CN111748497A

CN111748497A - 一株大山芽孢杆菌及其在快速降解亚硝酸盐中的应用

Info

Publication number: CN111748497A
Application number: CN202010643758.2A
Authority: CN
Inventors: 季相山; 宁文; 赵燕; 陈红菊
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2020-07-07
Filing date: 2020-07-07
Publication date: 2020-10-09
Anticipated expiration: 2040-07-07
Also published as: CN111748497B

Abstract

本发明公开了一株大山芽孢杆菌及其在降解亚硝酸盐中的应用，属于微生物技术领域。根据JY‑1菌株的菌体形态、菌落特征、生理生化特征，结合16S rDNA序列分析结果，将其鉴定为芽孢杆菌属中的一个稀有种：大山芽孢杆菌(Bacillus gaemokensis)，于2020年6月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2020185。该菌株具有快速降解亚硝酸盐的能力，3小时就能将1.0mg/L的亚硝酸盐降到0，在应急解决养殖池塘中高亚硝酸盐问题方面，应用前景广阔。

Description

一株大山芽孢杆菌及其在快速降解亚硝酸盐中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株大山芽孢杆菌及其在快速降解亚硝酸盐中的应用。

背景技术

在水产养殖池塘中，大量投饵导致池底残饵、粪便等含氮有机物难以完全被天然的微生物氧化分解，剩余的有机物日积月累在池底堆积，污染了池塘的底质和水质。因此，人为地施加能大量降解残饵等的微生物菌种来加速池底有机质的分解是非常重要的。此外，由于残饵、粪便等含氮有机物被分解释放到水体中，导致水体氨氮、亚硝酸盐含量过高，影响养殖动物的生长，甚至危及养殖动物的生命，因此，筛选能降低水体亚硝酸盐的微生物菌种应用于水产养殖生产意义重大。

允许在水产养殖中使用的芽孢杆菌数量随着研究的深入而逐渐增加，最初仅允许在水产中使用枯草和地衣芽孢杆菌，随后又增加了很多具有优异生物学特性的菌种，例如环状芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌等。芽孢杆菌不仅能改良水产养殖池塘的底质和水质，还能促进养殖动物对营养物质的消化吸收、调节养殖动物消化道的微生态平衡、增强养殖动物免疫能力与抗菌防病能力等。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一株大山芽孢杆菌JY-1。该大山芽孢杆菌 JY-1分离自养殖水体中，该菌株具有快速降解亚硝酸盐的能力，在应急解决养殖池塘中高亚硝酸盐问题方面，应用前景广阔。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一方面，提供一株大山芽孢杆菌(Bacillus gaemokensis)JY-1，该菌株已于2020年6月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内)，其保藏编号为：CCTCC M 2020185。

所述大山芽孢杆菌JY-1的菌体形态与菌落特征为：

在LB固体培养基平板上的菌落呈白色，边缘整齐且光滑，中间凸起，菌体生长物可向四周呈云雾状扩散。菌株胞体呈杆状，少数聚合在一起呈短链状排列。芽孢椭圆形，中生，不产生伴孢晶体，无鞭毛，为革兰氏阳性菌。

所述大山芽孢杆菌JY-1的生理生化特征为：

该菌株的过氧化氢酶、淀粉水解、硝酸盐肉汤、西蒙氏柠檬酸盐、葡萄糖、甘露醇、明胶液化、V.P.试验、溶菌酶和动力培养基生长或呈阳性反应；溶血试验为阴性。

含有所述大山芽孢杆菌JY-1的菌剂也属于本发明的保护范围。

所述菌剂中，大山芽孢杆菌JY-1可以以被培养的活细胞、菌悬液或发酵液的形式存在。

所述菌剂的剂型可以为液剂、乳剂、悬浮剂、颗粒剂、粉剂、可湿性粉剂或水分散剂。

本发明的第二方面，提供一种大山芽孢杆菌JY-1的发酵培养方法，包括以下步骤：

(1)将大山芽孢杆菌JY-1的单克隆接种至基础培养基中，振荡培养，离心，洗涤沉淀，将沉淀用无菌生理盐水重悬，制成菌悬液；

(2)将步骤(1)的菌悬液接种至发酵培养基中，在温度34-40℃、盐度1％的条件下，振荡培养40-48h，得到大山芽孢杆菌JY-1发酵液。

优选的，步骤(1)中，所述振荡培养的条件为：37℃、180r/min振荡培养12h。

优选的，步骤(2)中，所述发酵培养基的组成为：葡萄糖10g，蛋白胨10g，磷酸二氢钾0.2g，氯化钠1g，硫酸镁0.1g，加水定容至1000mL；pH6.5。

上述制备方法中，所制备的大山芽孢杆菌JY-1发酵液可以直接作为液体菌剂使用。

本发明的第三方面，提供上述大山芽孢杆菌JY-1或含有大山芽孢杆菌JY-1的菌剂在降解亚硝酸盐中的应用。

与一般芽孢杆菌不同的是，本发明的大山芽孢杆菌JY-1能够快速的降解亚硝酸盐，适合于应急解决养殖池塘中高亚硝酸盐问题。

本发明的第四方面，提供一种降解污染水体或水产养殖水体中亚硝酸盐的方法，包括：将大山芽孢杆菌JY-1或含有大山芽孢杆菌JY-1的菌剂施加于水产养殖水体或亚硝酸盐污染水体中的步骤。

优选的，大山芽孢杆菌JY-1或含有大山芽孢杆菌JY-1的菌剂的施加量为10⁴-10⁵cfu/ml。

本发明的有益效果：

本发明首次从养殖水体中分离筛选出一株快速降解亚硝酸盐的大山芽孢杆菌，在应急解决养殖池塘中高亚硝酸盐问题方面，应用前景广阔。

附图说明

图1：菌株JY-1的形态观察结果；其中，A：菌株JY-1的菌落形态；B：菌株JY-1 革兰氏染色结果；C：菌株JY-1芽孢染色结果。

图2：菌株JY-1的PCR产物凝胶电泳图谱(Marker:2000)。

图3：菌株JY-1的系统进化发育树。

图4：不同条件对菌株JY-1生长情况的影响；其中，A：不同C/N比对菌株生长情况的影响；B：不同pH对菌株生长情况的影响；C：不同温度对菌株生长情况的影响；D：不同盐度对菌株生长情况的影响。

图5：碳源种类对菌株JY-1产芽孢数量的影响。

图6：葡萄糖浓度对菌株JY-1产芽孢数量的影响。

图7：氮源种类对菌株JY-1产芽孢数量的影响。

图8：蛋白胨含量对菌株JY-1产芽孢数量的影响。

图9：无机盐种类对菌株JY-1产芽孢数量的影响。

图10：无机盐组合对菌株JY-1产芽孢数量的影响。

图11：无机盐组合浓度对菌株JY-1产芽孢数量的影响。

图12：菌株JY-1对水体中亚硝酸盐降解效果的考察。

图13：不同浓度的菌株JY-1对水体中亚硝酸盐的降解效果。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分介绍的，筛选能降低水体亚硝酸盐的微生物菌种应用于水产养殖生产意义重大。目前虽然已有一些能够降解水体中亚硝酸盐的芽孢杆菌的报道，但是其降解亚硝酸盐的速度大多较慢，不太适合应急解决养殖池塘中高亚硝酸盐问题。

大山芽孢杆菌是芽孢杆菌属中的一个稀有种，目前有关大山芽孢杆菌的研究很少。本发明首次从养殖水体中分离出一株大山芽孢杆菌，并发现该大山芽孢杆菌降解亚硝酸盐的速度非常快，3个小时就能将1mg/L的亚硝酸盐降到0，非常适合应急解决养殖池塘中高亚硝酸盐问题。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。其中：

基础培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，固体另加15g的琼脂，水1000 mL，调pH 6.5。

无色培养基：葡萄糖作为唯一碳源，亚硝酸钠作为唯一氮源，氯化钠1g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.2g，微量元素溶液0.5mL，调节pH后加水定容至1000mL。

发酵培养基：葡萄糖10g，蛋白胨10g，磷酸二氢钾0.2g，氯化钠1g，硫酸镁0.1g，加水定容至1000mL。

微量元素溶液：硫酸锌0.22g，硫酸铜0.08g，硫酸锰2.03g，硫酸亚铁0.2g，硼酸2.86g，钼酸铵0.02g，水1000mL，调节pH至6.5。

用于制备各个培养基的水均为去离子水，培养基配制完成后均在121℃温度下湿热灭菌20min。

本发明实施例中用OD₆₀₀值表征菌体生长量。C/N即碳氮质量比，又称碳氮比。

亚硝酸盐含通过采用重氮-偶氮法测定。

实施例1：大山芽孢杆菌JY-1的分离纯化及鉴定

一、菌种的分离纯化

1、降亚硝酸盐菌株的富集

在泰安多处水体各取水样100mL，将水样混合后取5mL接种于装有100mL富集培养基(在基础培养基中加NaNO₂，将亚硝酸盐浓度调至0.5mg/L得到富集培养基)的锥形瓶中，37℃、180r/min振荡培养1天；取培养1天后的培养液1mL再次接种于100mL 富集培养基中，如此反复富集培养6代。

2、降亚硝酸盐菌株的筛选、分离

取富集培养至第6代的培养液(OD₆₀₀值为1)1mL于1.5mL的离心管中，80℃煮15min，处理后的培养液用无菌水分别稀释至10^-5、10^-6、10^-7、10^-8倍，分别取上述四种稀释后的培养液100μL涂布于LB平板，37℃培养12h后观察菌落形态特征，挑取形态上类似大山芽孢杆菌且生长快、菌落大、数量多的菌落，采用三线法进行纯化，纯化3 代后，分别进行4℃斜面保存。

将上述单菌落分别接种于基础培养基中，37℃振荡培养12h，然后取适量涂布于基础培养基中，37℃培养24h，最后获得6株菌，分别命名为JY-1-JY-6(即JY-1、JY-2、 JY-3、JY-4、JY-5、JY-6)。将分离纯化的JY-1—JY-6分别接种于基础培养基中，37℃振荡培养12-16h，分别取培养物4000rpm离心10min，弃去上清液，用PBS重悬沉淀制成菌悬液，再分别接种于100mL的筛选培养基(在所述无色培养基的基础上调整NaNO₂的浓度，调节亚硝酸盐浓度至0.5mg/L得到筛选培养基)中，180r/min振荡培养1天后测定亚硝酸盐含量，结果显示降解亚硝酸盐效果最好的菌株为JY-1。

二、菌种的鉴定

1、形态观察

将JY-1菌株接种在LB固体培养基平板上，观察菌落形态特征。JY-1菌株的菌落照片见图1A，革兰氏染色结果见图1B，芽孢染色结果见图1C。JY-1单菌落呈白色，边缘整齐且光滑，中间凸起，菌体生长物可向四周呈云雾状扩散。菌株胞体呈杆状，少数聚合在一起呈短链状排列。芽孢椭圆形，中生，不产生伴孢晶体，无鞭毛，为革兰氏阳性菌。

2、生化鉴定

采用蜡样芽孢杆菌生化鉴定管对JY-1菌株进行生理生化鉴定，鉴定结果为芽孢杆菌。

菌株JY-1的生理生化反应结果汇总如表1所示：

表1：菌株JY-1的生理生化反应结果

生理生化反应	结果
		过氧化氢酶	+
淀粉水解	+
		硝酸盐肉汤	+
西蒙氏柠檬酸盐	+
		葡萄糖	+
甘露醇	+
		明胶液化	+
V.P.试验	+
		溶菌酶	+
动力培养基	+
		溶血试验	－

注：“+”表示生长或阳性反应；“-”表示不生长或阴性反应。

3、分子生物学鉴定

以JY-1菌液为模板进行16S rDNA部分序列的PCR扩增:

正向引物:5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，(SEQ ID NO.1)

反向引物:5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'。(SEQ ID NO.2)

PCR扩增程序：94℃预变性4min，94℃变性30s，56℃复性45s，72℃延伸90s， 35个循环后于72℃延伸7min，4℃保存。将PCR扩增产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳检测，电泳结果见图2。将纯化的PCR产物连接到PMD-18T载体上，然后转化进大肠杆菌感受态细胞内，PCR鉴定为阳性的克隆送公司测序，得到JY-1 16s rDNA序列，序列结果如SEQ ID NO.3所示。将测序结果进行Blast比对，利用MEGA软件构建进化树(图3)，发现JY-1与大山芽孢杆菌M25和JN205聚为1支。

综合形态鉴定、生化鉴定和分子生物学鉴定的结果，JY-1菌株被鉴定为大山芽孢杆菌 (Bacillus gaemokensis)，命名为大山芽孢杆菌(Bacillus gaemokensis)JY-1。并对该菌株进行生物保藏，保藏信息如下：

菌种名称：大山芽孢杆菌JY-1

拉丁名：Bacillus gaemokensis

保藏机构：中国典型培养物保藏中心

保藏机构简称：CCTCC

地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内

保藏日期：2020年6月8日

保藏编号：CCTCC M 2020185。

实施例2：菌种的安全性评价

将生长状况良好，体重为80g左右的220尾尼罗罗非鱼分为11个组(每组20尾鱼)，分别设为：大山芽孢杆菌JY-1组5个，灌服的大山芽孢杆菌JY-1浓度分别为10⁵、10⁶、 10⁷、10⁸、10⁹cfu/mL；无乳链球菌组5个，灌服的无乳链球菌浓度分别为10⁵、10⁶、10⁷、 10⁸、10⁹cfu/mL；生理盐水组1个，灌服无菌生理盐水。每尾鱼灌服1mL菌液或无菌生理盐水。结果如表2所示。

表2：菌种安全性评价结果

饲养14天后发现，灌服大山芽孢杆菌和生理盐水的死亡率均为0，而灌服无乳链球菌的尼罗罗非鱼死亡率在10-30％之间，这说明我们分离的大山芽孢杆菌JY-1是安全的。

实施例3：大山芽孢杆菌JY-1生长条件的研究

一、C/N对菌株生长的影响

1、挑取大山芽孢杆菌JY-1单克隆，接种于10mL基础培养基中，37℃、180r/min 振荡培养12h(使培养体系中的菌液OD₆₀₀值达到1.0)，4000rpm离心10min，收集菌体，用无菌生理盐水洗涤3次。

2、将上述菌体用无菌生理盐水重悬，各取2mL菌悬液分别接种于5个盛有100mL 无色培养基的锥形瓶中(pH为6.5)，分别调整各锥形瓶培养基中葡萄糖和亚硝酸钠的浓度，使5个锥形瓶培养基中的C/N分别为2、5、10、15和20，接着37℃、180r/min振荡培养24h后测定菌液OD₆₀₀值，结果发现，当C/N为15时，大山芽孢杆菌JY-1生长最好，C/N较高或较低时，大山芽孢杆菌JY-1的生长都受到一定程度的抑制(图4A)。因此，适宜大山芽孢杆菌JY-1生长的C/N为15。

二、pH对菌株生长的影响

2、将上述菌体用无菌生理盐水重悬，各取2mL菌悬液分别接种于6个盛有100mL 优化的无色培养基的锥形瓶中(C/N为15)，分别将各锥形瓶中培养基的pH调整为6.0、 6.5、7.0、7.5、8.0和8.5，接着37℃、180r/min振荡培养24h后测定菌液OD₆₀₀值，培养15h后发现，pH在6.5时，大山芽孢杆菌JY-1生长最好(图4B)。

三、温度对菌株生长的影响

1、挑取大山芽孢杆菌JY-1单克隆，接种于10mL基础培养基中，37℃、180r/min 振荡培养12h(使培养体系中的菌液OD₆₀₀值达到1.0)，4000rpm离心10min，用无菌生理盐水洗涤沉淀3次，接着将沉淀用无菌生理盐水重悬制成菌悬液。

2、各取2mL菌悬液分别接种于8个盛有100mL优化的无色培养基(C/N为15，pH 6.5)的锥形瓶中，分别于22℃、25℃、28℃、31℃、34℃、37℃、40℃和43℃下180r/min 振荡培养24h后测定菌液OD₆₀₀值，结果显示在37℃下大山芽孢杆菌JY-1生长最好(图 4C)。

四、盐度对菌株生长的影响

2、各取2mL菌悬液分别接种于6个盛有100mL优化的无色培养基(C/N为15，pH 6.5)的锥形瓶中，通过调整各培养基中的NaCl浓度，将培养基的盐度调整为0％、1％、 2％、3％、4％和5％，接着180r/min振荡培养24h后测定菌液OD₆₀₀值，结果显示在1％盐度下大山芽孢杆菌JY-1生长最好(图4D)。

实施例4：大山芽孢杆菌JY-1发酵培养基的研究

一、碳源种类及浓度对发酵的影响

1、挑取大山芽孢杆菌JY-1单克隆，接种于10mL基础培养基中，37℃、180r/min 振荡培养12h(使培养体系中的菌液OD600值达到1.0)，4000rpm离心10min，用无菌生理盐水洗涤沉淀3次，接着将沉淀用无菌生理盐水重悬制成菌悬液。

2、各取2mL菌悬液分别接种于4个盛有100mL发酵培养基(pH 6.5)的锥形瓶中，分别用葡萄糖、玉米粉、蔗糖和可溶性淀粉代替发酵培养基中的葡萄糖，37℃、180r/min 振荡培养48h后对芽孢数量和活菌数量进行统计，发现在促进芽孢生成方面，可溶性淀粉的效果最差，葡萄糖的效果最好，葡萄糖作为碳源时芽孢浓度为2.7×10⁸cfu/mL，远高于其他处理组(图5)。

3、各取2mL菌悬液分别接种于5个盛有100mL发酵培养基(pH 6.5)的锥形瓶中，调整锥形瓶中葡萄糖的含量分别为1％、2％、3％、4％和5％，37℃、180r/min振荡培养 48h后对芽孢数量和活菌数量进行统计，发现当葡萄糖浓度为1％时，芽孢生成量最多，随着葡萄糖浓度的升高，芽孢的生成量越低，对芽孢生成产生了抑制作用(图6)。

二、氮源种类及浓度对发酵的影响

2、各取2mL菌悬液分别接种于5个盛有100mL发酵培养基(pH 6.5)的锥形瓶中，分别用蛋白胨、酵母粉、硫酸铵、尿素和豆粕代替发酵培养基中的蛋白胨，37℃、180r/min 振荡培养48h后对芽孢数量和活菌数量进行统计，发现当以蛋白胨、酵母粉豆粕粉作为氮源时，芽孢浓度显著高于硫酸铵和尿素等无机氮源作为氮源的处理组，表明菌株JY-1对无机氮源的利用效果较差。其中蛋白胨对菌株JY-1的产芽孢效果最好，浓度为2.26×10⁸cfu/mL(图7)。

3、各取2mL菌悬液分别接种于5个盛有100mL发酵培养基(pH 6.5)的锥形瓶中，调整锥形瓶中蛋白胨的含量分别为1％、2％、3％、4％和5％，37℃、180r/min振荡培养 48h后对芽孢数量和活菌数量进行统计，发现随着蛋白胨浓度的升高，芽孢的生成量越低，对芽孢生成产生了抑制作用，结果显示，蛋白胨浓度为1％时，芽孢浓度最高(图8)。

三、无机盐及无机盐组合对发酵的影响

2、各取2mL菌悬液分别接种于6个盛有100mL发酵培养基(pH 6.5)的锥形瓶中，分别使培养基的无机盐为MgSO₄、MnSO₄、CaCl₂、NaCl、Na₂HPO₄、K₂HPO₄，37℃、180 r/min振荡培养48h后对芽孢数量和活菌数量进行统计，发现当以MgSO₄、NaCl和K₂HPO₄作为无机盐时芽孢浓度显著高于MnSO₄、CaCl₂和Na₂HPO₄等无机盐(图9)。

3、各取2mL菌悬液分别接种于6个盛有100mL发酵培养基(pH 6.5)的锥形瓶中，调整锥形瓶中无机盐组合分别为MgSO₄+NaCl+K₂HPO₄(组合A)、 MgSO₄+NaCl+K₂HPO₄+Na₂HPO₄(组合B)、MgSO₄+K₂HPO₄(组合C)、 MgSO₄+K₂HPO₄+CaCl₂(组合D)、MnSO₄+NaCl+K₂HPO₄(组合E)、MgSO₄+MnSO₄+K₂HPO₄+Na₂HPO₄(组合F)，37℃、180r/min振荡培养48h后对芽孢数量和活菌数量进行统计，发现当以MgSO₄+NaCl+K₂HPO₄(组合A)作为无机盐组合时，能明显促进芽孢生成量(图10)。

四、无机盐组合浓度对发酵的影响

各取2mL菌悬液分别接种于5个盛有100mL发酵培养基(pH 6.5)的锥形瓶中，调整锥形瓶中NaCl、K₂HPO₄和MgSO₄的浓度分别为1g、0.2g、0.2g(组合A)；2g、0.4g、 0.2g(组合B)；3g、0.6g、0.3g(组合C)；4g、0.8g、0.4g(组合D)；5g、1g、0.5g (组合E)，37℃、180r/min振荡培养48h后对芽孢数量和活菌数量进行统计，发现当 NaCl 1g、K₂HPO₄ 0.2g、MgSO₄ 0.1g(组合A)时芽孢产量最高，随着这三种无机盐浓度的升高，芽孢生成量逐渐下降，对芽孢生成产生了抑制作用(图11)。

实施例5：大山芽孢杆菌JY-1降解氨氮亚硝酸盐特性研究

一、标准曲线的绘制

1、取6支25ml具塞比色管、分别加入表3所示体积的亚硝酸盐氮标准使用溶液，加纯水至标线，混匀。

表3：各亚硝酸氮标准使用溶液

Table 3：Standard nitrite nitrogen solution

2、每支比色管中分别加入0.5ml磺胺溶液，混匀，分别加人0.5ml盐酸萘乙二胺溶液，混匀，放置显色15min，在波长543nm波长处，用10mm比色皿，以纯水作参比，测定吸光度，以上述系列标准溶液测得的吸光度Ai扣除试剂空白(1号管)的吸光度，得到校正吸光度A’i，以校正吸光度A’i为纵坐标，绘制吸光度对亚硝酸氮质量浓度 (ρNO2^--N)的标准曲线。

得出标准曲线的回归方程为：

A'＝b'{ρNO₂ ^--N}mg/L

二、降解亚硝酸盐特性研究

1、制备培养基甲：在无色培养基的基础上调整碳源和氮源的浓度，使亚硝酸盐浓度为0.5mg/L，C/N为15，pH为6.5。

2、挑取大山芽孢杆菌JY-1单克隆，接种于10mL基础培养基中，37℃、180r/min 振荡培养12h(使菌液OD₆₀₀值达到1.0)，4000rpm离心10min，用无菌生理盐水洗涤沉淀3次，接着用无菌生理盐水重悬沉淀制成菌悬液。

3、将1mL菌悬液接种于100mL培养基甲中，37℃、180r/min振荡培养，每隔3h 采样一次，检测离心后培养基中亚硝酸盐浓度。亚硝酸盐浓度参照标准曲线制作过程的步骤，显色并测定光度A水样。同时取25ml纯水重复上述操作，获得试剂空白的吸光度。将样品吸光度A水样扣除试制空白的吸光度，得到样品的校正吸光度A’水样。空白组仅不接种菌悬液，其他与加入菌悬液的JY-1组操作完全相同。

亚硝酸盐含量计算公式：

结果显示，与空白组(即图12中的对照组)相比，加入菌悬液的JY-1组(即图12 中的试验组)3h内亚硝酸盐含量降为0，且随着时间的推移，亚硝酸盐含量一直为0，即 JY-1菌株可有效分解培养基中的亚硝酸盐(图12)。由于大山芽孢杆菌JY-1具有很强的亚硝酸盐降解能力，可用于降低水产养殖池塘中的亚硝酸盐含量。

实施例6：大山芽孢杆菌JY-1最适降解亚硝酸盐浓度筛选

3、将菌悬液加入到20L水体中，使菌液浓度分别为10²、10³、10⁴、10⁵cfu/mL，微量充氧培养，每隔3h采样一次，检测离心后培养基中亚硝酸盐浓度。亚硝酸盐浓度参照标准曲线制作过程的步骤，显色并测定光度A水样。同时取25ml纯水重复上述操作，获得试剂空白的吸光度。将样品吸光度A水样扣除试制空白的吸光度，得到样品的校正吸光度 A’水样。空白组仅不接种菌悬液，其他与加入菌悬液的JY-1组操作完全相同。

亚硝酸盐含量计算公式：

结果显示，对亚硝酸盐降解速率最快(三小时内降到最低)的菌液浓度应该是介于10⁴cfu/mL和10⁵cfu/mL之间(图13A)。

4、将菌悬液加入到20L水体中，使菌液浓度分别为10⁴cfu/mL、2×10⁴cfu/mL、 4×10⁴cfu/mL、6×10⁴cfu/mL、8×10⁴cfu/mL，微量充氧培养，每隔3h采样一次，检测离心后培养基中亚硝酸盐浓度。亚硝酸盐浓度参照标准曲线制作过程的步骤，显色并测定光度 A水样。同时取25ml纯水重复上述操作，获得试剂空白的吸光度。将样品吸光度A水样扣除试制空白的吸光度，得到样品的校正吸光度A’水样。空白组仅不接种菌悬液，其他与加入菌悬液的JY-1组操作完全相同。

亚硝酸盐含量计算公式：

结果显示，对亚硝酸盐降解速率最快(三小时内降到最低)的菌液浓度应该是介于10⁴cfu/mL和2×10⁴cfu/mL之间(图13B)。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 一株大山芽孢杆菌及其在快速降解亚硝酸盐中的应用

<130> 2020

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agagtttgat cmtggctcag 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tacggytacc ttgttacgac tt 22

<210> 3

<211> 1616

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tatgcaatga tcccggccgc catggcggcc gcgggaattc gattagagtt tgatcatggc 60

tcagattgaa cgctggcggc aggcctaaca catgcaagtc gaacggtagc acagagagct 120

tgctctcggg tgacgagtgg cggacgggtg agtaatgtct gggaaactgc ctgatggagg 180

gggataacta ctggaaacgg tagctaatac cgcataacgt cgcaagacca aagaggggga 240

ccttcgggcc tcttgccatc agatgtgccc agatgggatt agctagtagg tggggtaacg 300

gctcacctag gcgacgatcc ctagctggtc tgagaggatg accagccaca ctggaactga 360

gacacggtcc agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat ggacgaaagt 420

ccgacggagc aacgccgcgt gagtgatgaa ggctttcggg tcgtaaaact ctgttgttag 480

ggaagaacaa gtgctagttg aataagctgg caccttgacg gtacctaacc agaaagccac 540

ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttat ccggaattat 600

tgggcgtaaa gcgcgcgcag gtggtttctt aagtctgatg tgaaagccca cggctcaacc 660

gtggagggtc attggaaact gggagacttg agtgcagaag aggaaagtgg aattccatgt 720

gtagcggtga aatgcgtaga gatatggagg aacaccagtg gcgaaggcga ctttctggtc 780

tgtaactgac actgagacgc gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt 840

ccacgccgta aacgatgagt gctaagtgtt agagggtttc cgccctttag tgctgaagtt 900

aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac ggccgcaagg ctgaaactca aaggaattga 960

cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaatccg aagcaacgcg aagaacctta 1020

ccaggtcttg acatcctctg aaaaccctag agatagggct tctccttcgg gagcagagtg 1080

acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccacaac 1140

gagcgcaacc cttgatctta gttgccatca ttaagttggg cactctaagg tgactgccgg 1200

tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gacctgggct 1260

acacacgtgc tacaatggac ggtacaaaga gctgcaagac cgcgaggtgg agctaatctc 1320

ataaaaccgt tctcagttcg gattgtaggc tgcaactcgc ctacatgaag ctggaatcgc 1380

tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc 1440

gtcacaccac gagagtttgt aacacccgaa gtcggtgggg taaccttttt ggagccagcc 1500

gcctaaggtg ggacagatga ttggggtgaa gtcgtaacaa ggtaaccgta atcactagtg 1560

aattcgcggc cgcctgcagg tcgaccatat gggagaaact cgcaaaattc tcgcga 1616

Claims

1.一株大山芽孢杆菌(Bacillus gaemokensis)JY-1，其保藏编号为：CCTCC M2020185。

2.含有权利要求1所述大山芽孢杆菌(Bacillus gaemokensis)JY-1的菌剂。

3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂中，大山芽孢杆菌JY-1以被培养的活细胞、菌悬液或发酵液的形式存在。

4.根据权利要求2或3所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂的剂型为液剂、颗粒剂、粉剂、可湿性粉剂或水分散剂。

5.一种大山芽孢杆菌JY-1的发酵培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将权利要求1所述的大山芽孢杆菌JY-1的单克隆接种至基础培养基中，振荡培养，离心，洗涤沉淀，将沉淀用无菌生理盐水重悬，制成菌悬液；

6.根据权利要求5所述的发酵培养方法，其特征在于，步骤(1)中，所述振荡培养的条件为：37℃、180r/min振荡培养12h。

7.根据权利要求5所述的发酵培养方法，其特征在于，步骤(2)中，所述发酵培养基的组成为：葡萄糖10g，蛋白胨10g，磷酸二氢钾0.2g，氯化钠1g，硫酸镁0.1g，加水定容至1000mL；pH6.5。

8.权利要求1所述的大山芽孢杆菌JY-1或权利要求2所述的含有大山芽孢杆菌JY-1的菌剂在降解亚硝酸盐中的应用。

9.一种降解污染水体或水产养殖水体中亚硝酸盐的方法，其特征在于，包括：将权利要求1所述的大山芽孢杆菌JY-1或权利要求2所述的含有大山芽孢杆菌JY-1的菌剂施加于水产养殖水体或亚硝酸盐污染水体中的步骤。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，大山芽孢杆菌JY-1或含有大山芽孢杆菌JY-1的菌剂的建议施加量为10⁴-10⁵cfu/ml。