CN111871395A - 一种疏水分离介质及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种疏水分离介质及其制备方法和应用。所述疏水分离介质包括PS/DVB固体基质以及包覆在PS/DVB固体基质表面的中性亲水包覆层；其中，所述中性亲水包覆层上通过‑OC(O)‑NH‑化学键合有疏水基团。本发明提供的疏水分离介质具有中性亲水性包覆层，包覆层将疏水性聚合物表面有效包覆，进而避免了疏水基质与生物大分子之间的非特异性吸附。同时本发明选择利用异氰酸酯引入疏水基团，以简单和可控的方式提供适当的选择性。最后以PS/DVB为基质的分离介质具有良好的化学和热稳定性，克服了以硅胶为基质的分离介质在这两方面的缺点，适用于在碱性环境下对分离介质进行有效清洗。

Description

一种疏水分离介质及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于蛋白分离分离技术领域，涉及一种疏水分离介质及其制备方法和应用。
背景技术
疏水作用层析(HIC)是一种通用的液相色谱技术，通常与离子交换层析和凝胶过滤层析结合使用，作为蛋白质分离纯化或分析的工具。HIC的独特之处在于其可以与蛋白质在高盐浓度下结合而在低盐浓度下洗脱；这以反向盐梯度体现，直接表明正在使用HIC技术。
HIC有时被理解为是反向层析(RPC)的一种较温和的形式。但HIC利用了较温和的结合和洗脱条件，通常可保留目标蛋白的生物学活性。HIC可以适用于最低限度的样品预处理，因此可以有效地与传统的蛋白质沉淀技术结合使用。适度高浓度的抗离液盐可促进蛋白质与HIC介质的结合，而盐也可以稳定蛋白质结构。HIC洗脱可通过线性或逐步降低吸附缓冲液中盐的浓度来实现获得满意的回收率；因此，HIC在研究和工业实验室中广泛用于纯化各种生物分子，例如血清蛋白、膜结合蛋白、核蛋白、受体、细胞或重组蛋白。
HIC介质通常具有亲水性表面，只有亲水性表面的小部分被疏水性配体修饰以提供疏水相互作用位点。HIC所使用的固体载体可以是硅胶，交联的琼脂糖或合成共聚物材料；在HIC对蛋白质进行分离时，固体载体表面通常需要具有没有离子交换特性的亲水表面，其对蛋白质的分离极其重要，因为对于分离蛋白质而言，除了主要的疏水作用，离子交换作用也会对分离蛋白质产生不利影响。虽然目前现有技术中有利用有机聚合物或交联的琼脂糖基质材料制备疏水层析介质，但是考虑到二氧化硅基基材具有更优异的机械稳定性，以及具有可控的孔径和可选择的粒径范围广，因此，选择二氧化硅基基材制备疏水性层析介质具有显著的优越性。
CN111013557A公开了一种疏水层析介质及其制备方法和应用，包括固体基质以及包覆在固体基质表面的中性亲水包覆层；其中，所述中性亲水包覆层上通过-OC(O)-NH-化学键合有疏水基团。该发明提供的疏水层析介质具有中性亲水包覆层，包覆层将硅胶表面硅羟基基团有效包覆，进而避免了硅羟基与生物大分子之间的相互作用，但硅胶基质的学稳定性和热稳定性较差，分离条件相对苛刻。
因此，我们希望开发一种具有优良的化学稳定性、物理稳定性、针对于生物大分子(例如单克隆抗体、蛋白等)高性能的疏水分离介质和色谱柱。
发明内容
本发明的目的在于提供一种疏水分离介质及其制备方法和应用。本发明提供的疏水分离介质具有中性亲水性包覆层，包覆层将PS/DVB基质表面有效包覆，进而避免了疏水性基质与生物大分子(例如蛋白质)之间的相互作用；同时本发明选择利用异氰酸酯引入适量的疏水基团，用简便、可控的方法提供了良好的分离选择性。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种疏水分离介质，所述疏水分离介质包括PS/DVB固体基质以及包覆在PS/DVB固体基质表面的中性亲水包覆层；
其中，所述中性亲水包覆层上通过-OC(O)-NH-化学键合有疏水基团。
本发明通过在PS/DVB固体基质表面引入中性亲水包覆层，使疏水性的PS/DVB固体基质表面被有效地包覆在包覆层内，因此，本发明提供的疏水作用分离介质可避免疏水基质对待分离蛋白质的不利影响。所述PS/DVB固体基质是以聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物为基质制备而成的聚合物微球，PS/DVB固体基质与硅胶基质相比，能够使分离介质具有更加优越的化学稳定性和热稳定性。
本发明所述中性亲水包覆层指的是电中性的亲水的包覆层，例如C-OH并不电离，具有电中性的同时，-OH具有亲水性，因此，本发明所述的中性亲水包覆层可以是带有C-OH的包覆层。所述中性亲水包覆层由带有环氧基的PS/DVB固体基质与多元醇进行交联反应制备得到。
优选地，所述PS/DVB固体基质为PS/DVB微球。
在本发明中，所述PS/DVB固体基质也可以为颗粒状、块状、片层状、方形、或不规则形状等目前现有技术中常用的各种形状。
优选地，所述PS/DVB固体基质为无孔或多孔材料。
在本发明中，所述PS/DVB固体基质的平均粒径为1.5-50μm，例如1.5μm、2μm、3μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm等。
优选地，所述PS/DVB固体基质的比表面积为0.5-300m2/g，例如0.5m2/g、1m2/g、5m2/g、10m2/g、50m2/g、100m2/g、150m2/g、200m2/g、250m2/g、300m2/g等。
优选地，所述PS/DVB固体基质为多孔材料，所述PS/DVB固体基质的平均孔径为
Figure BDA0002610658560000031
例如、
Figure BDA0002610658560000032
Figure BDA0002610658560000033
等。
第二方面，本发明提供了如第一方面所述的疏水分离介质的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)带有环氧基的PS/DVB固体基质与多元醇进行交联反应，形成中性亲水包覆层；
(2)将步骤(1)得到的产物与异氰酸酯进行反应，得到所述疏水分离介质。
本发明选择的固体基质为PS/DVB固体基质，通过异氰酸酯引入疏水基团，异氰酸酯与羟基可以在温和的条件下发生反应。此反应为加成反应，无副产物生成，并且反应平稳，可控性好。与用酯化反应偶联的方式相比，用本发明制备的分离介质具有更好的化学稳定性。
本发明对所能引入疏水基团的化合物进行了特异性选择，引入的疏水基团通常为C1-C8的烷基或芳香类的基团，其C1-C4和苯基官能团最常见。若疏水性能过强，则会导致待测物(蛋白)的非特异性吸附，影响分离结果。
优选地，步骤(1)所述多元醇包括乙二醇、二乙二醇或三乙二醇中的任意一种或至少两种的组合。
本发明通过引入多元醇与PS/DVB固体基质上的环氧基发生交联反应，在PS/DVB固体基质固体基质表面形成致密的中性亲水膜，进而可以避免疏水性表面的裸露，有效地降低了分离介质与待测蛋白分子间的非特异性吸附。
优选地，步骤(1)所述带有环氧基的PS/DVB固体基质与多元醇的质量比为(1-10):(10-1)，例如10:1、8:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:8、1:10等。
优选地，步骤(1)所述交联反应的催化剂为三氟化硼醚化物类催化剂，优选为三氟化硼乙醚。
优选地，步骤(1)所述交联反应在溶剂中进行，所述溶剂为四氢呋喃和/或1,4-二氧六环。
优选地，步骤(1)所述交联反应的温度为40-120℃(例如40℃、50℃、60℃、80℃、100℃、110℃、120℃等)或溶剂的回流温度，时间为1-48h，例如1h、2h、5h、8h、10h、12h、15h、18h、20h、25h、30h、40h、48h等，优选为8h。
本发明中，步骤(1)所述带有环氧基的PS/DVB固体基质由以下制备方法制备得到：将PS/DVB固体基质与带有环氧基的单体在引发剂的存在下进行自由基反应，得到所述带有环氧基的PS/DVB固体基质。
优选地，所述PS/DVB固体基质与所述带有环氧基的单体的的质量比为(1-10):(10-1)，例如10:1、8:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:8、1:10等。
优选地，所述带有环氧基的单体为甲基丙烯酸缩水甘油酯。
优选地，所述自由基反应在溶剂中进行，所述溶剂为甲苯、二甲苯或1,4-二氧六环中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述引发剂为AIBN。
优选地，所述自由基反应的温度为40-100℃，例如40℃、50℃、60℃、80℃、100℃等，所述自由基反应的时间为1-48h，例如1h、2h、5h、8h、10h、12h、15h、18h、20h、25h、30h、40h、48h等。
优选地，步骤(2)中所述步骤(1)的产物与所述异氰酸酯的质量比为10:(0.1-1.5)，例如10:0.1、10:0.2、10:0.4、10:0.6、10:0.8、10:1、10:1.1、10:1.2、10:1.3、10:1.4、10:1.5等。
在本发明的制备方法中，异氰酸酯的用量不能过多，过多则会导致由疏水性过强引起的非特异性吸附；也不能过低，否则起不到疏水保留的作用。
优选地，步骤(2)中所述异氰酸酯选自C1-C8的异氰酸酯，进一步优选C1-C6的异氰酸酯，再进一步优选异氰酸丁酯、异氰酸辛酯或异氰酸苯酯中的任意一种或至少两种的组合。
本发明所述的C1-C8可以是C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8，本发明所述的C1不包括异氰酸酯中的碳原子数，即异氰酸甲酯为C1的异氰酸酯。
同时，异氰酸酯的碳原子数目(不包括异氰酸酯基在内的碳原子数)不得超过8个，若超过8个，则会在实际应用过程中导致非特异性吸附，影响分离效果。
优选地，步骤(2)所述反应的温度为15-100℃，例如15℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃等，所述反应的时间为1-96h，例如1h、2h、5h、10h、12h、15h、20h、30h、40h、50h、60h、70h、80h、90h、96h等
优选地，所述疏水分离介质的制备方法包括如下步骤：
(1)将质量比为(1-10):(10-1)的PS/DVB固体基质与带有环氧基的单体在引发剂的存在下，在40-100℃下进行1-48h的自由基反应，得到所述带有环氧基的PS/DVB固体基质；将质量比为(1-10):(10-1)的带有环氧基的PS/DVB固体基质与多元醇置于溶剂中，在40-120℃或溶剂的回流温度下进行1-48h的交联反应，形成中性亲水包覆层；
(2)将质量比为10:(0.1-1.5)的步骤(1)得到的产物与异氰酸酯在15-100℃下进行1-96h的反应，得到所述疏水分离介质。
第三方面，本发明提供了一种如第一方面所述的疏水分离介质在蛋白分离或单抗分离中的应用。
本发明提供的疏水分离介质具有生物相容性，并且可选择的中性亲水包覆层以及包覆层上化学键合的疏水基团具有多样性，因此可得到具有不同选择性的分离介质。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明通过在PS/DVB固体基质表面引入中性亲水包覆层，使疏水性固体基质被有效地包覆在包覆层内，最大程度上降低了基质对待分离蛋白质的非特异性吸附；
(2)本发明通过异氰酸酯引入疏水基团，异氰酸酯与羟基可以在温和的条件下发生反应；此反应为加成反应，无副产物生成，并且反应平稳，可控性好；与用酯化反应偶联的方式相比，用本发明制备的分离介质具有更好的化学稳定性；本发明制备的分离介质具有优越的化学稳定性和热稳定性，克服了以硅胶为基质的分离介质在这两方面的缺点，适用于在碱性环境下对分离介质进行有效清洗；
(3)本发明提供的疏水分离介质对蛋白(单抗类)分子具有优越的分离效果。
附图说明
图1是采用实施例1提供的疏水分离介质进行IgG2的分离结果图；
图2是采用实施例1提供的疏水分离介质进行IgG4的分离结果图；
图3是采用实施例1提供的疏水分离介质进行抗体-药物-偶联物(ADC)的分离结果图；
图4是采用实施例1提供的疏水分离介质对于疏水性蛋白的残留测试图；
图5是采用实施例1提供的疏水分离介质的耐碱性测试图；
图6是采用实施例2提供的疏水分离介质进行IgG2的分离结果图；
图7是采用实施例2提供的疏水分离介质进行IgG4的分离结果图；
图8是采用实施例2提供的疏水分离介质进行抗体-药物-偶联物(ADC)的分离结果图；
图9是采用对比例1提供的疏水分离介质进行抗体-药物-偶联物(ADC)的分离结果图；
图10是采用对比例1提供的疏水分离介质的耐碱性测试图；
图11是采用对比例2提供的疏水分离介质进行抗体-药物-偶联物(ADC)的分离结果图；
图12是采用对比例1提供的疏水分离介质的耐碱性测试图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例和对比例所涉及的部分材料及厂家信息如下
Figure BDA0002610658560000081
实施例1
本实施例提供一种疏水分离介质，所述疏水分离介质由如下制备方法得到：
(1)在干燥氮气保护下，将50g甲基丙烯酸缩水甘油酯添加到50g PS/DVB A-1的甲苯(300mL中)分散液中，在室温下搅拌10min后加入1.0g的AIBN，继续搅拌10min。反应加热到60℃并保持搅拌24h后，将反应混合物过滤，依次用甲苯、二氧六环和丙酮洗涤，然后在50℃的真空中干燥8h，得到中间体I-a；在干燥氮气保护下，将40g乙二醇添加到50g中间体I-a的四氢呋喃(300mL)分散液中，在室温下搅拌15min后，将2mL三氟化硼乙醚加入到反应混合物中，然后将反应混合物加热至回流温度，继续搅拌8h。反应结束后将反应混合物过滤并依次用丙酮、去离子水和丙酮洗涤；滤饼在50℃的真空中干燥8h，得到中间体II-a；
(3)在干燥氮气保护下，将10g中间体II-a分散于30mL甲苯中，室温下继续搅拌分散液；向上述分散液中滴加1.0g异氰酸丁酯的10mL甲苯溶液；在100℃下搅拌8h；反应结束后将反应混合物过滤并依次用丙酮、去离子水和丙酮洗涤；滤饼在50℃的真空中干燥8h，得到疏水分离介质1。
对实施例1提供的疏水分离介质1进行性能测试，将待测试的疏水分离介质利用传统的高压浆料技术填充到4.6x100 mm不锈钢柱中，然后进行测试，方法如下：
a、测试IgG2的分离
测试条件：洗脱液，A：2.0M(NH4)2SO4+100mM磷酸盐缓冲液,pH7.0；B：70/30v/v100mM磷酸盐缓冲液,pH7.0/异丙醇；梯度洗脱：先用洗脱液A平衡10分钟后注入样品，0-1分钟，100％A，1-20分钟，100-0％A，0-100％B，然后再保持5分钟；流速，1mL/min；进样量，10μL；温度30℃；检测波长280nm。样品：单克隆抗体IgG2(1mg/mL)。
图1是采用实施例1提供的分离介质进行IgG2的分离结果图。由图1所示，IgG2洗脱为尖峰，其中一些异质体也得到分离，表明本发明提供的疏水分离介质适用于单克隆抗体IgG2的分离。
b、测试IgG4的分离
测试条件：洗脱液，A：2.0M(NH4)2SO4+100mM磷酸盐缓冲液,pH7.0；B：70/30v/v100mM磷酸盐缓冲液,pH7.0/异丙醇；梯度洗脱：先用洗脱液A平衡10分钟后注入样品，0-1分钟，100％A，1-20分钟，100-0％A，0-100％B，然后再保持5分钟；流速，1mL/min；进样量，10μL；温度30℃；检测波长280nm。样品：单克隆抗体IgG4(1mg/mL)。
图2是采用实施例1提供的分离介质进行IgG4的分离结果图。由图2所示，IgG4洗脱为尖峰，其中一些异质体也得到分离，表明本发明提供的疏水分离介质适用于单克隆抗体IgG4的分离。
c、抗体-药物-偶联物(ADC)的分离
测试条件：洗脱液，A：2.0M(NH4)2SO4+100mM磷酸盐缓冲液,pH7.0；B：70/30v/v100mM磷酸盐缓冲液,pH7.0/异丙醇；梯度洗脱：先用洗脱液A平衡10分钟后注入样品，0-1分钟，100％A，1-20分钟，100-0％A，0-100％B，然后再保持5分钟；流速，1mL/min；进样量，10μL；温度30℃；检测波长280nm。样品：抗体-药物-偶联物ADC(1mg/mL)。
图3是采用实施例1提供的疏水分离介质进行抗体-药物-偶联物(ADC)的分离结果图。由图3所示，一个ADC以载药量的顺序洗脱出一系列峰，载药量较低的ADC的洗脱时间要早于载药量较高的ADC的洗脱时间，这表明本发明提供的疏水分离介质适用于ADC的DAR(药物-抗体比率)测定。
d、HIC分离介质的残留评估
测试条件：A：2.0M(NH4)2SO4+100mM磷酸盐缓冲液,pH7.0；B：70/30v/v100mM磷酸盐缓冲液,pH7.0/异丙醇；梯度洗脱：先用洗脱液A平衡10分钟后注入样品，0-1分钟，100％A，1-20分钟，100-0％A，0-100％B，然后再保持5分钟；流速，1mL/min；进样量，10μL；温度30℃；检测波长280nm。样品：alpha-糜蛋白酶原(10mg/mL)。
图4是采用实施例1提供的疏水分离介质对于疏水性蛋白(alpha-糜蛋白酶原)的残留测试结果。非特异性吸附是蛋白分离中一大挑战，而由于疏水保留过度而引起的非特异性吸附尤为常见。PS/DVB基质自身的疏水性要求对其表面进行亲水层处理来有效地避免由此而引起的疏水吸附。此外，在用异氰酸酯对亲水层作疏水修饰时需要适量，否则会导致疏水吸附。本发明采用一种疏水性蛋白(alpha-糜蛋白酶原)进行残留测试。首先用高浓度的蛋白进样然后梯度洗脱得到该蛋白的色谱分离结果，然后用同样梯度走一针空白并记录色谱曲线，最后计算走空白时在alpha-糜蛋白酶原流出时间处的出峰面积与进样时alpha-糜蛋白酶原出峰面积的百分比不高于0.5％。这表明本发明提供的疏水分离介质具有很低的非特异性吸附，适用于蛋白分子的分离。
在蛋白质分离时，由于不可避免的吸附作用经常需要在碱性条件下清洗和再生色谱柱，因此需要分离介质具有良好的耐碱性。图5是采用实施例1提供的疏水分离介质的耐碱性测试图，如图5所示，当用此分离介质装填的色谱柱在100mM NaOH浸泡20h后，ADC的分离效果、半峰宽和信号响应与碱处理前相比没有明显变化。相比之下，对比例1和对比例2中的以硅胶为基质的疏水保留分离介质则显示出分离效果变差、峰形变宽和非特应性吸附加剧(色谱峰的数量减少，信号响应值降低)的现象。
实施例2
与实施例1的区别仅在于，将步骤(2)中的1.0g异氰酸丁酯替换为0.5g异氰酸苯酯，得到疏水分离介质2。
按照实施例1的测试方法，分别对疏水分离介质2进行对于IgG2、IgG4及抗体-药物-偶联物ADC的分离测试，具体测试结果(图6-图8)，图6是采用实施例2提供的疏水分离介质进行IgG2的分离结果图；图7是采用实施例2提供的疏水分离介质进行IgG4的分离结果图；图8是采用实施例2提供的疏水分离介质进行抗体-药物-偶联物(ADC)的分离结果图表明，由图6-图8可知本实施例提供的疏水分离介质适用于单抗(例如IgG2、IgG4)和ADC中的DAR(药物-抗体比率)测定。此外，在ADC的DAR分析中，实施例1和2提供的疏水保留分离介质显示了不同的选择性。
对比例1
与实施例1的区别仅在于，将步骤(1)中的PS/DVB A-1替换为硅胶A-1，得到分离介质7。
按照实施例1的测试方法，图9是采用对比例1提供的疏水分离介质进行抗体-药物-偶联物(ADC)的分离结果图，显示此对比例中的分离介质对单抗类物质具有良好的选择性和分离度。然而，当用此分离介质装填的色谱柱在100mM的NaOH浸泡20h后，图10是采用对比例1提供的疏水分离介质的耐碱性测试图，ADC的分离图谱表现出显著的峰形拖尾和变宽，以及峰的数量减少和响应值锐减的现象。其原因可以归结为多孔硅胶基质的溶解和固定相的流失。
对比例2
与实施例1的区别仅在于，将步骤(1)中的PS/DVB A-1替换为硅胶A-2，得到分离介质8。
按照实施例1的测试方法，图11是采用对比例2提供的疏水分离介质进行抗体-药物-偶联物(ADC)的分离结果图，分离结果图显示此对比例中的分离介质对单抗类物质具有良好的选择性和分离度。然而，当用此分离介质装填的色谱柱在100mM的NaOH浸泡20h后，图12是采用对比例1提供的疏水分离介质的耐碱性测试图，ADC的分离图谱表现出峰形拖尾和变宽，以及峰的数量减少和响应值减低的现象。其原因可以归结为多孔硅胶基质的溶解和固定相的流失。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的疏水分离介质及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种疏水分离介质，其特征在于，所述疏水分离介质包括PS/DVB固体基质以及包覆在PS/DVB固体基质表面的中性亲水包覆层；
其中，所述中性亲水包覆层上通过-OC(O)-NH-化学键合有疏水基团。
2.根据权利要求1所述的疏水分离介质，其特征在于，所述PS/DVB固体基质为PS/DVB微球；
优选地，所述PS/DVB固体基质为无孔或多孔材料。
3.根据权利要求1或2所述的疏水分离介质，其特征在于，所述PS/DVB固体基质的平均粒径为1.5-50μm；
优选地，所述PS/DVB固体基质的比表面积为0.5-300m2/g；
优选地，所述PS/DVB固体基质为多孔材料，所述PS/DVB固体基质的平均孔径为
Figure FDA0002610658550000011
4.根据权利要求1-3中任一项所述的疏水分离介质的制备方法，其特征在于，所述疏水分离介质的制备方法包括如下步骤：
(1)带有环氧基的PS/DVB固体基质与多元醇进行交联反应，形成中性亲水包覆层；
(2)将步骤(1)得到的产物与异氰酸酯进行反应，得到所述疏水分离介质。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述多元醇包括乙二醇、二乙二醇或三乙二醇中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，步骤(1)所述带有环氧基的PS/DVB固体基质与多元醇的质量比为(1-10):(10-1)；
优选地，步骤(1)所述交联反应的催化剂为三氟化硼醚化物类催化剂，优选为三氟化硼乙醚；
优选地，步骤(1)所述交联反应在溶剂中进行，所述溶剂为四氢呋喃和/或1,4-二氧六环；
优选地，步骤(1)所述交联反应的温度为40-120℃或溶剂的回流温度，时间为1-48h。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述带有环氧基的PS/DVB固体基质由以下制备方法制备得到：将PS/DVB固体基质与带有环氧基的单体在引发剂的存在下进行自由基反应，得到所述带有环氧基的PS/DVB固体基质；
优选地，所述PS/DVB固体基质与所述带有环氧基的单体的的质量比为(1-10):(10-1)；
优选地，所述带有环氧基的单体为甲基丙烯酸缩水甘油酯；
优选地，所述自由基反应在溶剂中进行，所述溶剂为甲苯、二甲苯或1,4-二氧六环中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述引发剂为AIBN；
优选地，所述自由基反应的温度为40-100℃，所述自由基反应的时间为1-48h。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述步骤(1)的产物与所述异氰酸酯的质量比为10:(0.1-1.5)；
优选地，步骤(2)中所述异氰酸酯选自C1-C8的异氰酸酯，进一步优选C1-C6的异氰酸酯，再进一步优选异氰酸丁酯、异氰酸辛酯或异氰酸苯酯中的任意一种或至少两种的组合。
8.根据权利要求4-7中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述反应的温度为15-100℃，所述反应的时间为1-96h。
9.根据权利要求4-8中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述疏水分离介质的制备方法包括如下步骤：
(1)将质量比为(1-10):(10-1)的PS/DVB固体基质与带有环氧基的单体在引发剂的存在下，在40-100℃下进行1-48h的自由基反应，得到所述带有环氧基的PS/DVB固体基质；将质量比为(1-10):(10-1)的带有环氧基的PS/DVB固体基质与多元醇置于溶剂中，在40-120℃或溶剂的回流温度下进行1-48h的交联反应，形成中性亲水包覆层；
(2)将质量比为10:(0.1-1.5)的步骤(1)得到的产物与异氰酸酯在15-100℃下进行1-96h的反应，得到所述疏水分离介质。
10.根据权利要求1-3中任一项所述的疏水分离介质在蛋白分离或单抗分离中的应用。
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