CN112158961A - 一种耐铬假单胞菌及其在高浓度铬污染黑臭水体治理中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种耐铬假单胞菌及其在高浓度铬污染黑臭水体治理中的应用。耐铬假单胞菌名称为Pseudogemmobacter bohemicus.SCU20，属于假单胞菌(Pseudomonas sp.)。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M2020179 SCU20。所述菌株的16S rRNA基因序列如序列表SEQ.ID.NO1所示。本发明利用假单胞菌Pseudogemmobacter bohemicus.SCU20治理高浓度铬污染黑臭水体，解决高浓度铬污染黑臭水体由于含重金属铬污染治理难度大，菌种不耐受而难以治理的问题。

Description

一种耐铬假单胞菌及其在高浓度铬污染黑臭水体治理中的 应用

技术领域

本发明属于黑臭水体治理领域，具体涉及假单胞菌在高浓度铬污染黑臭水体治理中的应用

背景技术

水体黑臭已成为世界性的环境问题，水体黑臭使得水质严重退化，生态系统破坏导致河道失去自净能力。在中国26个重点监测湖(河)中，重度污染占3.8％，中度污染占7.7％，轻度污染占30.8％。并且随着城市化的发展，黑臭水体中常伴随有重金属铬的污染，水体黑臭和重金属协同污染过程破坏水生态系统的正常循环。目前，物理清淤和化学药剂投放是治理此种污染的主要方式，但是长期使用化学药剂造成了药剂残留、生态平衡破坏和黑臭问题复发，对水资源保护造成严重影响。

微生物是水体环境和底泥中生态系统的重要组成部分，对水质的影响和环境的改善有显著作用。微生物修复法具有微生物细胞浓度高、反应速度快和抗环境冲击能力强等优点。然而微生物菌剂大多来自于国外，本土生产的菌剂相对很少。外来微生物菌剂虽然对提高水体水质有明显的效果，但是它在实际应用中难于适应新的生存环境，和水体中的土著菌群有竞争关系。因此，将土著微生物中具有特殊性质、特殊功能的微生物驯化出来，会更有利于本地水体的修复。

假单胞菌(Pseudomonas sp.)是土壤和水中普遍存在的微生物类型。近年来的研究发现，假单胞菌能够加速水中氮循环细菌的新陈代谢速率，促进氨化细菌、亚硝化细菌和硝化细菌生长繁殖，使氨化作用和硝化作用强度增加。现有研究将假单胞菌用于处理工业废水和养殖废水，但目前用于治理城市河流黑臭的研究较少，这是由于黑臭水体中常伴随有重金属铬的污染，并且浓度通常较高。铬在生态系统中为高毒性的致癌物和诱变剂，现有假单胞菌株耐铬性较弱，不能在高浓度重金属污染下处理废水。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种耐铬假单胞菌及其在高浓度铬污染黑臭水体治理中的应用，利用假单胞菌Pseudogemmobacterbohemicus.SCU20治理高浓度铬污染黑臭水体，解决高浓度铬污染黑臭水体由于含重金属铬污染治理难度大，菌种不耐受而难以治理的问题。

本发明提供的耐铬假单胞菌，名称为Pseudogemmobacterbohemicus.SCU20(以下简称SCU20)，属于假单胞菌(Pseudomonas sp.)。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心保藏(湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学)，保藏日期为2020年6月4日，保藏编号为CCTCC NO：M2020179。所述菌株的16S rRNA基因序列如序列表 SEQ.ID.NO1所示。

本发明提供的上述耐铬假单胞菌在高浓度铬污染黑臭水体治理中的应用。

上述应用，进一步地，将所述耐铬假单胞菌培养为SCU20降解菌剂投放到黑臭水体中，菌液的投放量为黑臭水体质量的3～10％。

上述应用，进一步地，所述SCU20降解菌剂通过以下方法制备：将SCU20菌种接种于铬浓度大于等于待处理黑臭水体铬浓度的含铬分离纯化液体培养基中，放在26℃恒温培养箱中培养，24h后取样测样，菌液的浓度大于等于1.0×10⁹cfu/mL时停止发酵，取所得发酵产物1‰～1％体积接种于相同的分离纯化液体培养基中于26～35℃， 120～150rpm条件下振荡培养12～24h，得到SCU20菌液。

上述应用，进一步地，所述含铬分离纯化液体培养基的组分及配比为：NaCl 1g/L；NaHCO₃ 1g/L；K₂HPO₄ 0.2g/L；NH₃Cl 1g/L；CH₃COONa 3g/L；MgSO4·7H₂O0.2g/L；酵母膏0.1g/L；去离子水1L；将前述组分混合均匀后在121℃高温高压灭菌20min后，用重金属过滤灭菌法加入重铬酸钾溶液使培养基中铬浓度大于等于待处理黑臭水体铬浓度。

本发明提供的上述SCU20假单胞菌的筛选方法，包括以下步骤：

(1)从黑臭湖(河)中采集底泥和水样，底泥用抓泥斗采集于水下，剔除石块和动植物残体等杂质，水样采集于表层水，经10μm的膜过滤，剔除大块悬浮颗粒、藻类和浮萍等杂质；采样时进行多点布置确保菌源的多样性，每个采样点采集相同质量的底泥和相同质量的水样；将采集的底泥和水样混合得到泥水混合物，作为微生物富集分离培养的来源；

(2)取混合均匀的泥水混合物转入三角瓶中，采用无菌NaCl溶液进行稀释，按照泥水混合物的质量：浓度为5％的无菌NaCl溶液的质量体积比为1:10混合；向三角瓶中按照泥水混合物质量：富集液体培养基的体积的比为1:25加入富集液体培养基，于 26～28℃恒温培养2～3天进行富集；待菌在培养基中大量生长后，取1‰～1％体积富集液于新的富集液体培养基中，在相同条件下培养，如此连续富集3次；

(3)取100μL第三次富集后得到的富集液涂布于铬浓度为5mg/L的含铬分离固体培养基上，于26～28℃培养箱中倒置恒温培养，待观察到菌落出现，挑取少量菌体在含铬浓度为10mg/L的分离固体培养基上划线直至获得单菌落，再将获得的单菌落依次在浓度为20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L的含铬分离固体培养基上连续培养3～6 代，形成形态稳定的菌落，得到耐铬假单胞菌SCU20。

上述筛选方法中，进一步地，所述富集液体培养基的配比以1L去离子水为基准计如下：NaCl 1g/L；NaHCO₃ 1g/L；K₂HPO₄ 0.2g/L；NH₃Cl 1g/L；CH₃COONa 3g/L； MgSO₄·7H₂O0.2g/L；酵母膏0.1g/L。将前述组分混合均匀后在121℃高温高压灭菌20min 得到富集液体培养基。

上述筛选方法中，进一步地，分离纯化液体培养基的组分及配比为：MgSO₄·7H₂O0.02g/L；NaHCO₃ 0.2g/L；K₂HPO₄ 0.02g/L；CH₃COONa 0.3g/L；NH₄Cl 0.1g/L；NaCl 0.2g/L；酵母膏0.1g/L。将前述组分混合后在121℃高温高压灭菌20min得到分离纯化液体培养基。

上述筛选方法中，进一步地，含不同浓度铬的分离固体培养基按照以下方法制备：将前述分离纯化液体培养基在121℃高温高压灭菌20min后，用重金属过滤灭菌法加入重铬酸钾溶液达到对应所需浓度铬，再加入琼脂得到。

上述方法中，进一步地，含铬污染黑臭水体中铬浓度不高于50mg/L。为了使用菌株达到最大的降解和处理效果，黑臭水体中铬浓度最好不高于50mg/L。这已经能够满足对大部分黑臭水体处理，一般黑臭水体铬污染浓度在50mg/L以内。

制备耐高浓度铬黑臭水降解假单胞菌液条件参数并不限于以上所述。凡是在适宜范围更改培养基的成分和振荡培养的摇床转速、培养温度和培养时长从而大量培养SCU20的方法均可用于制备所述耐高浓度铬黑臭水降解假单胞菌液。

本发明同时提供一种治理高浓度铬污染黑臭水体的方法，具体是采用本发明所述假单胞菌SCU20进行处理，所述SCU20的16Sr RNA基因序列如序列表所示。

上述方法中，进一步地，将SCU20菌液以黑臭水体质量3～10％的投加量均匀投入铬污染黑臭水中。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供的菌株SCU20能同时对含铬黑臭水质指标(氧化还原电位、溶解氧、化学需氧量、氨氮)有较强的降解作用，其菌液在模拟黑臭河道中指标NH₃-N降解率最高达到93.9％，COD降解率最高达到94.2％。同时对水质中铬表现出85.3％的降解能力。因此，该菌株具有良好的环境水质保护和净化应用前景。

2、本发明方法中，耐高浓度铬的具有黑臭水降解能力的假单胞菌繁殖迅速，培养成本低，便于产业化实施，可制成含铬黑臭水治理菌剂。

附图说明

图1为富集三次后菌株在液体培养基上生长情况。

图2为耐铬假单胞菌SCU20在不同浓度重金属铬胁迫下的菌落大小；其中，(A)Cr⁶⁺设置为10mg/L，(B)Cr⁶⁺设置为20mg/L，(C)Cr⁶⁺设置为50mg/L；左边为菌株SCU20，右边为对照。

图3为假单胞菌SCU20PCR(聚合酶链式反应)结果；

图4为假单胞菌SCU20基于16S rRNA基因构建的系统发育树。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明所述方法进一步说明。有必要指出，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员根据上述发明内容，对本发明做出一些非本质的改进和调整进行具体实施，仍属于发明保护的范围。

以下实施例中所用的菌种培养基制备方法如下：

富集液体培养基的组分及配比为：NaCl1g/L；NaHCO₃1g/L；K₂HPO₄ 0.2g/L；NH₃Cl1g/L；CH₃COONa 3g/L；MgSO4·7H₂O0.2g/L；酵母膏0.1g/L；去离子水1L。将前述组分混合均匀后在121℃高温高压灭菌20min得到富集液体培养基。

分离纯化液体培养基的组分及配比为：MgSO4·7H₂O 0.02g/L；NaHCO₃ 0.2g/L；K₂HPO₄ 0.02g/L；CH₃COONa 0.3g/L；NH₄Cl 0.1g/L；NaCl 0.2g/L；酵母膏0.1g/L。将前述组分混合后在121℃高温高压灭菌20min得到分离纯化液体培养基。

含铬分离纯化液体培养基：将前述分离纯化液体培养基在121℃高温高压灭菌20min后，用重金属过滤灭菌法加入重铬酸钾溶液，使培养基中铬浓度达到所述铬浓度即可。

分离固体培养基的组分及配比为MgSO₄.7H₂O 0.02g/L；NaHCO₃ 0.2g/L；K₂HPO₄0.02g/L；CH₃COONa0.3 g/L；NH₄Cl0.1g/L；NaCl 0.2g/L；酵母膏0.1g/L；琼脂粉2％，；将前述组分混合后在121℃高温高压灭菌20min得到分离固体培养基。

含不同浓度铬的分离固体培养基的制备：将前述分离纯化液体培养基在121℃高温高压灭菌20min后，用重金属过滤灭菌法加入重铬酸钾溶液，使培养基中铬浓度达到所述铬浓度，再后加入琼脂得到。

实施例1

假单胞菌SCU20的分离和筛选，具体步骤包括：

1、土壤假单胞菌的分离和保存

(1)取成都市典型黑臭湖(河)白鹤岛、老锦水河、府南河三个地区分别采集50g 底泥和对应表层水样，采集底泥时进行多点布置，确保菌源的多样性。将采集的底泥和对应的表层水混合得到泥水混合物，作为微生物富集分离培养的来源。水样采集于表层水，经10μm的膜过滤，剔除大块悬浮颗粒、藻类和浮萍等杂质。底泥用抓泥斗采集于水下，剔除石块和动植物残体等杂质。

(2)取10g泥水混合物转接于250mL三角瓶中，加入100ml质量浓度为5％的无菌NaCl溶液，向三角瓶中加满富集液体培养基至250mL，于28℃恒温培养2天进行富集。待菌在培养基中大量生长后，取10ml富集液于新的富集液体培养基中，在相同条件下培养，如此连续富集3次。

(3)取100μL第三次富集后得到的富集液涂布于含铬分离固体培养基，于28℃培养箱中倒置恒温培养，3天后观察到菌的出现。挑取少量菌体在含铬浓度为10mg/L的分离固体培养基上划线直至获得单菌落。再将获得的单菌落依次在浓度为20mg/L、 30mg/L、40mg/L、50mg/L的含铬分离固体培养基上连续培养3～6代，使菌落形态稳定。

2、菌种鉴定

将聚合酶链式反应(PCR)产物送上海派森诺生物进行测序，测序结果见序列表。测得的序列使用数据库RDP(TheRibosomalDatabaseProject)中的SeqMatch功能 (http://rdp.cme.msu.edu/seqmatch/seqmatch_intro.jsp)与现有的假单胞菌标准菌株的16SrRNA基因序列进行比对。再通过MEGAX构建系统发育树，如图3和图4结果所示。结合细菌的Biolog GP2和16S rDNA，该菌株鉴定为假单胞菌 (Pseudogemmobacterbohemicus)。命名该菌为SCU20，保存于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M2020179SCU20。

实施例2 SCU20菌种的应用

(1)对待处理的黑臭水体进行铬浓度检测，检测铬浓度为2mg/L；

(2)SCU20降解菌剂的制备：将SCU20菌种接种于铬浓度为10mg/L的待处理黑臭水体铬浓度的分离纯化液体培养基中，在26℃恒温培养箱中培养，24h后取样测样，菌液的浓度大于等于1.0×10⁹cfu/mL时停止发酵，取所得发酵产物1％体积接种于相同的分离纯化液体培养基中于28℃，150rpm条件下振荡培养24h，得到SCU20降解菌剂。

(3)将SCU20降解菌剂以黑臭水体质量3％的投加量均匀投入含铬污染黑臭水中。

应用在流动河流时，由于水体具有流动性，配合微生物固定技术使降解菌剂充分发挥作用。

实施例3 SCU20降解菌剂在铬浓度为50mg/L的不同流速黑臭河中的应用。

(1)按照实施例1的方法，用含铬浓度50mg/L的分离纯化液体培养基对耐铬SCU20菌种进行培养和驯化，得到SCU20降解菌剂。

(2)以占黑臭水体质量3％的质量比例将SCU20降解菌剂投放于铬浓度为50mg/L，流速分别为0.1m/s、0.15m/s、0.2m/s、0.3m/s的黑臭循环河道比尺模型中，保持水体能持续循环流动。黑臭河道比尺模型建设在恒温培养箱中，使环境温度保持为恒定26℃。

待黑臭水流动24h后，每日取样测定4个流速中水质指标氧化还原电位(Eh)、溶解氧(DO)、化学需氧量(COD)、氨氮(NH₃-N)和水体中Cr⁶⁺浓度。

采用一级动力学模型计算污染物的降解系数K：

降解系数由下述计算方法：

对公式两边积分可得到：C＝C₀e^-Kt；

式中：t为反应时间，day；K为污染物的降解系数，1/day；C为t时刻测定的污染物浓度，mg/L；C₀为初始污染物浓度，mg/L。

采用以下公式计算降解率：

表1 SCU20菌剂对不同流速黑臭水的7日降解效果(流动7天后测定结果)

数据显示，本发明SCU20菌种对含铬黑臭水体具有良好的治理效果，7日NH₃-N 降解率最高达到93.9％，COD降解率最高达到94.8％，同时对水质中Cr⁶⁺表现出85.3％的降解能力。

序列表

<110> 四川大学

<120> 一种耐铬假单胞菌及其在高浓度铬污染黑臭水体治理中的应用

<141> 2020-08-14

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1347

<212> DNA

<213> Pseudogemmobacter bohemicus

<400> 1

ctaccatgca gtcgagcgag accttcgggt ctagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg 60

aacgtaccct ttgctacgga atagcctcgg gaaactggga gtaataccgt atgtgccctt 120

cgggggaaag atttatcggc aaaggatcgg cccgcgttgg attagctagt tggtgaggta 180

atggctcacc aaggcgacga tccatagctg gtttgagagg atgaccagcc acactgggac 240

tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aatcttagac aatgggcgca 300

agcctgatct agccatgccg cgtgagcgat gaaggcctta gggttgtaaa gctctttcgc 360

tggggaagat aatgactgta cccagtaaag aagccccggc taactccgtg ccagcagccg 420

cggtaatacg gagggggcta gcgttattcg gaattactgg gcgtaaagcg cacgtaggcg 480

gactggaaag ttgggggtga aatcccgggg ctcaacctcg gaactgcctt caaaactccc 540

agtcttgagt tcgagagagg tgagtggaat tccgagtgta gaggtgaaat tcgtagatat 600

tcggaggaac accagtggcg aaggcggctc actggctcga tactgacgct gaggtgcgaa 660

agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgaatgcc 720

agacgtcggc aagcatgctt gtcggtgtca cacctaacgg attaagcatt ccgcctgggg 780

agtacggtcg caagattaaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc 840

atgtggttta attcgaagca acgcgcagaa ccttaccaac ccttgacatg tgtatcgcgg 900

ttccagagat ggttccttca gttcggctgg atacaacaca ggtgctgcat ggctgtcgtc 960

agctcgtgtc gtgagatgtt cggttaagtc cggcaacgag cgcaacccac actcttagtt 1020

gccatcattc agttgggcac tctaggagaa ctgccggtga taagccggag gaaggtgtgg 1080

atgacgtcaa gtcctcatgg cccttacggg ttgggctaca cacgtgctac aatggtagtg 1140

acaatgagtt aatctcaaaa agctatctca gttcggattg gggtctgcaa ctcgacccca 1200

tgaagtcgga atcgctagta atcgcgtaac agcatgacgc ggtgaatacg ttcccgggcc 1260

ttgtacacac cgcccgtcac accatgggaa ttgggtttac ccgacggccg tgcgctaacc 1320

agcaatggag gcagcggacc acggtag 1347

Claims (10)

1.一种耐铬假单胞菌，其特征在于，所述假单胞菌为Pseudogemmobacterbohemicus.SCU20，其16Sr RNA基因序列如序列表所示，保藏编号为CCTCC M2020179SCU20。

2.权利要求1所述假单胞菌在治理高浓度铬污染黑臭水体中的应用。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，将所述耐铬假单胞菌培养为SCU20降解菌剂投放到铬污染黑臭水体中，菌液的投放量为黑臭水体质量的3％～10％。

4.根据权利要求2或3所述应用，其特征在于，所述SCU20降解菌剂通过以下方法制备：将SCU20菌种接种于铬浓度大于等于待处理黑臭水体铬浓度的含铬分离纯化液体培养基中，放在26℃恒温培养箱中培养，24h后取样测样，菌液的浓度大于等于1.0×10⁹cfu/mL时停止发酵，取所得发酵产物1‰～1％体积接种于相同的分离纯化液体培养基中于26～35℃，120～150rpm条件下振荡培养12～24h，得到SCU20降解菌剂。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述含铬分离纯化液体培养基的组分及配比为：NaCl 1g/L；NaHCO₃ 1g/L；K₂HPO₄ 0.2g/L；NH₃Cl 1g/L；CH₃COONa 3g/L；MgSO4·7H₂O0.2g/L；酵母膏0.1g/L；去离子水1L；将前述组分混合均匀后在121℃高温高压灭菌20min后，用重金属过滤灭菌法加入重铬酸钾溶液使培养基中铬浓度大于等于待处理黑臭水体铬浓度。

6.一种耐铬高浓度铬的黑臭水体降解菌剂，其特征在于，包含权利要求1所述耐铬假单胞菌。

7.权利要求1所述耐铬假单包菌的筛选和驯化方法，包括以下步骤：

(1)从黑臭湖、河中采集底泥和水样，底泥用抓泥斗采集于水下，剔除石块和动植物残体等杂质，水样采集于表层水，经10μm的膜过滤，剔除大块悬浮颗粒、藻类和浮萍等杂质；采样时进行多点布置确保菌源的多样性，每个采样点采集相同质量的底泥和相同质量的水样；将采集的底泥和水样混合得到泥水混合物，作为微生物富集分离培养的来源；

(2)取混合均匀的泥水混合物转入三角瓶中，采用无菌NaCl溶液进行稀释，按照泥水混合物的质量：浓度为5％的无菌NaCl溶液的质量体积比为1:10混合；向三角瓶中按照泥水混合物质量：富集液体培养基的体积的比为1:25加入富集液体培养基，于26～28℃恒温培养2～3天进行富集；待菌在培养基中大量生长后，取1‰～1％体积富集液于新的富集液体培养基中，在相同条件下培养，如此连续富集3次；

(3)取100μL第三次富集后得到的富集液涂布于铬浓度为5mg/L的分离固体培养基上，于26～28℃培养箱中倒置恒温培养，待观察到菌落出现，挑取少量菌体在含铬浓度为10mg/L的分离固体培养基上划线直至获得单菌落，再将获得的单菌落依次在浓度为20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L的含铬分离固体培养基上连续培养3～6代，形成形态稳定的菌落，得到耐铬假单胞菌SCU20。

8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述富集液体培养基的配比以1L去离子水为基准计如下：NaCl 1g/L；NaHCO₃ 1g/L；K₂HPO₄ 0.2g/L；NH₃Cl 1g/L；CH₃COONa 3g/L；MgSO₄·7H₂O 0.2g/L；酵母膏0.1g/L；将前述组分混合均匀后在121℃高温高压灭菌20min得到富集液体培养基。

9.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述分离纯化液体培养基的组分及配比为：MgSO₄·7H₂O 0.02g/L；NaHCO₃ 0.2g/L；K₂HPO₄ 0.02g/L；CH₃COONa 0.3g/L；NH₄Cl 0.1g/L；NaCl 0.2g/L；酵母膏0.1g/L；将前述组分混合后在121℃高温高压灭菌20min得到分离纯化液体培养基。

10.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述分离固体培养基的组分及配比为MgSO₄.7H₂O 0.02g/L；NaHCO₃ 0.2g/L；K₂HPO₄ 0.02g/L；CH₃COONa0.3g/L；NH₄Cl0.1g/L；NaCl0.2g/L；酵母膏0.1g/L；琼脂粉2％，；将前述组分混合后在121℃高温高压灭菌20min得到分离固体培养基；所述含铬分离固体培养基是在分离纯化液体培养基的基础上，采用重金属过滤灭菌法加入重铬酸钾溶液使培养基中铬浓度分别为对应所需铬浓度，再加入琼脂得到。

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