CN103789237A - 一种产细菌漆酶的恶臭假单胞菌及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种产细菌漆酶的恶臭假单胞菌及应用。该产细菌漆酶的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida zk1)保藏编号为CCTCC NO：M2013280。恶臭假单胞菌用于制备细菌漆酶时，将恶臭假单胞菌接种倒富含铜离子的LB培养基中，在35‐39摄氏度之间培养48‐96h后，在离心机上离心处理，弃上清液收集菌体，用水将菌体重新悬浮，用细胞破碎仪破碎细胞，再次离心处理，收集上清液，得细菌漆酶。该细菌漆酶可应用于印染废水处理或客家酿酒澄清处理。本发明恶臭假单胞菌分离自农业堆肥，能产生大量细菌漆酶，其漆酶最适作用pH为碱性、能氧化多种酚类和非酚类底物，应用价值大。

Description

一种产细菌漆酶的恶臭假单胞菌及应用

技术领域

本发明涉及一种漆酶，特别是涉及一种产细菌漆酶的恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)，该恶臭假单胞菌是从自然界中筛选、分离、纯化得到，能氧化多种酚类及人工染料的漆酶；本发明属于生物工程技术领域。

背景技术

漆酶（EC.1.10.3.2）是一种含铜多酚氧化酶，以氧为电子受体，氧化包括酚类，多酚类，苯胺、木质素，多环芳香烃等一系列化学结构稳定的化学物质，在反应过程中生成的唯一副产物就是水。

第一种漆酶是由日本人Yoshida在1883年在植物漆树（Rhus vernicifera）树脂中发现，随后在多种植物和多种真菌检测到漆酶的活性。到2008年学者统计已经超过了上百中真菌漆酶并被分离提纯，并且这个数字还在快速的增加。但直到1993年，Givaudan才首次在水稻根围中分离得到一株产漆酶的脂固氮螺菌，这是第一次在原核生物检测到漆酶活性。2000年，Alexandre通过生物信息学分析技术，证实漆酶也普遍存在于原核生物中。迄今为止已经在多种原核微生物中如Marinomonas mediterranea、链霉菌、枯草芽孢杆菌、嗜麦芽寡养单胞菌中检测到漆酶活性。细菌漆酶与真菌漆酶在氨基酸序列上具有较大差异，因此也被定义为类漆酶。研究表明细菌漆酶与真菌漆酶往往具有稳定性好、pH作用范围广泛，不含糖基，易于异源表达等优点。但是关于细菌漆酶的研究报道还是非常少。

漆酶具有多种优点。漆酶氧化底物特异性不强，可以氧化包括酚类和非酚类多种底物，据不完全统计，其可以氧化底物超过了250种；漆酶与其他过氧化物酶比较，无需额外添加如H₂O₂辅助因子，对环境友好；漆酶在添加化学介质的条件下，可以将氧化还原电位高于漆酶的化学物质，或者无法接触到漆酶催化中心的大分子物质有效氧化。

漆酶的优点使得漆酶在印染废水处理、多酚废水的处理、木质素的降解与生物能源、纸浆漂白、有机物合成、果汁澄清、生物传感、生物检测等多个方面具有重要的应用潜力。Peralta利用云芝漆酶在酸性条件下对多种染料进行脱色（Peralta-Zamora P,Pereira C M,Tiburtius E R L,et al.Decolorization of reactive dyes by immobilized laccase[J].AppliedCatalysis B:Environmental,2003,42(2):131-144），研究表明云芝漆酶在固定化或者添加化学介导物的情况对靛蓝、偶氮染料活性黑G、孔雀石绿等染料具有良好的脱色效果。

Galliano等对木硬孔菌(Rigidoporus lignosus)产生的漆酶和锰过氧化物酶进行了体外研究，证实二者协同作用降解木质素；Ibarra-Escutia等将白腐菌产生的漆酶成功地固定到丝网印刷石墨电极上设计出安培生物传感器，能够准确、灵敏、快速地检测茶中酚化合物的含量；Ikeda等在不添加甲醛等有毒助剂的水溶液中，利用漆酶催丙烯酰胺聚合形成高分子量的化合物。因而，寻找能够新的能够产漆酶的细菌菌株微生物就显得非常有意义。

但现在普遍使用的漆酶均为真菌漆酶，适合作用的环境为酸性环境，对某些结构稳定染料的脱色需要额外添加化学介导物，限制了使用范围，增加应用成本。

发明内容

本发明的目的是提供一种产细菌漆酶的恶臭假单胞菌及应用，利用从自然环境中分离筛选出一株新的能够产细菌漆酶的菌株，产生的细菌类漆酶适于pH为碱性，对靛蓝等染料可以直接脱色，无需添加化学介导物，为细菌漆酶的生产制备提供一种新的可利用的微生物，为人工染料降解、酚类废水处理、木质素降解、生物传感等领域提供新的技术手段。

本发明目的通过如下技术方案实现：

一株产新型产漆酶的恶臭假单胞菌，建议的分类命名为恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida zk1)；本发明提供的菌株从农村堆肥中分离得到，能够产生一种新型作用pH范围，可以直接氧化多种顽固类染料的细菌漆酶，经微生物学鉴定和基因学归属后证实属恶臭假单胞菌，保存于中国典型培养物保藏中心（China Center for Type CultureCollection，简称CCTCC M2013280，湖北省武汉市，洪山区八一路，武汉大学中国典型培养物保藏中心，邮政编码430072，电话027-68752319)，保藏日为2013年6月23日。

该恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida zk1)为革兰阴性菌，短杆状，有鞭毛，该菌菌株的菌落为中等大小、圆形，规则，高突起，边缘呈叶状，白色、不产生黑色素等。

所述的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida zk1)用于制备细菌漆酶的应用，将恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida zk1)接种倒富含铜离子的LB培养基中，在35-39摄氏度之间培养48-96h后，在离心机上离心处理，弃上清液收集菌体，用水将菌体重新悬浮，用细胞破碎仪破碎细胞，再次离心处理，收集上清液，得细菌漆酶。

优选地，所述在离心机上离心处理的转速为6000r/min，时间10min-20min。所述再次离心处理的转速为13000r/min；时间为15-min25min。

一种细菌漆酶，由应用所述的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida zk1)制得。

所述的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida zk1)在添加铜离子的LB培养基中，可以产生大量的细菌漆酶，产生的细菌漆酶为胞内酶。该漆酶是一种碱性漆酶，最适作用pH在7-10之间，且在碱性条件下具有较好的稳定性，能够氧化愈创木酚、α-萘酚、靛蓝、孔雀石绿、刚果红、橙黄Ⅰ等多种底物，不同于己经报道的其他漆酶酶。该细菌漆酶可应用于印染废水处理或客家酿酒澄清处理。

相对于现有技术，本发明的优点在于，本发明恶臭假单胞菌分离自农业堆肥，能产生大量细菌漆酶，其漆酶最适作用pH为碱性、能氧化多种酚类和非酚类底物，该菌株应用价值大。

附图说明

图1为菌株zk1漆酶活性的pH值曲线图。

图2为zk1漆酶对客家酿酒稳定性的影响效果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，需要说明的是，实施例并非对本发明保护范围构成限制。

实施例1：zk1菌株的分离、筛选及鉴定

一、zk1菌株的分离

从广州市白云区沙龙新朗头村农村堆肥取样。添加到含有CuSO4质量浓度为0.05%的LB液体培养基中，在37℃培养箱进行富集培养48小时，利用无菌水进行梯度稀释，然后用固体LB液体培养基进行稀释平板法分离单个菌落，利用含有1%质量愈创木酚的乙醇溶液和1%质量的α-萘酚的乙醇溶液进行显色反应，挑选呈现粉红色或灰黑色菌落进行反复划线筛选获取纯菌落，接种于斜面培养基并进行摇瓶发酵复筛。所得Zk1菌株的菌落为中等大小、圆形、凸起、边缘整齐湿润的光滑型菌落，培养24h为白色，不产色素。

二、Zk1菌株的形态特征

取37℃恒温培养箱中培养zk1菌24h后，进行革兰染色和透射电子显微镜下进行观察，结果发现菌株zk1为革兰阴性菌，短杆状，大小约为0.5～1.0μm×2～4μm，有鞭毛。

三、zk1菌株的生理生化特征

将zk1菌种接种的LB培养基培养24h后，利用VITEK全自动细菌鉴定仪，采用革兰氏阴性鉴定卡，7h后读取鉴定结果，zk1菌种生化结果如表1所示。

表1Zh1的生化鉴定结果

丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶	—	蔗糖—
			侧金盏花醇	—	D-塔格糖—
吡咯烷基芳胺酶	—	D-海藻糖—
			L-阿拉伯醇	—	柠檬酸盐（钠）+
D-纤维二糖	—	丙二酸盐—

β-半乳糖苷酶	—	5-酮-葡萄糖苷—
			H2S产生	—	乳酸盐产碱+
β-N-乙酰葡萄糖苷酶	—	α-葡萄糖—
			谷氨酰芳胺酶	—	琥珀酸盐产碱+
D-葡萄糖	+	N-乙酰-β-半乳糖氨酶—
			γ-谷氨酰转移酶	+	α-半乳糖苷酶—
葡萄糖发酵	—	磷酸酶—
			β-葡萄糖苷酶	—	氨基乙酸芳胺酶—
D-麦芽糖	—	鸟氨酸脱羧酶—
			D-甘露醇	—	赖氨酸脱羧酶—
D-甘露糖	+	脱羧酶阴性控制—
			β-木糖苷酶	—	组氨酸同化+
β-丙氨酸芳胺酶	—	COURMARATE+
			L-脯氨酸芳胺酶	+	β-葡萄糖苷酸酶—
脂酶	—	O/129耐受+
			古老糖	—	谷氨酸-甘氨酸-精氨酸芳胺酶—
酪氨酸芳胺酶	+	L-苹果酸盐同化+
			尿素酶	—	ELLMAN—
D-山梨醇	—	L-乳酸盐同化+

VITEK全自动细菌鉴定结果为恶臭假单胞菌，可靠率为99%。

实施例2zk1菌种的16S rDNA基因序列测定及系统发育分析

一、基因组DNA提取：

将菌株zk1接种于LB固体培养基(10g蛋白胨，5g酵母提取物，5gNaCl，20g琼脂，pH为7.4，用水定容到1000mL，121℃灭菌20min，倒平板，含有琼脂，倒平板后会凝固成为固体)中培养24h，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA。扩增用引物为细菌通用引物，如下：

正向引物27F的序列为SEQ ID NO.1；

反向引物1492R的序列为SEQ ID NO.2。

PCR反应采用20μL的体系，具体如下：

10×Ex Taq buffer2.0μl

25mM MgCl21.6μl

2.5mM dNTP Mix1.6μl

5p Primer11μl

5p Primer21μl

Template0.5μl

5u Ex Taq0.2μl

ddH2O12.1μl

Total volume20μl

PCR反应条件：95℃变性5min，95℃预变性30s，55℃30s，72℃1min30s，24循环后72℃延伸10min。PCR扩增产物的纯化按上海美吉生物医药科技有限公司的小量胶回收PCR产物纯化试剂盒说明，测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成。

Zk1菌株的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.3，全长1260bp。

二、Zk1菌株的16S rRNA基因序列的系统发育分析

将zk1菌株16S rRNA基因1260bp的序列输入GenBanK与己收录的细菌基因序列进行BLASTn比较。选用MEGA(5.1)软件MUSCLE与其他相关细菌序列进行对比，Maximum Likelihood最大似然估计进行ML分析生成系统发育树，发育树用Bootstrap法(重复数为500)检验。

结果显示，与菌株zk1的16S rRNA基因序列一致性(identity)最高的为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，其一致性为97%。结合生化反应结果，充分证明该菌为嗜恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。因此命名Zk1菌株为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)zk1，申请人将其保存于中国典型培养物保藏中心（China Center for Type CultureCollection，地址湖北省武汉市，洪山区八一路，武汉大学中国典型培养物保藏中心，邮政编码430072，电话027-68752319），保藏编号为CCTCC NO：M2013280，)，保藏日为2013年6月23日。

实施例3zkl菌种细菌漆酶的提取及酶学性质

一、漆酶活性的初步检测

将菌株臭假单胞菌(Pseudomonas putida)zk1在富含铜离子的LB培养基(以质量百分比计，1%蛋白胨，0.5%酵母膏，0.5%的NaCl，0.05%CuSO₄，2%的琼脂，其余为水)划线培养，在37℃培养48h后，滴加含1.5%质量的愈创木酚的无水乙醇（无水乙醇的质量为愈创木酚的1.5%），半小时后观测菌落颜色，菌落呈现淡红色为漆酶活性。

二、菌株zk1培养液中漆酶活性的确定

摇瓶培养方法：斜面种子活化后接入LB培养基，培养24h，按10%体积接种量接入富含铜离子的LB培养基（10g蛋白胨，5g酵母提取物，5gNaCl，0.5g硫酸铜，pH为7.4，用水定容到1000mL，121℃灭菌20min）进行产酶培养。

三、细菌漆酶的粗提取

收集发酵培养基，在6000r/min离心10分钟，得到的沉淀物用蒸馏水溶解，在冰浴条件下，利用超声细胞破碎仪破碎细胞30分钟后，再用12000r/min高速离心20分钟，丢沉淀取上清液，即为细菌粗酶液。

四、细菌漆酶活性测定

4ml含有0.05%质量的愈创木酚水溶液作为底物，添加0.0004%质量的CuSO₄为反应体系，添加0.2mL细菌粗酶液（细菌漆酶）。用无粗酶提取液反应体系为空白，在38℃水浴加热30分钟，在465nm波长下测其吸光值变化量。根据下面公式（1）计算酶液活性。结果表明细菌漆酶发酵产率可以到15944U/L，远高于现在的普通细菌漆酶产率。U为酶活单位，定义为每分钟使1nmol愈创木酚转化所需的酶量为一个活力单位（U）。

$U=\frac{\mathrm{OD}\×V}{t\×\mathrm{\ϵ}\×{10}^{-9}\×V_0}---\left(1\right)$

OD:吸光度增加值（0.287）；   t：反应时间（30min）；

V：反应体积（4mL）；   ε：愈创木酚消光系数（12000L·mol^-1·cm^-1）；

V₀：酶液体积（0.2mL）。

五、细菌漆酶酶活的适宜pH

使用1mol/L的NaOH溶液和1mol/L的盐酸溶液调节pH，配制pH分别为2、4、6、8、10、12、14的水溶液备用，将配置的不同pH的水溶液代替原本的水溶液加入反应体系，加入0.2mL酶液摇匀后，置于45℃水浴中反应30min，测反应前后OD465值。实验结果如附图1所示，漆酶酶活在pH处于2-10之间，酶活随着pH的上升而上升，当pH超过了10以后，酶活迅速降低，可能与pH太高导致漆酶迅速失活有关。pH范围处于6-10之间时，酶活较高。说明该细菌漆酶最用pH范围广，漆酶的最适pH范围为8-10。

六、细菌漆酶对印染染料脱色

在试管中加入10mg/L橙黄Ⅰ染料溶液3.6mL，质量浓度为5%CuSO₄溶液0.2mL，按照三制备的粗酶液0.2mL，然后放入45℃水浴中反应，反应1h，用462nm波长测其反应前后的吸光值变化量。根据公式“脱色率=(1-AA₀)×100%”计算染料的脱色率。反应前的吸光值A₀=0.5775±0.0043，反应1小时后的吸光值为A=0.1361±0.0012。其脱色率可以达到76.4%。

在试管中加入10mg/L孔雀石绿染料溶液3.6mL，浓度为5%CuSO₄溶液0.2mL，按照三制备的粗酶液0.2mL，然后放入45℃水浴中反应，反应1h，用620nm波长测其反应前后的吸光值变化量。根据公式“脱色率=(1-AA₀)×100%”计算染料的脱色率。反应前的吸光值A₀=0.5829±0.0241，反应1小时后的吸光值为A=0.1050±0.0019。其脱色率可以达到81.9%。

在试管中加入50mg/L靛蓝染料溶液3.6mL，浓度为5%CuSO₄溶液0.2mL，按照三制备的粗酶液0.2mL，然后放入45℃水浴中反应，反应1h，用680nm波长测其反应前后的吸光值变化量。根据公式“脱色率=(1-AA₀)×100%”计算染料的脱色率。反应前的吸光值A₀=0.3973±0.0046，反应1小时后的吸光值为A=0.0317±0.0016。其脱色率可以达到92%。

在试管中加入50mg/L刚果红染料溶液3.6mL，浓度为5%CuSO₄溶液0.2mL，按照三制备的粗酶液0.2mL，然后放入45℃水浴中反应，反应1h，用497nm波长测其反应前后的吸光值变化量。根据公式“脱色率=(1-AA₀)×100%”计算染料的脱色率。反应前的吸光值A₀=0.9000±0.0048，反应1小时后的吸光值为A=0.2836±0.0158。其脱色率可以达到68.5%。

七、不同pH值对靛蓝染料的脱色效果

在试管中加入50mg/L靛蓝染料溶液3.6mL，质量浓度为5%的CuSO₄溶液0.2mL，按照本实施例步骤三制备的粗酶液0.2mL，使用1mol/L的NaOH溶液和1mol/L的盐酸溶液调节pH值，pH分别为6、8、10。然后放入45℃水浴中反应，反应1h，用680nm波长测其反应前后的吸光值变化量。根据公式“脱色率=(1-AA₀)×100%”计算染料的脱色率。

在pH值为6时，反应前的吸光值A₀=0.4538±0.0053，反应1小时后的吸光值为A=0.0238±0.0032。其脱色率可以达到94.9%。

在pH值为8时，反应前的吸光值A₀=0.5679±0.0021，反应1小时后的吸光值为A=0.0207±0.0013。其脱色率可以达到96.5%。

在pH值为10时，反应前的吸光值A₀=0.3593±0.0008，反应1小时后的吸光值为A=0.0276±0.0009。其脱色率可以达到92.6%。

印染废水一般具有如下几个特点：色度高、毒性大、可生化性差、印染废水多呈碱性（pH值一般为9～12）、盐分高。现在主要处理方法有物理法、化学法和生化法。这些方法往往因为成本高、条件苛刻等原因而未能推广。破坏印染废水中染料稳定结构及发色基团，对废水进行脱色脱毒，对于印染废水的处理具有重要意义。

现在使用漆酶一般为真菌漆酶，具有如下缺点，一：具有作用pH范围窄，局限在酸性范围内，当pH>6以后，就迅速失活；二：对结构稳定的靛蓝等染料脱色需要添加化学价格昂贵的介导物，如2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、1-羟基苯并三唑（HBT）等，增加漆酶应用成本等问题。

本发明恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida zk1)所产漆酶具有如下优势：一，本漆酶属于碱性漆酶，如在实验五显示，本漆酶在pH6-10之间具有较高活性，最适作用pH值为8-10之间，适用于与碱性环境；二，无需化学介导物，就可以对多种染料进行脱色，且具有较好的脱色效果，本实施例显示，在不需添加任何化学介导物的条件可以对靛蓝、刚果红、孔雀石绿及橙黄I等多种印染染料进行脱色，在1h以内，脱色效果均大于>50%，有些染料甚至可以高达90%以上；三，在较广的pH范围内，漆酶具有较好的脱色效果。如在七实验中显示，在pH6-10之间，本漆酶对靛蓝的脱色率均在90%以上。

由此可见，本发明细菌漆酶在印染废水的脱色脱毒处理过程中展现了较大的应用潜力。在印染废水的生物处理中具有重要用途。

七细菌漆酶在客家酿酒稳定性的作用

广东客家娘酒是岭南一带客家人民间传统发酵型黄酒。其酒体呈现红褐色，晶莹剔透，味道甘醇，香气浓郁，鲜甜爽口，余味绵长。与其它酒体相比，客家娘酒更符合现代社会绿色、营养与健康的大趋势，符合国家提倡发展低度、营养、保健的要求，已被国家列为重点扶植和发展的饮料酒之一。但是酒体是否浑浊是判断娘酒质量好坏的的一个重要标准。引起客家娘酒浑浊的原因复杂，科学界并无定论。一般认为娘酒发酵过程中微生物的生长繁殖过程中产生的代谢产物，打破了平衡体系，引起酒液混浊。添加本发明zk1细菌漆酶，可以有效的改善客家娘酒的稳定体系，减少沉淀，提高客家娘酒的澄清度。

取客家酿酒500mL，添加按照三制备的粗酶液0.2mL毫升处理24h后后过滤，在室温下储藏3个月。通过浊度仪测量酒体浊度，通过色泽、香气、口感、沉淀等感官评价指标对酒质量进行判断。实验结果如图2所示，在为经过细菌漆酶处理的客家娘酒其浊度高达139EBC，而经过zk1细菌漆酶处理后客家娘酒的浊度为82，其浊度明显下降。而通过感官评价，其处理组与对照组在酒的香气，口感等方面没有明显差异，颜色上对照组呈现深褐色略显浑浊，而漆酶处理组呈现橙黄色且清澈透明。在沉淀方面，对照组酒底存在少量肉眼可见沉淀，而漆酶处理组无可观测沉淀存在。实验证实细菌漆酶可以显著的提升客家酿酒的澄清度和稳定性。

Claims (6)

1.一种产细菌漆酶的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida zk1)，其特征在于：其保藏编号为CCTCC NO：M2013280。

2.权利要求1所述的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida zk1)用于制备细菌漆酶的应用，其特征在于，将恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida zk1)接种倒富含铜离子的LB培养基中，在35‐39摄氏度之间培养48‐96h后，在离心机上离心处理，弃上清液收集菌体，用水将菌体重新悬浮，用细胞破碎仪破碎细胞，再次离心处理，收集上清液，得细菌漆酶。

3.根据权利要求2所述的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida zk1)用于制备细菌漆酶的应用，其特征在于，所述在离心机上离心处理的转速为6000r/min，时间10min‐20min。

4.根据权利要求2所述的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida zk1)用于制备细菌漆酶的应用，其特征在于，所述再次离心处理的转速为13000r/min；时间为15‐min25min。

5.一种细菌漆酶，其特征在于，其由应用权利要求1所述的恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida zk1)制得。

6.权利要求5所述的细菌漆酶在印染废水处理或客家酿酒澄清处理中的应用。

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