KR101297927B1

KR101297927B1 - 글루타알데하이드를 이용한 키토산 부직포에 트립신을 고정화하는 방법

Info

Publication number: KR101297927B1
Application number: KR1020130046141A
Authority: KR
Inventors: 송화순; 이소희; 김정수
Original assignee: 숙명여자대학교산학협력단
Priority date: 2013-04-25
Filing date: 2013-04-25
Publication date: 2013-08-19

Abstract

본 발명은 글루타알데하이드(glutaraldehyde; GA)를 이용한 키토산 부직포에 트립신을 고정화하는 방법에 관한 것으로서, 상세하게는 섬유소재에 적합한 효소 고정화 기술을 도입하기 위하여 고정화 담체로 키토산 부직포를, 가교제로 글루타알데하이드를 사용한 최적의 트립신 고정화 방법에 대한 것이다. 또한, 본 발명은 키토산 부직포에 글루타알데하이드를 처리하는 글루타알데하이드 가교 단계; 및 상기 글루타알데하이드 가교된 키토산 부직포와 트립신(trypsin)을 반응시키는 고정화 단계를 포함하는 키토산 부직포에 트립신을 고정화하는 방법을 제공한다.

Description

글루타알데하이드를 이용한 키토산 부직포에 트립신을 고정화하는 방법{Method for immobilization of trypsin on chitosan non-woven using glutaraldehyde}

본 발명은 글루타알데하이드(glutaraldehyde; GA)를 이용한 키토산 부직포에 트립신을 고정화하는 방법에 관한 것으로서, 상세하게는 섬유소재에 적합한 효소 고정화 기술을 도입하기 위하여 고정화 담체로 키토산 부직포를, 가교제로 글루타알데하이드를 사용한 최적의 트립신 고정화 방법에 대한 것이다.

섬유산업에서 효소는 처리 조건이 온화하고 우수한 생분해성으로 인한 폐수발생을 감소시키는 등 친환경적 특성 뿐만 아니라, 특정기질에만 반응하는 기질 특이성으로 인하여 각광받고 있다. 그러나 효소의 최적 조건 이외의 반응 조건에서 급격한 활성 저하가 나타나며, 반응 후 회수 및 재사용이 어렵고, 효소의 생산단가가 높아 실제 산업에 적용하는데 한계가 있다. 효소 고정화는 효소를 일정한 곳에 물리적으로 구속하여 계속, 반복적으로 촉매 활성을 나타낼 수 있도록 하는 방법으로 효소의 이용성과 안정성을 증가시키기 때문에 위와 같은 효소의 한계점을 극복할 수 있는 대안으로 각광받고 있다. 섬유 산업에서 효소 고정화에 대한 연구는 락카아제, 아밀라아제, 셀룰라아제 등을 고정화하여 바이오표백, 염료탈색 및 분해, 산업 폐수 처리, 세탁용 세제의 오염 제거 효과 향상 등의 적용 가능성에 대하여 보고되었다.

효소 고정화 방법은 크게 담체결합법, 가교법, 포괄법, 복합법으로 분류되며, 담체결합법 중 담체와 가교제의 공유결합에 의한 효소 고정화 방법이 가장 널리 쓰인다. 효소와 담체 간 공유결합에 의한 고정화는 담체 표면에 유도된 기능기와 효소 표면의 아미노산 잔기 사이를 공유결합 함으로써 고정화하는 방법으로, 담체와 효소간의 강한 결합으로 인해 효소가 반응 중에 분리되는 일이 적고, 기질과 접촉이 쉬우며 효소의 열 안정성이 증가되는 장점이 있다. 효소 고정화 시 대표적으로 사용되는 가교제는 글루타알데하이드(GA)로 효소의 아미노기와 반응하여 강한 가교결합을 형성함으로써 효소를 안정시킬 뿐 아니라 항균 및 항바이러스 효과 등도 부여할 수 있다. 키토산 비드에 가교제인 글루타알데하이드(GA)를 이용해 가교 조건을 변화시켜 β-글루코시다아제를 고정화시키는 방법, 글리시돌과 글루타알데하이드(GA)로 키토산 겔을 활성 시킨 후 트립신을 고정화시키는 방법, 마이크로스페어에 글루타알데하이드(GA), 헥사메틸렌다이아민과 같은 가교제를 이용해 다양한 담체 표면을 만들어 트립신을 고정화시키는 방법 등이 보고되었다.

담체를 이용한 효소 고정화 시 효소와 담체 간의 강한 결합으로 인해 효소의 고차 구조가 변하여 고정화 효소의 활성이 저하될 수 있기 때문에 단백질과 높은 친화력, 물리·화학적 안정성, 우수한 기계적 강도 및 충분한 반응기를 가지고 있는 담체가 요구된다. 키토산은 인체에 대한 안전성이 뛰어날 뿐만 아니라, 항균성, 방취성, 흡착성, 보습성 등이 우수하며 부가가치가 높고, 생체적합성 및 생분해성으로 인해 의료, 섬유, 식품산업 및 농업 등의 다양한 분야에서 고정화 담체로서 주목받고 있다. 고정화 담체로서 키토산은 값이 저렴하고 우수한 친수성 및 상처 치유 촉진성, 높은 다공성, 효소에 대한 낮은 입체 장해(steric hinderance)를 가진다. 또한 키토산은 폴리글루코사민 사슬에 수산기(-OH)와 유리 아미노기(-NH2)를 가지고 있어 효소와 결합시키거나 화학적으로 변형시키기가 쉽다. 효소 고정화 시 키토산은 키토산 파우더, 키토산 비드, 키토산 층으로 코팅하거나 혼합시킨 겔과 비드, 멤브레인 등 다양한 형태의 고정화 담체로 연구되었다.

섬유로 만들어진 담체는 저렴한 가격, 넓은 비표면적, 우수한 기계적 성질 등의 이점으로 인해 최근 효소 고정화 담체로서 주목받고 있다. 다양한 섬유 재료들이 고정화 담체로 연구되는데, 특히 부직포 형태의 고정화 담체는 높은 비표면적, 우수한 기계적 강도, 화학적 안정성, 기질과 생성물의 낮은 확산 저항성 등의 이점을 가진다. 또한 부직포 자체의 내구성, 경량성, 취급의 용이성, 저렴한 가격으로 인해 섬유 산업에서 주목받고 있으며, 특히 통기성 및 흡수성으로 인해 의료용 섬유소재로도 사용되고 있다.

단백질 분해효소인 트립신은 의료 및 의약품 분야, 식품 분야, 생물 분야 등에서 널리 사용되고 있는 효소로, 가장 확연한 기질 특이성을 가지고 있다. 트립신은 단백질의 소화 외에도 소염효소로서 몸의 표면 및 내부의 염증 치료에 쓰인다.

한편, 한국특허출원 제10-0019901호에는 새로운 키토산 섬유 부직포 및 그 제조방법에 관한 것으로, 키토산 섬유 부직포는 키토산 용해성 용제로 키토산 섬유의 표면을 녹여 섬유 상호간을 서로 결합시킨 실질적으로 키토산 섬유만으로 이루어진 부직포로서 창상, 화상 또는 자상 등의 상처 피복, 보호재와 같은 의료용 제품이나, 기타 의류, 신발, 매트 등의 다양한 용도에 충분하게 적용시킬 수 있다고 개시하고 있지만, 본 발명의 글루타알데하이드(glutaraldehyde; GA)를 이용한 트립신 고정화방법에 대한 언급은 없다.

따라서 본 발명에서는 섬유소재에 적합한 효소 고정화 기술을 도입하기 위하여 고정화 담체로 지금까지 연구된 바 없는 키토산 부직포를, 가교제로 글루타알데하이드를 선정하여 최적의 트립신 고정화 방법을 확립하고자 하였다. 이를 위하여, 키토산 부직포와 트립신 반응 시 pH, 온도, 트립신 농도, 처리 시간 등의 반응 최적 조건을 결정하였고, 키토산 부직포에 GA로 가교 시 pH, GA 농도, 가교 시간에 따른 가교 정도 등의 조건을 최적화하였다. 또한, 선가교 및 후가교 방법으로 트립신을 고정화한 후, 고정화된 트립신의 활성 평가를 바탕으로 GA 가교 순서를 정하였고, 분광학적 분석과 표면관찰을 통해서 키토산 부직포에 GA 가교 및 트립신 고정화의 여부를 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 글루타알데하이드(glutaraldehyde; GA)로 가교하여 키토산 부직포에 트립신(trypsin)을 고정화하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 트립신이 고정화된 키토산 부직포을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 글루타알데하이드(glutaraldehyde; GA)로 가교하여 키토산 부직포에 트립신(trypsin)을 고정화하는 방법을 제공한다.

상세하게는, 키토산 부직포에 글루타알데하이드를 처리하는 글루타알데하이드 가교 단계; 및 상기 글루타알데하이드 가교된 키토산 부직포와 트립신(trypsin)을 반응시키는 고정화 단계를 포함하는 키토산 부직포에 트립신을 고정화하는 방법을 제공한다.

보다 상세하게는, 상기 글루타알데하이드 가교 단계는 글루타알데하이드 0.1 내지 15%(v/v), pH 7 내지 11으로, 10분 내지 900분 동안 처리하는 것을 특징으로 하고, 상기 고정화 단계는 트립신 1 내지 100%(on the weight of fabric; o.w.f), pH 7 내지 9, 30 내지 60℃로, 10 내지 240분 동안 반응시키는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기의 방법에 의해 트립신이 고정화된 키토산 부직포를 제공한다.

본 발명의 트립신이 고정화된 키토산 부직포는 소염작용을 하는 창상피복제로도 사용될 수 있는데, 미세공간이 많고 단위 중량당 표면적이 큰 특징을 가지고 피부와의 밀착성 및 공기투과도가 우수하며 외부로부터의 세균의 침투에 의한 감염을 방지할 수 있으므로, 손상된 조직의 세포를 효율적으로 재생시킬 수 있다.

본 발명은 글루타알데하이드(glutaraldehyde; GA)를 이용한 키토산 부직포에 트립신을 고정화하는 방법에 관한 것으로서, 상세하게는 섬유소재에 적합한 효소 고정화 기술을 도입하기 위하여 고정화 담체로 키토산 부직포를, 가교제로 글루타알데하이드를 사용한 최적의 트립신 고정화 방법에 대한 것이다. 종래에는 고정화 효소를 사용할 때, 마이크로비드, 겔 등의 담체에 고정화하였기 때문에 모듈성 및 안정성이 낮았지만, 부직포 형태로 제조된 담체를 사용할 경우, 넓은 비표면적에 효과적으로 고정화되기 때문에 재료로서 효과적이다. 또한 자체의 내구성, 경량성, 용이성, 경제성뿐만 아니라 기존의 필름이나 비드 등이 갖지 못한 통기성 및 흡습성 등도 가지고 있기 때문에 다양한 분야에서 다양한 용도의 고정화 담체로서 사용이 가능하다.

도 1은 키토산 부직포 상의 트립신 활성에 있어서 여러 조건의 pH 및 온도에 따른 영향을 나타낸 결과이다(트립신 농도 10%(o.w.f), 60분).
도 2는 키토산 부직포 상의 트립신 활성에 있어서 여러 조건의 처리 시간에 따른 영향을 나타낸 결과이다(pH 8.5, 37℃, 60분).
도 3은 키토산 부직포 상의 트립신 활성에 있어서 여러 조건의 트립신 농도에 따른 영향을 나타낸 결과이다(pH 8.5, 트립신 농도 15%(o.w.f)).
도 4는 키토산 부직포 상의 GA 가교에 있어서 여러 조건의 pH에 따른 영향을 나타낸 결과이다. (a) 염료 RR222 흡진율, (b) 고정화된 트립신의 흡광도. (GA 가교: GA 0.3%(v/v), 25℃, 2 시간)
도 5는 키토산 부직포 상의 GA 가교에 있어서 여러 조건의 GA 농도에 따른 영향을 나타낸 결과이다. (a) 염료 RR222 흡진율, (b) 고정화된 트립신의 흡광도. (GA 가교: pH 10, 25℃, 2 시간)
도 6은 키토산 부직포 상의 GA 가교에 있어서 여러 조건의 가교 시간에 따른 영향을 나타낸 결과이다. (a) 염료 RR222 흡진율, (b) 고정화된 트립신의 흡광도. (GA 가교: pH 10, GA 3%(v/v), 25℃)
도 7은 자유트립신 및 고정화된 트립신 활성에 대한 흡광도를 나타낸다(자유트립신: 15%(o.w.f), GA 가교: pH 10, GA 3%(v/v), 2 시간, 트립신 고정화: pH 8.5, 트립신 15%(o.w.f), 1 시간, 트립신 활성: 0.05M L-BAPA, 10분).
도 8은 미처리, GA 가교 및 트립신 고정화한 키토산 부직포의 FT-IR 측정 결과이다.
도 9는 미처리(a) 및 트립신 고정화한(b) 키토산 부직포의 표면관찰 결과이다.

이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 트립신과 키토산 부직포의 활성 평가

1. 시료 및 시약

본 발명에서 사용한 키토산 부직포의 시료 특성 및 트립신 효소의 특성은 표 1 및 표 2에 나타냈다.

조성(%)	두께(mm)	중량(g/m²)	제조방법
Chitosan 100	35.48	88.5	니들 펀칭 (Needle punching)

효소	출처	활성	형태	제조사
트립신 (Trypsin) (EC 3.4.21.4)	돼지 췌장 ( Porcine pancreas )	1000-2000 BAEE units/mg solid	동결건조된 분말 (Lyphophilized powder)	Sigma Chemicals Co.

효소 및 글루타알데하이드 처리 시 pH를 일정하게 유지하기 위하여 버퍼용액을 제조해서 사용하였으며, 버퍼로 Trizma base(Sigma Chemicals Co., USA)와 Trizma HCl(Sigma Chemicals Co., USA), 인산수소나트륨(sodium phosphate monobasic, Sigma Chemicals Co., USA)과 인산일수소나트륨(sodium phosphate dibasic, Sigma Chemicals Co., USA), 탄산나트륨(sodium carbonate, Duksan Pure Chemicals Co., Korea)과 탄산수소나트륨(sodium bicarbonate, Duksan Pure Chemicals Co., Korea)을 사용하였다. 트립신과 키토산 부직포의 활성 측정을 위해 브래드포드 시약(Sigma Chemicals Co., USA)을, 가교제로 25% 글루타알데하이드(이하 GA, Glutaraldehyde, Junsei Chemical Co., Japan)를 사용하였다. GA 가교한 키토산 부직포의 가교 정도를 평가하기 위해 반응성 염료 Sunfix Scarlet S2G 150%(C.I.Reactive Red 222, Oh Young Industrial Co., Korea)를 사용하였다. 트립신 활성 측정을 위해 트립신의 기질인 N_α-Benzoyl-L-arginine 4-nitroanilide hydrochloride(이하 L-BAPA, Sigma Chemicals Co., USA), 디메틸설폭시화물(이하 DMSO, dimethyl sulfoxide, Sigma Chemicals Co., USA), 염화칼슘(calcium chloride, Kanto Chemical Co., Japan)을 사용하였다.

2. 트립신과 키토산 부직포의 활성 측정

트립신과 키토산 부직포의 활성은 0.5g의 키토산 부직포를 액비 1:50, 25mM의 버퍼용액에 넣고, pH(7.0∼9.0), 온도(30∼60℃), 트립신 농도(1∼100%, o.w.f), 반응 시간(10∼240분)을 변화시켜 110rpm으로 항온진탕수조(Shaking water bath, BS-31, JEIO TECH Co., Korea)에서 처리하였다. 트립신과 키토산 부직포의 활성 정도는 브래드포드 법에 의해 반응한 상층액을 UV-Vis Spectrophotometer(M-3100, SCINCO CO, Korea)를 사용하여 595nm에서 흡광도를 측정하였다.

3. 결과

도 1 내지 도 3은 트립신과 키토산 부직포의 최적 반응 조건을 설정하기 위하여, 반응 용액의 pH 및 온도, 트립신 농도, 처리 시간을 변화시켜 처리한 결과이다. 트립신의 최적 반응 조건은 효소 처리 후 잔여 용액을 브래드포드 시약과 반응시킨 후 595nm에서 흡광도를 측정하여 평가하였다.

도 1은 키토산 부직포와 트립신 반응 시 트립신 농도 10%(o.w.f)로 60분간 처리 시 pH(7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0)와 온도(30, 37, 40, 45, 50, 60℃) 변화에 따른 트립신의 활성 측정 결과이다. 도 1에 나타난 바와 같이, 트립신의 활성은 pH 8.5, 37℃ 조건에서 최대 흡광도 값을 나타냈고, 45℃ 이하의 온도에서는 pH에 의한 흡광도 차이가 크고 그 이상의 온도에서는 pH에 의한 흡광도 차이가 작았다. 즉, 트립신은 키토산 부직포와 반응 시 45℃ 이하의 온도에서는 pH의 영향을 많이 받고, 그 이상의 온도에서는 pH 보다는 온도에 의해 영향을 많이 받음을 확인하였다. 브래드포드 시약은 단백질의 양전하를 띤 염기성 아미노산인 아르기닌, 리신, 히스티딘 잔기와 결합하여 푸른색을 띠며 595nm로 스펙트럼 이동을 보이는데, 45℃ 이상의 온도에서 온도가 높아짐에 따라 흡광도 값이 매우 작아지는 결과를 통해 위 온도에서 트립신은 그 구조가 변성되거나 부분적으로 사활 되어 키토산 부직포 및 브래드포드 시약과 반응하지 못한 것으로 판단된다. 또한 대부분의 효소는 강한 산성과 염기성 조건에서 변성으로 인해 안정성이 낮아진다. 본 발명에서는 트립신의 최적 pH인 pH 8.0 부근(pH 7.0-9.0)에서 트립신의 활성을 평가하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, 트립신의 활성은 pH 8.5에서 가장 우수하였다. 따라서 트립신과 키토산 부직포의 반응 시 최적 pH와 온도는 pH 8.5, 37℃이다.

도 2는 키토산 부직포와 트립신 반응 시 pH 8.5, 온도 37℃에서 60분간 처리 시 트립신 농도(1, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100%, o.w.f) 변화에 따른 트립신의 활성 측정 결과이다. 도 2에 나타난 바와 같이, 트립신의 활성은 트립신 농도 15%까지 트립신 농도가 증가함에 따라 선형적으로 증가하다가 15%에서 20%까지는 거의 일정한 수준을 유지한 후, 20% 이상의 농도에서 다시 증가하였다. 트립신 농도 20% 이상에서 흡광도 값의 꾸준한 증가는 트립신 용액 내 높은 농도의 미 반응 트립신과 브래드포드 시약의 반응 결과로 판단된다. 이에 도 2의 그래프 기울기에 따라서 기울기가 완만해지기 시작하는 트립신 농도 15%를 최적 농도로 보았다. 따라서 트립신과 키토산 부직포의 반응 시 최적 트립신 농도는 15%(o.w.f)이다.

도 3은 키토산 부직포와 트립신 반응 시 pH 8.5, 온도 37℃, 트립신 농도 15%(o.w.f)의 조건에서 처리 시간(10, 30, 60, 90, 120, 180, 240분) 변화에 따른 트립신의 활성 측정 결과이다. 도 3에 나타난 바와 같이, 트립신의 활성은 60분에서 최대 반응을 보인 후, 시간이 지남에 따라 다시 감소하여 일정 수준을 유지하였다. 이는 자유 트립신이 자가 분해 혹은 단백질의 변성과 응집에 따른 실활로 인해 60분에서의 최대 흡광도 값이 유지되지 않고 감소한 것으로 판단된다. 따라서 트립신과 키토산 부직포의 반응 시 최적 처리 시간은 60분이다.

이상, 키토산 부직포와 반응시킨 자유 트립신의 안정성을 평가한 결과, 자유 트립신의 최적 pH는 8.5이며, pH와 관계없이 45℃ 이상의 온도에서 점차적으로 활성이 저하되다가 60℃에서는 거의 사활 되었다. 또한 농도는 최적 농도 이상에서 과 농도로 인한 응집으로 트립신 활성의 상대적인 증가율이 감소하였다. 시간은 반응 60분이 지나면 트립신의 불안정성으로 자가분해 되어 활성이 감소함을 확인하였다. 따라서 본 발명에서는 키토산 부직포와 트립신 반응 시 pH 8.5, 온도 37℃, 트립신 농도 15%(o.w.f), 처리 시간 60분을 최적 반응 조건으로 설정하였다.

< 실시예 2> GA 가교 조건에 따른 반응성 염료의 흡착 및 고정화된 트립신의 활성 평가

1. GA 에 의한 키토산 부직포 가교

키토산 부직포의 가교는 0.15g의 키토산 부직포를 액비 1:50, 25mM의 버퍼용액에 넣고, pH(7.0∼11.0), GA 농도(0.1∼15%, v/v), 반응 시간(10∼900분)을 변화시켜 110rpm으로 항온진탕수조에서 처리하였다. GA 가교한 키토산 부직포는 해당 버퍼로 10분간 1회, 증류수로 10분간 2회 수세하여 잔여 GA를 제거한 후, 상온에서 건조하였다.

2. GA 가교한 키토산 부직포의 활성 측정

(1) 반응성 염료에 의한 활성 측정

반응 조건에 따라 GA 가교한 키토산 부직포의 GA 가교 정도는 키토산 부직포를 반응성 염료 RR222로 염색하여 측정하였다. 조건별로 GA 가교한 키토산 부직포를 0.5%(w/v) 반응성 염료 표준용액으로 제조한 액비 1:1000의 염료 용액에 넣고, 30℃에서 130rpm으로 항온진탕수조에서 3일간 반응시켰다. 잔여 용액의 흡광도는 506nm에서 UV-Vis Spectrophotometer로 측정한 후, 흡진율로 환산하여 GA 가교 정도를 평가하였다.

Exhaustion(%) = (C₀ - C₁)/C₀ ×100

상기 C₀은 염색 전의 염색 수조에서의 염료 흡광도이고, C₁은 염색 후의 염료 흡광도이다.

(2) 트립신 기질에 의한 활성 측정

반응 조건에 따라 GA 가교한 키토산 부직포를 액비 1:50, pH 8.5, 25mM의 버퍼용액에 넣고, 10%(o.w.f)의 트립신과 25℃에서 24시간 동안 110rpm으로 항온진탕수조에서 반응시켰다. 트립신 고정화한 키토산 부직포는 증류수로 여러 번 수세하여 고정화 되지 않은 잔여 트립신을 제거한 후, 효소의 변성이 적은 4℃에서 1시간 보관 후 고정화된 트립신의 활성을 측정하였다. 트립신 고정화된 키토산 부직포를 pH 8.5, 10mM 염화칼슘이 포함 50mM Tris 버퍼 10ml에 넣고, DMSO에 녹인 50mM L-BAPA 35μl를 넣은 후, 25℃에서 60분간 110rpm으로 항온진탕수조에서 반응시켰다. 반응한 상층액은 UV-Vis Spectrophotometer를 사용해서 410nm에서 흡광도를 측정하였다.

3. 결과

(1) pH의 영향

도 4는 키토산 부직포에 GA 가교 시 GA 농도 0.3%(v/v), 25℃, 2시간의 조건에서 GA 용액의 pH(7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 11.0) 변화에 따른 반응성 염료의 흡진율(a)과 고정화된 트립신의 L-BAPA에 대한 활성(b) 측정 결과이다.

도 4(a)에 나타난 바와 같이, 미처리 키토산 부직포의 흡진율은 100%이고 다른 pH 조건에서 GA 가교한 키토산 부직포의 흡진율은 각 pH 조건 간에 10% 내의 차이를 가졌으며 pH 8.0에서 가장 낮은 흡진율을 나타내었다. GA 가교한 키토산 부직포를 반응성 염료로 염색 시, 반응성 염료는 키토산의 아미노기(-NH₂)와 GA의 알데하이드기(-CHO)에 반응하는데, 이때 키토산의 아미노기와 우선적으로 반응하여 흡착한다. 즉, 흡진율이 낮게 나올수록 반응성 염료가 키토산의 아미노기와 거의 반응하지 못한 것이므로 GA의 알데하이드기가 키토산 부직포의 아미노기와 반응하여 GA 가교결합이 잘 된 것으로 판단할 수 있다. 따라서 흡진율 결과에 따른 최적 GA 가교 pH는 8.0이다. 도 4(b)에 나타난 바와 같이, 고정화된 트립신의 활성은 중성에서 염기성으로 pH가 증가함에 따라 증가하였으며 pH 10.0에서 최대 활성을 보인 후 다시 감소하였다. 이는 염기성 조건하에서 GA의 분자 구조와 관련이 있기 때문이다. 염기성 조건에서 GA는 분자 간의 빠른 알돌축합 반응으로 α,β-불포화 다중결합을 가진 중합된 GA 형태의 분자 구조를 만들며, 이 중합된 GA 분자 내부의 알데하이드기는 C-C 이중결합으로 연결되어 단백질의 아미노기와 반응해 Schiff 염기를 형성함으로써 단백질과 안정적으로 결합한다. 염기성 조건하에서 중합된 형태의 GA는 단백질의 아미노기와 반응하여 환원제 없이도 안정한 공명구조를 만들기 때문에 GA와 단백질의 가교 반응은 높은 pH가 적절하다. 또한 키토산은 단백질은 아니지만 분자 내부에 아미노기를 가지고 있기 때문에 염기성 조건에서 GA와 더 우수한 가교 반응을 한 것으로 판단된다. 또한, 이전의 보고에 따르면, 담체의 색이 갈색에 가까워질수록 GA 반응이 잘 일어나지 않기 때문에 담체로 쓸 수 없다. 본 실험결과, pH 7.0, 8.0에서 GA 가교한 키토산 부직포의 색은 노란 갈색에 가까운 색 변화를 보였으며, 위 조건에서 GA 가교한 키토산 부직포에 고정화된 트립신의 활성이 매우 낮음을 확인한 바, GA 반응으로 인한 담체의 색 변화가 GA 반응이 제대로 일어나지 않은 것으로 판단된다. 이에 키토산 부직포에 GA 가교 시 pH 8.0은 가장 낮은 흡진율을 나타냈지만 담체 표면의 GA 가교 증가와 효소의 활성은 비례 관계가 아니므로 최적 GA 가교시의 pH로 적절치 않다고 판단하였다. 따라서 고정화된 트립신 활성 측정 결과에 따른 최적 GA 가교 pH는 10.0이다.

(2) GA 농도의 영향

도 5는 키토산 부직포에 GA 가교 시 pH 10.0, 25℃, 2시간의 조건에서 GA 농도(0.1, 0.3, 1, 2, 3, 4, 5, 15%, v/v) 변화에 따른 반응성 염료의 흡진율(a)과 고정화된 트립신의 L-BAPA에 대한 활성(b) 측정 결과이다. 도 5(a)에 나타난 바와 같이 반응성 염료에 의한 흡진율은 GA 농도 0.1-3%까지는 선형적으로 크게 감소하다가 3-15%에서는 약 10% 정도로 완만하게 감소하였다. 이는 GA 농도 3% 이상부터는 중합된 GA 분자들이 키토산 부직포의 아미노기에 포화상태로 결합하였기 때문이다. 이는 GA 농도가 증가할수록 많은 양의 GA 분자들의 알돌축합 반응에 의한 중합화로 그 분자 크기가 커져 키토산 부직포의 아민기와 반응할 반응성 염료의 흡진율을 감소시킨 것으로 판단된다. 따라서 흡진율 결과에 따른 최적 GA 농도는 3%(v/v)이다. 도 5(b)에 나타난 바와 같이 키토산 부직포에 가교시키는 GA의 농도가 증가함에 따라 고정화된 트립신의 활성은 선형적으로 증가하였으며, GA 농도 3%에서 최대 활성을 나타내고, 그 이상의 농도에서는 약간 감소하여 일정 수준을 유지하였다. GA 농도는 가교결합 정도에 영향을 주는 중요한 요소로, GA 농도 2% 이하에서 트립신과 GA의 가교결합이 충분히 이루어지지 않아 고정화된 트립신의 활성이 낮게 나타난 것으로 판단된다. 또한 낮은 농도의 효소와 GA의 결합은 GA의 반응기가 효소의 같은 분자에 반응할 가능성을 높여 원치 않은 효소 분자 내 가교결합을 유도하기 때문에 위와 같은 결과가 나온 것으로 보인다. 고정화된 트립신의 활성은 GA 농도 4% 이상에서 다시 낮아지는 것으로 나타나 높은 GA 농도로 인한 과도한 가교 결합이 트립신 구조에 변성을 주어 촉매 활성에 영향을 준 것으로 판단된다. 따라서 고정화된 트립신 활성 측정 결과에 따른 최적 GA 농도는 3%(v/v)이다.

(3) 시간의 영향

도 6은 키토산 부직포에 GA 가교 시 pH 10.0, 25℃, GA 농도 3%(v/v)의 조건에서 가교 시간(0.5, 1, 2, 5, 15시간) 변화에 따른 반응성 염료의 흡진율(a)과 고정화된 트립신의 L-BAPA에 대한 활성(b) 측정 결과이다. 도 6(a)에 나타난 바와 같이 반응성 염료에 의한 흡진율은 GA 가교 시간이 증가함에 따라 감소하다가 2시간에서 가장 낮은 흡진율을 보이고 다시 증가하여 일정한 수준을 유지하였다. 이는 반응 초기 30분 동안 GA가 담체의 아미노기와 빠르게 반응한다는 연구결과와 일치하며, 본 발명에서도 미처리한 키토산 부직포에 비해 30분 동안 GA를 가교한 키토산 부직포의 흡진율이 100%에서 약 38% 로 급격히 감소한 것을 확인하였다. 즉, 같은 양의 GA를 다른 가교 시간 조건에서 처리한 키토산 부직포에 반응성 염료를 흡착시킨 결과는 2시간 동안 GA를 가교한 키토산 부직포가 가장 낮은 흡진율을 보였다. 따라서 최적 GA 가교 시간은 2시간이다. 도 6(b)에 나타난 바와 같이 고정화된 트립신의 활성은 2시간까지 가교 시간이 늘어남에 따라 증가하다가 2시간에서 최대 활성을 보인 후 2시간 이상으로 가교 시간이 길어짐에 따라 활성이 점차적으로 감소하였다. 따라서 고정화된 트립신 활성 측정 결과에 따른 최적 GA 처리 시간은 2시간이다. 이상의 결과를 바탕으로 GA 최적 가교 조건은 pH 10.0, GA 농도 3%(v/v), 가교 시간 2시간이다.

< 실시예 3> 키토산 부직포에 GA 가교 순서에 따른 트립신 고정화

1. 키토산 부직포에 GA 가교 후 트립신 고정화

GA와 키토산 부직포의 최적 가교 조건에서 GA와 키토산 부직포를 반응시킨 후, GA 가교한 키토산 부직포를 트립신과 키토산 부직포의 최적 반응 조건으로 트립신을 고정화시켰다. 반응하지 않은 잔여 GA를 제거하기 위해 GA 가교한 해당 버퍼로 10분간 1회 수세하고, 고정화 되지 않은 트립신이 검출되지 않을 때까지 증류수로 여러 번 수세한 후, 4℃에서 1시간 보관한 다음 위와 동일한 방법으로 고정화된 트립신의 활성을 측정하였다.

2. 키토산 부직포에 트립신을 흡착시킨 후 GA 가교

트립신과 키토산 부직포의 최적 반응 조건에서 트립신과 키토산 부직포를 반응시킨 후, 트립신 흡착된 키토산 부직포를 GA와 키토산 부직포의 최적 가교 조건으로 GA로 가교시켰다. 반응하지 않은 잔여 GA를 제거하기 위해 버퍼로 10분간 1회 수세하고, 고정화 되지 않은 트립신이 검출되지 않을 때까지 증류수로 여러 번 수세한 후, 4℃에서 1시간 보관한 다음 위와 동일한 방법으로 고정화된 트립신의 활성을 측정하였다.

3. 결과

도 7은 기질과 10분간 반응시킨 자유트립신과 GA 가교 순서에 따른 고정화된 트립신의 활성 측정 결과이다. GA 선가교는 키토산 부직포에 GA를 가교시킨 후 트립신을 고정화하였고, GA 후가교는 키토산 부직포와 트립신을 반응시킨 후 GA로 가교하여 고정화하였다. 이 두 가지 방법 모두 앞 실험에서 설정한 트립신과 키토산 부직포의 최적 반응 조건 및 GA와 키토산 부직포의 최적 가교 조건으로 실험하였다.

도 7에 나타난 바와 같이 고정화된 트립신의 활성은 GA 선가교의 방법이 GA 후가교의 방법보다 월등히 높았다. GA 선가교로 고정화 한 트립신의 활성이 더 우수한 원인 중 하나는 고정화에 따른 효소의 화학적 변형과 관련이 있다. GA로 먼저 고정화 담체를 활성 시킨 후 효소를 고정화하는 방법은 고정화에 관련된 효소 단백질 일부에만 영향을 끼쳤기 때문에 효소의 화학적 변형이 적은 반면, 아미노기를 가진 담체에 효소를 흡착시킨 후 GA로 처리하는 방법은 모든 단백질 표면이 변형될 수 있기 때문이다. 본 발명에서도 GA 후가교로 고정화한 트립신은 거의 활성이 없는 것으로 나타났다. 이는 키토산 부직포와 트립신간의 이온적 흡착이 잘 일어나지 않아 트립신이 고정화되지 않은 것으로 판단된다. 또한 키토산 부직포 역시 GA의 알데하이드기와 공유결합 하는 아미노기를 가지고 있기 때문에 GA 선가교 방법이 더 안정적이며 반응이 일어나기 쉬운 것으로 판단된다. 따라서 키토산 부직포에 GA를 이용한 트립신 고정화 시 GA 선가교의 방법이 GA 후가교의 방법보다 더 우수함을 확인하였다.

자유 트립신과 고정화 트립신의 활성을 비교해보면, 고정화 트립신의 활성이 자유 트립신 활성의 약 40%를 나타냈다. 이는 효소를 담체에 공유결합으로 고정화 할 때 효소의 고차 구조나 활성 중심이 일부 파괴될 수 있고, 물리적 구속에 의해 효소의 원활한 이동이 제한되어 기질과의 반응 속도가 저하되기 때문이다. 또한 트립신은 트립신의 특정 활성 지점(single point attachment)이 아닌 다지점(multi point attachment)에서 공유결합으로 고정화됨으로써 안정성을 향상시킬 수는 있지만, 효소의 여러 지점이 고체 표면 위에 직접 고정화되어 본연의 입체 구조가 변화될 수 있고, 무작위로 무배향성으로 고정되기 때문에 활성 지점이 가려져 활성이 감소될 수 있으므로, 고정화된 트립신이 자유트립신 활성의 약 40%를 보인 것으로 판단된다.

< 실시예 4> 트립신 고정화된 부직포의 구조분석 및 표면관찰

1. 분광학적 분석 및 표면형태

표면의 분광학적 분석은 적외선 분광광도계(FT/IR-670Plus, Jasco, Inc. USA)를 사용하여 비교, 관찰하였다.

표면형태는 주사 전자 현미경(JSM-7600F, JEOL KOREA LTD., Japan)을 사용하여 비교, 관찰하였다.

2. 결과

도 8은 미처리, GA 가교 및 트립신 고정화한 키토산 부직포의 FT-IR 측정 결과이다. 도 8에 나타난 바와 같이, GA 가교 및 트립신 고정화에 의해 1660-1670cm^-1 범위에서 새로운 피크가 나타났다. 이는 GA 가교 시 키토산 부직포의 아미노기와 GA의 알데하이드기가 결합하고 트립신 고정화 시 트립신의 아미노기와 GA의 알데하이드기가 결합함에 따라 C=N 결합이 생기기 때문이다. 따라서 C=N 결합을 통해 키토산 부직포에 GA 가교 및 트립신 고정화가 효과적으로 이루어짐을 확인하였다. 또한 GA 가교된 키토산 부직포에 트립신이 고정화되었는지의 여부는 표면 관찰을 통해 확인하였다.

도 9는 미처리 및 트립신 고정화한 키토산 부직포의 표면관찰 결과이다. 미처리 키토산 부직포의 표면이 매끈한 반면 트립신 고정화에 의해 표면은 둥글게 주름진 형태로 표면 거칠기가 증가하였다. 표면 거칠기의 증가는 GA 가교한 부직포 표면의 트립신 고정화에 의한 것으로 판단되며, 굴곡진 주름 형태의 표면은 트립신 단백질 결정의 재결정화에 의한 것으로 보인다. 따라서 표면관찰 결과를 통해, 키토산 부직포에 트립신이 공유결합 하여 고정화됨을 확인하였다.

Claims

글루타알데하이드(glutaraldehyde; GA)로 가교하여 키토산 부직포에 트립신(trypsin)을 고정화하는 방법.
제1항에 있어서, 키토산 부직포에 글루타알데하이드를 처리하는 글루타알데하이드 가교 단계; 및
상기 글루타알데하이드 가교된 키토산 부직포와 트립신(trypsin)을 반응시키는 고정화 단계를 포함하는 키토산 부직포에 트립신을 고정화하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 글루타알데하이드 가교 단계는 글루타알데하이드 0.1 내지 15%(v/v), pH 7 내지 11으로, 10분 내지 900분 동안 처리하는 것을 특징으로 하는 키토산 부직포에 트립신을 고정화하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 고정화 단계는 트립신 1 내지 100%(on the weight of fabric; o.w.f), pH 7 내지 9, 30 내지 60℃로, 10 내지 240분 동안 반응시키는 것을 특징으로 하는 키토산 부직포에 트립신을 고정화하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 트립신이 고정화된 키토산 부직포.