CN110902820A - 一种反硝化菌驯化培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一种反硝化菌驯化培养方法，包括：启动阶段用无水乙酸钠为COD唯一来源，启动成功后添加前处理垃圾渗滤液(PLL)作为混合碳源对反硝化菌进行驯化培养；利用KNO₃作为唯一氮源；以KH₂PO₄配制磷酸盐质量浓度，为反硝化菌提供磷源；以MgSO₄和CaCl₂满足反硝化菌对Mg²⁺和Ca²⁺的需求；并添加一定量微量元素。本发明利用前处理垃圾渗滤液作混合碳源驯化反硝化菌，驯化的反硝化菌具有高效的反硝化效能，能快速、高效处理高浓度硝态氮。

Description

一种反硝化菌驯化培养方法

技术领域

本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一种反硝化菌驯化培养方法。

背景技术

反硝化是我国目前污水处理主流的脱氮工艺，存在能耗高的缺点。在溶解氧不足条件下，反硝化菌以有机碳源作为电子供体，以硝态氮或亚硝态氮作为电子受体发生生物氧化反应，最终将硝态氮还原为氮气，因此反硝化是一个耗能的过程，碳源含量很大程度上决定了硝态氮的去除速率和效率，然而我国的大多数城市污水处理系统普遍存在原水碳源不足、可生物降解有机物含量低的问题，使出水总氮达到较高排放标准的目标面临困难，提供充足的反硝化碳源成为实际生产运行的一个重要控制因素。

垃圾渗滤液的合理处置是一个公认的世界性难题。国内外对于垃圾渗滤液的研究仍然处在不断发展和完善阶段，处理技术愈来愈多样化，但也存在着不少问题，比如现在主流的纳滤、反渗透、高级氧化技术和活性炭吸附等深度处理工艺，由于结构复杂、费用高昂、存在二次污染等弊端，导致它们的处理能力跟不上垃圾渗滤液的产生速度，从而带来了巨大的后续处理压力，因此需求一种经济高效的垃圾渗滤液处理方案迫在眉睫。

垃圾渗滤液中含有高浓度的有机物质，其中新鲜垃圾渗滤液中的小分子COD含量丰富，BOD/COD高达0.4～0.7，可生化性较高。本发明结合反硝化碳源需求量大和垃圾渗滤液富含有机物的特点，利用垃圾渗滤液中的COD作为反硝化碳源驯化活性污泥，可以节省外加碳源的投入、减少运行费用，一方面能够使垃圾渗滤液得到合理处置，另一方面能够为反硝化提供优质碳源，降低实际生产的运行成本，最终达到“以废治废、变废为宝”的目的。

现有技术CN104673738A提供了一种异养硝化好氧反硝化细菌的驯化与筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将样品接种至含有含氮废水的富集营养液中对脱氮菌群进行摇瓶异养富集培养，得脱氮菌群的富集培养液；(2)在好氧曝气反应器中用含氮废水使富集培养液的脱氮菌群快速增殖；(3)用实际含氮废水在SBR反应器进行异养脱氮菌群驯化培养；(4)用A/O工艺及实际含氮废水在对脱氮菌群进行驯化培养；(5)从A/O工艺驯化污泥中分离纯化脱氮细菌；(6)纯化菌株的异养硝化好氧反硝化能力验证；(7)将异养硝化好氧反硝化能力强的菌株进行鉴定。该技术方案存在的缺陷和需要进一步解决的技术问题：该技术方案涉及曝气过程，耗电量大，存在运行成本高的弊端。

以及CN107673466A提供了一种快速驯化硫循环耦合反硝化除磷系统的方法，该方法包括下列步骤：(i)向反应器注入含有富集程度大于50％的硫酸盐还原菌的污泥；(ii)进含硫废水；(iii)在隔绝空气的条件下搅拌，运行厌氧阶段，直至水中碳源浓度为零并且磷酸根浓度保持不变；(iv)加入浓度为1-4gN/L的硝酸盐溶液，使得硝酸根在反应器中的浓度为35-65mgN/L，运行缺氧阶段，直至硝酸根的浓度小于或等于0.5mgN/L，或磷酸根的浓度小于或等于1～2mgP/L；(v)沉淀，导出上清液；重复上述步骤(ii)至步骤(v)，直至驯化结束；系统的pH值保持为6.5-8.5。该技术方案存在的缺陷和需要进一步解决的技术问题：该技术方案需要投加补充碳源，未能利用垃圾渗滤液中的碳源，存在运行成本高的缺点。

发明内容

鉴于现有技术存在的问题，本发明提供了一种反硝化菌驯化培养方法，包括：驯化启动阶段用无水乙酸钠为COD唯一来源，启动成功后添加前处理垃圾渗滤液(PLL)作为混合碳源；利用KNO₃作为唯一氮源；以KH₂PO₄配制磷酸盐质量浓度，为反硝化菌提供磷源；以MgSO₄和CaCl₂满足反硝化菌对Mg²⁺和Ca²⁺的需求；并添加一定量的微量元素。

启动阶段各物质有严格的要求，比如：如果N：P偏高会导致富营养化，如果偏低，则微生物不能充分利用碳源合成细胞物质，过多的能量将被转化为多糖的形式储存起来，从而造成污泥膨胀，最终影响到污泥的沉降性。

启动成功后添加垃圾渗滤液的依据：1、碳源不足是生物脱氮工艺的主要限制性因素；2、我国大多数城市的污水处理系统普遍存在原水碳源不足的问题；3、垃圾渗滤液中富含高浓度的有机碳源。

启动成功后添加垃圾渗滤液的好处：1、可以为反硝化细菌提供外加碳源，提高反硝化速率，进而提高脱氮效率。2、减少传统外加碳源的投加量，可以降低运行成本；3、含有较高的碱度，能够稳定污水硝化和反硝化过程中的pH值。

作为本发明的一种优选技术方案，驯化启动阶段用无水乙酸钠为COD唯一来源培养，控制进水碳氮比(COD：NO₃ ^-，下称C/N)为5.0，硝态氮浓度根据驯化程度采取阶梯式上升的方式在50mg·L^-1～500mg·L^-1内逐渐增加。

该物质浓度的选择的好处是：在C/N＝5提前下，可以为反硝化菌的生长提供充足的碳源物质，还可以为硝态氮的还原提供足量的电子供体，此时对比反硝化速率可以排除碳源不足的影响。

硝态氮浓度在50mg·L^-1～500mg·L^-1内逐渐增加过程可以使反硝化菌逐步适应高浓度硝态氮，减轻高浓度硝态氮负荷对反硝化菌的危害，提高系统对硝态氮的耐冲击负荷，有利于驯化筛选出能够耐高硝态氮负荷的反硝化菌。

作为本发明的一种优选技术方案，优选PLL添加体积分数为10％。

通过大量的实验优选得到PLL添加体积分数为10％时，反硝化速率最大为62.28mg·(g·h)^-1，COD最大去除率为96.77％；

对驯化的作用体现在：添加10％的PLL使系统在兼顾COD去除率的同时又能得到高效的反硝化速率，显著提高驯化污泥的碳、氮去除能力。

作为本发明的一种优选技术方案，KNO₃、KH₂PO₄、以及MgSO₄和CaCl₂各自的浓度选择如下表所示：

前述各物质的浓度通过大量实验优选得到，相对于其他比例的优势在于：N：P＝5:1不会偏高也不会偏低，避免导致富营养化问题，不会出现污泥膨胀现象，使系统能够在预期内平稳运行，最大程度缩短反硝化菌的驯化周期。

作为本发明的一种优选技术方案，微量元素添加量为1mL·L^-1。其中，1L微量元素溶液中含有10.00g EDTA、1.50g FeCl₃·6H₂O、0.03g CuSO₄·5H₂O、0.12g ZnSO₄·7H₂O、0.15g CoCl₂·6H₂O、0.12g MnCl₂·4H₂O、0.06g Na₂MoO₄·2H₂O、0.18g KI、0.15g H₃BO₃。

微量元素是微生物生长代谢中必不可少的营养物质，对细菌的生长、ATP的产生、反硝化关键酶的催化活性和脱氮性能的增强具有积极影响，有利于反硝化菌的驯化与筛选。

Fe元素是多种酶的辅助因子或激活剂，也是细胞色素和某些蛋白质的组成成分，0.31mg·L^-1Fe³⁺在微生物的代谢活动中起促进作用；

Cu元素是反硝化过程中亚硝态氮还原酶的辅因子，适量浓度的Cu有助于亚硝态氮的还原，0.008mg·L^-1Cu²⁺可以提高硝态氮还原酶和亚硝态氮还原酶的活性，从而加快反硝化速率；

Mn元素是细菌胞内多种酶(如多聚酶、丙酮酸缩化酶、歧化酶)的组成部分，以及某些水解酶、磷酸化酶、激酶等蛋白的激活剂，0.033mg·L^-1Mn²⁺对活性污泥的生长和电子传递起促进作用；

Zn元素是构成含锌蛋白质的重要组成部分，同时也是多种酶(如乙醇脱氢酶、乳酸脱氢酶)的组分和激活剂，可维持某些酶的有机分子配位基的结构构性并在酶反应时起到辅酶作用，可以调节反硝化菌的多种生命代谢活动，0.028mg·L^-1Zn²⁺有利于反硝化菌的繁殖，在此浓度下硝酸盐还原菌和亚硝酸盐还原菌的活性有所提升，能够刺激反硝化微生物的驯化，有利于总氮和硝酸盐氮的去除；

Co元素是维生素B12不可或缺的一部分，同时也是多种微生物生化过程中细胞内核酸和氨基酸合成的重要元素，0.037mg·L^-1Co²⁺能够提高微生物的代谢活性，促进微生物的生长繁殖；

Mo元素是硝酸盐还原酶的重要激活元素，0.024mg·L^-1Mo⁶⁺能够提升硝酸盐的还原性能，并且对反硝化微生物生长的促进作用最佳。

EDTA的适量添加可以防止细胞结团，细胞间是通过粘性分子(CAM)相连的，而很多粘性分子需要在有二价金属离子(如Ca²⁺、Mg²⁺)存在下的前提下才能发挥作用，加入EDTA能够螯合这些二价离子，使细胞更易于聚集形成颗粒化，有利于微生物的生长与驯化。

作为本发明的一种优选技术方案，驯化过程控制DO≤0.4mg·L^-1，保持缺氧状态；进水pH控制在7.5±0.1；水温为室温，即21.5～25.6℃。

该参数的DO、pH和温度是通过大量实验获得的反硝化菌的最优生长条件。反硝化菌为异养型兼性厌氧菌，温度、pH值、溶解氧等是影响反硝化菌生长的环境因素。

相对于其他比例，本发明控制的参数对驯化的好处在于：反硝化菌的环境最适pH值为6.0～8.0，当pH值高于8或低于6时，反硝化速率将大为下降；反硝化菌的最佳生长温度为20～40℃，本发明将温度控制在21.5～25.6℃，有利于驯化时提高反硝化菌的增值速率与代谢速率；溶解氧浓度超过0.5mg·L^-1时，会抑制反硝化菌体内硝酸盐还原酶的合成，本发明驯化过程控制DO≤0.4mg·L^-1，有利于提高硝酸盐还原酶的活性。

本发明进一步提供了一种硝态氮处理方法，其特征在于，采用前述驯化培养方法获得的反硝化菌，能快速、高效处理高浓度硝态氮。

本发明相对于现有技术的有益效果包括：

1.利用前处理垃圾渗滤液作混合碳源驯化反硝化菌；

2.驯化的反硝化菌具有高效的反硝化效能；

3.能快速、高效处理高浓度硝态氮。

附图说明

图1，本发明实验装置示意图。

其中，实验装置由2个相同的有机玻璃材质柱形SBR(R0和R1)组成，有效柱高为65cm，内径为10cm，有效容积10L，在反应器底部设有排泥口，直径为10mm。反应器侧面15、25、35、45、55cm处分别设有取样口，反应器顶部设置搅拌器，使泥水保持混合状态，反应器进水方式为上进下出，反应装置如图1所示。

具体实施方式

下面结合具体实例和附图对本发明进行说明，以下实施方式仅用于说明本发明，而不用于限制本发明所要求保护的范围。

实施例1

一种反硝化菌驯化培养方法，包括：驯化启动阶段用无水乙酸钠为COD唯一来源，启动成功后添加前处理垃圾渗滤液(PLL)作为混合碳源；利用KNO₃作为唯一氮源；以KH₂PO₄配制磷酸盐质量浓度；以MgSO₄和CaCl₂满足反硝化菌对Mg²⁺和Ca²⁺的需求；并添加一定量的微量元素。

KNO₃、KH₂PO₄、以及MgSO₄和CaCl₂各自的浓度选择如下表所示：

驯化启动阶段用无水乙酸钠为COD唯一来源培养，控制进水碳氮比(COD：NO₃ ^-，下称C/N)为5.0，硝态氮浓度根据驯化程度采取阶梯式上升的方式在50mg·L^-1～500mg·L^-1内逐渐增加。

其中，PLL添加体积分数为10％。

微量元素添加量为1mL·L^-1。其中，1L微量元素溶液中含有10.00g EDTA、1.50gFeCl₃·6H₂O、0.03g CuSO₄·5H₂O、0.12g ZnSO₄·7H₂O、0.15g CoCl₂·6H₂O、0.12g MnCl₂·4H₂O、0.06g Na₂MoO₄·2H₂O、0.18g KI、0.15g H₃BO₃。

驯化过程控制DO≤0.4mg·L^-1，保持缺氧状态；进水pH控制在7.5±0.1；水温为室温，即21.5～25.6℃。

驯化前后活性污泥中菌的种类如下表，从表中可以看出，反硝化菌的相对丰度有明显的提高：

实施例2

采用实施例1驯化培养的反硝化菌，进行反硝化处理，可以分为3个阶段，即驯化阶段、反硝化速率对比阶段、最佳投加比例研究阶段。

实验装置由2个相同的有机玻璃材质柱形SBR(R0和R1)组成，有效柱高为65cm，内径为10cm，有效容积10L，在反应器底部设有排泥口，直径为10mm。反应器侧面15、25、35、45、55cm处分别设有取样口，反应器顶部设置搅拌器，使泥水保持混合状态，反应器进水方式为上进下出，反应装置如图1所示。

微生物驯化完成后，R0作为对照组按原驯化方式运行，而R1反应器则以无水乙酸钠+PLL为碳源进行培养，此时PLL添加体积分数为10％，提供足量电子供体排除碳源不足的影响，从而对2种不同碳源的反硝化速率进行比较。

为了探究前处理垃圾渗滤液的最佳掺入比例，设置C/N分别为2.5、3.2、4.5、4.9、5.6、6.1的批次实验，每批6组反应器(在六连搅拌器内进行)中，前处理垃圾渗滤液的投加体积分数分别为0％、5％、10％、15％、20％、25％，无水乙酸钠的添加量则依次减少。

测定每组每批次的反硝化速率和COD去除率，重复3个周期；批次实验活性污泥均取自R1反应器，接种300mL纯水洗涤3次后的污泥，最终体积为1.0L。

其中，垃圾滤液的组成：

以及具体参数下的处理结果，如C/N分别为2.5、3.2、4.5、4.9、5.6、6.1；前处理垃圾渗滤液的投加体积分数分别为0％、5％、10％、15％、20％、25％等的处理结果如下：

(1)COD去除率/％

(2)反硝化速率(mg·(g·h)^-1)

结果显示R1反应器内硝态氮可在2.5h内几乎完全去除，硝态氮去除率提高至98.3％±1％反硝化速率高达58.05mg·(g·h)^-1,为未加PLL的1.79倍。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种反硝化菌驯化培养方法，其特征在于，包括：驯化启动阶段用无水乙酸钠为COD唯一来源，启动成功后添加前处理垃圾渗滤液(PLL)作为混合碳源；利用KNO₃作为唯一氮源；以KH₂PO₄配制磷酸盐质量浓度；以MgSO₄和CaCl₂满足反硝化菌对Mg²⁺和Ca²⁺的需求；并添加一定量的微量元素。

2.根据权利要求1所述的一种反硝化菌驯化培养方法，其特征在于，驯化启动阶段用无水乙酸钠为COD唯一来源培养，控制进水碳氮比(COD：NO₃ ^-，下称C/N)为5.0，硝态氮浓度根据驯化程度采取阶梯式上升的方式在50mg·L^-1～500mg·L^-1内逐渐增加。

3.根据权利要求1所述的一种反硝化菌驯化培养方法，其特征在于，优选PLL添加体积分数为10％。

4.根据权利要求1所述的一种反硝化菌驯化培养方法，其特征在于，KNO₃、KH₂PO₄、以及MgSO₄和CaCl₂各自的浓度选择如下表所示：

5.根据权利要求1所述的一种反硝化菌驯化培养方法，其特征在于，微量元素添加量为1mL·L^-1，其中，1L微量元素溶液中含有10.00g EDTA、1.50g FeCl₃·6H₂O、0.03g CuSO₄·5H₂O、0.12g ZnSO₄·7H₂O、0.15g CoCl₂·6H₂O、0.12g MnCl₂·4H₂O、0.06g Na₂MoO₄·2H₂O、0.18g KI、0.15g H₃BO₃。

6.根据权利要求1所述的一种反硝化菌驯化培养方法，其特征在于，驯化过程控制DO≤0.4mg·L^-1，保持缺氧状态；进水pH控制在7.5±0.1；水温为室温，即21.5～25.6℃。

7.一种硝态氮处理方法，其特征在于，采用前述权利要求1-6任一权利要求所述驯化培养方法获得的反硝化菌，能快速、高效处理高浓度硝态氮。

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