介质为凝胶过滤介质、离子交换介质、亲和层析介质或疏水层析介质。在多孔支撑层表面及其网状孔内部根据实际用途涂覆不同的层析介质后，再对层析介质进行交联，对其进行位置固定，以防其在使用过程中在压力的冲刷下进行洗脱和部分堆积而造成部分堆积，或者出现部分位置无层析介质层，而造成流穿；因此，涂刷复合层析过滤膜的多孔支撑层外表面及其网状孔内部以致于不会堵塞复合层析过滤膜的孔隙，同时根据不同层析介质的粒径大小，多孔支撑层的孔径大于层析介质的粒径，以使其能进入其内部，层析介质的粒径比过滤膜的孔径大三倍及以上，这样既保留了大部分用于对流的结构，又使其在使用中确保功能层的吸附效果，同时过滤膜能确保层析介质不被冲刷；需要说明的是多孔支撑层充当着用于吸附性层析介质的支撑骨架，多孔支撑层的孔隙结构提供均匀的流动分布、高通量和高表面积，多孔支撑层可以是由合成的或天然的聚合材料制成，其主要可以为无纺布、各种织物，材料主要包括聚醚砜、聚砜、聚偏氟乙烯、尼龙、聚丙烯、聚乙烯、改性纤维素、聚四氟乙烯等单种或者上述的混合物，其他也可包括天然纤维素或人工改性后的再生纤维素。

功能层具有吸附性并带有负责吸引并保留杂质的化学基团(结合基团)是可选择的，形成功能层的层析介质含有易于改性而并入结合基团的化学基团，功能层能渗透过生物分子，因此在功能层的深处能够捕获蛋白质和其他杂质，提高吸附容量，层析介质可以为的凝胶层析介质、离子交换层析介质、亲和层析介质、疏水层析介质，其都可以商购获得，所有这些均可用于涂覆在多孔支撑层中形成具有层析介质本身所具备的纯化分离功能的吸附功能层，且都可以选择合适的交联剂对其进行固定。涂覆的层析介质的克重在1-60g/m²，优选为20-30g/m²，复合层析过滤膜的厚度在50-600um，优选150-350um。

作为优选，所述过滤膜为微滤膜、超滤膜、纳滤膜或网状多孔层无纺布；其孔径大小可以是500Da、1000Da、5KDa、10KDa、50KDa、100KDa、300KDa的纳滤膜或者超滤膜，也可以是0.1um、0.22um、0.45um、0.8um、1.2um、3um、5um、8um、10um的微滤膜，也可以是孔径更大的网状多孔层无纺布。所述过滤膜可以是亲水性的或疏水性的，亲水基质材料的实例包括但不限于混合纤维素、聚酰胺以及天然亲水性的纤维素，以及经表面处理后的亲水多孔性膜；疏水材料的包括但不限于聚烯烃、聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯、聚砜、聚醚砜，通过那些任何本领域技术人员已知的方法由基质材料形成多孔性结构，例如溶液相转化等，由于本发明通用的性质，事实上任何可利用的形成多孔性结构的方法都适用于制备用于膜的支撑骨架，已经发现由超高分子量聚乙烯制成的基质材料是有用的，这是因为它的机械性质、化学、腐蚀和γ稳定性都表现的非常优异。

作为优选，所述过滤膜的材质为聚醚砜、聚砜、聚偏氟乙烯、尼龙、聚丙烯、聚乙烯、改性纤维素或聚四氟乙烯。

作为优选，交联剂与层析介质反应使得其不溶于水且位置固定，在压力的作用下不会被移动或冲刷，因此保留在多孔支撑层的骨架表面，选择合适的交联剂为与层析介质的反应的二官能的或多官能的分子，且可溶解在选取的溶剂中，最好为最简单易得，优选为水；交联剂选自环氧氯丙烷、丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟丙酯、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟丙酯、二乙烯基苯、N-羟甲基丙烯酰胺、双丙酮丙烯酰胺、表氯醇、聚乙二醇二缩水甘油醚中的一种或多种按任意比混合，优选的交联剂为表氯醇、聚乙二醇二缩水甘油醚，它们易溶于水，提供快速且有效的交联，以及亲水性的，中性的，无毒的和易于获得，交联剂的量为基于聚合物和交联剂上的反应性基团的摩尔比，优选的比例在大约10到100范围内，更优选在25至50以内，更多的交联剂将会阻碍层析介质的吸附及解析能力，因此降低动态吸附容量，而更少的交联剂将会导致不完全的交联，导致在使用过程中，层析介质在分离压力的作用下被挪移或冲刷。

本发明还提供一种含有吸附介质的复合层析过滤膜的制备方法，该方法包括如下步骤：

(1)将过滤膜热复合在多孔支撑层上，复合后放置于RO水中进行浸泡，使膜孔隙被填满充分，再挤干水分；

(2)将层析介质涂覆在多孔支撑层外侧，形成一层功能层，再放置于交联剂溶液中，使功能层和多孔支撑层进行交联；

(3)交联后，再放置于RO水中漂洗，干燥，获得含有吸附介质的复合层析过滤膜。

本发明还提供了上述的含有吸附介质的复合层析过滤膜在层析系统上的应用。

当由疏水的聚烯烃及含氟聚合物制备的多孔网状过滤膜不容易被水所润湿时，可以先将其用低表面张力的润湿助剂加入到溶液中，润湿助剂可以是任何与聚合物溶液相容的且不能使膜溶解或溶胀的有机溶剂，同时也需要满足它们对层析交联反应时没有负面影响，且在后续水洗中容易去除。

采用涂刷的方法可以使层析介质容易进入多孔支撑层，层析介质溶液能润湿多孔支撑层，层析介质溶液以控制的方式强行进入网中以便均匀的浸透并且不会剩余疏水性斑点或盲区；也可采用一定的压力使含有一定层析介质浓度的溶液通过挤压出的压力进入多孔支撑层，这可以通过例如从缝隙压网或非常接近网处而将溶液挤出实现，本领域的技术人员能够确定制备均匀涂层所需的压力、速度和几何形状的条件。优选的用于形成含有层析介质的具有吸附能力的过滤的实施方法包括：1、制备一定浓度的层析介质溶液，该浓度主要取决于具体的实际应用需求；2、将层析介质溶液涂刷于多孔支撑层上，挤干多余的液体；3、放入含有交联剂溶液中，此溶液能完全润湿复合膜；4、对层析介质在多孔支撑层上进行交联；5、冲洗并干燥膜；将溶液制备成含有合适的聚合物和交联剂，这两个组分的浓度决定这沉积层的厚度和溶胀度，这反过来限定了它的吸附容量，聚合物和交联剂溶解在合适的溶剂中，优选为水，溶液可以任选含有其他成分，例如润湿助剂，分散助剂和pH调节剂，如果使用疏水聚合物制备的微孔滤膜和疏水性多孔支撑层，溶液的表面张力必须低到足够润湿它，聚合物水溶液典型的不会润湿疏水微孔膜，因此必须将有机溶剂加入到溶液中，最后，取决于交联剂的化学特性，需要升高pH值以便实现交联反应。

相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

本发明提供的复合层析过滤膜其在流道上直接交联上层析介质，流道孔隙相连配体，消除了传质上内部孔隙扩散的影响，此外，与有效的流动分配器结合使用的具有致密的孔隙尺寸分布的微孔膜基质的使用可以使轴向分散最小化，并提供所有活性位点的均一利用，因此，膜吸附器介质的传质速率会比标准的小球基层析介质高一个数量级，这便允许了高的效率和高通量分离，由于单一的或甚至堆叠的膜与用小球基基质堆积的柱子相比是非常薄的，发现沿着层析床的压力降减小了，从而使得流动速率和生产率增加，通过使用具有足够内表面积的膜，生产具有非常大的直径与长度比外形的装置来达到必要的结合容量。

本发明提供的膜层析吸附具有远比标准预制的小球基好30-100倍的传统层析分离效率，因此，为了在膜吸附器或装置上获得相同水平或更高的分离效率，可以使用多次折折叠后的床高，对于膜吸附组件而言，与传统的30-60cm的层高，直径2m左右的层析柱系统相比，18层的膜层析叠加的层高就足以达到同样的要求，由于大体积的膜吸附器要求极端的柱形比例，膜层析技术能满足各种应用场景，克服了现在的市面上膜吸附产品各种各样的缺点，包括低的结合强度，在去除病毒、内毒素和核酸等。

当过滤液流动通过复合层析过滤膜时，高多孔性的、介质相互连接的复合层析过滤膜具有除去(吸附和/或吸收)一些溶液组分的能力，复合层析过滤膜的这种性质和它在必须应用中表现良好的能力取决于层析介质的孔隙结构以及过滤膜的孔径，还有与溶液中的分离介质的性质等都有关系；首先由不溶于水的聚合物过滤膜且其具有优异的机械性质，过滤膜通过现有相分离方法制备的多孔网络结构的膜片，通常要求分离膜具有多孔性结构的外部及内部孔隙表面以便赋予其必要的拦截能力，因为膜结构经常由亲水或疏水性聚合物制备而成，对于疏水性聚合物制备的过滤膜，往往需要对其表面进行改性，使其表面成为亲水性或水可润湿性的。

疏水过滤膜采用现有公开的亲水改性方法，其主要包括：吸附、等离子、原位自由基聚合、接枝和涂覆，这些方法的大多数都导致在膜的表面上相成类似单层的结构，这些简单易行的方法，很容易使其表面实现亲水性能，但是一般不能赋予其可接受的吸附特性，对于被吸附物的要求吸附物具有高载量或容量，这一定义为可以被给定的介质体积保留的被吸附物的量，如果吸附发生在过滤膜的表面，这一容量将会受到膜表面积的限制，由于他们的特性，微孔过滤膜与层析小球相比具有较低的表面积，一种增加其表面积的方法为降低孔隙尺寸，这明显的会导致失去过滤膜的通量会大大降低，不考虑表面相互作用的类型，类比实验发现，对于相同的吸附组件(宽和高相同)，在0.8um聚醚砜单层膜上蛋白质吸附的最大值大约26mg/ml，这远远小于20um琼脂糖层析小球，其容量大约为93mg/ml，而本发明通过过滤膜与多孔支撑层复合，且在多孔支撑层上交联所需的层析介质，且可以根据实际应用需交联单位克重的层析介质，既起到了过滤的作用，又能实现层析吸附，这种层析与过滤分步进行且又复合形成具有层析吸附的过滤膜。

增加过滤膜吸附表面载量除了提高其有效的表面积以外，最好的方式应该是与层析介质直接相结合的方式，利用层析微球的超高比表面积，结合微孔滤膜多孔网络结构特点，相互作用所形成的特定的膜吸附过滤产品，能完全满足于从单克隆抗体的溶液中除去病毒、核酸、内毒素和宿主蛋白质的高容量、高亲和力吸附器的需要。

在分离过程中，过滤杂质具有比单抗隆抗体更低的等电点，这就意味着在某一pH值下它们是显负电性的，需要用阴离子层析介质与滤膜复合，利用电荷异性相吸的原理，即承载正电荷的层析介质通过离子吸引而除去这些杂质，现有技术都没有认识到控制聚胺涂层厚度或聚合物在那种涂层中的交联度的重要性，所有他们都依赖于含胺的化合物与共价固定在表面上的反应性基团的化学反应，通过接枝或直接反应，在任何这些过程的最后，实质上受到单层型含胺涂层的限制，这些膜的高吸附性容量仅仅可以通过增加表面积获得，正如琼脂糖层析小球的情况，本发明通过膜表面建立相对的松散交联的聚合性层而获得高吸附性容量。

具体实施方式

以下包括的实施例用于说明本发明的目的而并不倾向于限制本发明。

本发明的优选实施方案中，要进行本文中纯化方法的组合物是由中国仓鼠卵巢重组宿主细胞培养物表达的重组生产的抗体，优选完整抗体，任选的是，所述组合物在膜离子交换层析之前已经进行过最少一个纯化步骤，所述组合物含有感兴趣的抗体和一种或多种污染物，诸如中国仓鼠卵巢蛋白质，浸出的蛋白A核酸，期望抗体的变体，片段、聚集物或衍生物，其他多肽、内毒素、病毒污染物、细胞培养基成分等，可以在膜离子交换层析方法之前，期间、或之后实施的别的纯化规程的例子包括在疏水性相互作用层析上分级分离，乙醇沉淀、热沉淀等，在使用重组技术时，可以在细胞内、在周质空间中生成抗体，或者直接分泌到培养基中，如果在细胞内生成抗体，那么作为第一步，例如通过离心或过滤将重组宿主细胞与细胞培养液分开。

大部分纯化在蛋白A亲和层析期间发生，蛋白A是一种细菌细胞壁蛋白质，其特异性结合抗体的Fc区，当被固定化到层析介质上时，蛋白A提供了一种用于纯化重组蛋白的技术，因为它能选择性结合复杂溶液中的抗体，容许杂质流通，蛋白A亲和柱的基本方案是直截了当的，在大约中性pH结合并在酸性pH洗脱，使用在固定相上固定化的蛋白A来纯化含有C_H2/C_H3区的多肽，固相优选是包含玻璃、硅土或琼脂糖表面来固定化蛋白A的柱，优选地，固相是可控多孔玻璃柱、硅酸柱、或高度交联琼脂糖蛋白A柱的一个例子，有时，所述柱用试剂诸如甘油包被，试图防止对柱的非特异性粘附，用合适的缓冲液平衡用于蛋白A层析的固相在经过平衡的固相上单克隆抗体的生物反应器滴度随细胞培养条件改进而升高，使用传统的柱层析可能难以纯化较大批次的单抗，结合容量增大的新树脂可能不足以消除循环或平行运行多个柱的需要，没有能力有效操作较大的批次可能负面地影响货物成本和工厂容量，另外，生物加工业需要更加方便，划算的工具来降低货物成本，因此能同时降低确认和劳动成本的小型，一次性使用的纯化技术是人们想要的，随着工业进化，离子交换膜可变得对单抗加工更加有利。

虽然柱层析方法是有力的且可靠的，但是他们一般具有较低的质量吞吐，因为分开性能依赖于孔扩散，产物和杂质必须缓慢扩散入孔以达到结合位点，相反，膜不受孔扩散的限制，分开性能不依赖于流速，因此膜能够实现与树脂相比高得多的质量吞吐，膜还比树脂更加方便，因为他们不需要柱体，填充/清空柱、或定性，工业规模膜可以以能在使用一次后处置掉的筒或自我封装形式获得，进一步消除与再次使用和存储有关的确认费用，膜还比树脂填充柱更小且更显著更轻，这便于在制造设备内操作，膜确实具有一些缺点，与树脂相比，他们是一种相对较新的技术，仍然有待经历工业规模的广泛整合，商品化的膜的类型和完善表征的配体的选择是有限的，膜还显著比离子交换树脂更加昂贵，另外，他们不是实施工业规模结合和洗脱层析的最佳介质，膜具有相对较低的结合容量，这难以经由循环来经济地弥补不，随着新一代膜的开发，许多这些问题有可能得到解决。

尽管有缺点，但是膜在下游纯化方面也有其独到之处，已经证明离子交换膜作为蛋白A单抗捕捉的后续步骤是成功的，膜在这个位置是理想的，因为杂质水平较低，而且当以流通模式使用时，结合容量不再是限制性的，流通层析定义为靶蛋白质流动通过吸附剂介质，不结合，而带适宜电荷的杂质被吸附的层析操作，延伸至膜层析，它是如下的一种技术，其利用膜与单抗之间建立的互斥力，使得大多数结合位点仍然可用于吸附带相反电荷的CHOP种类。

为了提高结合容量，每家制造商将多层膜组合成每个装置，总层数和厚度随制造商和所作的装置尺寸而变化，滤出液样品收集技术以三种不同方式收集滤出液，定时样品和级分是最常见的，定时样品指在特定吞吐时采集的较小的瞬时滤出液试样，级分指较大的滤出液样品，而且以吞吐范围来限定，还作为单一较大集合来收集滤出液，集合分析是有效的，但是定时样品和级分对于监测单抗和CHOP水平一般更加有用，因为能组合连续样品来显示趋势。

实施例

以下通过实施例详细地解释本发明，但这些实施例不以任何方式限制本发明，各实施例的通量都是在pH＝7，温度25度，水是经过二级反渗透膜纯化后测得的，所有的静态结合容量都以mg/cm²为单位测得，动态结合载量是为被吸附物穿过本发明的复合层析滤膜直到所述被吸附物在复合层析过滤膜的出流中的浓度被吸附物在入流中的浓度的规定分数时的被吸附物的量，单位为：mg/ml；以下实施例中，层析介质均为市售产品，可以从市场上购得。

实施例1：复合涂层C18硅胶层析介质

将厚度为120um，膜孔径大小0.45um的聚醚砜微孔滤膜与厚度150um聚酯无纺布进行热复合后，裁切成20×20cm的膜片，用RO水进行完全浸润后润湿，浸泡时间半小时，膜孔隙被填满充分，用双棍挤压挤干水分；市购得反相C18硅胶填料，其粒径为2-10um，碳载量为10-12％，将其配制成乙醇凝胶溶液，均匀涂敷在复合滤膜上，涂覆层为聚酯无纺布层面，涂覆克重为50g/㎡，将其浸泡在含有表氯醇的无水乙醇溶液中，表氯醇占无水乙醇溶液的质量分数比为5％；在常温下反应2h后，将所述的膜在RO水中漂洗30min，将过多水分挤掉，室温干燥24h后，所得膜即为含有层析介质具有吸附功能的复合层析过滤膜。

实施例2：复合涂层反相聚合物层析介质，表面基团为苯基

将厚度为120um，膜孔径大小0.45um的聚醚砜微孔滤膜与厚度150um聚酯无纺布进行热复合后，裁切成20×20cm的膜片，用RO水进行完全浸润后润湿，浸泡时间半小时，膜孔隙被填满充分，用双棍挤压挤干水分；市购得反相聚合物层析填料，基质为聚甲基丙烯酸甲酯，其表面基团含有苯基，粒径为3-10um，层析介质孔径300-500埃，将其配制成乙醇凝胶溶液，均匀涂敷在复合滤膜上，涂覆层为聚酯无纺布层面，涂覆克重为60g/㎡；配制含过硫酸氢的N-羟甲基丙烯酰胺溶液1000毫升，过硫酸氢铵占总溶液的质量分数比为0.5％，N-羟甲基丙烯酰胺占总溶液的质量分数比为10％，将涂覆有层析介质的复合膜，浸泡在上述1000毫升的溶液中，在常温下反应2h后，将所述的膜在RO水中漂洗30min，将过多水分挤掉，室温干燥24h后，所得膜即为含有层析介质具有吸附功能的复合层析过滤膜。

实施例3：复合涂层疏水层析介质，表面基团为丁基

将厚度为120um，膜孔径大小5um的聚醚砜微孔滤膜与厚度200um，孔径为100um的聚丙烯无纺布进行热复合后，裁切成20×20cm的膜片，用RO水进行完全浸润后润湿，浸泡时间半小时，膜孔隙被填满充分，用双棍挤压挤干水分；市购得疏水层析填料，基质为聚甲基丙烯酸甲酯，其表面基团含有丁基，粒径为15um，层析介质孔径1000埃，将其配制成乙醇凝胶溶液，均匀涂敷在复合滤膜上，涂覆层为聚丙烯无纺布层面，涂覆克重为60g/㎡；配制含过硫酸氢的N-羟甲基丙烯酰胺溶液1000毫升，过硫酸氢铵占总溶液的质量分数比为0.5％，N-羟甲基丙烯酰胺占总溶液的质量分数比为10％；将涂覆有层析介质的的复合膜，浸泡在上述1000毫升的溶液中，在常温下反应2h后，将所述的膜在RO水中漂洗30min，将过多水分挤掉，室温干燥24h后，所得膜即为含有层析介质具有吸附功能的复合层析过滤膜。

实施例4：复合涂层离子交换层析介质，表面基团为羧基(CM)

将厚度为120um，膜孔径大小5um的聚醚砜微孔滤膜与厚度200um，孔径为100um的聚丙烯无纺布进行热复合后，裁切成20×20cm的膜片，用RO水进行完全浸润后润湿，浸泡时间半小时，膜孔隙被填满充分，用双棍挤压挤干水分；市购得离子交换层析填料，基质为聚甲基丙烯酸甲酯，其表面基团含有羧基(CM)，粒径为30um，层析介质孔径500埃，将其配制成乙醇凝胶溶液，均匀涂敷在复合滤膜上，涂覆层为聚丙烯无纺布层面，涂覆克重为65g/㎡；配制含过硫酸氢的N-羟甲基丙烯酰胺溶液1000毫升，过硫酸氢铵占总溶液的质量分数比为0.5％，N-羟甲基丙烯酰胺占总溶液的质量分数比为8％；将涂覆有层析介质的复合膜，浸泡在上述1000毫升的溶液中，在常温下反应2h后，将所述的膜在RO水中漂洗30min，将过多水分挤掉，室温干燥24h后，所得膜即为含有层析介质具有吸附功能的复合层析过滤膜。

实施例5：复合涂层离子交换层析介质，表面基团为磺酸基(SP)

将厚度为100um，膜孔径大小10um的聚四氟乙烯微孔滤膜与厚度200um，孔径为100um的聚丙烯无纺布进行热复合后，裁切成20×20cm的膜片，用RO水进行完全浸润后润湿，浸泡时间半小时，膜孔隙被填满充分，用双棍挤压挤干水分；市购得离子交换层析填料，基质为聚甲基丙烯酸甲酯，其表面基团含有磺酸基(SP)，粒径为30um，层析介质孔径500埃，将其配制成乙醇凝胶溶液，均匀涂敷在复合滤膜上，涂覆层为聚丙烯无纺布层面，涂覆克重为80g/㎡；配制含过硫酸氢的N-羟甲基丙烯酰胺溶液1000毫升，过硫酸氢铵占总溶液的质量分数比为0.5％，N-羟甲基丙烯酰胺占总溶液的质量分数比为8％，；将涂覆有层析介质的复合膜，浸泡在上述1000毫升的溶液中，在常温下反应2h后，将所述的膜在RO水中漂洗30min，将过多水分挤掉，室温干燥24h后，所得膜即为含有层析介质具有吸附功能的复合层析过滤膜。

实施例6：复合涂层离子交换层析介质，表面基团为叔胺基(DEAE)

将厚度为100um，膜孔径大小10um的聚四氟乙烯微孔滤膜与厚度200um，孔径为100um的聚丙烯无纺布进行热复合后，裁切成20×20cm的膜片，用RO水进行完全浸润后润湿，浸泡时间半小时，膜孔隙被填满充分，用双棍挤压挤干水分；市购得离子交换层析填料，基质为聚甲基丙烯酸甲酯，其表面基团含有叔胺基(DEAE)，粒径为30um，层析介质孔径500埃，将其配制成乙醇凝胶溶液，均匀涂敷在复合滤膜上，涂覆层为聚丙烯无纺布层面，涂覆克重为80g/㎡；配制含过硫酸氢的N-羟甲基丙烯酰胺溶液1000毫升，过硫酸氢铵占总溶液的质量分数比为0.5％，N-羟甲基丙烯酰胺占总溶液的质量分数比为8％，；将涂覆有层析介质的复合膜，浸泡在上述1000毫升的溶液中，在常温下反应2h后，将所述的膜在RO水中漂洗30min，将过多水分挤掉，室温干燥24h后，所得膜即为含有层析介质具有吸附功能的复合层析过滤膜。

实施例7：复合涂层离子交换层析介质，表面基团为季胺基(Q)

将厚度为100um，膜孔径大小10um的聚四氟乙烯微孔滤膜与厚度200um，孔径为100um的聚丙烯无纺布进行热复合后，裁切成20×20cm的膜片，用RO水进行完全浸润后润湿，浸泡时间半小时，膜孔隙被填满充分，用双棍挤压挤干水分，市购得离子交换层析填料，基质为聚甲基丙烯酸甲酯，其表面基团含有季胺基(Q)，粒径为30um，层析介质孔径500埃，将其配制成乙醇凝胶溶液，均匀涂敷在复合滤膜上，涂覆层为聚丙烯无纺布层面，涂覆克重为100g/㎡，配制含过硫酸氢的N-羟甲基丙烯酰胺溶液1000毫升，过硫酸氢铵占总溶液的质量分数比为0.5％，N-羟甲基丙烯酰胺占总溶液的质量分数比为8％；将涂覆有层析介质的复合膜，浸泡在上述1000毫升的溶液中，在常温下反应2h后，将所述的膜在RO水中漂洗30min，将过多水分挤掉，室温干燥24h后，所得膜即为含有层析介质具有吸附功能的复合层析过滤膜。

实施例8：复合涂层亲和层析介质，表面基团为耐碱性rProtein A

将厚度为100um，膜孔径大小5um的聚偏氟乙烯微孔滤膜与厚度200um，孔径为50um的聚丙烯无纺布进行热复合后，裁切成20×20cm的膜片，用RO水进行完全浸润后润湿，浸泡时间半小时，膜孔隙被填满充分，用双棍挤压挤干水分；市购得亲和层析填料，基质为聚甲基丙烯酸甲酯，其表面基团含有耐碱性rProtein A，粒径为15um，层析介质孔径500埃，将其配制成乙醇凝胶溶液，均匀涂敷在复合滤膜上，涂覆层为聚丙烯无纺布层面，涂覆克重为90g/㎡，配制含过硫酸氢的甲基丙烯酸羟丙酯溶液1000毫升，过硫酸氢铵占总溶液的质量分数比为0.25％，甲基丙烯酸羟丙酯占总溶液的质量分数比为10％；将涂覆有层析介质的复合膜，浸泡在上述1000毫升的溶液中，在常温下反应2h后，将所述的膜在RO水中漂洗30min，将过多水分挤掉，室温干燥24h后，所得膜即为含有层析介质具有吸附功能的复合层析过滤膜。

对上述制备得到的复合层析过膜的评估：

1)通量测定：

将膜先用无水乙醇浸泡3-5min，然后用纯化水处理10-20min，使其充满去离子水，连接到氮气瓶或者空气压力源，加压到1bar，在单位时间内收集滤出液，使用测试的膜面积计算通量，测试膜通量的介质为纯化水，测试温度25度，换算后即得复合膜通量。

2)测定复合膜带正电膜的静态结合容量

将具有20cm²的有效膜面积的膜在50ml的25mM TRIS/HCl(pH＝7.1)中以约60-100r/min振荡6分钟，相同步骤重复2次。然后，将膜在50ml含3.2mg/ml牛血清蛋白(BSA)溶液(sigma)的25mM TRIS/HCl(pH＝7.1)溶液中，在25℃下以约100rpm振荡20h。随后，将膜用50ml 25mM TRIS/HCl(pH＝7.1)漂洗3次，每次20分钟。然后，将膜样品在包含25mM TRIS/HCl溶液和1.2M氯化钠水溶液的20ml混合物(pH＝7.1)中振荡。洗脱的牛血清蛋白的量用紫外分光光度计280nm下测量光密度(OD)来测定。

3)测定复合膜带正电膜的动态结合容量

将5层膜夹到针头过滤器的外壳中，该叠膜具有20.6cm2的膜面积、5.5cm2的流动面积和1.5mm的膜厚度。将在持膜器中的膜用25mM TRIS/HCl缓冲液(pH＝7.1)浸润，然后，使用包括两个步骤的测试程序，就BSA(牛血清蛋白)结合测试膜或膜叠。测试程序的两个步骤如下所述：

1.用20ml pH＝7.1的60mM 25mM TRIS/HCl缓冲液使膜平衡；

2.用含1.6mg/ml BSA的25mM pH＝7.1的TRIS/HCl缓冲液载膜，直到在UV检测器中浓度为原始浓度的8％。

两个步骤都以20ml/min的流速进行。在所有步骤中，在膜单元以外的UV检测器中，测量在280nm下的吸光度。将这样绘制的穿透曲线上方的面积在减去死体积之后进行积分，且因此计算在8％穿透时的动态结合容量。

表1为实施例1到实施例8制备得到的复合层析过滤膜的通量和容量的数据；

表1：

实施例2-实施例5制得得到的复合层析过滤膜具有至少一种具有阴离子基团的配位体，对于球蛋白和溶菌酶仅具有极低静态结合容量，而具有苯基和磺酸基基团二者作为配位体的膜即使在高盐浓度下也对溶菌酶和γ-球蛋白显示出高静态结合容量，如表2所示。

表2：

注：通量使用25mM乙酸盐缓冲液pH＝5.2与200mM NaCl测量。

表3为以盐浓度和pH参数为变量的各吸附器去除病毒(MVM)的数据比较；

表3：

表4为从三种不同的单克隆抗体中去除HCP的数据比较；

表4：

表5为市场不同产品对比数据：

表5：

表6为本发明复合层析过滤膜的性能表现；

表6：

不同保留时间下的载量表现(2S-15S)。

Claims (10)

1.一种含有吸附介质的复合层析过滤膜，其特征在于，包括多孔支撑层和复合在多孔支撑层上的过滤膜，多孔支撑层的外侧交联有一层由层析介质构成的功能层，所述层析介质为凝胶过滤介质、离子交换介质、亲和层析介质或疏水层析介质。

2.根据权利要求1所述的一种含有吸附介质的复合层析过滤膜，其特征在于，所述过滤膜为微滤膜、超滤膜、纳滤膜或网状多孔层无纺布。

3.根据权利要求1所述的一种含有吸附介质的复合层析过滤膜，其特征在于，所述过滤膜的材质选自聚醚砜、聚砜、聚偏氟乙烯、尼龙、聚丙烯、聚乙烯、改性纤维素、聚四氟乙烯。

4.根据权利要求1所述的一种含有吸附介质的复合层析过滤膜，其特征在于，所述层析介质的粒径比过滤膜的孔径大三倍及以上。

5.根据权利要求1所述的一种含有吸附介质的复合层析过滤膜，其特征在于，交联所采用的交联剂选自环氧氯丙烷、丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟丙酯、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟丙酯、二乙烯基苯、N-羟甲基丙烯酰胺、双丙酮丙烯酰胺、聚乙二醇二缩水甘油醚中的一种或多种按任意比混合。

6.一种含有吸附介质的复合层析过滤膜的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)将过滤膜热复合在多孔支撑层上，复合后放置于RO水中进行浸泡，使膜孔隙被填满充分，再挤干水分；

(2)将层析介质涂覆在多孔支撑层外侧，形成一层功能层，再放置于交联剂溶液中，使功能层和多孔支撑层进行交联。

(3)交联后，再放置于RO水中漂洗，干燥，获得含有吸附介质的复合层析过滤膜。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述过滤膜为微滤膜、超滤膜、纳滤膜或网状多孔层无纺布；所述过滤膜的材质选自聚醚砜、聚砜、聚偏氟乙烯、尼龙、聚丙烯、聚乙烯、改性纤维素、聚四氟乙烯。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述层析介质的粒径比过滤膜的孔径大三倍及以上。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，交联所采用的交联剂选自环氧氯丙烷、丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟丙酯、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟丙酯、二乙烯基苯、N-羟甲基丙烯酰胺、双丙酮丙烯酰胺、表氯醇、聚乙二醇二缩水甘油醚中的一种或多种按任意比混合。

10.一种权利要求1所述的含有吸附介质的复合层析过滤膜在层析系统上的应用。