CN102858419A - 实施体积排阻色谱的设备和方法 - Google Patents

实施体积排阻色谱的设备和方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及实施体积排阻色谱的设备和方法。本发明的实施方式以在常规高效液相色谱或超高效液相色谱压力及更高压力下使用小颗粒的体积排阻色谱的设备和方法为特征。

Description

实施体积排阻色谱的设备和方法
相关申请
本申请要求享有2009年12月15日提交的美国临时专利申请第61/286,582号和2009年6月17日提交的美国临时专利申请第61/355,970号的优先权，这两篇申请的全部公开内容通过引用结合于此。
技术领域
本发明涉及实施体积排阻色谱的设备和方法。本发明的实施方式以在常规高效液相色谱或超高效液相色谱压力及更高压力下使用小颗粒的体积排阻色谱的设备和方法为特征。
发明背景
本发明将使用如下定义的以下术语，除非出现该术语的上下文要求不同的含义。
色谱是用于浓缩或分离在混合物中发现的一种或更多种化合物的分离方法。化合物通常存在于样品中。本文使用术语“样品”广泛地代表其中一个个体需要分析的任何混合物。术语“混合物”在含有一种或更多种溶解的化合物的流体的意义上使用。流体可包含水和/或其它液体和气体。感兴趣的化合物称为被分析物。
色谱是一种差异化的迁移过程。混合物中的化合物以不同的速率经过色谱柱，导致它们的分离。这种迁移通过与被称为固定相的颗粒填冲床或多孔整体结构有关的被称为流动相的流体的传送而发生。在某些色谱模式下，差异化迁移由被分析物与固定相和流动相的亲和性的差异而发生。
体积排阻色谱（SEC）是基于水动力半径来分离或孤立混合物中的各被分析物的一类色谱。在SEC中，分离因为被分析物探测多孔性固定相介质的体积的能力不同而发生。参见例如A.M.Striegel等人，Modern Size-Exclusion Chromatography:Practice of Gel Permeation andGel Filtration Chromatography，第二版，Wiley，NJ，2009。SEC典型地用于分离大分子或分子的复合物。例如，非限制性地，许多生物来源的大分子例如脱氧核糖核酸（DNA），核糖核酸（RNA），蛋白质、多糖、以及其片断和复合物都用SEC分析。合成多聚物、塑料等也用SEC分析。
SEC一般使用具有颗粒填充床的柱子来实施。这种颗粒的填充床是分离介质或者固定相，流动相将流经所述介质或固定相。放置柱子使其与泵和样品注射器流体相通。通过样品注射器在压力下将样品混合物加载到柱子上，混合物和流动相在泵的推动下通过柱子。混合物中的化合物离开柱子或从柱子上洗脱，最大的化合物首先离开，最小的分子最后离开。
放置柱子使其与检测器流体相通，当溶液离开柱子时，检测器能检测溶液的性质的变化。检测器将把这些变化作为图（称为色谱图）登记和记录，用于确定被分析物的存在与否。被分析物离开柱子的时间是分子的大小的指示。分子的分子量能使用标准校正曲线来估算。用于体积排阻色谱的检测器的例子是但不限于，折光率检测器、紫外检测器、光散射检测器和质谱仪。
希望具有用于SEC技术的柱子，所述柱子能在高于5000psi的压力和高流速下操作以加速分析时间。还希望具有附加的或提高的效率和分辨率；减少的溶剂使用量；改善的与先进的检测器的兼容性。希望具有带如此固定相的柱子，所述固定相具有精确定义的孔隙结构和粒径以产生可高重复的结果。最后，希望具有带如此固定相的柱子，所述固定相具有与生物大分子相容的表面修饰基团。
发明内容
本发明的实施方式涉及用于实施SEC的设备和方法。本发明的实施方式在常规高效液相色谱(HPLC)和超高效液相色谱(UHPLC)压力下和快流速下操作以加速分析时间，所述压力从约1000psi至约10000psi以及更高。本发明的实施方式以如此的固定相为特征，其具有精确定义的孔隙结构和粒径以产生可高重复的结果。本发明的实施方式以如此的固定相为特征，其具有与生物大分子相容的表面修饰基团。
在一个方面，本发明提供实施体积排阻色谱的设备，其包括：
外壳，具有至少一个壁来限定具有进口和出口的腔；和
容纳于上述腔内的包含核和表面成分的固定相材料；
其中，所述固定相材料包含由式1代表的颗粒或整体料(monolith)：
W-[X]-Q
式1
其中：
X是核成分，具有包含二氧化硅核材料、金属氧化物核材料、有机-无机杂合物核材料或它们的一组嵌段聚合物的表面；
W是氢或羟基；和
Q不存在或是使与被分析物的静电相互作用、范德华相互作用、氢键合相互作用或其它相互作用最小化的官能团。
在本发明的实施SEC的设备的某些实施方式中，W和Q占据了核成分材料X的自由价或核成分的表面。
在本发明的设备的其它实施方式中，选择W和Q以形成表面成分。在其它实施方式中，可选择X以形成一种嵌段聚合物或一组嵌段聚合物。
在其它实施方式中，固定相材料包含颗粒。在固定相材料包含颗粒的本发明的设备的实施方式中，其中颗粒状固定相材料的颗粒具有平均粒径分布为0.4-3.0微米；0.5-3.0；0.6-3.0；0.7-3.0；0.9-3.0或1.0-3.0微米的直径。
在本发明的设备的其它实施方式中，固定相材料包含整体料。在固定相材料包含颗粒的本发明的设备的实施方式中，固定相材料的整体料表现出具有0.4-3.0微米；0.5-3.0；0.6-3.0；0.7-3.0；0.9-3.0或1.0-3.0微米的平均粒径分布的颗粒填充的颗粒床的色谱效率和渗透性。
在本发明的设备的其它实施方式中，固定相材料的颗粒或整体料具有0.8至1.7cm3/g;0.9至1.6cm3/g;1.0至1.5cm3/g或1.1至1.5cm3/g的孔体积。
在本发明的设备的其它实施方式中，腔能在以下柱进口压力下实施体积排阻色谱：高于1000psi；高于2000psi；高于3000psi；高于4000psi；高于5000psi；高于6000psi；高于7000psi；高于8000psi；高于9000psi；高于10000psi；高于15000psi；或高于20000psi。在其它实施方式中，柱进口压力为约1000psi至约20000psi；约5000psi至约20000psi；约7000psi至约20000psi；约10000psi至约20000psi；约1000psi至约15000psi；约5000psi至约15000psi。
在本发明的设备的某些实施方式中，X是二氧化硅核、二氧化钛核、氧化铝核、有机-无机杂化物核或包含脂肪族桥连的硅烷的有机无机杂化物核。
在特定的实施方式中，X是包含脂肪族桥连的硅烷的有机-无机杂化物核。在某些其它特定的实施方式中，脂肪族桥连的硅烷的脂肪族基团是乙烯。
在本发明的设备的其它实施方式中，Q是亲水性基团、疏水性基团或不存在。
在本发明的设备的一些实施方式中，其中Q是亲水性基团，Q是脂肪族基团。在其它实施方式中，所述脂肪族基团是脂肪族二醇。
在其它实施方式中，Q用式2来表示：
式2
其中，
n1是0-30的整数;
n2是0-30的整数;
R1、R2、R3和R4每次出现独立地代表氢、氟、低级烷基、保护的或脱保护的醇、两性离子或基团Z；
Z代表：
a）通过固定相材料的表面与式3的部分之间的与共价或非共价的键的形成产生的表面连接基团：
(B1)x(R5)y(R6)zSi-
式3:
其中x是1-3的整数，
y是0-2的整数，
z是0-2的整数，
且x+y+z=3
R5和R6每次出现独立地代表甲基、乙基、正丁基、异丁基、叔丁基、异丙基、叔己基(thexyl)、取代或未取代的芳基、环烷基、支链烷基、低级烷基、保护的或脱保护的醇或两性离子基团；
B1代表-OR7、-NR7’R7”、-OSO2CF3或-Cl；其中R7、R7’和R7”各自代表氢、甲基、乙基、正丁基、异丁基、叔丁基、异丙基、叔己基、苯基、支链烷基或低级烷基；
b）通过直接的碳-碳键形成或通过杂原子、酯、醚、硫醚、胺、酰胺、酰亚胺、脲、碳酸酯、氨基甲酸酯、杂环、三唑或尿烷键直接连接到X的表面杂合基团；或
c）非共价连接到固定相材料的表面的被吸附基团；
d）通过由固定相材料表面（当W为氢时）与乙烯基或炔基反应形成共价键产生的表面连接基团；
Y代表直接的键；杂原子键；酯键；醚键；硫醚键；胺键；酰胺键；酰亚胺键；脲键；硫脲键；碳酸酯键；氨基甲酸酯键；杂环键；三唑键；尿烷键；二醇键；多元醇键；苯乙烯、乙二醇或丙二醇的低聚物；苯乙烯、乙二醇或丙二醇的聚合物；糖基、多支链糖基、树状高分子或分枝状聚合物(dendrigraph)或两性离子基团；且
A代表
i）亲水性末端基团；
ii）氢、氟、氟烷基、低级烷基或Z基团；或
iii）可官能化基团。
在本发明的设备的某些实施方式中，其中Q是式2的脂肪族二醇，n1是2-18或2-6的整数。在本发明的设备的其它实施方式中，其中Q是式2的脂肪族二醇，n2为0-18或0-6的整数。在本发明的设备的其它实施方式中，其中Q是式2的脂肪族二醇，n1是2-18的整数且n2是0-18的整数，n1是2-6的整数且其中n2是0-18的整数，n1是2-18的整数且n2是0-6的整数，或n1是2-6的整数且n2是0-6的整数。
在本发明的设备的其它实施方式中，其中Q是式2的脂肪族二醇，A代表i）亲水性末端基团，且所述亲水性末端基团是保护的或脱保护形式的醇、二醇、缩水甘油醚、环氧、三醇、多元醇、季戊四醇、乙氧基季戊四醇、1,3-二氧六环-5,5-二甲醇、三(羟甲基)氨基甲烷,、三（羟甲基）氨基甲烷聚乙二醇醚、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、单价、二价或多价糖基、多支链的糖、含有外部亲水性基团的树状高分子、含有外部亲水基团的分枝状聚合物或是两性离子基团。
在本发明的设备的其它实施方式中，其中Q是式2的脂肪族二醇，A代表ii）氢、氟、甲基、乙基、正丁基、叔丁基、异丙基、低级烷基或基团Z。
在本发明的设备的其它实施方式中，其中Q如式2所示，A代表iii）可官能化的基团，所述可官能化的基团是保护的或脱保护形式的胺、醇、硅烷、烯烃、硫醇、叠氮化物或炔烃。在一些实施方式中，所述可官能化的基团在随后的反应步骤中产生新的表面基团，其中，所述反应步骤是偶联、置换、自由基加成、氢化硅烷化、缩合、裂解(click)或聚合。
在本发明的设备的某些实施方式中，Z代表通过直接的碳-碳键形成或通过杂原子、酯、醚、硫醚、胺、酰胺、酰亚胺、脲、碳酸酯、氨基甲酸酯、杂环、三唑或尿烷键直接连接到表面杂化基团。
在其它实施方式中，Z代表非共价连接到材料的表面的被吸附的表面基团。该表面基团可以是交联的聚合物或其它被吸附的基团。例子包括但不限于醇、胺、硫醇、聚胺、树状高分子或聚合物。
在本发明的设备的一些实施方式中，外壳配有一个或更多个熔块以容纳固定相材料。在其它实施方式中，外壳配有一个或更多个能使该设备置于与样品注射器设备、监测器或这两者流体相通的配件。
在另一个方面，本发明提供实施SEC的方法，该方法包括以下步骤：
A）提供外壳，其具有至少一个壁来限定具有进口和出口的腔；和容纳于所述腔内的包含核和表面成分的固定相材料；
其中所述颗粒状固定相包含由式1代表的具有核成分和表面成分的颗粒：
W-[X]-Q
式I
其中：
X是核成分，其具有包含二氧化硅核材料、金属氧化物核材料、有机-无机杂化物核材料或它们的一组嵌段聚合物的表面；
W是氢或羟基；且
Q不存在或是使与被分析物的静电相互作用、范德华相互作用、氢键合相互作用或其它相互作用最小化的官能团；
B）以高于1000psi的柱进口压力向所述腔内加载样品以使样品流经所述固定相介质；和
C）基于大小将样品分离成一种或更多种成分。
在本发明的方法的实施方式中，柱进口压力高于2000psi；高于3000psi；高于4000psi；高于5000psi；高于6000psi；高于7000psi；高于8000psi；高于9000psi；高于10000psi；高于15000psi；或高于20000psi。在其它实施方式中，柱进口压力为约1000psi至约20000psi；约5000psi至约20000psi；约7000psi至约20000psi；约10000psi至约20000psi；1000psi至约15000psi；约5000psi至约15000psi。
在本发明的方法的另一个实施方式中，所述方法还包括以下步骤
D）分离所述一种或更多种成分。
在本发明的方法的另一个实施方式中，所述方法还包括以下步骤
E）检测所述一种或更多种成分。
在本发明的方法的另一个实施方式中，所述方法还包括以下步骤
D）分离所述一种或更多种成分；和
E）检测所述一种或更多种成分。
在本发明的方法的某些实施方式中，其中样品为生物大分子。在样品是生物大分子的实施方式中，Q可以是亲水性的。在一些实施方式中，Q是脂肪族基团。在其它实施方式中，所述脂肪族基团是脂肪族二醇。在其它实施方式中，Q由式2表示：
Figure BDA00001892453800091
式2
其中
n1是0-30的整数；
n2是0-30的整数；
R1、R2、R3和R4每次出现独立地代表氢、氟、低级烷基、被保护的或脱保护的醇、两性离子或基团Z；
Z代表：
a）通过固定相材料的表面与式3的部分之间的共价的或非共价的键的形成而产生的表面连接基团：
(B1)x(R5)y(R6)zSi-
式3
其中x是1-3的整数，
y是0-2的整数，
z是0-2的整数，
且x+y+z=3
R5和R6每次出现独立地代表甲基、乙基、正丁基、异丁基、叔丁基、异丙基、叔己基、取代的或未取代的芳基、环烷基、支链烷基、低级烷基、保护的或脱保护的醇或两性离子基团；
B1代表-OR7、-NR7’R7”、-OSO2CF3或-Cl；其中R7、R7’和R7”各自代表氢、甲基、乙基、正丁基、异丁基、叔丁基、异丙基、叔己基、苯基、支链烷基或低级烷基；
b）通过直接的碳-碳键形成或通过杂原子、酯、醚、硫醚、胺、酰胺、酰亚胺、脲、碳酸酯、氨基甲酸酯、杂环、三唑或尿烷键直接连接到X的表面杂合基团；或
c）非共价连接到固定相材料的表面的被吸附的基团；
d）通过固定相材料表面（当W为氢时）与乙烯基或炔基反应形成共价键产生的表面连接基团；
Y代表直接的键；杂原子键；酯键；醚键；硫醚键；胺键；酰胺键；酰亚胺键；脲键；硫脲键；碳酸酯键；氨基甲酸酯键；杂环键；三唑键；尿烷键；二醇键；多元醇键；苯乙烯、乙二醇或丙二醇的低聚物；苯乙烯、乙二醇或丙二醇的聚合物；糖基、多支链糖基、树状高分子或分枝状聚合物或两性离子基团；且
A代表
i）亲水性末端基团；
ii）氢、氟、氟烷基、低级烷基或Z基团；或
iii）可官能化基团。
在本发明的方法的其它实施方式中，样品是合成的有机聚合物。在样品是合成的有机聚合物的实施方式中，Q可以是疏水性的部分。另一个方面，本发明提供降低体积排阻色谱分析中光散射检测器获得噪音的发生率的方法，该法包括以下步骤：
A）提供外壳，其具有至少有一个壁以限定具有进口和出口的腔；和容纳于所述腔内的包含核和表面成分的固定相材料；
其中所述固定相材料包含由式I代表的颗粒或整体料：
W-[X]-Q
式I
其中：
X是核成分，其具有包含二氧化硅核材料、金属氧化物核材料、有机-无机杂合物核材料或它们的一组嵌段聚合物的表面；
W是氢或羟基；且
Q不存在或是使与被分析物的静电相互作用、范德华相互作用、氢键合相互作用或其它相互作用最小化的官能团；
B)以高于1000psi的柱进口压力向所述腔的所述固定材料上加载样品并使样品流经所述固定相介质；
C)基于大小将样品分离成一种或更多种成分；和
D）使用光散射检测器检测所述一种或更多种成分。在另一个方面，本发明提供降低体积排阻色谱分析中光散射检测器获得的鬼峰的发生率的方法，所述方法包括以下步骤：
A）提供外壳，其具有至少有一个壁以限定具有进口和出口的腔；
和容纳于所述腔内的包含核和表面成分的固定相材料；
其中所述固定相材料包含由式I代表的颗粒或整体料：
W-[X]-Q
式I
其中：
X是核成分，其具有包含二氧化硅核材料、金属氧化物核材料、有机-无机杂合物核材料或它们的一组嵌段聚合物的表面；
W是氢或羟基；且
Q不存在或是使与被分析物的静电相互作用、范德华相互作用、氢键合相互作用或其它相互作用最小化的官能团；
B)以高于1000psi的柱进口压力向所述腔的所述固定材料上加载样品并使样品流经所述固定相介质；
C)基于大小将样品分离成一种或更多种成分；和
D）使用光散射检测器检测所述一种或更多种成分。
对于本领域的技术人员来说，在看了下述的附图和阅读了随后的详细描述后，将明白到本发明的这些和其它特征和优点。
附图简述
图1描述了本发明的设备。
图2描述了根据本发明的SEC的结果。
图3描述了根据本发明制备的原型“K”装填的柱子的H-u曲线。柱子尺寸是4.6×150mm。流速范围是0.1-0.7mL/min。
图4描述了原型“D”的H-u曲线。柱子尺寸是4.6×150mm。流速范围是0.1-0.7mL/min。
图5描述了用表6中所述的材料装填的柱子的归一化了的校准曲线。斜率由每条曲线的线性区域获得。
图6描述由图5中所示各曲线获得的归一化的斜率对比孔容作的图。斜率是在每条曲线的线性范围内确定。
图7描述的是流速对用根据本发明制备的原型“K”装填的柱子（4.6×150mm）分离单克隆抗体的单体和二聚体的影响。
图8描述了流速对用比较柱“L”(4.6×300mm)分离单克隆抗体单体和二聚体的比较影响。
图9描述了用原型“K”装填的柱子(4.6×150mm)来分离单克隆抗体单体和二聚体时流速对塔板高度和分辨率的影响.
图10描述了用比较柱“L”(4.6×300mm)来分离单克隆抗体单体和二聚体时流速对塔板高度和分辨率的影响。
图11描述了温度对分离（1）甲状腺球蛋白、（2）IgG1、（3）牛血清白蛋白(BSA)、（4）肌红蛋白、（5）尿嘧啶的影响。顶部：用原型“K”填充的柱子，4.6×150mm。底部：比较柱“L”，4.6×300mm。
图12描述了盐类型对被分析物的保留时间的影响。流动相由10mM磷酸钠(pH 6.8)与200mM给定的盐组成。在磷酸盐的情况下，盐的浓度为100mM。
图13进一步描述了盐类型对被分析物的保留时间的影响。流动相由10mM磷酸钠(pH6.8)与200mM给定的盐组成。在磷酸盐的情况下，盐浓度为100mM。
图14描述了离子强度对碱性蛋白溶菌酶的保留时间的影响，使用a）根据本发明制备的柱子；和b）比较柱。
图15描述了使用具有原型“K”的柱子在0.2mL/min的流速下分离BSA的色谱图。图上同时显示了来自紫外检测器和光散射检测器的记录。
图16描述了使用具有原型“K”的柱子在0.5mL/min的流速下分离BSA的色谱图。图上同时显示了来自紫外检测器和光散射检测器的记录。
图17描述了使用比较柱L在0.3mL/min的流速下分离BSA的色谱图。图上同时显示了来自紫外检测器和光散射检测器的记录。
图18描述了使用比较柱M在0.3mL/min的流速下分离BSA的色谱图。图上同时显示了来自紫外检测器和光散射检测器的记录。
图19描述了使用比较柱N在0.3mL/min的流速下分离BSA的色谱图。图上同时显示了来自紫外检测器和光散射检测器的记录。
发明详述
现详细说明作为实施SEC的设备和方法的本发明的实施方式，同时应理解此类设备和方法是优选的设备和方法。这样的设备和方法构成发明人认为实施本发明的最佳的模式。本领域的技术人员将认识到这样的设备和方法是可以修改和改变的。
现在看图1，描绘了体现本发明的特征的设备，一般由编号11指示。设备11，用于实施SEC，包括以下主要元件或组件：外壳13和颗粒状固定相介质15。
外壳13具有至少一个壁17来确定腔19。如所描绘的，壁17呈具有内表面21和外表面23的圆筒的形式。虽然此处描述成柱子，但确定腔19的外壳13和壁17可以采取任何形状。例如，但非限制地，外壳13可以是平面片状结构，腔19形成于其中。
如所描绘的，至少一个壁17确定具有入口25和出口27的腔。虽然图1中，入口25不明显，但入口25和出口27有几个共同特征。入口25和出口27具有熔块料，只有出口27的熔块29显示出来了。如所描绘的，熔块是含有固定相的柱内元件，但允许流动相通过。在某些实施方式中，熔块可以由烧结金属或类似材料组成。在其它实施方式中，该熔块还可以由将床中的颗粒聚在一起的粘合剂或胶水组成，但其具有足够的多孔性以允许流体流过该床。在其它实施方式中，固定相材料可以是整体料。在这样的实施方式中，可以不需要熔块元件。
至少一个壁17在入口25处或附近具有第一连接装置，在出口27处或附近具有第二连接装置。第一连接装置包括通过配合螺纹[未显示]结合到至少一个壁17上的紧固螺母37。类似地，第二连接装置包括通过配合螺纹41结合到至少一个壁17上的第二紧固螺母39来支撑壁17。第一和第二连接装置可包括配合配件、夹子、互锁槽等（未显示）。第一连接装置和第二连接装置还可以包括套圈、密封圈、O形环等[未显示]，为了简洁这些部分在图中被省略了。
腔17的入口25与流体和样品的来源（通过数字43以块图形式绘制）流体相通。优选的流体和样品的来源具有在常规或超高效液相色谱范围内的约5000psi的操作压力。但颗粒和设备11能承受的操作压力为高于1000psi；高于2000psi；高于3000psi；高于4000psi；高于5000psi；高于6000psi；高于7000psi；高于8000psi；高于9000psi；高于10000psi。在本发明的设备的其它实施方式中，颗粒和设备11能承受的操作压力为约1000psi至约15000psi；约5000psi至约15000psi；约7000psi至约15000psi；约10000psi至约15000psi；约1000psi至约10000psi或约5000psi至约10000psi。
在某些特定的实施方式中，流体和样品的来源是
Figure BDA00001892453800141
Figure BDA00001892453800142
分离模块(Waters公司,Milford,Massachusetts,USA)。
腔17的出口27与检测器45流体相通。多个检测器是可使用的，然而，特定的检测器是
Figure BDA00001892453800143
可调紫外检测器(Waters公司,Milford,Massachusetts,USA)。
颗粒状固定相介质15保持在腔17中。颗粒状固定相介质15包含颗粒，它们在图1中没有被按比例绘制。颗粒通常是球形的，也可以是色谱中可用的任何形状。颗粒通常具有一定的大小分布，其中平均直径在1-3微米。
定义
如上使用的，术语“脂肪族基团”包括以直链或支链为特征的有机化合物，典型地具有1-22个碳原子。
脂肪族基团包括烷基、烯基和炔基。在复杂的结构中，链可以是支链的或交联的。烷基包括具有一个或更多个碳原子的饱和烃类，包括直链烷基和支链烷基。这样的烃部分可以在一个或更多个碳原子上被例如卤素、羟基、巯基、氨基、烷氧基、烷基羧基、烷硫基或硝基取代。除非对碳的数量另外指定，如本文中使用的“低级脂肪族”指的如上定义的脂肪族基团（例如低级烷基、低级烯基、低级炔基），但是具有1至6个碳原子。这种低级脂肪族基团例如低级烷基代表性的有甲基、乙基、正丙基、异丙基、2-氯丙基、正丁基、仲丁基、2-氨基丁基、异丁基、叔丁基、3-硫代戊基等。如本文中使用的，术语“硝基”指-NO2；术语“卤素”指-F、-Cl、-Br或-I;术语“巯基”表示SH；术语“羟基”表示-OH。因此，如本文中使用的术语“烷基氨基”表示其上连接了氨基的如上定义的烷基。合适的烷基氨基包括具有1至约12个碳原子或1至6个碳原子的基团。术语“烷硫基”是指其上连接了巯基如上定义的烷基。合适的烷硫基包括具有1至约12个碳原子或1至约6个碳原子的基团。如本文中使用的术语“烷基羧基”表示其上连接了一个羧基的如上定义的烷基。如本文中使用的术语“烷氧基”表示其上连接了一个氧原子的如上定义的烷基。代表性的烷氧基包括1至约12个碳原子或1至约6个碳原子的基团，例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔丁氧基等。术语“烯基”和“炔基”指类似于烷基的不饱和的脂肪族基团，但分别含有至少一个双键和三键。合适的烯基和炔基包括具有2至约12个碳原子或1至约6个碳原子的基团。
术语“脂环族基团”包括3个或更多个碳原子的闭环结构。脂环族基团包括环烷烃或环烷（是饱和的环状烃），环烯烃（具有2个或更多个双键的不饱和的），环炔烃（具有三键）。它们不包括芳香族基团。环烷烃的例子包括环丙烷、环己烷和环戊烷。环烯烃的例子包括环戊二烯和环辛四烯。脂环族基团还包括稠环结构和取代的脂环族基团如烷基取代的脂环族基团。在脂族环的情况下，这种取代基可进一步包括低级烷基、低级烯基、低级烷氧基、低级烷基硫基、低级烷基氨基低级烷基羧基、硝基、羟基、-CF3、-CN等。
术语“杂环基团”包括闭合的环结构，其中环中的一个或更多个原子是除碳以外的其它元素，如氮、硫或氧。杂环基团可以是饱和或不饱和的，杂环基团如吡咯和呋喃能具有芳香族的性质。它们包括稠环结构例如喹啉和异喹啉。杂环基团的其它例子包括吡啶和嘌呤。杂环基团还可在一个或更多个组成原子处被以下基团取代，如卤素、低级烷基、低级烯基、低级烷氧基、低级烷基硫基、低级烷基氨基、低级烷基羧基、硝基、羟基、-CF3、-CN等。合适的杂芳族和杂脂环族基团一般将有1至3个独立的或稠合的环，每环具有三至八个成员，和一个或更多个氮、氧或硫原子，例如，香豆素基、喹啉基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、呋喃基、吡咯基、噻吩基、噻唑基、噁唑基、咪唑基、吲哚基、苯并呋喃基、苯并噻唑基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、哌啶基、吗啉基和吡咯烷基。
术语“芳香族基团”包括含有一个或更多个环的不饱和环状烃。芳香族基团包括可含有0-4个杂原子的五元和六元单环基团，例如苯、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、三唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶等。芳香环可以在一个或更多个环位点被例如卤素、低级烷基、低级烯基、低级烷氧基、低级烷基硫基、低级烷基氨基、低级烷基羧基、硝基、羟基、-CF3、-CN等取代。
术语“烷基”包括饱和的脂肪族基团，包括直链烷基、支链烷基、环烷基（脂环族基团）、烷基取代的环烷基和环烷基取代的烷基。在某些实施方式中，直链或支链烷基在其主链中具有30个或更少的碳原子，如C1-C30的直链或C3-C30的支链。在某些实施方式中，直链或支链烷基在其主链中含有20个或更少的碳原子，如C1-C20的直链或C3-C20的支链，在一些实施方式中为18个或更少。类似的，特定的环烷基在它们的环结构中具有4-10个碳原子，在一些实施方式中，具有4-7个碳原子。术语“低级烷基”指主链中具有1至6个碳原子的烷基或环结构中具有3至6个碳原子的环烷基。
而且，贯穿整个说明书和权利要求书所用的术语“烷基”（包括“低级烷基”）包括“未取代的烷基”和“取代的烷基”，后者指在烃主链的一个或更多个碳原子上的氢被取代基取代的烷基。这样的取代基可包括卤素、羟基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、羧酸酯基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷硫基羰基、烷氧基、磷酸酯、膦酸酯(phosphonato)、次膦酸酯(phosphinato)、氰基、氨基（包括烷基氨基、二烷基胺基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基）、酰氨基（包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨甲酰基和脲基）、脒基、亚氨基、巯基、烷基硫基、芳基硫基、硫代羧酸酯、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、芳烷基、芳香族或杂芳香族基团。本领域的技术人员将理解，如果适当，烃链上的被取代的部分本身能被取代。环烷基能进一步被例如上述的取代基取代。“芳烷基”部分是被芳基(例如，具有1至3个独立的或稠合的环和6至约18个碳环原子的芳基)取代的烷基，如苯甲基（苄基）。
术语“芳基”包括可含有0-4个杂原子的五元和六元单环芳族基团，例如未取代和取代的苯、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、三唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶等。芳基还包括多环稠合的芳香族基团，例如萘基、喹啉基、吲哚基等。芳香族环可以在一个或更多个环位置上被例如以上针对烷基所述的取代基取代。合适的芳基包括未取代的和取代的苯基。如本文中使用的术语“芳氧基”表示其上连接氧原子的如上定义的的芳基。
如本文中使用的术语“芳烷氧基”表示其上连接氧原子的芳烷基。合适的芳烷氧基具有1至3个独立的或稠合的环和6至约18个碳环原子，如：O-苄基。
如本文中使用的术语“氨基”指式-NRaRb的未取代的或取代的部分，其中Ra和Rb各自独立地是氢、烷基、芳基或杂环，或者Ra、Rb和它们所连接的氮原子一起形成环中具有3至8个原子的环部分。因此，术语“氨基”包括环状氨基部分，例如哌啶基或吡咯烷基（除非另有说明）。“氨基取代的氨基”是指其中Ra和Rb中的至少一个进一步被氨基取代的氨基。
如本文中使用的术语“保护基团”指有机合成领域中众所周知的官能团的化学改性。示例性的保护基团可以不同并且通常在《ProtectiveGroups in Organic Synthesis》[T.W.Green和P.G.M.Wuts,JohnWiley & Sons,Inc,1999]中有描述。
“杂合物”，包括“有机-无机杂合物材料”，包括无机为基础的结构，其中有机官能度对内部或“骨架”无机结构以及杂合物材料表面都是不可或缺的。杂合物材料的无机部分可以是例如氧化铝、二氧化硅、钛、铈、锆或它们的氧化物、或陶瓷材料。“杂合物”包括无机为基础的结构，其中有机官能度对内部或“骨架”无机结构以及杂合物材料表面都是不可或缺的。如上所述，示例性的杂合物材料显示于美国专利第4,017,528、6,528,167、6,686,035和7,175,913号中。
如本文中使用的术语“BEH”，指有机-无机杂合物材料，其是以乙烯桥接的杂合物材料。
如本文中使用的术语“被吸附的基团”，代表非共价地连接到核材料上的单体、低聚物或高聚物，交联的或非交联的。在本发明的某些实施方式中，其中Z代表被吸附的基团，这个基团可以被吸附到核材料X上、核材料X的表面或固定相材料的表面上。例子包括但不限于，醇、胺、硫醇、聚胺、树状高分子或聚合物。
术语“官能化基团”或的“可官能化的基团”包括赋予固定相某种色谱官能度的有机官能团。
如本文中使用的术语“末端基团”代表不能进一步发生反应的基团。在某些实施方式中，末端基团可以是亲水性基团。亲水性末端基团包括但不限于，保护或脱保护形式的醇、二醇、缩水甘油醚、环氧、三元醇、多元醇、季戊四醇、乙氧基化季戊四醇基、1,3-二氧六环-5,5-二甲醇、三（羟甲基）氨基甲烷、三（羟甲基）氨基甲烷聚乙二醇醚、乙二醇、丙二醇、聚(乙二醇）、聚（丙二醇）、单价、二价或多价糖基、多支链糖、含外部亲水性基团的树状高分子、含有外部亲水基团的分枝状聚合物或两性离子基团。
如本文中使用的术语“表面连接基团”，代表可以反应以便以共价键、非共价键、吸附或以其它方式连接到核材料、核材料的表面或固定相材料的表面的基团。在某些实施方式中，表面连接基团通过硅氧烷键连接到核材料的表面。
如本文中使用的术语“减少噪音的发生率”指减少或降低检测器获得的噪音的量或严重程度。这种减少可以由本领域的普通技术人员通过在相同的条件下（温度、浓度、流速等）与常规的SEC柱（例如Tosoh TSKgel(R)SuperSW3000,4.6×300mm,P/N 18675）的样品的比较来容易地确定。
如本文中使用的术语“减少鬼峰的发生率”，指减少或降低检测器获得的鬼峰的数量或严重程度。此类减少可以由本领域的普通技术人员通过在相同的条件下（温度、浓度、流速等）与常规的SEC柱（例如Tosoh TSKgel(R)SuperSW3000,4.6×300mm,P/N 18675）的样品的比较来容易地确定。
固定相材料
本发明的设备和方法使用固定相材料。这种材料可以由整体料、一种或更多种颗粒、一种或更多种球形颗粒或一种或更多种薄膜颗粒组成。
在某些实施方式中，所述固定相材料包含由式I代表的具有核成分和表面成分的颗粒或整体料：
W-[X]-Q
式1
其中：
X是核成分，其表面包含二氧化硅核材料、金属氧化物核材料、有机-无机杂合物核材料或它们的一组嵌段聚合物；
W是氢或羟基；且
Q不存在或是使与被分析物的静电相互作用、范德华相互作用、氢键合相互作用和其它相互作用最小化的官能团。
而且，在某些实施方式中，W和Q占据了核成分X的自由价或核成分的表面。在本发明的设备的其它实施方式中，选择W和Q以形成表面成分。在其它实施方式中，可选择X以形成一种或一组嵌段聚合物。
在当固定相为颗粒状时的本发明的各方面中，颗粒状固定相颗粒可具有平均粒径分布为0.4-3.0微米;0.5-3.0;0.6-3.0;0.7-3.0;0.9-3.0或1.0-3.0微米的直径内。
在本发明的设备的其它实施方式中，固定相材料包含整体料。在固定相材料包含颗粒的本发明的设备的实施方式中，固定相材料的整体料表现出用具有0.4-3.0微米；0.5-3.0；0.6-3.0；0.7-3.0；0.9-3.0或1.0-3.0微米的平均粒径分布的颗粒装填的颗粒床的色谱效率和渗透性。
在本发明的设备的其它实施方式中，固定相材料具有0.8至1.7cm3/g;0.9至1.6cm3/g;1.0至1.5cm3/g或1.1至1.5cm3/g的孔体积。
在固定相材料的某些实施方式中，X是二氧化硅、二氧化钛、氧化铝或包含脂肪族桥接的硅烷的有机-无机杂合物核材料。
在特定的实施方式中，X是包含脂肪族桥接的硅烷的有机-无机杂合物核。在某些其它特定的实施方式中，脂肪族桥接的硅烷的脂肪族基团是乙烯。
在某些其它的实施方式中，核材料X可以是氧化铈、氧化锆或陶瓷材料。在某些其它的实施方式中，核材料X可具有在色谱上提高的孔几何特征(CEPG)。CEPG包括被发现提高材料的色谱分离能力的几何特征，例如显著不同于本领域中其它色谱介质的几何特征。例如，能形成、选择或构建几何特征，各种性质和/或因素能用于确定材料的色谱分离能力是否得到了“提高”，例如与本领域中已知或常规使用的作比较。这些因素的例子包括高的分离效率，更长的柱寿命和高的传质性质（这些可以从例如减小的谱带扩展和良好的峰形得到证实）。这些性质可以用业内认可的技术来测定或观察。例如，本发明的多孔无机/有机杂合物颗粒的色谱上提高的孔几何特征显著不同于现有技术颗粒，因其不存在“墨水瓶”或“壳形”孔几何特征或形态学特征，这两者都是不希望的，因为它们例如降低了传质速率，导致更低的效率。色谱上提高的孔几何特征发现于含有仅少量微孔的杂合物材料中。当所有直径约
Figure BDA00001892453800211
的孔造成的材料的比表面积小于约110m2/g时，在杂合物材料中实现少量微孔。具有如此的低微孔表面积（MSA）的杂合物材料能给出色谱提高，包括高的分离效率和优良的传质性质（这些可以从例如减小的谱带扩展和良好的峰形得到证实）。微孔表面积（MSA）被定义为直径小于或等于
Figure BDA00001892453800212
的孔的表面积，是使用BJH法通过从等温线的吸附段(adsorption leg)的多点氮气吸附分析来测定。如本文中使用的，首字母缩写词“MSA”和“MPA”可互换地用于表示“微孔表面积”。
在某些实施方式中，核材料X可以是用式“Za(R’)bSi-R”的表面改性剂表面改性的，其中Z=Cl、Br、I、C1-C5烷氧基、二烷基氨基或三氟甲基磺酸酯；a和b各自是0至3的整数，只要a+b=3；R’是C1-C6直链、环状或支链烷基，R”是官能化基团。
在另一个实施方式中，核材料X可以通过用聚合物涂布而被表面改性。
在某些实施方式中，表面改性剂选自辛基三氯硅烷、十八烷基三氯硅烷、辛基二甲基氯硅烷和十八烷基二甲基氯硅烷。在一些实施方式中，表面改性剂选自辛基三氯硅烷和十八烷基三氯硅烷。在其它实施方式中，表面改性剂选自异氰酸酯或1,1’-羰基二咪唑（尤其是当杂化合物基团含有(CH2)3OH基团时）。
在另一个实施方式中，材料已通过有机基团和硅烷醇基团改性的组合表面改性。
在另一个实施方式中，材料已通过有机基团改性和用聚合物涂布的组合表面改性。在另一个实施方式中，有机基团包含手性部分。
在另一个实施方式中，材料已通过硅烷醇基团改性和用聚合物涂布的组合表面改性。
在其它实施方式中，材料的表面改性是通过材料上的有机基团与改性试剂之间有机共价键的形成来实现的。
在其它实施方式中，材料已通过有机基团改性、硅烷醇基团改性和用聚合物涂布的组合表面改性。
在另一个实施方式中，材料已通过硅烷醇基团改性表面改性。在某些实施方式中，表面改性的层可以是多孔或非多孔的。
在固定相材料的其它实施方式中，Q是亲水性基团、疏水性基团或不存在。
在固定相材料的一些实施方式中，其中Q是亲水性基团，Q是脂肪族基团。在其它实施方式中，所述脂肪族基团是脂肪族二醇。
在其它实施方式中，Q用式2表示：
Figure BDA00001892453800221
式2
其中：
n1是0-30的整数；
n2是0-30的整数；
每个R1、R2、R3和R4每次出现独立地代表氢、氟、低级烷基、保护的或脱保护的醇、两性离子或基团Z；
Z代表：
a)通过固定相材料的表面与式3的部分之间的共价的或非共价的键的形成而产生的表面连接基团：
(B1)x(R5)y(R6)zSi-
式3
其中x是1-3的整数，
y是0-2的整数，
z是0-2的整数，
且x+y+z=3
R5和R6每次出现独立地代表甲基、乙基、正丁基、异丁基、叔丁基、异丙基、叔己基、取代的或未取代的芳基、环烷基、支链烷基、低级烷基、保护的或脱保护的醇或两性离子基团；
B1代表-OR7、-NR7’R7”、-OSO2CF3或-Cl；其中R7、R7’和R7”各自代表氢、甲基、乙基、正丁基、异丁基、叔丁基、异丙基、叔己基、苯基、支链烷基或低级烷基；
b）通过直接的碳-碳键形成或通过杂原子、酯、醚、硫醚、胺、酰胺、酰亚胺、脲、碳酸酯、氨基甲酸酯、杂环、三唑或尿烷键直接连接到X的表面杂合基团；或
c）非共价连接到固定相材料的表面的被吸附的基团；
d）通过固定相材料表面（当W为氢时）与乙烯基或炔基反应形成共价键产生的表面连接基团；
Y代表直接的键；杂原子键；酯键；醚键；硫醚键；胺键；酰胺键；酰亚胺键；脲键；硫脲键；碳酸酯键；氨基甲酸酯键；杂环键；三唑键；尿烷键；二醇键；多元醇键；苯乙烯、乙二醇或丙二醇的低聚物；苯乙烯、乙二醇或丙二醇的聚合物；糖基、多支链糖基、树状高分子或分枝状聚合物或两性离子基团；且
A代表
i）亲水性末端基团；
ii）氢、氟、氟烷基、低级烷基或Z基团；或
iii）可官能化基团。
在本发明的设备的某些实施方式中，其中Q是式2的脂肪族二醇，n1是2-18或2-6的整数。在本发明的设备的其它实施方式中，其中Q是式2的脂肪族二醇，n2为0-18或0-6的整数。在本发明的设备的其它实施方式中，其中Q是式2的脂肪族二醇，n1是2-18的整数且n2是0-18的整数，n1是2-6的整数且其中n2是0-18的整数，n1是2-18的整数且n2是0-6的整数，或n1是2-6的整数且n2是0-6的整数。
在固定相材料的其它实施方式中，其中Q是式2的脂肪族二醇，A代表i）亲水性末端基团，且所述亲水性末端基团是保护的或脱保护形式的醇、二醇、缩水甘油醚、环氧、三醇、多元醇、季戊四醇、乙氧基化季戊四醇、1,3-二氧六环-5,5-二甲醇、三(羟甲基)氨基甲烷、三（羟甲基）氨基甲烷聚乙二醇醚、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、单价、二价或多价糖基、多支链的糖、含有外部亲水性基团的树状高分子、含有外部亲水基团的分枝状聚合物或是两性离子基团。
在固定相材料的其它实施方式中，其中Q是式2的脂肪族二醇，A代表ii）氢、氟、甲基、乙基、正丁基、叔丁基、异丙基、低级烷基或基团Z。
在固定相材料的其它实施方式中，其中Q是式2的脂肪族二醇，A代表iii）可官能化的基团，所述可官能化的基团是保护的或脱保护形式的胺、醇、硅烷、烯烃、硫醇、叠氮化物或炔烃。在一些实施方式中，所述可官能化的基团在随后的反应步骤中产生新的表面基团，其中，所述反应步骤是偶联、置换、自由基加成、氢化硅烷化、缩合、裂解(click)或聚合。
在其它实施方式中，Q可以是表面改性剂。能用于这些材料的表面改性剂的非限制性例子包括：
A）产生亲水性表面改性的硅烷
Figure BDA00001892453800241
亲水性表面
Figure BDA00001892453800251
其中A选自以下基团：
Figure BDA00001892453800252
或
B）产生疏水性或混合的亲水性/疏水性表面改性的硅烷
Figure BDA00001892453800261
疏水性表面
Figure BDA00001892453800262
其中A选自以下基团：H、苯基、NHC(O)NHR8、NHC(O)R8、OC(O)NHR8、OC(O)OR8或三唑-R8，其中R8是十八烷基、十二烷基、癸基、辛基、己基、正丁基、叔丁基、正丙基、异丙基、苯基、苄基、苯乙基、苯基乙基、苯基丙基、二苯基乙基、联苯基。
在本发明的设备的某些实施方式中，Z代表通过直接的碳-碳键形成或通过杂原子、酯、醚、硫醚、胺、酰胺、酰亚胺、脲、碳酸酯、氨基甲酸酯、杂环、三唑或尿烷键结合到表面有机官能杂合物基团上。
在其它实施方式中，Z代表非共价地连接到材料表面的被吸附的表面基团。这种表面基团可以是交联的聚合物或其它被吸附的表面基团。例子包括但不限于醇、胺、硫醇、聚胺、树状高分子或聚合物。外壳、检测器和进样器
在本发明的设备的一些实施方式中，外壳配备了一个或多个熔块来容纳固定相材料。在固定相材料为整体料的实施方式中，可使用不包括一个或多个熔块的外壳。
在其它实施方式中，外壳配备了一个或多个配件，所述配件能安置设备使其与进样器、检测器或同时与这两者流体连通。
用于体积排阻色谱的检测器的例子包括但不限于折光率检测器、紫外检测器、光散射检测器和质谱。
进样器的例子包括但不限于柱头(on-column)进样器、程序升温（PTV）进样器、气体取样阀、吹扫捕集系统、多进样器、分流进样器、不分流进样器、分流/不分流进样器。
实施体积排阻色谱的方法
在另一个方面，本发明提供实施体积排阻色谱的方法，该方法包括以下步骤：
A)提供外壳，其具有至少一个壁来限定具有进口和出口的腔；和容纳于所述腔内的包含核和表面成分的固定相材料；其中所述颗粒状固定相包含式1代表的具有核成分和表面成分的颗粒：
W-[X]-Q
式I
其中：
X是核成分，其具有包含二氧化硅核材料、金属氧化物核材料、有机-无机杂合物核材料或它们的一组嵌段聚合物的表面；
W是氢或羟基；且
Q不存在或是使与被分析物的静电相互作用、范德华相互作用、氢键合相互作用或其它相互作用最小化的官能团；
B)以高于1000psi的柱进口压力向所述腔内加载样品以使样品流经所述固定相介质；和
C)基于大小将样品分离成一种或更多种成分。
在本发明的方法的某些实施方式中，柱进口压力高于2000psi；高于3000psi；高于4000psi；高于5000psi；高于6000psi；高于7000psi；高于8000psi；高于9000psi；高于10000psi；高于15000psi；或高于20000psi。在其它实施方式中，柱进口压力为约1000psi至约20000psi；约5000psi至约20000psi；约7000psi至约20000psi；约10000psi至约20000psi；约1000psi至约15000psi；或约5000psi至约15000psi。
在本发明的方法的另一个实施方式中，所述方法还包括以下步骤
D）分离所述一种或更多种成分
在本发明的方法的另一个实施方式中，所述方法还包括以下步骤
E）检测所述一种或更多种成分
在本发明的方法的另一个实施方式中，所述方法还包括以下步骤
D）分离所述一种或更多种成分；和
E）检测所述一种或更多种成分。
在本发明的方法的某些实施方式中，所述样品为生物大分子。在样品是生物大分子的实施方式中，Q可以是亲水性的。在一些实施方式中，Q是脂肪族基团。在其它实施方式中，所述脂肪族基团是脂肪族二醇。在其它实施方式中，所述脂肪族二醇由式2表示：
Figure BDA00001892453800281
式2
其中
n1是0-30的整数；
n2是0-30的整数；
R1、R2、R3和R4每次出现独立地代表氢、氟、低级烷基、保护的或脱保护的醇、两性离子或基团Z；
Z代表：
a)通过固定相材料的表面与式3的部分之间的共价的或非共价的键的形成而产生的表面连接基团：
(B1)x(R5)y(R6)zSi-
式3
其中x是1-3的整数，
y是0-2的整数，
z是0-2的整数，
且x+y+z=3
R5和R6每次出现独立地代表甲基、乙基、正丁基、异丁基、叔丁基、异丙基、叔己基、取代的或未取代的芳基、环烷基、支链烷基、低级烷基、保护的或脱保护的醇或两性离子基团；
B1代表-OR7、-NR7’R7”、-OSO2CF3或-Cl；其中R7、R7’和R7”各自代表氢、甲基、乙基、正丁基、异丁基、叔丁基、异丙基、叔己基、苯基、支链烷基或低级烷基；
b）通过直接的碳-碳键形成或通过杂原子、酯、醚、硫醚、胺、酰胺、酰亚胺、脲、碳酸酯、氨基甲酸酯、杂环、三唑或尿烷键直接连接到X的表面杂合基团；或
c）非共价连接到固定相材料的表面的被吸附的基团；
d）通过固定相材料表面（当W为氢时）与乙烯基或炔基反应形成共价键产生的表面连接基团；
Y代表直接的键；杂原子键；酯键；醚键；硫醚键；胺键；酰胺键；酰亚胺键；脲键；硫脲键；碳酸酯键；氨基甲酸酯键；杂环键；三唑键；尿烷键；二醇键；多元醇键；苯乙烯、乙二醇或丙二醇的低聚物；苯乙烯、乙二醇或丙二醇的聚合物；糖基、多支链糖、树状高分子或分枝状聚合物或两性离子基团；且
A代表
i）亲水性末端基团；
ii）氢、氟、甲基、乙基、正丁基、叔丁基、异丙基、低级烷基或基团Z；或
iii）可官能化基团。
在本发明的方法的其它实施方式中，样品是合成的有机聚合物。在样品是合成的有机聚合物的实施方式中，Q可以是疏水性的。
在另一个方面，本发明提供降低体积排阻色谱分析中光散射检测器获得噪音的发生率的方法，该法包括以下步骤：
A）提供外壳，其具有至少有一个壁以限定具有进口和出口的腔；和容纳于所述腔内的包含核和表面成分的固定相材料；
其中所述固定相材料包含由式I代表的颗粒或整体料：
W-[X]-Q
式I
其中：
X是核成分，其具有包含二氧化硅核材料、金属氧化物核材料、有机-无机杂合物核材料或它们的一组嵌段聚合物的表面；
W是氢或羟基；且
Q不存在或是使与被分析物的静电相互作用、范德华相互作用、氢键合相互作用或其它相互作用最小化的官能团；
B）以高于1000psi的柱进口压力向所述腔的所述固定材料上加载样品并使样品流经所述固定相介质；
C）基于大小将样品分离成一种或更多种成分；和
D）使用光散射检测器检测所述一种或更多种成分。
在另一个方面，本发明提供降低体积排阻色谱分析中光散射检测器获得的鬼峰的发生率的方法，所述方法包括以下步骤：
A)提供外壳，其具有至少有一个壁以限定具有进口和出口的腔；和容纳于所述腔内的包含内核和表面成分的固定相材料；
其中所述固定相材料包含由式I代表的颗粒或整体料：
W-[X]-Q
式I
其中：
X是核成分，其具有包含二氧化硅核材料、金属氧化物核材料、有机-无机杂合物核材料或它们的一组嵌段聚合物的表面；
W是氢或羟基；且
Q不存在或是使与被分析物的静电相互作用、范德华相互作用、氢键合相互作用或其它相互作用最小化的官能团；
B)以高于1000psi的柱进口压力向所述腔的所述固定材料上加载样品并使样品流经所述固定相介质；
C)基于大小将样品分离成一种或更多种成分；和
D)使用光散射检测器检测所述一种或更多种成分。
在特定的实施方式中，噪音和鬼峰的减少使用标准的常规SEC柱来测定。在其它实施方式中，噪音和鬼峰的减少用标准的常规未经预洗的SEC柱来测定。任何情况下，噪音和鬼峰的减少都使用普通的样品在基本上等同的条件下（温度，进口压力，检测器，柱尺寸等等）来测定，这是本领域的普通技术人员已知的。
对于本领域的技术人员来说，在看了下述的附图和阅读随后的详细描述后，将清楚地认识到本发明的这些和其它特征和优点将明显。
实施例
本发明可通过描述色谱设备和方法的以下非限制性的实施例来进一步说明。
材料
所有的试剂都以收到时的状态来使用，除非另作说明。本领域的技术人员将认识到存在以下供应品和供应商的等同体，因此，以下所列的供应商不应解释为限制性的。
表征
本领域的技术人员将认识到存在以下仪器和供应商的等同体，因此，以下所列的仪器不应解释为限制性的。
％C值通过燃烧分析（CE-440元素分析仪，Exeter Analytical Inc.,North Chelmsford,MA）或通过库仑碳分析仪(Coulometric CarbonAnalyzer）（模块CM5300,CM5014,UIC Inc.,Joliet,IL）来测定。溴和氯含量通过烧瓶燃烧随后离子色谱分析（Atlantic Microlab,Norcross,GA）来测定。材料的比表面积（SSA）、比孔容（SPV）和平均孔径（APD）使用多点N2吸附法（(Micromeritics ASAP 2400;Micromeritics Instruments Inc.,Norcross,GA）来测定。使用BET法计算SSA，SPV是对P/P0>0.98测定的单点值，APD是使用BJH法从等温线的脱附段(desorption leg)计算得到的。微孔表面积（MSA）被测定为比表面积（SSA）减去孔径
Figure BDA00001892453800321
的孔的累积吸附孔径数据。
间隙孔直径中值（MMPD）和间隙孔孔体积（MPV）通过水银孔率法测定（Micromeritics AutoPore II 9220或AutoPore IV,Micromeritics,Norcross,GA）。骨架密度使用Micromeritics AccuPyc1330氦比重瓶（V2.04N，Norcross,GA）来测定。颗粒大小使用Beckman CoulterMultisizer3分析仪（30微米孔径，70000计数；迈阿密，佛罗里达州）来测定。粒子直径（dp50）测定为基于粒径分布的体积的50％累积直径的。分布的宽度测定为90％累积体积直径除以10％累积体积直径（表示为90/10比率）。这些材料的黏度使用Brookfield数字粘度计DV-II型（Middleboro，MA）来测定。pH值的测定使用Oakton pH100系列表（Cole-Palmer，Vernon Hills,Illinois），并在使用之前用Orion（Thermo Electron,Beverly,MA）pH标准缓冲液在室温下进行校准。
使用Metrohm 716 DMS Titrino自动滴定仪（Metrohm,Hersau,Switzerland）进行滴定，记录为毫当量/克（mequiv/g）。多核（13C，29Si）CP-MAS NMR谱使用Bruker InstrumentsAvance-300分光光度计（7毫米双宽带探头）获得。旋转速度典型地为5.0-6.5kHz，再循环延迟是5秒，交叉极化的接触时间为6毫秒。使用外标金刚烷（13CCP-MAS NMR，□38.55）和六甲基环三硅氧烷（29Si CP-MAS NMR，□-9.62）记录相对四甲基硅烷的报导的13C和29Si CP-MAS NMR谱的迁移。不同的硅环境的个体数使用DMFit软件通过光谱反卷积法来评估。[Massiot,D.;Fayon,F.;Capron,M.;King,I.;Le Calvé,S.;Alonso,B.;Durand,J.-O.;Bujoli,B.;Gan,Z.;Hoatson,G.Magn.Reson.Chem.2002,40,70-76]
实施例1
将
Figure BDA00001892453800331
X-100（X100,陶氏化学(Dow Chemical),Midland,MI）、去离子水和乙醇(EtOH;无水,J.T.Baker,Phillipsburgh,NJ）的水性混合物在55℃下加热0.5小时。在独立的烧瓶中，油相溶液通过把POS（按US 6,686,035B2的实施例1h中详细描述的制备）与甲苯（Tol;HPLC级,J.T.Baker,Phillipsburgh,NJ）混合0.5小时来制备。在快速的搅拌下，将油相溶液加入到EtOH/水/X100的混合物中，并用转子/定子混合器（100L型,Charles Ross & Son Co.,Hauppauge,NY）乳化于水相中。然后把30%的氢氧化铵（NH4OH;J.T.Baker,Phillipsburgh,NJ）加到该乳化液中。悬浮在溶液中，把胶凝化的产品转移到烧瓶中并在55℃下搅拌18小时。在0.5微米的滤纸上收集所得分子式为{(O1.5SiCH2CH2SiO1.5)(SiO2)4}的球状、多孔、杂合物无机/有机颗粒，并连续用水和甲醇（HPLC级,J.T.Baker,Phillipsburgh,NJ）洗涤。然后，将产品在真空干燥烘箱中于80℃干燥过夜。用于制备这些产品的原料的特定的量列在表3中。这些材料的%C值、比表面积（SSA）、比孔容（SPV）和平均孔径（APD）列在表1中。经扫描电镜确认，通过这种方法制备的产品是高度球形的自由流动的颗粒。
随着甲苯/POS质量比的增加造成SPV从1.07到1.68cm3/g的增加。而需要增加颗粒的多孔性是SEC分离领域内众所周知的。
表1
Figure BDA00001892453800341
实施例2
虽然实施例1中制备的产品的球状形态学和SPV可与许多高质量SEC填充材料相媲美，大部分这些产品的APD低于为较大分子分离（例如，
Figure BDA00001892453800342
设计的大多数的商品填充材料。为了在更有用的范围内增加APD以用于更大大分子的SEC，本实施例阐述了对这些材料使用水热处理的开发。
按一定尺寸制备实施例1中的多孔性颗粒以产生1.5-3.0微米的粒度分布。可以使用多种众所周知的定尺寸(size)技术。这样的定尺寸技术在例如W.Gerhartz等人（编辑）《Ullmann’s Encyclopedia ofIndustrial Chemisty》，第五版，第B2卷：单元操作I，VCHVerlagsgesellschaft mbH,(Weinheim,Fed.Rep.Germ.1988)中有描述。
这些颗粒与三（羟甲基）氨基甲烷（TRIS;Aldrich,Milwaukee,WI）或三乙胺（TEA;Aldrich,Milwaukee,WI）的水溶液混合以产生浆料。按需要通过加入稀释的乙酸调节浆料的pH。然后将所得悬浮液转移到一个不锈钢高压釜内，加热到120-155℃，维持20-41小时。反应2a和2c在玻璃器皿内进行。在高压釜冷却到室温后，在0.5微米的滤纸上分离产品并用水和甲醇（HPLC级,J.T.Baker,Phillipsburgh,NJ）重复洗涤，然后在真空下于80℃干燥20小时。具体的水热处理条件列在表2中（碱溶液的毫升数/克颗粒、初始碱溶液的浓度和pH、反应温度、反应持续时间）。这些材料的比表面积（SSA）、比孔容（SPV）、平均孔径（APD）、微孔表面积（MSA）和%C值列在表2中。
表2
Figure BDA00001892453800361
Figure BDA00001892453800371
Figure BDA00001892453800381
实施例3
将根据实施例2制备的多孔性颗粒分散在1摩尔的盐酸溶液中（Aldrich,Milwaukee,WI），在98℃保持20小时。酸处理完成后，颗粒用水洗至中性pH，然后用丙酮洗涤（HPLC级,J.T.Baker,Phillipsburgh,N.J.）。颗粒可以进一步通过在丙酮中沉降来处理，以除去亚微米级的细小颗粒。颗粒在真空下于80℃干燥16小时。这些材料的具体的特征数据列在表3中。
表3
Figure BDA00001892453800401
Figure BDA00001892453800411
实施例4
将根据实施例2制备的多孔性颗粒被分散在缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷（GLYMO,Aldrich,Milwaukee,WI）在20mM醋酸缓冲液（pH 5.5，用醋酸和醋酸钠制备，J.T.Baker）中的溶液中，该溶液已在70℃下预混合60分钟。该混合物在70℃下保持20小时。然后将反应物冷却，过滤产品并连续用水和甲醇（J.T.Baker）洗涤。然后将产品在80℃在减压下干燥16小时。反应数据列于表4中。表面覆盖率为5.72-6.09μmol/m2，通过元素分析由表面改性前后颗粒%C的区别来测定。通过13C CP-MAS NMR光谱法对这些材料的分析表明这些材料中存在环氧和二醇基团的混合物。
表4
Figure BDA00001892453800412
实施例5
将根据实施例2制备的多孔性颗粒分散在缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷（GLYMO,Aldrich,Milwaukee,WI）在醋酸缓冲液（20mM，pH 5.5，稀释倍数5mL/g，用醋酸和醋酸钠制备，J.T.Baker）中的溶液中，该溶液已在70℃预混合60分钟。反应5e使用60mM缓冲溶液。该混合物在70℃保持20小时。然后将反应物冷却，过滤产品并连续使用水和甲醇（J.T.Baker）洗涤。然后使材料在70℃于0.1M的醋酸溶液（稀释倍数5mL/g，J.T.Baker）中回流20小时。使产品5q-5s回流2小时。然后使反应物冷却，过滤产品并连续用水和甲醇（J.T.Baker）洗涤。然后将产品在80℃于减压下干燥16小时。反应数据列于表5中。表面覆盖率为0.55-7.05μmol/m2，通过元素分析由表面改性前后颗粒%C值的区别来测定。通过13C CP-MAS NMR光谱法分析这些材料表明产品5a-5p中没有可测定量的环氧基团残余，仅存在二醇基团。产品5q-5s具有少量的环氧基团存在。对5q-5s重复醋酸水解步骤，持续20小时。这些反应的产物具有相当的表面覆盖率，通过13C CP-MAS NMR光谱法表明没有可测定量的环氧基团残留。产品5a通过在100mM的磷酸盐缓冲液（pH 7.0，稀释倍数10mL/g）中于70°C下加热2小时进行进一步处理。所得材料的表面覆盖率与产品5a相当。
表5
Figure BDA00001892453800421
Figure BDA00001892453800431
实施例6
使多孔性二氧化硅或杂合物颗粒在甲苯（175mL,Fisher Scientific,Fairlawn,NJ）中回流1小时。使用Dean-Stark阱除去混合物中的痕量的水。冷却后，加入咪唑（Aldrich,Milwaukee,WI）和一种或更多种表面改性剂。然后将反应加热以回流16-18小时。然后将反应冷却，过滤产品并连续使用水、甲醇和丙酮（所有溶剂来自Fisher Scientific）洗涤。使材料进一步在丙酮/水/0.12M醋酸铵水溶液（Sigma ChemicalCo.,St.Louis,MO）中回流2小时。将反应物冷却，过滤产品并连续使用水和丙酮（所有溶剂来自Fisher Scientific）洗涤。将产品在70℃下于减压条件下干燥16小时。表面覆盖率使用元素分析通过表面改性前后颗粒%C值的区别来测定。产品能进一步与三甲基氯硅烷、三甲基氯硅烷、三正丁基氯硅烷、三异丙基氯硅烷、叔丁基二甲基氯硅烷或六甲基二硅氮烷在类似条件下反应以便进一步使表面硅醇基团反应。
这个普遍的方法能应用到各种不同的多孔性材料上。其中包括球状、粒状和不规则的二氧化硅或杂合物无机/有机材料。球状、粒状或不规则材料的粒径可以从0.4-3.0μm或1-3μm变化。这些材料的APD可以从50至
Figure BDA00001892453800441
或从90至
Figure BDA00001892453800442
或从120至
Figure BDA00001892453800443
变化。这些材料的TPV可以从0.5至1.7cm3/g；或从1.0至1.5cm3/g；或从1.1至1.4cm3/g变化。
在这些反应中使用的表面改性剂包括具有如本文中所述的式2结构的硅烷。
实施例7a
来自实施例5中的测试材料5g的多孔性颗粒的样品用于分离蛋白质的混合物。使用浆液填充技术装填4.6×150mm的色谱柱。色谱系统由
Figure BDA00001892453800444
系统和
Figure BDA00001892453800445
可调紫外检测器组成。使用Empower 2色谱数据软件（Build 2154）进行数据采集和分析。流动相条件为：100mMNa2HPO4/NaH2PO4，pH6.8；流速：0.30mL/min；温度：30℃；检测：280nm；分析物：甲状腺球蛋白、免疫球蛋白(IgG)、牛血清白蛋白、肌红蛋白和尿嘧啶。结果显示在图2中。
实施例7b
含有C18改性表面的多孔性颗粒的样品用于分离聚苯乙烯标准品的混合物。使用浆液充填技术装填4.6×150mm的色谱柱。色谱系统由系统和可调紫外检测器组成。
使用Empower 2色谱数据软件（Build 2154）进行数据采集和分析。流动相由四氢呋喃组成。流速是0.30mL/min；温度：30℃；检测：260nm；分析物：分子量在500Da至2,000,000Da范围内的聚苯乙烯标准品。
实施例8
本文中描述的色谱介质已显示保持用于UPLC应用的1.7微米颗粒所需的机械强度要求。同样，相比传统的二氧化硅BEH颗粒上的减少的硅醇酸度导致与带电被分析物的二次相互作用的减小。
图14显示离子强度对碱性蛋白溶菌酶的保留的影响。在低盐的情况下，固定相表面上带负电的硅醇和带正电的溶菌酶之间的静电相互作用是最大的。通过增加流动相的离子强度，被分析物与固定相之间的静电相互作用变得更弱。该图显示，由二氧化硅制成的SEC二醇材料的情况下，硅醇相互作用显著大于由BEH制成的材料。
实施例9
本实施例讨论的是颗粒尺寸、孔体积和孔径分布对色谱分辨率的影响，以及温度对SEC性能的影响。给出基于大小的分离，包括从聚集体中分离单克隆抗体单体的实施例。
材料性质
合成具有不同的总孔体积、平均孔径、表面积和平均颗粒大小的固定相颗粒。所有的材料都是二醇键合的从而提供显示低蛋白质结合的稳定的化学表面。
表6本研究中使用的色谱材料的性质。
Figure BDA00001892453800461
颗粒大小和孔径对效率的影响
对反相色谱，与传统的HPLC分离相比，亚二微米颗粒和超高效液相色谱仪的引入导致色谱效率和通量的显著提高。然而，至今，类似的优点并未在其它模式的色谱上得到证实，例如体积排阻色谱。Held等人最近的出版物中指出对SEC，使用亚二微米颗粒填装的色谱柱不能获得此类优点。（D Held,G Reinhold和P Kilz,“U-GPC?MakingGPC/SEC Faster,”The Column(April 6,2010)10-14)
评估了在用一系列孔径和颗粒大小的颗粒填充的柱子上，流速对于不同蛋白质色谱分离的影响。首先针对系统影响校正保留时间和峰宽数据。图3和图4显示了塔板高度对隙间线速度（在50%峰高处测得）的图。结果显示，具有1.7μm颗粒的柱子相比2.6μm颗粒的柱子性能有显著提高。对于蛋白质，所使用的流速著显高于扩散限制区域，所以将数据拟合成线性方程，H=A+C·u。理论预测A-项和C-项分别正比于1/dp和1/dp2。实验数据很好地符合这种预期。还观察到孔径作为流速的函数对色谱性能的影响有限。
表7从图3和图4得到的A-和C-项。注意大的A项，可能是由于一个峰中多个组分的部分分辨造成的。
Figure BDA00001892453800471
表8从图3和图4得到的A/dp和C/dp
Figure BDA00001892453800472
孔体积对选择性的影响
确定使用材料A-I（其总孔隙体积在0.68-1.63cm3/g内变化）填装的柱子的蛋白质的保留时间，如表6所示。对每种材料绘制保留体积对log MW的关系图(图5)，对每根柱子确定各曲线的斜率（在有代表性的线性区域）。图6显示孔隙体积对斜率的图。可以看出，这两个因素具有良好的相关性。
单克隆抗体(MAb)单体/聚集体的分离
对于用原型“K”（4.6×150mm）装填的柱子和比较柱“L”（4.6×300mm），比较流速对单克隆抗体单体和二聚体的分辨率的影响。尽管前者的柱长更短，但是在相等的流速下操作时，发现二种柱子的分辨率相当。原型“K”装填的柱子中的更小的颗粒，通过能够在更高的流速下操作而具有甚至更短的运行时间，而仍达到必需的分辨率。
图7和8显示了流速对单克隆抗体单体和二聚体的分离的影响。
图9和10显示了流速对分离单克隆抗体单体和二聚体的塔板高度和分辨率的影响。
温度的影响
通过以下表达式从热力学上确定温度对色谱分离的影响：
Figure BDA00001892453800481
其中ΔH°和ΔS °分别为标准焓和熵，R是摩尔气体常数，T是绝对温度和φ是柱子的相比率。
在吸附色谱中，熵通常可以被忽略，因为熵相对于焓可以忽略不计。然而在SEC模式中，情况正好相反。因此，在熵驱动的分离例如SEC中，保留应该首先独立于温度。然而色谱材料的表面可能有离子型或其它官能团，它们可导致结合。理想的情况是，固定相和色谱条件经过优化以防止吸附相互作用。
研究不同温度下的保留情况提供关于是否发生吸附的信息。可能有助于温度引起的保留变化的其它因素（例如构象的变化或水合层的变化）可考虑在内。
图11中显示的色谱图显示温度对蛋白测试混合物的保留的影响。上面的色谱图是用原型“K”填装的柱子获得的，而下面的色谱图来自比较柱“L”。在后一种情况下，观察到对蛋白质显著更大的保留变化。这归因于固定相表面上硅醇的的更强的酸度，其能与蛋白质相互作用并吸附蛋白质。
注意在这两种情况下，尿嘧啶的保留都受温度影响。不受理论的限制，认为这是由氢键相互作用引起的。
盐的影响
研究了流动相中不同的盐添加剂的影响。发现保留和峰形都受到盐种类的影响。
色谱图显示在图12和13中，按照对阴离子和阳离子的霍夫迈斯特次序(Hofmeister Series)：
SO4 2->PO4 2->OAc->Cl->ClO4 -
NH4 +>K+>Na+
一般地，观察到保留按照霍夫迈斯特次序减小，而氯化钠是一个显著的例外。在这种情况下，保留大于其它分析物。此外，峰也显著变宽。
实施例10
对噪音减少、柱流失和鬼峰的影响
已知SEC柱在使用过程中流失颗粒。多角度光散射（MALS）检测器对这些颗粒高度灵敏。本研究中，“柱流失”定义为颗粒的随机流失，这导致基线噪音的发生率增加。颗粒的流失也能在向LC柱进样时发生。这将导致宽的“鬼峰”，其在排阻标记物(excluded marker)的保留时间洗脱。鬼峰妨碍了在排阻窗(exclusion window)附近洗脱的被分析物的定量。认为鬼峰的发生是由进样时发生的压力冲击引起的，导致一部分颗粒穿过柱子到达检测器。柱生产商建议柱子在使用前要彻底地清洗以减少柱流失和鬼峰。
实验
液相色谱系统：Waters ACQUITY
Figure BDA00001892453800491
流动相：100mM磷酸钠缓冲液,pH 6.8
温度：室温
流速：0.2-0.5mL/min
样品：牛血清白蛋白(BSA)3mg/mL
进样体积：10μL
柱平衡：以0.2mL/min的流速平衡20分钟
检测器1：Waters ACQUITY PDA,280nm
检测器2：Wyatt miniDAWNTM TREOS MALS检测器,入射角度为90°
MALS数据获得速度:15Hz
测试一根带原型“K”的4.6×150mm柱子和3根4.6×300mm柱子（比较柱“L”、“M”和“N”）。
结果
图15-19显示了使用带原型“K”的柱子和比较柱“L”、“M”和“N”分离BSA的色谱图。图15和16分别显示在原型“K”柱上以0.2和0.5mL/min的流速运行时的结果。图17、18和19是当以0.3mL/min的流速运行时来自比较柱“L”、“M”、“N”的结果。这些图同时显示了来自紫外和光散射检测器的记录。与三根比较柱相比，发现原型“K”柱的柱流失大幅减少，这通过噪音的频率和幅度测定。相比比较柱，原型柱“K”的RMS噪音和随机噪音的频率减小了5倍多。
原型柱“K”在测试条件下没有出现鬼峰，而现有技术柱L和N显示鬼峰的证据。在图17和19中都观察到宽峰，保留时间分别为4.9和5.5分钟。
等同形式
一些元件的功能可在替代的实施方式中通过更少的元件或单个元件来实现。类似地，在一些实施方式中，任何功能元件可以比说明的实施方式中所述的元件实施更少或不同的操作。而且，为了说明的目显示为分离的功能元件（例如模块，计算机等）可以并入其它功能元件中，分离为不同的硬件中或分布于特定的执行步骤中。
虽然已经描述本发明的某些实施方式，但是，本发明并不仅局限于所述的实施方式。在不背离本发明的精神或范围的情况下，可以对所描述的任何实施方式进行各种变化和/或修改。而且，所述实施方式的元件、步骤、特征和/或方面的各种组合都是有可能的并被考虑，即使本文中没有明确地指出。
通过引用的结合
本文中引用的所有专利、已公开的专利申请和其它参考文献的全部内容在此以其全部通过引用明确纳入本文中。

Claims (55)

1.实施体积排阻色谱的设备，所述设备包括：
外壳，其具有至少一个壁来限定具有进口和出口的腔；和
容纳于所述腔内的包含核和表面成分的固定相材料；
其中，所述固定相材料包含由式1代表的颗粒或整体料：
W-[X]-Q
式1
其中：
X是核成分，其具有包含二氧化硅核材料、金属氧化物核材料、有机-无机杂合物核材料或它们的一组嵌段聚合物的表面；
W是氢或羟基；和
Q不存在或是使与被分析物的静电相互作用、范德华相互作用、氢键合相互作用或其它相互作用最小化的官能团。
2.如权利要求1所述的实施体积排阻色谱的设备，其中，W和Q占据了核成分X的自由价或所述核成分的表面。
3.如权利要求1所述的实施体积排阻色谱的设备，其中，选择W和Q以在所述核成分的表面上形成表面成分，X形成一种或一组嵌段聚合物。
4.如权利要求1所述的实施体积排阻色谱的设备，其中，所述固定相包含颗粒。
5.如权利要求4所述的实施体积排阻色谱的设备，其中，所述固定相材料的颗粒具有平均粒径分布为0.4-3.0微米的直径。
6.如权利要求5所述的实施体积排阻色谱的设备，其中，所述固定相材料的颗粒具有平均粒径分布为1.0-3.0微米的直径。
7.如权利要求1所述的实施体积排阻色谱的设备，其中，所述固定相包含整体料。
8.如权利要求7所述的实施体积排阻色谱的设备，其中，所述固定相材料的整体料表现出用平均粒径分布为0.4-3.0微米的颗粒装填的颗粒床的色谱效率和渗透性。
9.如权利要求8所述的实施体积排阻色谱的设备，其中，所述固定相材料的整体料表现出用平均粒径分布为1.0-3.0微米的颗粒装填的颗粒床的色谱效率和渗透性。
10.如权利要求1所述的实施体积排阻色谱的设备，其中，所述固定相材料的颗粒或整体料具有0.8至1.7 cm3/g的孔体积。
11.如权利要求10所述的实施体积排阻色谱的设备，其中，所述固定相材料具有1.0至1.5 cm3/g的孔体积。
12.如权利要求11所述的实施体积排阻色谱的设备，其中，所述固定相材料具有从1.1至1.5 cm3/g的孔体积。
13.如权利要求1所述的实施体积排阻色谱的设备，其中，所述腔能够在大于1000 psi的柱进口压力下实施体积排阻色谱。
14.如权利要求13所述的实施体积排阻色谱的设备，其中，所述腔能够在大于5000 psi的柱进口压力下实施体积排阻色谱。
15.如权利要求14所述的实施体积排阻色谱的设备，其中，所述腔能够在大于7000 psi的柱进口压力下实施体积排阻色谱。
16.如权利要求15所述的实施体积排阻色谱的设备，其中，所述腔能够在大于10000 psi的柱进口压力下实施体积排阻色谱。
17.如权利要求1所述的实施体积排阻色谱的设备，其中，X是二氧化硅核、二氧化钛核、氧化铝核、有机-无机杂合物核或包含脂肪族桥接的硅烷的有机-无机杂合物核。
18.如权利要求17所述的实施体积排阻色谱的设备，其中X是包含脂肪族桥接的硅烷的有机-无机杂合物核。
19.如权利要求18所述的实施体积排阻色谱的设备，其中，所述脂肪族桥接的硅烷的脂肪族基团是乙烯。
20.如权利要求1所述的实施体积排阻色谱的设备，其中，Q是亲水性基团。
21.如权利要求1所述的实施体积排阻色谱的设备，其中，Q是疏水性基团。
22.如权利要求1所述的实施体积排阻色谱的设备，其中，Q不存在。
23.如权利要求20所述的实施体积排阻色谱的设备，其中，Q是脂肪族基团。
24.如权利要求23所述的实施体积排阻色谱的设备，其中，所述脂肪族基团是脂肪族二醇。
25.如权利要求1所述的实施体积排阻色谱的设备，其中，Q由式2表示：
Figure 710598DEST_PATH_IMAGE001
式2
其中，
n 1 是0-30的整数;
n 2 是0-30的整数;
R 1 、R 2 、R 3 和R 4 每次出现独立地代表氢、氟、低级烷基、保护的或脱保护的醇、两性离子或基团Z；
Z代表：
a) 通过所述固定相材料的表面与式3的部分之间的共价的或非共价的键的形成产生的表面连接基团：
(B1)x(R5)y(R6)zSi-
式3 :
其中x是1-3的整数，
y是0-2的整数，
z是0-2的整数，
且x+y+z = 3
R5和R6每次出现独立地代表甲基、乙基、正丁基、异丁基、叔丁基、异丙基、叔己基、取代或未取代的芳基、环烷基、支链烷基、低级烷基、保护或脱保护的醇或两性离子基团；
B 1 代表-OR7、-NR7’R7’’、-OSO2CF3或-Cl；其中R 7 、R 7’ 和R 7’’ 各自代表氢、甲基、乙基、正丁基、异丁基、叔丁基、异丙基、叔己基、苯基、支链烷基或低级烷基；
b）通过直接的碳-碳键形成或通过杂原子、酯、醚、硫醚、胺、酰胺、酰亚胺、脲、碳酸酯、氨基甲酸酯、杂环、三唑或尿烷键直接连接到X的表面杂合基团；或
c）非共价连接到所述固定相材料的表面的被吸附基团；
d）当W为氢时，通过由所述固定相材料表面与乙烯基或炔基反应形成共价键产生的表面连接基团；
Y代表直接的键；杂原子键；酯键；醚键；硫醚键；胺键；酰胺键；酰亚胺键；脲键；硫脲键；碳酸酯键；氨基甲酸酯键；杂环键；三唑键；尿烷键；二醇键；多元醇键；苯乙烯、乙二醇或丙二醇的低聚物；苯乙烯、乙二醇或丙二醇的聚合物；糖基、多支链糖、树状高分子或分枝状聚合物或两性离子基团；且
A代表
i）亲水性末端基团；
ii）氢、氟、氟烷基、低级烷基或Z基团；或
iii）可官能化基团。
26.如权利要求25所述的实施体积排阻色谱的设备，其中，n 1 是2-18的整数。
27.如权利要求26所述的实施体积排阻色谱的设备，其中，n 1 是2-6的整数。
28.如权利要求25所述的实施体积排阻色谱的设备，其中，n 2 是0-18的整数。
29.如权利要求28所述的实施体积排阻色谱的设备，其中，n 2 是0-6的整数。
30.如权利要求25所述的实施体积排阻色谱的设备，其中，n 1 是2-18的整数且n 2 是0-18的整数。
31.如权利要求30所述的实施体积排阻色谱的设备，其中，n 1 是2-6的整数且n 2 是0-18的整数。
32.如权利要求25所述的实施体积排阻色谱的设备，其中，n 1 是2-18的整数且n 2 是0-6的整数。
33.如权利要求32所述的实施体积排阻色谱的设备，其中，n 1 是2-6的整数且n 2 是0-6的整数。
34.如权利要求25所述的实施体积排阻色谱的设备，其中A代表i）亲水性末端基团，且所述亲水性末端基团是保护的或脱保护形式的醇、二醇、缩水甘油醚、环氧、三醇、多元醇、季戊四醇、乙氧基化季戊四醇、1,3-二氧六环-5,5-二甲醇、三(羟甲基)氨基甲烷,、三（羟甲基）氨基甲烷聚乙二醇醚、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、单价、二价或多价糖基、多支链的糖、含有外部亲水性基团的树状高分子、含有外部亲水基团的分枝状聚合物或两性离子基团。
35.如权利要求25所述的实施体积排阻色谱的设备，其中，A代表ii）氢、氟、甲基、乙基、正丁基、叔丁基、异丙基、低级烷基、氟烷基或基团Z。
36.如权利要求25所述的实施体积排阻色谱的设备，其中， A代表iii）可官能化基团，所述可官能化基团是保护的或脱保护的形式的胺、醇、硅烷、烯烃、硫醇、叠氮化物或炔烃。
37.如权利要求36所述的实施体积排阻色谱的设备，其中，所述可官能化基团在随后的反应步骤中能产生新的表面基团，其中，所述反应步骤是偶联、置换、自由基加成、氢化硅烷化、缩合、裂解或聚合。
38.如权利要求1所述的实施体积排阻色谱的设备，其中，所述外壳配备有一个或更多个熔块以容纳所述固定相材料。
39.如权利要求1所述的实施体积排阻色谱的设备，其中，外壳配备有一个或更多个能安置所述设备使其与进样器、检测器或这两者流体连通的配件。
40.一种实施体积排阻色谱的方法，所述方法包括以下步骤：
A)提供外壳，其具有至少一个壁来限定具有进口和出口的腔；和容纳于所述腔内的包含核和表面成分的固定相材料；
其中所述固定相材料包含由式1 代表的颗粒或整体料：
W-[X]-Q
式I
其中：
X是核成分，其具有包含二氧化硅核材料、金属氧化物核材料、有机-无机杂合物核材料或它们的一组嵌段聚合物的表面；
W是氢或羟基；且
Q不存在或是使与被分析物的静电相互作用、范德华相互作用、氢键合相互作用或其它相互作用最小化的官能团；
B)以高于1000 psi的柱进口压力向所述腔内的所述固定材料上加载样品并使样品流经所述固定相介质；和
C)基于大小将样品分离成一种或更多种成分。
41.如权利要求40所述的实施体积排阻色谱的方法，其中，所述柱进口压力大于5000 psi。
42.如权利要求41所述的实施体积排阻色谱的方法，其中，所述柱进口压力大于7000 psi。
43.如权利要求42所述的实施体积排阻色谱的方法，其中，所述柱进口压力大于10000 psi。
44.如权利要求40所述的实施体积排阻色谱的方法，其进一步包括以下步骤
     D）分离所述一种或更多种成分。
45.如权利要求40所述的实施体积排阻色谱的方法，其进一步包括以下步骤
     E）检测所述一种或更多种成分。
46.如权利要求40所述的实施体积排阻色谱的方法，其进一步包括以下步骤
     D）分离所述一种或更多种成分；和
     E）检测所述一种或多种成分。
47.如权利要求40所述的实施体积排阻色谱的方法，其中，所述样品是生物大分子。
48.如权利要求47所述的实施体积排阻色谱的方法，其中，Q是亲水性的。
49.如权利要求48所述的实施体积排阻色谱的方法，其中，Q是脂肪族基团。
50.如权利要求49所述的实施体积排阻色谱的方法，其中，所述脂肪族基团是脂肪族二醇。
51.如权利要求40所述的实施体积排阻色谱的方法，其中，Q由式2表示：
Figure 627739DEST_PATH_IMAGE001
式2
其中，
n 1 是0-30的整数;
n 2 是0-30的整数;
R 1 、R 2 、R 3 和R 4 每次出现独立地代表氢、氟、低级烷基、保护的或脱保护的醇、两性离子或基团Z；
Z代表：
a) 通过所述固定相材料的表面与式3的部分之间的共价的或非共价的键的形成产生的表面连接基团：
(B1)x(R5)y(R6)zSi-
式3 :
其中x是1-3的整数，
y是0-2的整数，
z是0-2的整数，
且x+y+z = 3
R5和R6每次出现独立地代表甲基、乙基、正丁基、异丁基、叔丁基、异丙基、叔己基、取代或未取代的芳基、环烷基、支链烷基、低级烷基、保护或脱保护的醇或两性离子基团；
B 1 代表-OR7、-NR7’R7’’、-OSO2CF3或-Cl；其中R 7 、R 7’ 和R 7’’ 各自代表氢、甲基、乙基、正丁基、异丁基、叔丁基、异丙基、叔己基、苯基、支链烷基或低级烷基；
b）通过直接的碳-碳键形成或通过杂原子、酯、醚、硫醚、胺、酰胺、酰亚胺、脲、碳酸酯、氨基甲酸酯、杂环、三唑或尿烷键直接连接到X的表面杂合基团；或
c）非共价连接到所述固定相材料的表面的被吸附基团；
d）当W为氢时，通过由所述固定相材料表面与乙烯基或炔基反应形成共价键产生的表面连接基团；
Y代表直接的键；杂原子键；酯键；醚键；硫醚键；胺键；酰胺键；酰亚胺键；脲键；硫脲键；碳酸酯键；氨基甲酸酯键；杂环键；三唑键；尿烷键；二醇键；多元醇键；苯乙烯、乙二醇或丙二醇的低聚物；苯乙烯、乙二醇或丙二醇的聚合物；糖基、多支链糖、树状高分子或分枝状聚合物或两性离子基团；且
A代表
i）亲水性末端基团；
ii）氢、氟、氟烷基、低级烷基或Z基团；或
iii）可官能化基团。
52.如权利要求40所述的实施体积排阻色谱的方法，其中，所述样品是合成的有机聚合物。
53.如权利要求52所述的实施体积排阻色谱的方法，此处Q是疏水性部分。
54.降低体积排阻色谱分析中光散射检测器获得噪音的发生率的方法，该法包括以下步骤：
A）提供外壳，其具有至少有一个壁以限定具有进口和出口的腔；和容纳于所述腔内的包含核和表面成分的固定相材料；
其中所述固定相材料包含由式I代表的颗粒或整体料：
W-[X]-Q
式I
其中：
X是核成分，其具有包含二氧化硅核材料、金属氧化物核材料、有机-无机杂合物核材料或它们的一组嵌段聚合物的表面；
W是氢或羟基；且
Q不存在或是使与被分析物的静电相互作用、范德华相互作用、氢键合相互作用或其它相互作用最小化的官能团；
B)以高于1000 psi的柱进口压力向所述腔的所述固定材料上加载样品并使样品流经所述固定相介质；
C)基于大小将样品分离成一种或更多种成分；和
D）使用光散射检测器检测所述一种或更多种成分。
55.降低体积排阻色谱分析中光散射检测器获得的鬼峰的发生率的方法，所述方法包括以下步骤：
A）提供外壳，其具有至少有一个壁以限定具有进口和出口的腔；和容纳于所述腔内的包含核和表面成分的固定相材料；
其中所述固定相材料包含由式I代表的颗粒或整体料：
W-[X]-Q
式I
其中：
X是核成分，其具有包含二氧化硅核材料、金属氧化物核材料、有机-无机杂合物核材料或它们的一组嵌段聚合物的表面；
W是氢或羟基；且
Q不存在或是使与被分析物的静电相互作用、范德华相互作用、氢键合相互作用或其它相互作用最小化的官能团；
B)以高于1000 psi的柱进口压力向所述腔的所述固定材料上加载样品并使样品流经所述固定相介质；
C)基于大小将样品分离成一种或更多种成分；和
D)使用光散射检测器检测所述一种或更多种成分。
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