KR101442512B1 - 내부로의 물질 전달능이 향상된 고정화 불용성 담체 및 이를 이용한 바이오센서와 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 내부로의 물질 전달능이 향상된 고정화 불용성 담체 및 이를 이용한 바이오센서와 그 제조방법에 관한 것으로서, 자세하게는 탐지용 생체물질을 고정화시키기 위한 고정화 불용성 담체로서, 상기 담체 내부로의 물질 전달능을 향상시켜 기질이 담체 내부로 효율적으로 확산되도록 하기 위하여, 내부에 친수성 비드가 혼합되는 것을 특징으로 하는 고정화 불용성 담체 및 이를 이용한 바이오센서와 그 제조방법에 대한 것이다.
본 발명에 따르면 고정화 불용성 담체 내부로의 물질 전달능을 향상시켜 기질이 담체 내부로 효율적으로 확산되도록 함으로써, 고정화시 발생하는 기질의 확산저해 현상을 방지하고 센서의 탐지성능 및 반응속도를 높일 수 있다.

Description

내부로의 물질 전달능이 향상된 고정화 불용성 담체 및 이를 이용한 바이오센서와 그 제조방법 {Entrapment matrix enhancing internal mass transfer, and biosensor using the same, and preparing method of the same}

본 발명은 내부로의 물질 전달능이 향상된 고정화 불용성 담체 및 이를 이용한 바이오센서와 그 제조방법에 관한 것으로서, 자세하게는 탐지용 생체물질을 고정화시키기 위한 고정화 불용성 담체로서, 상기 담체 내부로의 물질 전달능을 향상시켜 기질이 담체 내부로 효율적으로 확산되도록 하기 위하여, 내부에 친수성 비드가 혼합되는 것을 특징으로 하는 고정화 불용성 담체 및 이를 이용한 바이오센서와 그 제조방법에 대한 것이다.

본 발명에 따르면 고정화 불용성 담체 내부로의 물질 전달능을 향상시켜 기질이 담체 내부로 효율적으로 확산되도록 함으로써, 고정화시 발생하는 기질의 확산저해 현상을 방지하고 센서의 탐지성능 및 반응속도를 높일 수 있다.

효소 또는 미생물과 같은 탐지용 생체물질을 화학적, 물리적 방법에 의하여 고정하여 이동성을 제한하는 것을 고정화(immobilization)라고 한다. 이와 같이 탐지용 생체물질을 고정화하면 고정하지 않고 용액상태로 사용하는 경우에 비하여 여러가지 장점이 있다.

먼저, 재사용이 가능하기 때문에 비용이 절감되고 사용 후 분리를 시행할 필요가 없다. 또한, 탐지용 생체물질은 주로 불용성이기 때문에 연속 반응기에서도 이용이 가능하며, 고정화되어 있기 때문에 외부 조건 변화에 따른 민감성을 감소시킬 수 있다.

한편, 고정화 방법에는 물리적인 방법과 화학적인 방법이 있으며, 물리적 방법에는 매트릭스막 속에 효소를 포괄적으로 고정화하는 포괄법, 효소를 막에 물리적으로 흡착시키는 흡착법 등이 있고, 화학적 방법에는 고분자 막 또는 무기담체 막에 효소를 공유결합시키는 공유결합법과 효소끼리 서로 가교하여 막 모양으로 형성하는 가교법 등이 있다.

이 중 포괄법(entrapment)은 중합체로 망상구조를 만들고 효소 혹은 미생물을 이 가교된 중합체 안에 가두어 고정하는 방법(격자형)과 반투막인 고분자의 엷은 막으로 된 미세캡슐(microcapsule) 안에 가두는 방법(microcapsule형)이 있다.

상기 포괄법은 특정 효소 또는 미생물 등을 담체 중에 고농도로 고정화시킬 수 있어서 탐지 효율이 높으며 외부 환경의 변동에 강한 장점이 있다. 그러나, 포괄법의 경우에는 효소나 미생물이 담체 내부에 고정화되어 있기 때문에 기질의 확산이 반응의 율속단계(rate limiting step)가 되는 경우가 자주 있다.

따라서, 상기 고정화 방법을 바이오센서에 적용하는 경우, 담체 내부로의 기질 확산이 물질전달 저항으로 인하여 떨어지게 되며, 그에 따라 담체 내부의 기질 농도가 실제 수용액 상의 농도보다 현저히 저하되고 효소, 미생물 등의 작용부위가 불활성화되어 반응 신호가 낮게 나타나게 되며, 결과적으로 반응성능 및 반응속도가 떨어지는 문제가 발생하게 된다.

따라서 고체 겔의 입자 크기를 조절하거나 고정화 막을 얇게 하여 기질 확산의 저해를 줄이려는 시도가 있으나, 입자크기를 조절하는 데 어려움이 있으며, 얇은 막을 사용할 경우 고정화된 효소나 미생물 등의 이탈이 발생할 뿐만 아니라 원하는 크기로 제작할 수 없다는 단점이 있다.

이에, 고정화 불용성 담체 내부로의 물질 전달능을 향상시켜 기질이 담체 내부로 효율적으로 확산되도록 함으로써, 고정화시 발생하는 기질의 확산저해 현상을 방지하고 센서의 탐지성능 및 반응속도를 높일 수 있는 바이오센서의 개발이 필요하였다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로, 고정화 불용성 담체 내부로의 물질 전달능을 향상시켜 기질이 담체 내부로 효율적으로 확산되도록 함으로써, 고정화시 발생하는 기질의 확산저해 현상을 방지하고 센서의 탐지성능 및 반응속도를 높일 수 있는 고정화 불용성 담체 및 이를 이용한 바이오센서를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 탐지용 생체물질을 고정화시키기 위한 고정화 불용성 담체로서, 상기 담체 내부로의 물질 전달능을 향상시켜 기질이 담체 내부로 효율적으로 확산되도록 하기 위하여, 내부에 친수성 비드가 혼합되는 것을 특징으로 하는 고정화 불용성 담체를 제공한다. 이때, 상기 친수성 비드가 유리비드이고, 상기 유리비드의 매질 내 함량은 5~20%(w/v)인 것이 바람직하다.

한편, 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 i) 탐지용 생체물질, ⅱ) 상기 탐지용 생체물질을 내부에 가두어 고정하는 격자형 불용성 담체, 및 ⅲ) 상기 담체 내부로의 물질 전달능을 향상시키기 위하여 상기 담체 내에 혼합되는 친수성 비드를 포함하는 바이오센서를 제공한다.

이때, 상기 격자형 불용성 담체는 탐지용 생체물질을 내부에 고정화시킬 수 있는 다양한 물질로 이루어질 수 있으나, 일 실시예로서 실리케이트 류에 의한 무기물 중합체로 이루어지거나 아가(agar) 또는 아가로스 (agarose)의 하이드로젤로 이루어질 수 있다.

또한, 상기 격자형 불용성 담체는 a-알진산염(Ca-alginate), 아가(agar),κ－카라지난(κ－carrageenan), 폴리아크릴아미드 및 콜라겐(collagen)으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 고분자로 이루어지거나, 폴리에틸렌글리콜 성분이 중합된 백본(backbone) 사이에 가교결합이 형성되어 있는 3차원 망상 구조로 이루어질 수 있다.

그리고, 상기 담체 내의 기질 확산을 촉진하기 위하여, 상기 친수성 비드가 상기 불용성 담체보다 더 강한 친수성을 가지는 것이 바람직하다.

한편, 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 i) 기질탐지용 생체물질을 고정하기 위한 담체를 졸(sol) 상태로 준비하는 단계; ⅱ) 상기 졸(sol) 상태의 담체에 기질탐지용 생체물질과 친수성 비드를 혼합하는 단계; 및 ⅲ) 상기 기질탐지용 생체물질과 친수성 비드가 혼합된 졸(sol) 상태의 담체를 젤(gel) 상태로 변환하여 상기 기질탐지용 생체물질과 친수성 비드를 고정화하는 단계;를 포함하는 탐지성능이 향상된 바이오센서의 제조방법을 제공한다.

이때, 상기 담체 내의 기질 확산을 촉진하기 위하여, 상기 친수성 비드가 상기 불용성 담체보다 더 강한 친수성을 가지는 것이 바람직하며, 상기 친수성 비드가 유리비드이고, 상기 유리비드의 매질 내 함량이 5~20%(w/v)인 것이 바람직하다.

본 발명의 고정화 불용성 담체를 적용한 바이오센서는 고정화 불용성 담체 내부로의 물질 전달능을 향상시켜 기질이 담체 내부로 효율적으로 확산되도록 함으로써, 담체 내부의 기질 농도를 증가시켜 고정화시 발생하는 기질의 확산저해 현상을 획기적으로 방지하고 센서의 탐지성능 및 반응속도를 효과적으로 높일 수 있다.

도 1은 본 발명의 내부로의 물질 전달능이 향상된 고정화 불용성 담체의 구조를 보여주는 개념도이다.
도 2는 본 발명의 비교예로서 유리비드를 넣지 않은 고정화 발광박테리아가 마이토마이신시에 시간별로 반응하는 발광량을 나타내는 전하결합소자 카메라의 영상이다.
도 3는 본 발명의 일 실시예에 따라 유리비드를 넣은 고정화 발광박테리아가 마이토마이신시에 시간별로 반응하는 발광량을 나타내는 전하결합소자 카메라의 영상이다.

이하, 본 발명의 내부로의 물질 전달능이 향상된 고정화 불용성 담체 및 이를 이용한 바이오센서와 그 제조방법의 일 실시예를 첨부한 도면을 참조하여 상세히 살펴본다. 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

본 발명의 고정화 불용성 담체는 담체 내부로의 물질 전달능을 향상시켜 기질이 담체 내부로 효율적으로 확산되도록 하기 위하여, 도 1에 도시된 바와 같이 내부에 친수성 비드가 혼합되는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 고정화 불용성 담체를 이용한 본 발명의 바이오센서는 i) 탐지용 생체물질, ⅱ) 상기 탐지용 생체물질을 내부에 가두어 고정하는 격자형 불용성 담체, 및 ⅲ) 상기 담체 내부로의 물질 전달능을 향상시키기 위하여 상기 담체 내에 혼합되는 친수성 비드를 포함하도록 구성된다.

종래의 포괄법을 이용한 고정화 방법은 특정 효소 또는 미생물 등을 담체 중에 고농도로 고정화시킬 수 있다는 장점이 있으나, 효소나 미생물이 담체 내부에 고정화되어 있기 때문에 담체 내부로의 기질 확산이 물질전달 저항으로 인하여 떨어진다는 문제가 있었다.

이에 따라 담체 내부의 기질 농도가 실제 수용액 상의 농도보다 현저히 떨어질 뿐만 아니라 효소, 미생물 등의 작용부위가 불활성화되어 센서의 반응 신호가 낮게 나타나게 되며, 결과적으로 반응성능 및 반응속도가 저하될 수 밖에 없었다.

이러한 문제를 해결하기 위하여 본 발명의 고정화 불용성 담체는 내부에 친수성 비드를 주입, 혼합시키는 것을 특징으로 한다. 포괄법 고정화시 사용되는 매질은 수용액 상의 기질이 내부로 침투되어야 하기 때문에 격자 구조를 가지며 친수성을 띠는 것이 일반적인데, 상기 격자형 매질에 친수성 비드를 주입함으로써, 상기 친수성 매질의 내부 공간 및 격자의 폭이 넓어지는 효과를 얻을 수 있다. 특히 상기 격자형 매질의 친수성보다 더 강한 친수성 표면을 가진 입자의 경우 매질 내에서 수용액의 이동을 더 빠르게 촉진하는 효과를 얻을 수 있다.

결과적으로, 상기 격자형 매질에 친수성 비드를 주입, 혼합함으로써 담체 내부로의 물질 전달능이 향상되어 기질이 담체 내부로 효율적으로 확산되어 담체 내의 기질의 농도가 획기적으로 증가하게 된다.

종래의 매질 성분이나 조성비를 변화시켜 격자의 크기를 조절하는 방법은 최적의 조건을 찾는 과정이 까다롭고, 격자의 크기를 원하는 대로 조절할 정도로 매질 종류가 다양하지 않아 현실적으로 한계가 있었으나, 본 발명의 고정화 불용성 담체는 단순히 친수성 비드를 주입, 혼합하는 것만으로 매질 내 기질의 확산을 효율적으로 향상시킬 수 있어 적용범위가 훨씬 다양하며 경제적이다.

본 발명의 친수성 비드는 친수성을 가지는 다양한 물질이 사용될 수 있으나, 일 실시예로서 유리비드가 사용되는 것이 바람직하며, 탐지용 생체물질을 안정적으로 지지하면서도 내부로의 물질 전달능을 향상시킬 수 있도록 상기 유리비드의 매질 내 함량이 5~20%(w/v)인 것이 바람직하다.

한편, 본 발명의 고정화에 사용되는 효소 또는 미생물 등의 탐지용 생체물질은 기질을 탐지하기 위한 다양한 물질이 사용될 수 있으며, 일 실시예로 페놀류를 탐지하는 타이로시네이즈 (tyrosinase), 락케이즈 (laccase), 페록시데이즈 (peroxidase) 등이나 재조합 미생물 발광박테리아 등이 사용될 수 있다.

또한, 상기 격자형 불용성 담체는 탐지용 생체물질을 내부에 고정화시킬 수 있는 다양한 물질로 이루어질 수 있으나, 일 실시예로서 실리케이트 류에 의한 무기물 중합체로 이루어지거나 아가(agar) 또는 아가로스 (agarose)의 하이드로젤로 이루어질 수 있으며, 바람직한 일 실시예로서 아가와 테트라메틸오소실리케이트가 함께 사용될 수도 있다.

또한, 상기 격자형 불용성 담체는 a-알진산염(Ca-alginate), 아가(agar),κ－카라지난(κ－carrageenan), 폴리아크릴아미드 및 콜라겐(collagen)으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 고분자로 이루어지거나, 폴리(에틸렌글리콜) 아크릴레이트, 폴리(에틸렌글리콜) 디아크릴레이트, 폴리(에틸렌글리콜) 메타아크릴레이트, 폴리(에틸렌글리콜) 디메타아크릴레이트, 폴리(에틸렌글리콜) 디비닐 에테르, 폴리(에틸렌글리콜) 에틸 에테르 메타아크릴레이트, 폴리(에틸렌글리콜) 메틸 에테르 아크릴레이트, 폴리(에틸렌글리콜) 메틸 에테르 메타아크릴레이트, 및 폴리(에틸렌글리콜) 페닐 에테르 아크릴레이트 등의 폴리에틸렌글리콜 성분이 중합된 백본(backbone) 사이에 가교결합이 형성되어 있는 3차원 망상 구조로 이루어질 수 있다.

한편, 상기에서 설명한 탐지성능이 향상된 바이오센서는 i) 기질탐지용 생체물질을 고정하기 위한 담체를 졸(sol) 상태로 준비하는 단계, ⅱ) 상기 졸(sol) 상태의 담체에 기질탐지용 생체물질과 친수성 비드를 혼합하는 단계, 및 ⅲ) 상기 기질탐지용 생체물질과 친수성 비드가 혼합된 졸(sol) 상태의 담체를 젤(gel) 상태로 변환하여 상기 기질탐지용 생체물질과 친수성 비드를 고정화하는 단계를 통하여 제조할 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명의 효과를 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

유리비드를 효소바이오센서의 고정화

페놀을 분해하여 벤조퀴논을 생성하는 효소인 타이로시네이즈를 가지고 페놀을 탐지하는 효소 바이오센서를 만들기 위해 테트라메틸오소실리케이트 3㎖와 멸균수 1.5㎖, 0.1M 염산 0.2㎖와 10mM 소디움포스페이트 용액 (pH 6.5) 1㎖를 혼합한 용액을 10분 동안 초음파 처리한 후 4℃에서 하루 동안 보관하여 효소 용액과 1:10의 비율로 혼합한다.

이때 최종적으로 효소의 농도가 300㎍/㎖이 되도록 효소의 양을 조절한다. 유리비드의 효과를 확인하기 위해 시험군에는 유리비드를 10 %(w/v)의 비율로 고정화 용액과 섞고 대조군으로는 유리비드를 넣지 않은 고정화 용액을 반응시킨다. 이 효소 고정화 용액 중 200㎕를 마이크로센트리푸즈 튜브에 떨어뜨려서 젤 상태가 되도록 상온에서 1시간 건조시키고 사용할 때까지 4℃에서 보관한다.

유리비드를 효소바이오센서의 페놀 측정

유리비드 혼합 고정화 방식의 성능 향상을 확인하기 위해 페놀을 분해능을 시험군과 대조군에서 실시하였다. 페놀용액을 10 ppm, 50 ppm, 300 ppm을 준비하여 효소 고정화 용액이 젤 상으로 존재하는 마이크로센트리푸즈 튜브에 떨어뜨리고 용액의 흡광도를 510 nm에서 스펙트로포토미터로 측정하였다. 페놀 분해에 따른 벤조퀴논의 생성에 따라 510 nm에서 흡광도가 증가하게 된다. 도 2에서 보는 바와 같이 세 개 농도 모두에서 10 %의 유리비드를 섞어 주었을 때 효소의 반응 정도와 반응 속도 자체가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

유리비드를 이용한 발광박테리아 센서의 고정화

특정 독성에 대해서 빛이 증가하는 유전자 재조합 발광박테리아를 유리비드를 이용하여 고정화하기 위해 EBSoxS균주의 콜로니 한 개를 5㎖의 LB 배양액에 배양하였다. 이후 O.D.가 0.8에 도달하였을 때 1㎖의 배양액을 100㎖의 신선한 LB 배양액에 넣고 이 용액의 O.D.가 0.8dp 도달했을 때 균주를 고속 원심분리로 분리시켜 상층액을 버리고 여기에 20 ㎖의 아가 용액을 넣고 혼합시킨 후 여기에 200 mg의 유리비드 (지름 150~212 ㎛)를 넣고 혼합시킨 후 2㎕를 유리 칩 위에 떨어뜨려서 상온에서 건조시킨다.

대조군으로 상기 과정 중 200 mg의 유리비드를 넣지 않고 오직 아가 용액과 미생물 용액만을 혼합하여 2 ㎕를 떨어뜨려서 상온에서 건조시킨 것을 사용한다.

발광박테리아 센서의 독성 반응

상기 실시예에서 고정화한 유전자 재조합 발광박테리아 EBSoxS 균주는 재조합 플라스미드인 soxS :: luxCDABE가 포함된 균주로써 슈퍼록사이드 라디컬에 의한 산화적 손상을 받으면 soxS 프로모터가 발현하여 하부에 있는 luxCDABE 유전자가 전사를 시작하여 최종적으로 파장 490 nm의 빛을 발생하게 된다. 이 빛의 양을 통해 샘플 내에 존재하는 산화적 손상 독성을 탐지하게 된다.

유리비드의 첨가를 통한 발광박테리아 바이오센서의 탐지 능력 향상을 확인하기 위해 상기 고정화된 균주에 슈퍼록사이드 라디컬을 생성시키는 파라콰트를 0.5 mM과 반응하여 시간별로 빛의 변화를 cooled CCD 카메라를 이용하여 측정하였다.

도 3에서와 같이 유리비드를 섞은 고정화 방법을 사용한 균주 스팟에서는 10분부터 빛의 반응이 나타나기 시작한다. 센서에서는 빠른 반응 시간이 중요한데 유리비드없는 균주 스팟에서는 아직 반응이 나오지 않을 때 유리비드 혼합 균주에서 반응이 나타나고 있다. 또한 모든 시간에서 반응양인 빛의 양이 유리비드를 섞은 균주에서 더 많이 나오고 있는 것을 볼 수 있다.

이를 통해서 본 발명에서 개발된 신호 증폭 방법이 실제 아가 매트리스 안에 고정화되어 있는 바이오센서 균주의 반응을 향상시키는 것을 볼 수 있었으며, 이를 통하여는 포괄법에 의한 고정화 방법시 친수성 입자를 혼합함으로써 매질 내의 물질 이동을 향상시켜 센서의 성능을 향상시킬 수 있다는 것을 확인하였다.

이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이러한 실시예에 한정되는 것이 아니고, 상기 실시예들을 기존의 공지기술과 단순히 조합적용한 실시예와 함께 본 발명의 특허청구범위와 상세한 설명에서 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자가 변형하여 이용할 수 있는 기술은 본 발명의 기술범위에 당연히 포함된다고 보아야 할 것이다.

Claims (13)

1. 탐지용 생체물질을 고정하기 위한 고정화 불용성 담체로서,
   상기 담체 내부로의 물질 전달능을 향상시켜 기질이 담체 내부로 효율적으로 확산되도록 하기 위하여, 내부에 친수성 비드가 혼합되며,
   상기 친수성 비드가 유리비드이고, 상기 유리비드의 매질 내 함량이 5~20%(w/v)인 것을 특징으로 하는 고정화 불용성 담체.
2. 삭제
3. 삭제
4. i) 탐지용 생체물질, ⅱ) 상기 탐지용 생체물질을 내부에 가두어 고정하는 격자형 불용성 담체, 및 ⅲ) 상기 담체 내부로의 물질 전달능을 향상시키기 위하여 상기 담체 내에 혼합되는 친수성 비드를 포함하며,
   상기 친수성 비드가 유리비드이고, 상기 유리비드의 매질 내 함량이 5~20%(w/v)인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
5. 제4항에 있어서,
   상기 격자형 불용성 담체가 실리케이트 류에 의한 무기물 중합체로 이루어진 것을 특징으로 하는 탐지성능이 향상된 바이오센서.
6. 제4항에 있어서,
   상기 격자형 불용성 담체가 아가(agar) 또는 아가로스 (agarose)의 하이드로젤로 이루어진 것을 특징으로 하는 탐지성능이 향상된 바이오센서.
7. 제4항에 있어서,
   상기 격자형 불용성 담체가 Ca-알진산염(Ca-alginate), 아가(agar),κ－카라지난(κ－carrageenan), 폴리아크릴아미드 및 콜라겐(collagen)으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 고분자로 이루어진 것을 특징으로 하는 탐지성능이 향상된 바이오센서.
8. 제4항에 있어서,
   상기 격자형 불용성 담체가 폴리에틸렌글리콜 성분이 중합된 백본(backbone) 사이에 가교결합이 형성되어 있는 3차원 망상 구조인 것을 특징으로 하는 탐지성능이 향상된 바이오센서.
9. 제4항에 있어서,
   상기 담체 내의 기질 확산을 촉진하기 위하여, 상기 친수성 비드가 상기 불용성 담체보다 더 강한 친수성을 가지는 것을 특징으로 하는 탐지성능이 향상된 바이오센서.
10. i) 기질탐지용 생체물질을 고정하기 위한 담체를 졸(sol) 상태로 준비하는 단계; ⅱ) 상기 졸(sol) 상태의 담체에 기질탐지용 생체물질과 친수성 비드를 혼합하는 단계; 및 ⅲ) 상기 기질탐지용 생체물질과 친수성 비드가 혼합된 졸(sol) 상태의 담체를 젤(gel) 상태로 변환하여 상기 기질탐지용 생체물질과 친수성 비드를 고정화하는 단계;를 포함하며,
    상기 친수성 비드가 유리비드이고, 상기 유리비드의 매질 내 함량이 5~20%(w/v)인 것을 특징으로 하는 탐지성능이 향상된 바이오센서의 제조방법.
11. 제10항에 있어서,
    상기 친수성 비드가 상기 담체보다 더 강한 친수성을 가지는 것을 특징으로 하는 탐지성능이 향상된 바이오센서의 제조방법.
12. 삭제
13. 삭제

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