CN116240135A - 一种高负荷异养反硝化菌剂的生产工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明是一种高负荷异养反硝化菌剂的生产工艺，本发明的特点是通过利用高通量测序技术迅速筛选高菌种丰度的目标菌源，利用人工富集的方法快速提高反硝化功能菌的丰度，使其在筛菌过程中具有生长优势，通过平板划线分离及多种培养基结合的方法选出底物亲和力高、脱氮速率快、传代时间短的全程异养反硝化菌株，并利用响应曲面的方法进行菌种复配，并根据需求确定菌剂的实际用量，适用于含有硝态氮和亚硝态氮的废水脱氮。

Description

一种高负荷异养反硝化菌剂的生产工艺
技术领域
本发明属于水处理应用领域，具体涉及一种高负荷异养反硝化菌剂的生产工艺。
背景技术
随着工业的发展，水体污染的情况越来越严重，其中氮素污染占据相当大的比例。
目前化工行业常用的脱氮工艺为SBR或A/O工艺：SBR反应器脱氮效率低，脱氮负荷一般为0.02-0.06 kgN/(m3·d)；而A/O工艺由于废水碳氮比低的原因，脱氮效果不理想，总氮去除率一般为70%左右。现阶段大多数的污水厂构筑物只能将污水TN降低到15 mg/L，而随着城市污水排放标准的进一步提高，进一步降低出水TN成为技术难点。为了高效快速的解决总氮小于15 mg/L的废水脱氮，并使出水小于1.5 mg/L，需要筛选高效反硝化细菌。
传统的筛选方法依靠培养基进行培养，分离，生化鉴定及计数的微生物研究方法，操作繁琐，速度较慢，无用功概率高。
Illumina公司的新一代测序仪准确性高，具有高通量，高灵敏度，和低运行成本等突出优势，可以同时完成传统基因组学研究（测序和注释）以及功能基因组学（基因表达及调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究。
筛选反硝化菌株的实验原理是反硝化菌株能在含有硝态氮的培养基上生长，在该培养基上其他种类微生物的生存则较为不利，而得以快速分离纯化目标菌株。
反硝化细菌群落简单地分为两类：仅将硝酸盐还原为亚硝酸盐并导致亚硝酸盐积累的“硝酸盐呼吸”细菌，以及能够还原硝酸盐到氮气的“真正的反硝化菌”细菌。利用Giltay培养基法筛选菌株，培养基颜色由绿变为蓝，说明可以进行硝酸盐还原为亚硝酸盐的步骤。而亚硝酸盐进一步还原成氧化亚氮或氮气时，则可以在培养基中观察到产气现象。
将以上两个方法结合起来，可以高效、快速的筛选出反硝化细菌丰度高的泥源，同时结合反硝化实验结果，剔除反硝化性能差的污泥样本，提高反硝化菌株筛选效率。
目前常用筛菌方法基本遵从采样-分散-平板划线-提纯-逐级放大-复配-使用的流程，整个流程不确定性高，需要人工的操作量大，而专利CN104450592A公开了一种基于生物多样性信息分离反硝化脱硫细菌的方法，虽然也使用了高通量测序的方法，但是高通量测序的主要目的为提供特定反应器的生态分布信息，且为各种菌株均提供了相应的培养基，使筛出的菌株在实际环境中的竞争力降低，可能导致产品研发失败。
本发明的目的是提供一种高负荷异养反硝化菌剂的生产工艺，主要方法是通过高通量测序筛选出反硝化细菌丰度高的污泥，并辅以反硝化动力学筛选出高反硝化细菌丰度，高反硝化负荷的污泥，利用人工富集的方法进一步提高污泥的反硝化能力，同时利用实际废水等多种培养基相结合，筛选出反应速率高，生长速度快，可直接适用于实际废水的全程反硝化菌株。并利用响应曲面的方法对菌株进行复配，剔除互相负影响的菌株，制成高负荷菌剂。与传统菌剂研发方法相比，本发明的菌剂筛选方法针对性强，成功率高，并可根据实际项目定制高效异养反硝化菌剂，同时减少了操作人员的工作量，整体流程简便，快速。
发明内容
针对常规菌剂开发过程中的菌剂开发流程长，产品不稳定等问题，结合上述技术背景，本发明提供了一种菌剂的生产工艺，主要利用高通量测序技术和人工富集相结合，同时利用选择性培养基选择出符合筛选要求的高性能菌株。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明所述生产工艺包括优秀泥源筛选，反硝化菌株筛选，反硝化菌剂复配和菌剂制作。具体步骤如下：
（1）优秀泥源筛选：利用高通量测序技术和反硝化动力学的方法筛选出反硝化菌丰度高且反硝化负荷大于0.02 kgN/(kgSS·d)的目标泥源；
（2）反硝化菌株筛选：使用人工富集的方法，利用人工配水进一步提高目标菌源低浓度反硝化的能力；利用低浓度的反硝化细菌固体培养基和Giltay培养基筛选全程反硝化细菌；使用低浓度反硝化细菌液体培养基筛选出生长速度快、反应速率高、处理效果好的几种反硝化菌株；
（3）反硝化菌剂复配：利用响应曲面的试验方法将筛选出的菌株进行复配，配置出比所有单菌负荷都要高的复合反硝化菌剂；
（4）菌剂制作：将上述复合反硝化菌剂扩大生产，并判断其传代稳定性。
所述的工艺可用于筛选反硝化菌株，具体处理对象为含有硝态氮和亚硝态氮的废水。
所述步骤（1）中利用高通量测序技术可将污泥样品送至专门进行生物测序的公司，生物测序公司可选择生工生物工程（上海）有限公司、上海派森诺生物科技股份有限公司、美吉生物集团、基迪奥生物、华大基因、北京博莱明创生物技术有限公司、北京华大中生科技发展有限公司、北京斯克尔基因生物技术有限公司、百替生物等进行提供高通量服务的公司，也可使用试剂盒自行进行检测。
所述步骤（1）中所述的反硝化菌属丰度高指的是现有研究中已经报道过的具有反硝化功能的菌属丰度之和高，优选Pseudomonas，Flavobacterium，Methyloversatilis， Methylotenera，Hyphomicrobium，Thiothrix，Hydrogenophaga，Comamonas的丰度之和高。
所述步骤（2）中人工配水的水质为：使用污水厂的二沉池出水，并根据C/N=3-8的比例投加碳源。
所述步骤（2）中泥源的反硝化能力应提高至当污泥浓度为2000-5000 mg/L，容积负荷达到0.4 kgN/(m³·d)以上时。
所述步骤（2）中低浓度反硝化细菌固体培养基是指目标污水厂的二沉池出水，并根据C/N=3-8的比例投加碳源，同时加入1%-2%的琼脂制成的固体培养基。低浓度反硝化细菌液体培养基指的是上述配置方法未添加琼脂的培养基。
所述的碳源优选为中国专利202110612710.X公开的复合碳源，由以下组分组成：0%~5%甲醇，0%~5%乙醇，5%~30%乙酸钠，0%~5%葡萄糖，0.1%~2%糖蜜，1%~5%的腐殖酸发酵液，其余为水；其中，腐殖酸发酵液COD为1~8万mg/L。
所述步骤（2）中选出的全程反硝化细菌指的是可以让Giltay培养基变色及发生产气现象的细菌。
所述步骤（2）中使用生长动力学和反硝化动力学筛选出生长速度快、反应速率高、处理效果好的反硝化菌株的方法为：使用实际废水培养基、Giltay培养基和生长动力学筛选出同时满足可以让Giltay培养基变色及发生产气现象，同时满足处理1-10批次配水后OD600增量大于0.05、OD600在0.1-0.6之间时，菌株负荷达到0.1-1 kgN/(m³·d)、出水TN<1.5 mg/L三个指标的反硝化细菌。
所述步骤（3）利用响应曲面的试验方法将筛选出的菌株进行复配的方法为：是利用响应曲面的试验方法，选出加入活性污泥中可以提高活性污泥反硝化速率，同时按照该比例配置出的复合菌剂处理效果优于使用的所有单菌株运行数据的菌株配比。
所述步骤（4）中扩大生产及判断生产稳定性的方法为：在无菌操作的条件下将菌剂培养到体积大于0.5m³且浓度超过100 mg/L后，进行一次动力学检测，性能不低于筛选出菌剂的指标的70%后，开始非无菌培养，当菌剂总量超过初始菌剂量100倍以上时，依然满足性能不低于筛选出菌剂的指标的70%。
所述的生产工艺进一步包括通过与活性污泥联合培养来确定菌剂的使用比例及使用稳定性的步骤(5)，具体包括如下步骤：在活性污泥中投加原有污泥量0.01-1 %的菌剂后，使得反硝化反应器负荷到达3 kgN/(m³·d)的培养时间比使用普通活性污泥的培养时间缩短4天以上；反应器进水硝酸盐氮或亚硝酸盐氮突然升高1倍以上或者经历pH值在6-9以外的范围低于24 h的突变后，通过延长水力停留时间或者调节体系pH值回到6-9之后，反应器出水总氮依然可以达到1.5 mg/L以下，且一周内反应器负荷可以恢复到冲击前的状态。
本发明的进一步改进是：提前对目标菌源进行高通量测序，并根据测序结果结合现有文献研究筛选出反硝化细菌丰度高的污泥泥源，同时结合反硝化动力学的方法辅助判断目标泥源是否是高性能的目标泥源，和传统直接筛菌的方法相比，减轻了实验人员的前期准备工作，提高了有效菌株的筛选概率。
利用人工富集的方法提高了目标菌源的反硝化活性，进一步富集目标菌株的丰度，提高筛菌成功概率。
利用实际废水制成培养基，并配合Giltay培养基可以高效筛选出全程反硝化的高效菌株，同时排除只能进行反硝化呼吸的菌株，减少出水亚硝酸盐的积累，可以提高含氮废水的反硝化效率，实现高反应负荷低出水浓度的目标，同时可以使目标菌株具有更强的针对性。
利用响应曲面配置菌剂，可以减少菌株之间的组合数量，减少实验次数，并利用数学计算的方法精确得出菌株的最佳配置，提高了菌剂配方确定效率。
利用非无菌扩大生产，并且联合活性污泥测试，可以提前确定菌剂生产过程中的稳定性及菌剂在实际应用中的状态，减少菌剂生产过程中的困难性及实际应用中的流失及无效性的发生。
本发明的特点是：利用高通量测序的方法提前锁定目标菌源，并结合实际废水定向培养筛选，Giltay培养基的全程生长阶段追踪，可以减少操作人员劳动量，节省菌株筛选时间，剔除只能进行硝酸盐呼吸的伪反硝化细菌，准确筛选出生长速度快，反应速率高，处理效果好的反硝化菌株，利用响应曲面制作菌剂，并利用非无菌状态扩大菌剂培养，同时提前利用活性污泥进行菌剂测试，可以提高菌剂制作成功性、减少菌剂生产难度，同时提高菌剂使用过程中的留存率。该方法人工投入少，筛选成功率高，具有普适性和实用性，为达成市政尾水深度脱氮，出水总氮达到1.5 mg/L以下的目标提供了新的技术支持。
附图说明
图1为一种高负荷异养反硝化菌剂的生产工艺的流程示意图
图2 为总氮去除负荷提高与ZH15、ZH33添加量和C/N之间的响应曲面
图3 为菌剂和污泥联合实验（a 菌剂优化组污泥负荷冲击实验；b 菌剂激发组污泥负荷冲击实验；c 菌剂优化组pH值冲击实验；d 菌剂激发组pH值冲击实验；e 普通污泥组污泥冲击实验）
实施方式
以下结合附图并通过实例对本发明作进一步说明：
调研人员从多个污水处理厂带回泥样后，将样品按照要求送至生物测序公司，取得测序数据后，选取Pseudomonas，Flavobacterium，Methyloversatilis，Methylotenera， Hyphomicrobium，Thiothrix，Hydrogenophaga，Comamonas丰度之和丰度最高的污泥样本。
将污泥进行反硝化培养，待反应器反硝化能力应提高至当污泥浓度为2000-5000mg/L，容积负荷达到0.4 kgN/(m³·d)以上时后，取反应器中污泥进行筛菌操作，利用实际废水制成的从固体培养基通过稀释涂布方法分离获得反硝化细菌，将筛出的反硝化细菌在Giltay培养基培养一段时间后挑选出培养基变色及观察到产气现象的细菌。
将细菌在实际废水中进行反硝化实验，选出生长速度快，反应速率高，处理效果好的反硝化菌株。筛选出反硝化菌株后，按比例投加到活性污泥中，根据响应曲面实验结果将菌株按比例进行复配后进行菌剂生长动力学和反硝化动力学的实验，确保复配的菌剂可以让Giltay培养基变色及发生产气现象的细菌、同时满足处理1-10批次配水后OD600增量大于0.05、OD600在0.1-0.6之间时，菌株负荷达到0.1-1 kgN/(m³·d)、出水TN<1.5 mg/L三个指标的反硝化细菌。
最后将菌剂进行扩大化培养，当菌剂量扩大到100倍后，再进行一次菌剂生长动力学和反硝化动力学的实验，确保菌剂的扩培稳定性。最后将菌剂掺入污泥中进行实验，确定菌剂的最终使用性能。
实施例
选择多家污水处理厂进行取样调研，主要包括市政污水处理厂、煤化工污水站、化肥厂污水站等，将污泥样品送至生工生物工程（上海）有限公司进行污泥测序，同时对样本的污泥反硝化活性进行实验，具体数据见表1及表2，从数据可以看出市政污水厂2的污泥反硝化菌的污泥丰度和反硝化性能均为最高，是优质的目标泥源。
表1 污泥样本反硝化菌属丰度
Figure SMS_1
表2 反硝化性能对比
Figure SMS_2
将目标污泥放置在反硝化反应器中，反硝化连续流反应器由有机玻璃柱制成，有效容积为0.5L（内径为3cm，高为60cm）,运行方法为上进下出。反应器填充污泥为20cm，上升流速为3.5m/h，在此上升流速下，污泥膨胀到40 cm。采用某市政污水厂二沉池污水进行富集实验，其进水硝态氮浓度为10-15 mg/L，根据上述进水硝态氮浓度投加碳源，所述碳源具体为按照中国专利202110612710.X的实施例1的技术方案配制的复合碳源，使C/N 为4，同时添加0.5mg/L的总磷，调节pH值到7.2。
接种时反应器负为0.1 kgN/(m³·d)当反应器运行到第40天后，反应器进水硝酸盐氮在10-15 mg/L之间，出水硝酸盐氮和亚硝酸盐氮之和低于1.5 mg/L，反应器最大容积负荷处在0.5 kgN/(m³·d)左右，污泥负荷已经是接种时的5倍，已经达到可以筛菌的标准。
利用二沉池出水制成反硝化细菌培养基，通过稀释涂布方法分离获得反硝化细菌，获得53株细菌，编号为ZH1-ZH53。
将53株反硝化细菌在Giltay培养基培养一段时间后，培养基变化和产气情况如表3所示ZH1，9，12，15，19，23，26，29，33，45，49和51在25℃培养箱培养1天后，培养基由绿色变为蓝色，并观察到气泡的产生，说明这是全程反硝化细菌，可以进行进一步筛选。
表3 反硝化性能对比
Figure SMS_3
表4展示了初步筛出的12株菌株在市政二沉池出水中进行25℃恒温培养16h后的OD600的吸光度及容积负荷变化，菌株15，33拥有生长速度快，反硝化速率高的优点。可以作为重点反硝化菌株培养。
表4 12株反硝化细菌OD600
Figure SMS_4
结合两株反硝化的高效菌株的投加量及影响反硝化过程碳氮比的三个因素，采用Design-Expert 数值软件，以Box-Behnken Design构建出3水平3因素的试验设计，因素水平编码表如表1所示
表5 菌株反硝化实验响应曲面设计
Figure SMS_5
根据Design-Expert 数值软件提供的设计方案，实验设计方案进行实验，以总氮去除负荷的提高为响应值，可得总氮去除负荷提高与ZH15、ZH33添加量和C/N之间的三次多项方程式：Y=16..68+12.9A+14.2B+1.2C+2.1AB+0.9AC+0.45BC+4.96A2+3.06B2+1.31C2-1.3A2B+0.25A2C+AB2，并根据实验结果做出相应曲面图，结果如图2所示。
根据模型预测，ZH15添加量为9.75%，ZH33投加量为9.86%。C/N比为4，此时反应器负荷可以提高53%。
即菌剂组合为ZH15：ZH33=1：1时，效果最好，对该组合进行培养，25℃恒温培养16h后的OD600的吸光度提高了0.3659及容积负荷为0.71 kgN/(m³·d)，满足菌剂生产要求，先对菌剂进行无菌培养，菌剂体系从1L扩大到1m³后，此时菌剂浓度为1500mg/L，将菌剂体积扩大到100m³后，此时菌剂浓度为4000mg/L，取部分菌剂进行实验，25℃恒温培养16h后的OD600的吸光度提高了0.3598及容积负荷为0.83 kgN/(m³·d)。
为了验证菌剂的对活性污泥的反硝化激活及强化效果，进行了连续流实验，实验分为普通污泥组，菌剂激发组（ZH15和ZH33投加量为0.1%）和菌剂优化组（ZH15和ZH33投加量为10%），实验结果如图3所示。
从实验数据可以看出，菌剂优化组启动时负荷可以达到0.7 kgN/(m³·d)，出水TN低于1.5 mg/L，而菌剂激发组的反应器启动时间短，负荷提升后稳定时间比普通污泥组少5d；同时，菌剂激发组由于活性污泥量与实际几乎相同，所以和菌剂优化组相比，对于pH值的冲击适应性更强，在pH值低于6和高于9的情况下，负荷降低量低于优化组的50%，且恢复时间更短，3天内都可以恢复到原来状态。
实施例经过多次测试，菌株15，33均具有生长速度快，反硝化速率高的特点，同时制成菌剂后依然保存生长速度快，反硝化速率高的特点，同时对活性污泥反硝化具有促进作用，是理想的反硝化菌剂，证明本申请的技术方案具有实用性。

Claims (10)

1.一种高负荷异养反硝化菌剂的生产工艺，其特征在于：所述工艺具体包括如下步骤：
（1）优秀泥源筛选：利用高通量测序技术和反硝化动力学的方法筛选出反硝化菌属丰度高且反硝化负荷大于0.02 kgN/(kgSS·d)的目标泥源；
（2）反硝化菌株筛选：使用人工富集的方法，利用人工配水进一步提高目标菌源的反硝化的能力；利用低浓度的反硝化细菌固体培养基和Giltay培养基筛选全程反硝化细菌；使用低浓度反硝化细菌液体培养基筛选出生长速度快、反应速率高、处理效果好的反硝化菌株；
（3）反硝化菌剂复配：利用响应曲面的试验方法将筛选出的菌株进行复配，配置出比所有单菌株负荷都要高的复合反硝化菌剂；
（4）菌剂制作：将上述复合反硝化菌剂扩大生产并判断其传代稳定性。
2.如权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，所述的反硝化菌剂的处理对象为含有硝态氮和亚硝态氮的废水。
3.如权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，步骤(1)中所述的反硝化菌属丰度高具体指的是Pseudomonas，Flavobacterium，Methyloversatilis，Methylotenera， Hyphomicrobium，Thiothrix，Hydrogenophaga，Comamonas的丰度之和高。
4.如权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，所述目标泥源的污泥负荷大于0.02kgN/(kgSS·d)。
5.如权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，所述人工富集的方法具体如下：利用污水厂的二沉池出水，并根据C/N=3-8的比例投加碳源，将目标菌源的反硝化能力提高到污泥浓度在2000-5000 mg/L时，容积负荷为0.4 kgN/(m³·d)以上。
6.如权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，所述分离纯化反硝化细菌的方法为：利用目标污水厂的二沉池出水，根据C/N=3-8的比例投加碳源，同时加入1%-2%的琼脂固化后分离纯化反硝化细菌。
7.如权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，所述的生长速度快、反应速率高、处理效果好的异养反硝化菌株同时满足以下条件：
a) Giltay培养基变色及发生产气现象；
b) 处理1-10批次配水后OD600增量大于0.05；
c) OD600在0.1-0.6之间时，菌株负荷达到0.1-1 kgN/(m³·d)；
d) 出水TN<1.5 mg/L。
8.如权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，所述步骤(4)的具体方法为：在无菌操作的条件下将菌剂培养到体积大于0.5m³且浓度超过100 mg/L后，进行一次动力学检测，性能不低于筛选出菌剂的指标的70%后，开始非无菌培养，当菌剂总量超过初始菌剂量100倍以上时，依然满足性能不低于筛选出菌剂的指标的70%。
9.如权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，所述的生产工艺进一步包括通过与活性污泥联合培养来确定菌剂的使用比例及使用稳定性的步骤(5)，具体包括如下步骤：
在活性污泥中投加原有污泥量0.01-1 %的菌剂后，使得反硝化反应器负荷到达3 kgN/(m³·d)的培养时间比使用普通活性污泥的培养时间缩短4天以上；反应器进水硝酸盐氮或亚硝酸盐氮突然升高1倍以上或者经历pH值在6-9以外的范围低于24 h的突变后，通过延长水力停留时间或者调节体系pH值回到6-9之后，反应器出水总氮依然可以达到1.5 mg/L以下，且一周内反应器负荷可以恢复到冲击前的状态。
10.一种高负荷异养反硝化菌剂，其特征在于，使用如权利要求1-9任一项所述的生产工艺生产得到。
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Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110084022A1 (en) * 2009-10-09 2011-04-14 Leaderman & Associates Co., Ltd. Process for treating nitrogenous wastewater with simultaneous autotrophic denitrification, hetertrophic denitrification and COD removal
CN102041291A (zh) * 2009-10-21 2011-05-04 中国石油化工股份有限公司 一种反硝化菌的筛选方法
CN102604870A (zh) * 2012-03-26 2012-07-25 浙江师范大学 复苏可培养化的vbnc节杆菌dsc4菌株及其复苏方法和应用
CN104017752A (zh) * 2014-04-24 2014-09-03 丁林贤 复苏可培养化的vbnc节杆菌odslc13菌株及其复苏方法和应用
CN104450592A (zh) * 2014-12-31 2015-03-25 哈尔滨工业大学 一种基于生物多样性信息分离反硝化脱硫细菌的方法
CN108070543A (zh) * 2017-12-22 2018-05-25 浙江省环境保护科学设计研究院 一种适用于低c/n比废水处理的脱氮菌制剂的制备和应用
CN108330081A (zh) * 2017-11-27 2018-07-27 天津工业大学 一株异养硝化-好氧反硝化细菌及其应用
CN110386667A (zh) * 2019-07-18 2019-10-29 曲阜师范大学 一种反硝化施氏假单胞菌强化缺氧池污水脱氮方法
CN110407333A (zh) * 2019-07-23 2019-11-05 中国科学院南京地理与湖泊研究所 一种水平潜流湿地反硝化脱氮增强方法
CN111172061A (zh) * 2019-12-25 2020-05-19 广东石油化工学院 一种好氧反硝化复合菌剂及其应用
CN113754051A (zh) * 2021-01-13 2021-12-07 上海大学 一种生物脱氮缓释碳源复合材料及其制备方法和应用

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110084022A1 (en) * 2009-10-09 2011-04-14 Leaderman & Associates Co., Ltd. Process for treating nitrogenous wastewater with simultaneous autotrophic denitrification, hetertrophic denitrification and COD removal
CN102041291A (zh) * 2009-10-21 2011-05-04 中国石油化工股份有限公司 一种反硝化菌的筛选方法
CN102604870A (zh) * 2012-03-26 2012-07-25 浙江师范大学 复苏可培养化的vbnc节杆菌dsc4菌株及其复苏方法和应用
CN104017752A (zh) * 2014-04-24 2014-09-03 丁林贤 复苏可培养化的vbnc节杆菌odslc13菌株及其复苏方法和应用
CN104450592A (zh) * 2014-12-31 2015-03-25 哈尔滨工业大学 一种基于生物多样性信息分离反硝化脱硫细菌的方法
CN108330081A (zh) * 2017-11-27 2018-07-27 天津工业大学 一株异养硝化-好氧反硝化细菌及其应用
CN108070543A (zh) * 2017-12-22 2018-05-25 浙江省环境保护科学设计研究院 一种适用于低c/n比废水处理的脱氮菌制剂的制备和应用
CN110386667A (zh) * 2019-07-18 2019-10-29 曲阜师范大学 一种反硝化施氏假单胞菌强化缺氧池污水脱氮方法
CN110407333A (zh) * 2019-07-23 2019-11-05 中国科学院南京地理与湖泊研究所 一种水平潜流湿地反硝化脱氮增强方法
CN111172061A (zh) * 2019-12-25 2020-05-19 广东石油化工学院 一种好氧反硝化复合菌剂及其应用
CN113754051A (zh) * 2021-01-13 2021-12-07 上海大学 一种生物脱氮缓释碳源复合材料及其制备方法和应用

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