WO2016032031A1 - 산화철 요크 쉘 나노구조체를 이용한 효소 고정화 - Google Patents

산화철 요크 쉘 나노구조체를 이용한 효소 고정화 Download PDF

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이정걸
강윤찬
파텔쿠마싱산자이
김태수
최승호
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건국대학교 산학협력단
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    • C02F2305/08—Nanoparticles or nanotubes

Definitions

  • the present invention relates to a carrier for enzyme immobilization using a Fe 2 O 3 yolk-shell structure, an immobilized enzyme using the carrier, a method for preparing the immobilized enzyme, and a method of using the same.
  • a general enzyme immobilization method is a physical adsorption method or a chemical method.
  • the physical adsorption method mainly uses an ion-exchange method, but the ion-exchange method has the advantage of being non-toxic, but its binding strength is weak.
  • a chemical method uses a chemical reagent to fix an enzyme by forming a covalent bond by a chemical reaction. Although the method has a strong crosslinking ability, the food or pharmaceutical-related industries have a high degree of cross-linking ability due to the toxicity of the reagents used to immobilize the enzyme. The disadvantage is that it is difficult to use.
  • Enzyme immobilization is well known by immobilizing enzymes by binding them to organic or inorganic carriers to perform re-use and continuous treatment processes.
  • Organics e.g., cellulose, nylon, polyacrylamide
  • cellulose, nylon, polyacrylamide are disadvantageous as carriers because of poor mechanical stability and corrosion due to solvents, changes in pH and ionic strength, and invasion by microorganisms, which can disrupt bonds with enzymes. Because it can. Therefore, an inorganic carrier to which an enzyme is adsorbed or covalently adsorbed has been proposed.
  • the binding type depends on the conditions of use of the enzyme and the characteristics of the substrate.
  • the adsorption method cannot be applied because the adsorption of the adsorbed enzyme occurs, and covalent bonding of the enzyme takes precedence.
  • the surface of the carrier should encompass specific functional groups that induce the binding of enzymes. Most carriers cannot cover functional groups and require surface pretreatment. Immobilization by covalent bonds is a method of covalently bonding the surface of the carrier and the enzyme with a binder or a pier to surface-treat the carrier or to introduce functional groups into the enzyme, and to prevent the active enzymes of the supported enzyme from being blocked.
  • the present invention solves the above problems, and it is an object of the present invention to provide a novel enzyme immobilization carrier.
  • Another object of the present invention is to provide an effective method of enzyme immobilization.
  • the present invention provides a carrier composition for immobilizing a biocatalyst comprising a Fe 2 O 3 yolk-shell structure.
  • the Fe 2 O 3 yoke-shell structure is preferably formed with one or more pores having an average particle diameter of 10-50 nm on the surface,
  • the term 'surface' is a concept that includes not only the outermost shell surface but also inner shell surfaces having one or more layers stacked therein.
  • the present invention also provides an enzyme immobilization method using the carrier composition of the present invention.
  • the enzyme immobilization method comprises the step of immobilizing the enzyme to the Fe 2 O 3 yoke-shell structure, cross-linking the immobilized enzyme to create a crosslinking But is not limited thereto.
  • the enzyme is preferably a laccase enzyme, but is not limited thereto.
  • the cross-linking is preferably performed by glutaraldehyde, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a Fe 2 O 3 yoke-shell structure-enzyme complex composition comprising an Fe 2 O 3 yoke-shell structure to which an enzyme is immobilized.
  • the present invention provides a method for decolorizing a dye comprising treating the Fe 2 O 3 yoke-shell structure-enzyme complex composition of the present invention to dye wastewater.
  • the present invention is intended to immobilize the laccase enzyme for efficient decolorization of dye in the wastewater, and attach the commercial laccase enzyme to a carrier activated by glutaraldehyde.
  • the immobilization of the enzyme for decolorization of the dye wastewater dye creates an environment in which the activity of the enzyme can be maintained for a long time.
  • the carrier used for the immobilization of the enzyme in the present invention is characterized in that the Fe 2 O 3 yolk-shell structure is selected.
  • Fe 2 O 3 yolk-shell structure has a structure that contains a small sphere that can move in the sphere of the sphere is excellent adsorption and porous carrier, has the ability to adsorb a variety of proteins.
  • the enzyme is immobilized in Fe 2 O 3 yolk-shell structure of the present invention by cross-linking to maintain the activity of the enzyme for a long time, to ensure high stability of the enzyme and resistance to organic solvents.
  • the carrier immobilized on the Fe 2 O 3 yolk-shell structure formed by cross-linking by cross-linking by the above method can be usefully used for the decolorization of the dye in the dyeing wastewater.
  • the present invention provides a catalyst for immobilizing a biocatalyst comprising a Fe 2 O 3 yolk-shell structure, an immobilizing enzyme using the carrier, and cross-linking the enzyme to increase the stability of the enzyme and the stability of the organic solvent and a method of using the same. It is about.
  • the biocatalyst immobilization carrier and the enzyme immobilized thereon according to the present invention are reusable, have increased stability, facilitate reactivity, pH and temperature control, and can be widely used in the food or pharmaceutical related industries.
  • Fig. 1A and B is a view of the image of observing the lacquer azepin the Fe 2 O 3 yolk-shell before and after the immobilization on the structure Fe 2 O 3 yolk-shell structure surface with an electron microscope
  • Fig. 1C is Fe 2 O 3 yolk -An image showing the observation of the surface of the shell structure with an electron microscope.
  • Figure 2 is a graph showing the FTIR absorbance characteristics when cross-linking the laccase immobilized on Fe 2 O 3 yolk-shell structure.
  • FIG. 3 is a graph showing the optimum reaction temperature of the laccase immobilized and cross-linked by Fe 2 O 3 yolk-shell structure.
  • ⁇ pure lacquer enzyme
  • ⁇ Fe 2 O 3 yolk -shell the lacquer enzyme
  • ⁇ immobilized on the structure Fe 2 O 3 and then fixed to the yolk-shell structure cross-linking the enzyme lacquer.
  • Figure 4 is a graph showing the optimal reaction pH of laccase immobilized and cross-linked by Fe 2 O 3 yolk-shell structure.
  • ⁇ pure lacquer enzyme
  • ⁇ Fe 2 O 3 yolk -shell the lacquer enzyme
  • ⁇ immobilized on the structure Fe 2 O 3 and then fixed to the yolk-shell structure cross-linking the enzyme lacquer.
  • FIG. 5 is a graph showing the stability of the enzyme according to the number of operations of the laccase immobilized by Fe 2 O 3 yolk-shell structure.
  • Gray square Lacase enzyme immobilized on Fe 2 O 3 yolk-shell structure.
  • ⁇ Lacase enzyme cross-linked after immobilization on Fe 2 O 3 yolk-shell structure.
  • Figure 6 is a graph of the resistance of the cross-lining immobilized enzyme to the organic solvent, a graph showing the stability of the enzyme according to the number of operations of the laccase immobilized by Fe 2 O 3 yolk-shell structure.
  • ⁇ Pure Lacase Enzyme
  • Gray Square Lacase Enzyme cross-linked after immobilization on Fe 2 O 3 yolk-shell structure.
  • the Fe 2 O 3 yolk-shell structure was synthesized by spray pyrolysis as follows. After preparing a transparent spray solution in which a metal salt and a drying aid dextrin are prepared, the solution is dried through a spray drying process to synthesize a metal oxide-carbon composite powder. After mass production of metal oxide-carbon composites, simple post-heating at 300 ⁇ C or more results in the synthesis of yolk-shell structures due to the staged combustion of the carbon composites. Detailed synthesis conditions are as follows.
  • Solution Preparation 0.15 M Fe nitrate is added to distilled water to dissolve completely. Dissolve 10 g of dextrin in 200 ml of aqueous solution. The prepared solution is sprayed into the spray drying reactor using a nozzle to recover the particles.
  • Transmission electron microscopy was used to confirm the Fe 2 O 3 yolk-shell construct before and after the immobilization of the laccase (FIG. 1; before A- and after B-immobilization). 1; As shown in C, the Fe 2 O 3 yolk-shell structure consists of a small sphere that can move within a spherical sphere and has 21 nm of porous particles. Transmission electron microscopy revealed that the multi-shell structure of the Fe 2 O 3 yolk-shell structure was due to the staged combustion of dextrin.
  • the enzyme can be immobilized only in the outermost part, whereas the yolk-shell Fe 2 O 3 structure is immobilized to the inside of the particle, so that the amount per unit volume and mass, that is, the minimum amount compared to the conventional micron particles Three to four times the amount of enzyme immobilization is possible.
  • Fe 2 O 3 yolk-shell structure was synthesized showing excellent performance as the enzyme support.
  • Activation of Fe 2 O 3 yolk-shell nanostructures is carried out by glutaaldehyde treatment and follows the following procedure.
  • the Fe 2 O 3 yolk-shell nanostructures are washed twice with distilled water.
  • the Fe 2 O 3 yolk-shell nanostructures are then treated with 1M glutaaldehyde. After 4 hours at 25 °C, 250rpm stirred incubator to help the activation.
  • Activated Fe 2 O 3 yolk-shell nanostructures are washed with 30 ml of distilled water and washed once with 100 mM phosphate buffer (pH 7).
  • Cross-linking was performed to maximize the stability of immobilized laccase.
  • the enzyme immobilized on Fe 2 O 3 yolk-shell nanostructure was treated with glutaaldehyde at various concentrations of 0.01 1.00 M in the presence of phosphate buffer pH 7.0 (50 mM) for 2-8 hours at 4 ° C. and 150 rpm.
  • Table 1 is a table showing the efficiency of the immobilization of various enzymes, such as laccase.
  • FIG. 3 is a diagram comparing the optimum temperature of the original laccase, the laccase immobilized on Fe 2 O 3 yolk-shell structure (YS-IM) and the laccase cross-linked (YS-IMC) the immobilized enzyme. . Temperature conditions were confirmed at various temperatures of 25 ⁇ 70 °C. The YS-IM and YS-IMC enzymes had an optimum temperature of 5 ° C. higher than the unimmobilized laccase enzyme (FLac). In addition, at 50 ° C to 70 ° C, YS-IMC had higher residual activity than FLac and YS-IM.
  • Example 7 Fe with pH change 2 O 3 Characterization of Lacase Immobilized on yolk-shell Structure
  • the stability of the enzyme was measured by measuring the change in relative activity according to the number of operations using the immobilized enzyme.
  • the reaction was performed at 25 ° C. using ABTS 1 mM and 0.05 ⁇ g of immobilized enzyme.
  • YS-IMC and gray squares represent relative activity changes according to the number of operations of YS-IM.
  • the relative activity of YS-IMC is 94.1, 87.5% or more, and YS-IM is about 88.6, 70.6%.
  • the enzyme immobilized on YS-IMC appeared to be more stable.
  • the resistance of FLac to 12 organic solvents (25% v / v) was confirmed by reaction at 25 ° C. for 4 hours.
  • the residual activity was 15.8 to 84.7%, whereas the FLac had only 8% of the remaining activity.
  • the least toxic organic solvent to YS-IMC was 13 times and 32 times higher than that of FLac when reacted with acetone for 4 hours and 12 hours (FIG. 6).

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Abstract

본 발명은 Fe2O3 yolk-shell 구조체를 포함하는 생물 촉매 고정화용 담체, 상기 담체를 이용한 고정화 효소 및 그 효소를 cross-linking 하여 효소의 안정성 및 유기용매에 대한 안정성을 높인 것에 관한 것이다. 본원 발명에 따른 생물 촉매 고정화 담체 및 이에 고정화된 효소는 재사용이 가능하고 안정성이 증가되며 반응성, pH 및 온도 조절이 용이할 뿐만 아니라, 다양한 생물화학공학 산업에 널리 사용될 수 있다.

Description

산화철 요크 쉘 나노구조체를 이용한 효소 고정화
본 발명은 Fe2O3 yolk-shell 구조체를 이용한 효소 고정화용 담체, 상기 담체를 이용한 고정화 효소, 상기 고정화 효소의 제조방법 및 이의 이용방법에 관한 것이다.
효소 고정화의 중요한 목적은 효소를 쉽게 회수하여 재이용할 수 있기 때문에 효소 반응공정의 경제성을 높여줄 수 있으며, 반응양식을 회분식 또는 연속식으로 다양하게 적용할 수 있다는 데 있다. 따라서 자연 효소를 생물화학 공정에서 효과적으로 이용하기 위해서는 효소를 고정화시켜야 하는데, 일반적인 효소 고정화 방법은 물리적 흡착방법 또는 화학적 방법이다. 물리적 흡착방법은 주로 이온 교환(ion-exchange) 방법을 이용하는데, 이온 교환 방법은 비독성이라는 장점이 있으나 그 결합력이 약하다는 문제점이 있다. 또한 화학적 방법은 화학 반응에 의해 공유결합을 형성시켜 효소를 고정시키기 위하여 화학시약을 사용하는 것으로, 상기 방법은 가교 결합력이 강하기는 하지만 효소의 고정화를 위해 사용하는 시약의 독성때문에 식품 또는 의약 관련 산업에는 사용하기가 힘들다는 단점이 있다.
유기 혹은 무기담체에 효소를 결합시켜서 효소를 고정화하여 재사용과 연속처리 공정을 수행하는 효소고정화는 잘 알려져 있다. 유기물(예, 셀룰로스, 나일론, 폴리아크릴아미드)이 담체로서 불리한 이유는 기계적 안정성이 좋지 않으며, 용매에 의한 부식, pH와 이온 강도에 따르는 변화와 미생물에 의한 침해로 인하여 효소와의 결합이 파괴될 수 있기 때문이다. 따라서 효소가 흡착 혹은 공유적으로 흡착하는 무기물 담체가 제안되었는데, 결합형태는 효소의 사용조건과 형태 및 기질의 특성에 따른다. 즉, 기질이 강한 염농도이면, 흡착된 효소의 불착이 일어나기 때문에 흡착법은 적용될 수 없으며, 효소의 공유결합이 우선한다. 담체의 표면은 효소의 결합을 유도하는 특이한 기능기를 포괄하여야 한다. 대부분 담체는 기능기를 포괄할 수 없기 때문에, 표면의 전처리가 필요하다. 공유결합에 의한 고정화는 담체의 표면과 효소를 결합제 혹은 교각으로 공유결합시키는 방법으로 담체를 표면처리하거나 효소에 작용기를 도입하여야 하며, 지지된 효소의 활성소가 차폐되지 않도록 하여야 한다.
[선행 특허 문헌]
대한민국 특허 공개번호 제1019880007719호
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 신규한 효소 고정화용 담체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 효과적인 효소 고정화 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 Fe2O3 요크(yolk)-쉘(shell) 구조체를 포함하는 생체 촉매 고정화용 담체 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 Fe2O3 요크-쉘 구조체는 표면에 평균 입경이 10 - 50 nm인 기공이 하나 이상 형성되어 있는 것이 바람직하며,
본 발명에서 '표면'이란 가장 바깥 쉘 표면뿐만 아니라 내부에 하나 이상 겹겹이 포개어져 있는 내부 쉘 표면들도 포함하는 개념이다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 담체 조성물을 이용한 효소 고정화 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 효소 고정화 방법은 상기 Fe2O3 요크-쉘 구조체에 효소를 고정화시키고, 상기 고정화된 효소를 크로스-링킹(cross-linking)하여 가교를 만드는 단계를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 효소는 라카아제 효소인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 크로스-링킹은 글루타알데하이드에 의하여 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 효소가 고정화된 Fe2O3 요크-쉘 구조체를 포함하는, Fe2O3 요크-쉘 구조체-효소 복합체 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 Fe2O3 요크-쉘 구조체-효소 복합체 조성물을 염료 폐수에 처리하는 단계를 포함하는 염료의 탈색 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명에서는 염색폐수에서 염료의 효율적 탈색을 위해 라카아제 효소를 고정화시키고자 하며, 글루타알데하이드(glutaraldehyde)에 의해 활성화된 담체에 상업용 라카아제 효소를 부착시킨다. 본 발명에서는 염색폐수 염료의 탈색을 위한 효소의 고정화는 효소의 활성이 장기간 유지될 수 있는 환경을 조성해준다.
본 발명에서의 효소 고정화에 사용한 담체로는 Fe2O3 yolk-shell 구조체를 선택함을 특징으로 한다. Fe2O3 yolk-shell 구조체는 구형의 구 안에 움직일 수 있는 작은 구가 들어있는 구조를 가지고 있어 우수한 흡착성과 다공성 담체로서, 다양한 종류의 단백질에 대해 흡착력을 가진다.
상기와 같은 조건 하에서, 본 발명의 Fe2O3 yolk-shell 구조체에 고정화 된 효소를 cross-linking함으로써 효소의 활성을 장기간 유지하며, 효소의 높은 안정성과 유기 용매에 내성을 확보한다.
라카아제 효소를 최적의 Fe2O3 yolk-shell 구조체에 고정화하고 cross-linking하여 효소의 안정성과 활성 그리고 유기용매에 내성을 동시에 확보함으로써 생산 비용을 크게 줄이는 한편 생산성을 극대화할 수 있다.
상기 방법으로 cross-linking를 통해 가교를 형성한 Fe2O3 yolk-shell 구조체에 효소를 고정화한 담체는 염색폐수에서 염료의 탈색에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 Fe2O3 yolk-shell 구조체를 포함하는 생물 촉매 고정화용 담체, 상기 담체를 이용한 고정화 효소 및 그 효소를 cross-linking 하여 효소의 안정성 및 유기용매에 대한 안정성을 높이는 것과 이의 이용방법에 관한 것이다. 본원 발명에 따른 생물 촉매 고정화 담체 및 이에 고정화된 효소는 재사용이 가능하고 안정성이 증가되며 반응성, pH 및 온도 조절이 용이할 뿐만 아니라, 식품 또는 의약관련 산업에 널리 사용될 수 있다.
도 1A 및 B는 라카아제를 Fe2O3 yolk-shell 구조체에 고정화하기 전후의 Fe2O3 yolk-shell 구조체 표면을 전자현미경으로 관찰한 이미지를 나타낸 도면이고, 도 1C는 Fe2O3 yolk-shell 구조체 표면을 전자현미경으로 관찰한 이미지를 나타낸 도면이다.
도 2는 Fe2O3 yolk-shell 구조체에 고정화된 라카아제를 cross-linking 했을 때의 FTIR 흡광도 특성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 Fe2O3 yolk-shell 구조체에 의해 고정화 및 cross-linking된 라카아제의 최적 반응 온도를 나타낸 그래프이다. ● : 순수 라카아제 효소, ○ : Fe2O3 yolk-shell 구조체에 고정화된 라카아제 효소, ▼ : Fe2O3 yolk-shell 구조체에 고정화 후 cross-linking한 라카아제 효소.
도 4는 Fe2O3 yolk-shell 구조체에 의해 고정화 및 cross-linking된 라카아제의 최적 반응 pH를 나타낸 그래프이다. ● : 순수 라카아제효소, ○ : Fe2O3 yolk-shell 구조체에 고정화된 라카아제 효소, ▼ : Fe2O3 yolk-shell 구조체에 고정화 후 cross-linking한 라카아제 효소.
도 5는 Fe2O3 yolk-shell 구조체에 의해 고정화된 라카아제의 조업 횟수에 따른 효소의 안정성을 나타낸 그래프이다. 회색 네모 : Fe2O3 yolk-shell 구조체에 고정화된 라카아제 효소, ■ : Fe2O3 yolk-shell 구조체에 고정화 후 cross-linking한 라카아제 효소.
도 6은 cross-lining된 고정화 효소의 유기용매에 대한 내성 그래프로, Fe2O3 yolk-shell 구조체에 의해 고정화된 라카아제의 조업 횟수에 따른 효소의 안정성을 나타낸 그래프이다. ■ : 순수 라카아제 효소, 회색 네모 : Fe2O3 yolk-shell 구조체에 고정화 후 cross-linking한 라카아제 효소.
이하, 본 발명을 비한정적인 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예 1: 분무열분해 공정에 의한 Fe 2 O 3 yolk-shell 구조체의 합성
해당 Fe2O3 yolk-shell 구조체는 다음과 같이 분무열분해 공정에 의해 합성하였다. 금속염과 건조보조제인 덱스트린을 녹인 투명한 분무 용액을 준비한 후, 용액을 분무건조 공정을 통하여 건조시키게 되면 금속산화물-탄소 복합체 분말이 합성된다. 금속산화물-탄소 복합체를 대량으로 생산한 뒤, 300 ˚C 이상에서 간단한 후열처리를 해주면 탄소 복합체의 단계적 연소로 인해 Yolk-shell 구조가 합성된다. 자세한 합성 조건은 다음과 같다.
- 용액 제조 : 증류수에 0.15 M의 Fe nitrate를 첨가하여 완전히 용해시킨다. 200 ml의 수용액에 10g의 덱스트린을 용해시킨다. 준비 된 용액을 노즐을 이용하여 분무건조 반응기 내부로 분사하여 입자를 회수한다.
- 제조 조건 (분무건조 장치 작동조건) : 입구 온도 300˚C. 출구 온도 120˚C, 노즐 압력 2.4 bar.
- 사용 시약 : Iron nitrate (Junsei), 덱스트린 (Samchun)
투과형 전자 현미경을 이용하여 Fe2O3 yolk-shell 구조체가 라카아제를 고정화하기 전과 후를 확인하였다 (도 1; A- 고정화 전, B- 고정화 후). 도 1; C에서 보는 것과 같이 Fe2O3 yolk-shell 구조는 구형의 구 안에 움직일 수 있는 작은 구가 들어있는 구조로 구성되어 있으며, 21nm의 다공성 입자를 가지고 있다. 투과형 전자 현미경 분석 결과 Fe2O3 yolk-shell 구조체의 다중 껍질 구조는 덱스트린의 단계적 연소 때문에 생성된 것이다. 기존의 마이크론 입자에서는 최외각 부분에만 효소를 고정화 시킬 수 있는 반면, yolk-shell Fe2O3 구조체는 입자의 내부까지 효소의 고정화가 이루어져서 단위 부피 및 질량 당 많은 양, 즉, 기존 마이크론 입자 대비 최소 3~4배 양의 효소 고정화가 가능하다. 이와같이 본 발명에서는 효소 지지체로서 우수한 성능을 보이는 Fe2O3 yolk-shell 구조체를 합성하였다.
실시예 2: 라카아제 효소의 고정화방법
Fe2O3 yolk-shell 나노구조체의 활성화는 글루타알데하이드 처리에 의해 수행되며 다음과 같은 과정을 따른다. Fe2O3 yolk-shell 나노구조체를 증류수로 2회 세척한다. 그 후 Fe2O3 yolk-shell 나노구조체를 1M 글루타알데하이드로 처리한다. 이후 활성화를 돕기 위하여 25℃, 250rpm의 교반배양기에서 4시간 반응시킨다. 활성화된 Fe2O3 yolk-shell 나노구조체는 30 ml의 증류수로 세척하고, 100 mM phosphate buffer (pH 7)로 1회 세척한다.
활성화된 담체 10 mg과 정제된 효소 1 mg을 50 mM phosphate buffer (pH 7)에 섞어준 후, 4℃, 150 rpm에서 24시간 동안 교반배양기에서 반응한다. 활성화된 담체와 결합되지 않는 단백질은 증류수와 100 mM phosphate buffer (pH 7)를 이용하여 세척한다.
실시예 3: Fe 2 O 3 yolk-shell 나노구조체에 고정화된 효소를 cross-linking하는 방법
Cross-linking은 고정화된 라카아제의 안정성을 극대화하기 위하여 수행하였다. Fe2O3 yolk-shell 나노구조체에 고정화된 효소를 phosphate buffer pH 7.0 (50 mM) 존재 하에 0.01 1.00 M의 다양한 농도의 글루타알데하이드를 처리하여 4℃, 150rpm에서 2-8 시간 처리하였다.
실시예 4: Fe 2 O 3 yolk-shell 구조체에 고정화된 라카아제를 cross-linking한 결과를 확인
도 2는 Fe2O3 yolk-shell 구조체에 고정화된 라카아제를 cross-linking 했을 때의 FTIR 흡광도 특성을 나타낸 그래프이다. 도 2의 FTIR 스펙트럼에서 1600-1800 cm-1의 흡광도에서 보이는 것과 같이 cross-linking에 의해서 생긴 아마이드 결합 (N=C=O)을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 다양한 나노 담체에 고정화된 라카아제 효소의 고정화 효율
2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS, 시그마-알드리치사 제품)을 기질로 사용하여 위의 실시예에서 제조된 고정화 효소 및 다양한 담체에 고정화 한 효소의 활성을 비교하였다 (표 1). 1 mM 의 ABTS과 0.05 μg의 고정화 효소를 1 ml 의 반응매질(50 mM 소듐 시트레이트 버퍼, pH 3.0)에 투입한 후, 25 ℃의 반응온도에서 5 분 동안 ABTS의 산화 반응을 진행시켰다. 5분 동안의 반응 완료 후, 반응혼합물로부터 고정화 효소를 자석을 이용하여 분리한 후, ABTS의 산화로 생성된 생성물은 420 nm 에서 흡광도를 통해 분석하였다.
상용화 및 합성 담체에 라카아제를 고정화 한 후 고정화 수율 (immobilization yield: IY) 및 고정화 효율 (immobilization efficiency: IE)을 비교한 결과 고정화 수율은 18.7 - 90.6%, 고정화 효율은 18.4-87.5%의 값을 나타내었다. 다양한 담체 중 유사한 조건 하에서 Fe2O3 yolk-shell 구조체가 가장 우수한 90.6%의 고정화 수율과 87.5%의 고정화 효율을 나타내었다.
표 1
Nano-particles Immobilization yield (IY) % Immobilization Efficiency (IE) %
Commercial particles
Al2O3 45.5 ± 3.7 37.8 ± 3.5
SnO2 18.7 ± 1.5 24.5 ± 2.1
Fe2O3 64.2 ± 5.1 30.8 ± 2.6
Fe3O4 37.4 ± 3.2 55.6 ± 5.1
SiO2(15nm) 35.6 ± 3.0 48.4 ± 4.1
SiO2(20nm) 48.2 ± 4.2 34.8 ± 3.0
SiO2(80nm) 63.5 ± 5.3 69.0 ± 6.1
SrFe12O19 42.5 ± 3.6 30.5 ± 2.5
TiO2 53.0 ± 4.1 40.1 ± 3.2
Y3Fe5O12 45.7 ± 3.8 23.2 ± 2.0
ZrO2 26.4 ± 2.1 18.4 ± 1.4
Synthesized particles
Fe2O3 yolk-shell 90.6 ± 6.5 87.5 ± 7.1
Fe2O3anti-cave 44.5 ± 4.8 58.2 ± 4.6
NiO@void@SiO2 47.5 ± 4.2 52.1 ± 4.4
Co3O4(nanotube) 42.4 ± 4.0 46.1 ± 4.0
SnO2(TubeinTube) 48.6 ± 4.1 48.2 ± 4.2
NiO@void@SiO210% 53.8 ± 4.0 64.5 ± 5.1
NiO@void@SiO240% 59.1 ± 4.3 48.5 ± 3.8
상기 표 1은 라카아제의 다양한 나노 담체에의 고정화 효율 등을 나타낸 표이다.
실시예 6: 온도 변화에 따른 Fe 2 O 3 yolk-shell 구조체에 고정화 된 라카아제의 특성
도 3은 원래의 라카아제, Fe2O3 yolk-shell 구조체에 고정화된 라카아제(YS-IM) 및 고정화된 효소를 cross-linking (YS-IMC)한 라카아제의 최적 온도를 비교한 그림이다. 온도 조건은 25 ~ 70℃의 다양한 온도에서 확인하였다. YS-IM 및 YS-IMC 효소는 고정화하지 않은 라카아제 효소(FLac)보다 최적 온도가 5℃ 높았다. 또한 50℃ ~ 70℃에서는 YS-IMC는 FLac와 YS-IM보다 잔존 활성이 높았다.
실시예 7: pH 변화에 따른 Fe 2 O 3 yolk-shell 구조체에 고정화 된 라카아제의 특성
도 4는 pH 변화에 따른 라카아제의 잔존활성을 확인하였다. 최적 pH는 FLac의 경우 3, YS-IM는 4, YS-IMC는 4 였다. pH 5 7 범위에서는 YS-IMC의 잔존 활성이 FLac와 YS-IM보다 높았다. 즉, YS-IMC의 경우 FLac보다 같은 조건에서 2.7, 4.5, 8.3배 잔존 활성이 증가하였다.
실시예 8: 고정화 효소를 이용한 반응 시 라카아제의 안정성
고정화한 효소를 이용하여 조업 횟수에 따른 상대 활성의 변화를 측정하여 효소의 안정성을 측정하였다. ABTS 1 mM, 고정화 효소 0.05 μg을 사용하여 25℃에서 반응을 진행하였다. 도 5에서 ■는 YS-IMC, 회색 네모는 YS-IM의 조업 횟수에 따른 상대 활성 변화를 나타낸다. 도 5에서 보듯이, 조업 횟수가 5회, 10회에 도달했을 경우 YS-IMC의 상대 활성은 94.1, 87.5%이상이고, YS-IM는 88.6, 70.6% 내외이다. 따라서 YS-IMC에 고정화된 효소가 더 안정성이 우수한 것으로 나타났다.
실시예 9: 고정화 라카아제의 유기용매에 대한 안정성
FLac의 12가지 유기 용매 (25% v/v)에 대한 내성을 25℃에서 4시간 반응하여 확인하였다. YS-IMC의 경우 잔존 활성이 15.8 84.7%인 것에 비해 FLac은 잔존활성이 8% 밖에 되지 않았다. YS-IMC에 가장 독성이 적은 유기용매는 acetone으로 4시간, 12시간 반응하였을 경우 잔손활성이 FLac에 비해 13배, 32배 높았다 (도 6).

Claims (9)

  1. Fe2O3 요크(yolk)-쉘(shell) 구조체를 포함하는 생체 촉매 고정화용 담체 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 Fe2O3 요크-쉘 구조체는 표면에 평균 입경이 10 - 50 nm인 기공이 하나 이상 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 담체 조성물.
  3. 제 1항의 담체 조성물을 이용한 효소 고정화 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 효소 고정화 방법은 상기 Fe2O3 요크-쉘 구조체에 효소를 고정화시키고, 상기 고정화된 효소를 크로스-링킹(cross-linking)하여 가교를 만드는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 3항에 있어서, 상기 효소는 라카아제 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 크로스-링킹은 글루타알데하이드에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 효소가 고정화된 Fe2O3 요크-쉘 구조체를 포함하는, Fe2O3 요크-쉘 구조체-효소 복합체 조성물.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 효소는 라카아제 효소인 것을 특징으로 하는 Fe2O3 요크-쉘 구조체-효소 복합체 조성물.
  9. 제 7항의 Fe2O3 요크-쉘 구조체-효소 복합체 조성물을 염료 폐수에 처리하는 단계를 포함하는 염료의 탈색 방법.
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