JPS6027511B2 - 無機ピロリン酸塩による細菌生育刺激 - Google Patents
無機ピロリン酸塩による細菌生育刺激Info
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- JPS6027511B2 JPS6027511B2 JP58501076A JP50107683A JPS6027511B2 JP S6027511 B2 JPS6027511 B2 JP S6027511B2 JP 58501076 A JP58501076 A JP 58501076A JP 50107683 A JP50107683 A JP 50107683A JP S6027511 B2 JPS6027511 B2 JP S6027511B2
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Description
【発明の詳細な説明】
技術分野
この発明は、エネルギー源として無機ピロリン酸塩を利
用する微生物の生育に関するものである。
用する微生物の生育に関するものである。
この発明は、多くの種の微生物、特に、重要な商業的お
よび工業的プロセスにおいて使用される微生物の生育が
遅いという問題を克服するものである。背景技術 無機ピロリン酸塩（ＰＰｉ）はアデノンシン三リン酸（
ＡＴＰ）の進化前駆体として提案されている（Ｆ．Ｌｉ
ｐｍａ血，Ｔｈｅ仇ｉｇｎｓｏｆＰｒｅｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌＳ＄ｔｅｍｓ，ｐｐ．２６１一２７１Ｍｉｒ．，
Ｍｏｓｃｏｗ，１９６９）。
よび工業的プロセスにおいて使用される微生物の生育が
遅いという問題を克服するものである。背景技術 無機ピロリン酸塩（ＰＰｉ）はアデノンシン三リン酸（
ＡＴＰ）の進化前駆体として提案されている（Ｆ．Ｌｉ
ｐｍａ血，Ｔｈｅ仇ｉｇｎｓｏｆＰｒｅｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌＳ＄ｔｅｍｓ，ｐｐ．２６１一２７１Ｍｉｒ．，
Ｍｏｓｃｏｗ，１９６９）。
さらに最近になってこの化合物は多数のエネルギー生成
反応に関与していることが証明された（Ｒ．Ｅ．Ｒｅｅ
ｖｅｓ．ＴＢＳＩ：５３，１９７６；日．Ｇ．Ｗｏｏｄ
，Ｗ．Ｅ．０’Ｂｒｉｅｎ，Ｇ．Ｍｉｃｈａｅｌｓ，Ａ
ｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，４５；８５，１９７７：Ｋ．
Ｓ．Ｌａｍ，Ｃ．Ｂ．Ｋａｓｐｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｊ．，７７：１９２７，１９８０：
Ｎ．Ｗ．Ｃａｒｎａｌ，Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋ，Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｏｎ．，８
６２０，１９７９；Ｄ．Ｃ．Ｓａｂ虹ａｒｓｅおよびＲ
．Ｌ．Ａｈｄｅｒｓｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１００：１４２３１斑
１）。米国特許第３９６０６６４号および米国特許第３
０１０８７６号は無機ピロリン酸塩を生育塔地の重要で
ない成分として開示している。しかし米国特許第３９６
０６６４号および米国特許第３０１雌７６号は無機ピロ
リン酸塩をエネルギー源として利用することに言及して
いない。発明の開示 硫酸塩還元細菌の二つの属すなわちデスルホビブリオ（
Ｄｅｓ山ｆｏｖｉｂｒｉｏ）およびデスルホトマクラム
（Ｄｅｓ山ｆｏ−ｔｏｍａｃｕｌｍｍ）による呼吸的硫
酸塩還元の生物エネルギー論は基本的に異なっている（
Ｃ．Ｌ．Ｌｉｕ，日．Ｄ．Ｐｅｃｋ，Ｊて．，Ｊ．Ｂａ
ｃにｒｉｏｌ．，１４５：９６６，１９８１）。
反応に関与していることが証明された（Ｒ．Ｅ．Ｒｅｅ
ｖｅｓ．ＴＢＳＩ：５３，１９７６；日．Ｇ．Ｗｏｏｄ
，Ｗ．Ｅ．０’Ｂｒｉｅｎ，Ｇ．Ｍｉｃｈａｅｌｓ，Ａ
ｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，４５；８５，１９７７：Ｋ．
Ｓ．Ｌａｍ，Ｃ．Ｂ．Ｋａｓｐｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｊ．，７７：１９２７，１９８０：
Ｎ．Ｗ．Ｃａｒｎａｌ，Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋ，Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｏｎ．，８
６２０，１９７９；Ｄ．Ｃ．Ｓａｂ虹ａｒｓｅおよびＲ
．Ｌ．Ａｈｄｅｒｓｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１００：１４２３１斑
１）。米国特許第３９６０６６４号および米国特許第３
０１０８７６号は無機ピロリン酸塩を生育塔地の重要で
ない成分として開示している。しかし米国特許第３９６
０６６４号および米国特許第３０１雌７６号は無機ピロ
リン酸塩をエネルギー源として利用することに言及して
いない。発明の開示 硫酸塩還元細菌の二つの属すなわちデスルホビブリオ（
Ｄｅｓ山ｆｏｖｉｂｒｉｏ）およびデスルホトマクラム
（Ｄｅｓ山ｆｏ−ｔｏｍａｃｕｌｍｍ）による呼吸的硫
酸塩還元の生物エネルギー論は基本的に異なっている（
Ｃ．Ｌ．Ｌｉｕ，日．Ｄ．Ｐｅｃｋ，Ｊて．，Ｊ．Ｂａ
ｃにｒｉｏｌ．，１４５：９６６，１９８１）。
デスルホビブリオの場合には、呼吸的硫酸塩還元の第一
酵素反応段階において酵素アデノシントリホスフェート
スルフリラーゼ（式１）によってアデノシン三リン酸（
ＡＴＰ）から生産される無機ピロリン酸塩（ＰＰｉ）は
、無機ピロホスフアターゼ（式２）によってオルトリン
酸塩（Ｐｉ）に加水分解される。
酵素反応段階において酵素アデノシントリホスフェート
スルフリラーゼ（式１）によってアデノシン三リン酸（
ＡＴＰ）から生産される無機ピロリン酸塩（ＰＰｉ）は
、無機ピロホスフアターゼ（式２）によってオルトリン
酸塩（Ｐｉ）に加水分解される。
式Ｉ ＡＴＰ＋ＳＯＺ２→ＡＴＰ＋ＰＰｉ式２ ＰＰｊ
＋日２０→がｉ このように、無機ピロリン酸塩（ＰＦｉ）の無水物の結
合の化学エネルギーは保存されない。
＋日２０→がｉ このように、無機ピロリン酸塩（ＰＦｉ）の無水物の結
合の化学エネルギーは保存されない。
乳酸塩−硫酸塩培地上における生育の際にアデノシン三
リン酸（ＡＴＰ）の正味収量を得るために、デスルホビ
プリオ属はこの生育モードにおいて電子移動で連結され
たリン酸化を行なっている。これとは対照的に、デスル
ホトマクラム属は酵素すなわち無機ピロホスフェートア
セテードホスホトランスフェラーゼ（式３）によってア
デノシントリホスフェート（ＡＴＰ）スルフリラーゼ（
式１）により生成するピロリン酸塩の結合エネルギーを
保存することができる（Ｒ．Ｅ．Ｒｅｅｖｅｓ．Ｊ．Ｂ
．Ｇｕｔｈｅｒｉｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ
．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ−ｍｕｎ．，６■：１巡９ １９７５
）。式３ 酢酸塩＋ＰＰｉ→アセチルホスフェート十Ｐ
ｉアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）はアセテートキナーゼ
（式４）によってアセチルホスフェートとアデノシンジ
ホスフエート（ＡＤＰ）からつくることができる。
リン酸（ＡＴＰ）の正味収量を得るために、デスルホビ
プリオ属はこの生育モードにおいて電子移動で連結され
たリン酸化を行なっている。これとは対照的に、デスル
ホトマクラム属は酵素すなわち無機ピロホスフェートア
セテードホスホトランスフェラーゼ（式３）によってア
デノシントリホスフェート（ＡＴＰ）スルフリラーゼ（
式１）により生成するピロリン酸塩の結合エネルギーを
保存することができる（Ｒ．Ｅ．Ｒｅｅｖｅｓ．Ｊ．Ｂ
．Ｇｕｔｈｅｒｉｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ
．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ−ｍｕｎ．，６■：１巡９ １９７５
）。式３ 酢酸塩＋ＰＰｉ→アセチルホスフェート十Ｐ
ｉアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）はアセテートキナーゼ
（式４）によってアセチルホスフェートとアデノシンジ
ホスフエート（ＡＤＰ）からつくることができる。
式４ ＡＤＰ＋アセチルホスフェート
→酢酸塩＋ＡＴＰ
これらの２つの酵素反応によってデスルホトマクラム属
は、乳酸塩−硫酸塩培地上の乳酸塩により生育する際に
硫化物に還元された硫酸塩当たり１個の高エネルギーリ
ン酸塩を基質レベルリン酸化によって生成することがで
きる。
は、乳酸塩−硫酸塩培地上の乳酸塩により生育する際に
硫化物に還元された硫酸塩当たり１個の高エネルギーリ
ン酸塩を基質レベルリン酸化によって生成することがで
きる。
デスルホトマクラム属は、乳酸塩と硫酸塩による生育の
際に電子移動により連結されたリン酸化を行なう必要が
ない。微生物の生育のためのエネルギー源として無機ピ
ロリン酸塩を利用することは全く新しい知見であり、嫌
気性細菌およびある種の好気性微生物のエネルギー代謝
に関するユニークな概念である。
際に電子移動により連結されたリン酸化を行なう必要が
ない。微生物の生育のためのエネルギー源として無機ピ
ロリン酸塩を利用することは全く新しい知見であり、嫌
気性細菌およびある種の好気性微生物のエネルギー代謝
に関するユニークな概念である。
これは基礎生物学，微生物生態学および応用微生物学に
とって多くの重要な結果を有すると思われる。デスルホ
トマクラム属に属する硫酸塩還元菌において、エネルギ
ー源として無機ピロリン酸塩を利用することは、全体と
して、ただ一種の特定の酵素すなわちピロホスフェート
アセテートホスホトランスフェラーゼに加えていたると
ころに存在するアセテートキナーゼを必要とする生物学
分野において最も簡単なアデノシン三リン酸産性システ
ムを示している。微生物生態学の見地から、無機ピロリ
ン酸塩の利用が広く起こることは無機ピロリン酸塩が新
しいタイプのエネルギー移動系として機能していること
を示唆するものである。
とって多くの重要な結果を有すると思われる。デスルホ
トマクラム属に属する硫酸塩還元菌において、エネルギ
ー源として無機ピロリン酸塩を利用することは、全体と
して、ただ一種の特定の酵素すなわちピロホスフェート
アセテートホスホトランスフェラーゼに加えていたると
ころに存在するアセテートキナーゼを必要とする生物学
分野において最も簡単なアデノシン三リン酸産性システ
ムを示している。微生物生態学の見地から、無機ピロリ
ン酸塩の利用が広く起こることは無機ピロリン酸塩が新
しいタイプのエネルギー移動系として機能していること
を示唆するものである。
無機ピロリン酸塩がリンサィクルの重要な一部を成して
いることの論証は、塩水沼地および沈降物、淡水沼地お
よび沈降物、嫌気性スラツジ消化菌およびルーメンのよ
うな異なる生態系における微生物およびそれらの関係に
ついての理解に大きな寄与を示すことになろう。無機ピ
ロリン酸塩による微生物の生育の刺激は応用微生物学に
おいて多数の潜在的な応用を有するものであり、無機ピ
ロリン酸塩は普通のしかも安価な化学物質である。本発
明は、無機ピロリン酸塩をエネルギー源として利用する
微生物の生育方法である。
いることの論証は、塩水沼地および沈降物、淡水沼地お
よび沈降物、嫌気性スラツジ消化菌およびルーメンのよ
うな異なる生態系における微生物およびそれらの関係に
ついての理解に大きな寄与を示すことになろう。無機ピ
ロリン酸塩による微生物の生育の刺激は応用微生物学に
おいて多数の潜在的な応用を有するものであり、無機ピ
ロリン酸塩は普通のしかも安価な化学物質である。本発
明は、無機ピロリン酸塩をエネルギー源として利用する
微生物の生育方法である。
本発明の目的は、固定炭素細胞物質の生合成に必要であ
るがエネルギー源としては利用されない有機物分子の存
在下に生育のためのアデノシンニリン酸源として無機ピ
ロリン酸塩を利用する方法を提供することである。
るがエネルギー源としては利用されない有機物分子の存
在下に生育のためのアデノシンニリン酸源として無機ピ
ロリン酸塩を利用する方法を提供することである。
この発明のこれらの目的およびその他の目的、特徴およ
び効果は、後述の説明および請求の範囲を考慮すること
により明らかになろう。
び効果は、後述の説明および請求の範囲を考慮すること
により明らかになろう。
低品位硫化鉄鉱のリーチング、石炭の脱硫、バイオマス
のエタノールへの転換およびバイオマスのメタンへの転
換のような商業的および工業的用途に使用される微生物
の生育速度を刺激するためにエネルギー源として無機ピ
ロリン酸塩を使用する方法を提供することもこの発明の
目的である。
のエタノールへの転換およびバイオマスのメタンへの転
換のような商業的および工業的用途に使用される微生物
の生育速度を刺激するためにエネルギー源として無機ピ
ロリン酸塩を使用する方法を提供することもこの発明の
目的である。
第１図はデスルホトマクラム・ルミニス
（Ｄｅｓ山ｆｏｔｏｍａ−ｃｕｌｍｍｍｍｉｎｉｓ）の
生育に対する無機ピロリン酸塩濃度の効果を示すもので
ある。 生育条件は以下に示す実施例Ｄと同じであり、基本培地
と種々の濃度の無機ピロリン酸塩を使用している。第２
図は以下の実施例Ｗに示すような塩化ナトリウム２．５
％を加えた基本培地を用いて無機ピロリン酸塩（ＰＰｉ
）を富化した海底の泥の中で生育する微生物の２枚の顕
微鏡写真を示している。発明を実施するための態様 無機ピロリン酸塩．酢酸塩．酵母エキス．硫酸塩および
塩類を含む培地でデスルホトマクラム．ニグリフイカ
ン ス（Ｄｅ測地ｏｍａｃｕｌ側ｎｉｇｒｉｆｉｃａｎ
ｓ）、デスルホトマクラム・ルミニス（Ｄｅｓ山ｆｏｔ
ｏｍａｃｕｌｍｍｍｍｉｎｉｓ）およびデスルホトマク
ラム・オリエンチス（Ｄｅｓのｆｏｔｏｍａｃｕｌｍｍ
ｏｎｅ−ｎｔｉｓ）を生育させた。 硫酸塩還元菌デスルホトマクラム属の微生物の場合には
、生育のプロセスにおいてエネルギー源として無機ピロ
リン酸塩を利用するとただ一種の特定の酵素すなわちピ
ロホスフエートアセテートホスホトランスフエラーゼを
必要とする。汎存酵素アセテートキナーゼも必要とされ
る。アデ／シン三リン酸がこの系においてつくられる。
また海水沼地（ａ ｍａｎｎｅｓｐａｍＭｍａｒｓｈ）
および淡水沼地から得られた粗増菌培養物も同様にエネ
ルギー源として無機ピロリン酸塩を用いて生育させた。
後述の実施例１は無機ピロリン酸塩によるデスルホトマ
クラム・ニグリフィカンスの嫌気性生育条件を説明して
いる。 下記の第１表は種々の培地における生育を比較したもの
である。酢酸塩，酵母エキス，硫酸塩および塩類を含む
基本塔地はこの微生物の生育を持続させない。この基本
培地に無機ピロリン酸塩を加えると、生育は乳酸塩プラ
ス硫酸塩での通常の生育条件におけるよりも良好になっ
た。この基本塔地においては、無機ピロリン酸塩はデス
ルホビブリオ・ブルガリス（Ｄｅｓのｆｏｖｉｂｒｊｏ
ｖ山ｇａｒｉｓ）の生育を刺激しない。 添加した無機ピロリン酸塩と均等物であるオルトリン酸
塩は、デスルホトマクラム・ニグリフイカンス，デスル
ホトマクラム・ルミニスおよびデスルホトマクラム・オ
リェンチスの生育を維持しなし・。無機ピロリン酸塩培
地においてデスルホトマクラム・ニグリフィカンスの生
育を最適にするためには、酢酸塩、酵母エキスおよび硫
酸塩が必要であった。酢酸塩および酵母エキスは固定炭
素源であり、硫酸塩はこれらの微生物にこの基本培地の
固定炭素源の酸化レベルを調節するためのエレクトロン
シンクを与える。硫酸塩の濃度は通常の乳酸塩−硫酸塩
培地に使用されるもののわずかに１／１０であったが、
酢酸塩に対する要求は予想外に高く、濃度が０．２％よ
り低いと殆んど生育しなかった。この酢酸塩に対する高
い要求の生理学的な根拠は、デスルホトマクラム・ニグ
リフィカンス中に酢酸塩が浸透するという生物エネルギ
ー論と関連をもつかもしれない。無機ピロリン酸塩が生
育に及ぼす刺激効果は、酢酸塩の消失対硫化物の生成の
比が３：１４であり予想される比１：１よりかなり大き
いことから、無機ピロリン酸塩による嫌気的酢酸塩酸化
の促進によるものとは思われない。同様の生育応答がデ
スルホトマクラム・ルミニスおよびデスルホトマクラム
・オリェンチスについても見出された。従って、無機ピ
ロリン酸塩はこれらの嫌気性硫酸塩還元微生物の生育の
ためのエネルギー源として働いたものである。第１表
エネルギー源として無機ピロリン酸塩（ＰＰｉ）を利用
するデスルホトマクラム生育の要求性 言宅 ＊５８仇皿で測定：アルゴン中５５ｑ０で４劉時
間培養後の２個のフラスコの平均値。 第１図に示した後述の実施例Ｄのデータは、無機ピロリ
ン酸塩の増加に対するデスルホトマクラム・ルミニスの
生育応答を説明している。 生育応答は０．０４％まで無機ピロリン酸塩濃度に比例
しており、また生育は無機ピロリン酸塩の加水分解を伴
うものであった。生育しない場合には、添加した無機ピ
ロリン酸塩の加水分解は殆んどなかった。０．０５％以
上では無機ピロリン酸塩による生育は阻害された。 これは無機ピロリン酸塩の加水分解によって堵地がアル
カリ性化（ｐＨ８．５）したためであるかも知れない。
同じような結果がデスルホトマクラム・ニグリフイカン
スとデスルホトマクラム・オリェンチスについても得ら
れた。乳酸塩−硫酸塩培地地で生育したデスルホトマク
ラム・オリヱンチスの細胞の酵素総合有量を、基本培地
プラス無機ピロリン酸塩で生育した細胞のそれと比較し
た。生育塔地は後述の実施例ｍｌこ示す。無機ピロリン
酸塩と乳酸塩−硫酸塩で生育したデスルホトマクラム・
オリェンチスの細胞に見出された各種酵素の特異的な活
性を以下の第２表に示す。呼吸的硫酸塩還元のレダクタ
ーゼ類、ＡＰＳレダクターゼ、チオスルフエートレダク
ターゼ、ビスルフアイトレダクターゼおよびアデノシン
トリホスフエートスルフリラーゼはそれぞれの細胞調製
物中でほぼ同じレベルの活性をもっていた。フマレート
レダクターゼは無機リン酸塩で生育した細胞および乳酸
塩−硫酸塩で生育した細胞のいずれにも存在しなかった
。ナイトライトレダクターゼ、ホルメートデヒドロゲナ
ーゼ、無機ピロホスフエートアセテートキナーゼ、ピロ
ホスフアターゼおよびピルベートデヒドロゲナーゼは同
様の比活性濃度で存在していた。無機ピロリン酸塩で生
育した細胞中のヒドロゲナーゼが有意に高い理由は検定
方法の難しさによるものかも知れない。これらの酵素の
特異な存在は、デスルホトマクラム・ニグリフイカンス
とデスルホトマクラム・ルミニスについても確認された
。これは無機ピロリン酸塩で生育した細胞がその代謝パ
ターンに基本的な変化を示さないことを示している。酵
素活性は次の標準的な検定方法により測定した（０ｄｏ
‐ｍ，Ｊ．Ｍ．およびＰｅｃｋ，日．Ｄ．Ｊｒ．，Ｊ．
Ｂａｃｔｅｒｉ‐ｏｌ．１４７：１６１‐ １６９，１
９８１．Ｅｍのｍｅａｓｓａが．）。ペンジルビオロゲ
ン‐またはメチルビオロゲン−結合したナイトライト，
スルフアィト，フマレートおよびチオスルフエートレダ
クターゼ類およびヒドロゲナーゼはすべて検圧法により
検定した。反応混合物は総量１．０の‘中に、リン酸塩
１０仇Ｍ（ＰＨ７．４）、ベンジルビオロゲンまたはメ
チルビオロゲン５．山ｈＭ、および亜硫酸塩、フマル酸
塩またはチオ硫酸塩２０．皿Ｍ、または亜硝酸塩５．仇
Ｍを含んでいた。デスルホビブリオ・ブリガリス由来の
部分的に精製したヒドロゲナーゼ（第ＩＤＥＡＥカラム
通過）（ｖａｎｄｅｒＷｅｓ‐にｎ，日．，Ｓ．Ｇ．Ｎ
損ｙｈｅｗ．およびＣ．Ｖｅｅ舞ｒ，ＦＥＢＳ比ｔｔ．
８６：１２２‐１２０１９７８）をヒドロゲナーゼ検定
を除くすべての検圧法ビオロゲン結合した検定試料中に
加えた。ビルベート‐ＢＶ２十およびホルメート‐ＢＶ
２十レダクターゼ類をべックマンモデル２筋ご光光度計
により５４５ｎｍで分光測定した。ホルメート‐ＢＶ２
十反応用の反応混合物はＢＶ２十５．仇ｈＭ、ジチオス
レイトール１０．仇ｈＭ、ｌｊソ酸カリウム緩衝液（Ｐ
Ｈ７．４）ｌｏ肌Ｍ、およびギ酸ナトリウム２仇ｈＭを
含んでおり、またピルベート‐ＢＶ２十反応用の反応混
合物はＢＶ２十５．仇ｈＭ、還元型補酵素Ａ２．血Ｍ、
リン酸カリウム緩衝液（ＦＨ７．４）１０瓜ｈＭ、およ
びピルビン酸ナトリウム２０．仇ｈＭを含んでいた。い
ずれの検定もツンベルク・コベツト（Ｔｈ血にｒｇｃｏ
ｖｅｔｔｅｓ）中アルゴン雰囲気下で行なった。スクシ
ネート‐フェリシアナィドレダクターゼとＡＰＳレダク
ターゼの検定は、ＡＰＳレダクターゼ反応についてはア
デノシンーリン酸４０．仇Ｍ、亜硫酸塩３０．仇ｈＭ、
フェリシアナィド１．仇ｈＭ、リン酸カリウム１０仇ｈ
Ｍ、ＰＨ７．４を用い（Ｂｒａｍｌｅｔｔ，Ｒ．および
日．Ｄ．Ｐｅｃｋ，Ｊｒ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２５０：２９７９‐２９８６，１９７５）、スクシネー
ト‐フェリシアナイドレダクターゼ反応についてはコハ
ク酸カリウム２０．仇ｈＭ、フェリシアナィド肌ｈＭ、
リン酸カリウム１０位ｈＭ、ｐＨ７．４を用い、空気中
分光光度計により４２血ｍにおいて行なった。Ｃ型チト
クロームの分析は５３８〜５５１ｎｍ（４０）における
示差分光分析法によって行なった。膜画分および全細胞
については、０２‐酸化されたおよびジチオネート‐還
元された膜の示差スペクトルをＡｍｉｍｏＤＷ−２分光
光度計により１側の光路で液体窒素の温度において測定
した。液体窒素温度における見掛上の吸光係数の変化は
、室温における既知量のチトクロームＣ３の示差スペク
トル（Ｍｒ＝１３０００）を測定することによって考慮
した（Ｓｈｉｐｐ．Ｗ．Ｓ．，ふＣｈ．ＢｊｏＣｈｅｍ
．Ｂｉｏｐｈ＄．１５０：４５９‐４７２，１９７２）
。チトクロームｂはそのピリジンヘモクロモゲンの吸収
スペクトルの差によって測定した。フラピンアデニンジ
ヌクレオチドおよびフラビンモ／ヌクレオチドは酸性お
よび中性ｐＨにおける総光によって測定した（Ｓｉｅ滋
１，Ｌ．Ｍ．，Ｍｅ比ｏｄｓＥｎＺｙｍｏｌ．５の：４
１９‐４２９，１９７９）。メナキノンはクローガーの
方法により測定した（Ｋｒｏ鞍ｒ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄ
ｓＥｎｚｙｍｏｌ．５如：５７９‐５９１，１９７９）
。非へム鉄はｏ‐フェナントロリンによる色素生成を測
定することにより検定した（氏ｉｎｅ比．日．，Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０：３２５‐３３４．１９６７
）。蛋白質はビューレツト法によって測定した（Ｇｏｍ
ａｌｌ，Ａ．Ｇ．，○．Ｊ．＆ｒ舷ｗｉｌｌ．およびＭ
．Ｍ．Ｄａｖｉｄ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１７７：
７５１‐ ７６６，１９４９）。Ｌｉｕ，Ｃｈｉ‐Ｌｉ
およびＰｅｃｋ，日．○．Ｊｒ．，Ｊ．斑ｃｔｅｒｉｏ
ｌ．１４５：４６６‐６７３，１職１．Ａｓｓａ＄．）
。アデノシントリホスフエートスルフリラーゼはウイル
ソンとバンドルスキーにより記載されているＭｏｏ葦−
を用いて測定した（Ｗｉｌｓｏｎ．Ｌ．Ｇ．およびＲ．
Ｓ．Ｂａｎｄｍｓｋｉ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３
３：９７５‐９８１，１９５８）。無機ピ。ホスフアタ
ーゼはアカギとキャ＊ンプベルの方法により測定した（
Ａｋａｇｉ，Ｊ．Ｍ．およびＬ．Ｌ．Ｃａｍｐｂｅｌｌ
，Ｊ．Ｂａｃ‐ｔｅｒｉｏｌ．８４：１１９４‐１２０
１．１９６２）。無機ピロホスフアターゼアセテートホ
スホトランスフエラーゼはリーブスとグスリーの条件を
用いることにより検定した（Ｒｅｅｖｅｓ，Ｒ．Ｅ．お
よびＪ．Ｂ．Ｇｕｔｈｒｊｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ
ｐｈ侭．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ側．６６：１３８９‐１３９
５，１９７５）。ただし、酢酸塩とピロリン酸塩から生
成されるアセチルリン酸（Ｌｉｐｍａｎｎ，Ｆ．および
Ｌ．Ｃ．Ｔｕｔｔｌｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１５
９：２１‐２８，１９４５）を測定した。硫化物はシー
ゲルの方法により測定した（Ｓｉｅｇｅｌ．ＬＭ．，Ａ
Ｍ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１：１２６‐３２，１９６５
）。蛋白質はピューレツト法により測定した（Ｌｅｖｉ
ｎ，Ｒ．およびＲ．Ｗ．Ｂｒａ雌ｒ，Ｊ，Ｌａｂ，ＣＩ
ｉｎ，Ｍｅｄ，３８：４７４．４７９，１９５１）。乳
酸塩および酢酸塩は水素炎イオン化デテクターを取付け
たＶａｒｉａｎＡｅｒｏ‐ｇａｐｈ２７００ガスクロマ
トグラフにより測定した。第２表：（正６本培地）＋し
無機ピロリン酸塩〔ＰＰｉ〕）および乳酸塩イ流雌雄塩
塔地で生育したデスルホトマクラム・オリェンチスの抽
出物中の蟹費蓑耐性生育のためのエネルギー源として無
機ピロリン酸塩を利用するものがデスルホトマクラム属
に限定されると信じる演縄的な理由はない。 〔基本培地〕十〔無機ピロリン酸塩〕培地でその他の属
の微生物の生育を微生物の増菌培養物を用いて試験した
。具体的に説明すると、塩水沼地（ａｓａＩＷａｔｅｒ
ｓｐａｒｔｉＭｍａ岱ｈ）かち得られた泥試料から採取
した微生物を使用し、塩化ナトリウムを添加した基本培
地に無機ピロリン酸塩を加えまたは加えずに接種し、後
述の実施例Ｗに示すような嫌気性条件において培養した
。３７０２４時間以内に無機ピロリン酸塩を含む微生物
培地は大量の微生物の生育を示した。 この増菌した微生物の顕微鏡写真を撮った。これらの増
菌培養物の顕微鏡写真は驚くほど多数の予期せぬ数の形
態の微生物類を含んでいた。後述の実施例Ｖに示すよう
に、同じ塔地から塩化ナトリウムを除いた培地を用いて
淡水環境から得られた無機ピロリン酸塩富化生育塔溶物
についても同じような結果が得られた。細胞の種類の多
様性は、無機ピロリン酸塩をエネルギー源として利用す
るものが胞子形成棒状体によって特徴付けられるデスル
ホトマクラム属に制限されないことを示している。これ
らの増菌培養物からのいくつかの初期単離物は硫酸塩還
元微生物ではなく、生育のために酢酸塩または硫酸塩を
必要としなかった。デスルホトマクラム属、メタノバク
テリウム（Ｍｅｔｈａｎｏ‐ｂａｃにｒｉｕｍ）属およ
びメタノサルシナ（Ｍｅ山ａｎｏｓａｒｃｉＭ）属は、
バイオマスおよび有機廃棄物を始めとするセルロースを
メタンおよび二酸化炭素に転換する微生物群に直接に含
まれている。デスルホトマクラム属は乳酸塩、脂肪酸類
およびアルコール類などの発酵生成物を酢酸、二酸化炭
素および水素に変換し、メタノバクテリゥム属は二酸化
炭素及び水素をメタンに変換し、メタノサルシナ属は酢
酸塩をメタンおよび二酸化炭素に変換する。上記の如く
発酵生成物を変換し酢酸塩または水素とＣ０２からメタ
ンを製造することはこの重要な生物学的プロセスにおけ
るステップを制限しており、これらの細菌を特徴づける
生育すなわち生理学的プロセスは後述の実施例Ｗに示す
ように無機ピロリン酸塩によって刺激される。淡水の沼
地から得られた粗セルロース富化物を用いて無機ピロリ
ン酸塩によるメタン生成の刺激が後述の実施例皿に示す
ように立証された。メタノサルシナ・バーケリイ（Ｍｅ
ｔｈａ側ｓａｒｃｉ岬ｂａｒｋｅｒ‐ ｉ）は後述の実
施例肌で示すように無機ピロリン酸塩の存在下に酢酸塩
から遠い速度でメタンを直接に生成することがわかつた
。 好熱性発酵嫌気性菌であるサーモアナェロバクタ−・ェ
タ／リカス（Ｔｈｅ肌ｏａＭｅｒｏ鼠ｃｔｅｒｅ仇ａｎ
ｏｌｉｃ瓜）が無機ピロリン酸塩で生育するということ
は予想されなかったが、このような種類の嫌気性菌が無
機ピロリン酸塩を代謝することができるという事実は無
機ピロリン酸塩を用いて発酵生成物のパターンを変化さ
せる方法を示唆している。 サーモアナエロバクター・エタノリカスはグルコース１
．０モルからエタノール１．８モル、酢酸塩０．１モル
、乳酸塩１．０モル、を生成するので、酢酸塩と乳酸塩
の蓄積によってサーモアナェロバクタ一・ヱタノリカス
を使用してエタノールを連続生産することは制限される
。無機ピロリン酸塩を添加すると酢酸塩と乳酸塩の生成
が排除され少なくなりあるいは完全になくなるので、後
述の実施例Ｋに示すようにサーモアナェロバクタ一・ェ
タノリカスによるエタノールの連続生産が容易になる。
・チオバチルス（Ｔｈｉｏｂａｃｍ船
）属は低品位硫化鉄鉱のリーチングに商業的に用いられ
ている微生物である。 このリーチングは主としてこれらの微生物の生育速度の
ためにゆっくりしたプロセスである。無機ピロリン酸塩
を添加すると後述の実施例Ｘ‘こ示すように、これらの
微生物の初期生育速度が増大し、リーチングプロセスが
促進される。滞留時間が少なくなるためにこのプロセス
に使用されている現存設備の能力が増大する。無機ピロ
リン酸塩を加えたチオバチルス属による微生物リーチン
グの第二の特徴は、これらの微生物の初期生育速度を増
大させることによって脱硫プロセスを加速し、これによ
ってプロセスに必要な菌体量を増加させるということで
ある。 石灰スラリーの滞留時間が少なくなることによりこのプ
ロセスは経済的に実施することができる。多数の酵素、
ファインバイオケミカルズおよび医薬の工業的生産のた
めに微生物学的プロセスが利用されている。製造培地に
無機ピロリン酸塩を添加するとこれらの生成物の収量お
よび微生物が増加する。例えばメタノサルシナ・バーケ
リィによるビタミン耳２の収率は後述の実施例ＸＯに示
すように無機ピロリン酸塩を添加することによって増大
する。またクロストリジウム・サーモセラム（ＣＩｏｓ
ｔｒｉ‐ｄｉｕｍｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）によって
生産されるセルラーゼの量は後述の実施例×ｍに示すよ
うに無機ピロリン酸塩を添加することによって増大する
。無機ピロホスフェートアセテートホスホトランスフヱ
ラーゼは基質からＡＴＰを生産するための最も簡単な生
物学的システムを示している。 ある微生物から他の微生物にデオキシリボ核酸（ＤＮＡ
）を移す従来の方法、すなわち米国特許第４２３７２２
４号（コーェンおよびボィャーによる生物学的機能を有
する分子キメラを製造する方法はこの技術分野において
知られている方法である。 微生物中で外来遺伝子を複製し発現させる方法および組
成物が提供される。プラスミドまたはウイルスのデオキ
シリボ核酸を開裂して所望の表現特性をもつ生物学的機
能をもつレプリコンをつくる。このレプリコンを形質転
換によって微生物細胞中に挿入する。形質転換体を単離
すると、改変プラスミド中に存在するデオキシリボ核酸
分子を複製し発現する細胞が得られる。この方法は遺伝
能力を微生物中に導入して、医学的にまたは商業的に有
用な酵素のような蛋白質および核酸を製造する便利で効
率のよい方法を提供するものである。この方法はホルモ
ン、抗生物質などの医薬の製造、窒素の固定、発酵、特
定の材料の利用などに直接的に有用性をもち利用するこ
とができる）を用いて、酵素の生合成のための遺伝情報
を無機ピロホスフエートアセテートホスホトランスフエ
ラーゼ・をもたない微生物に導入し、後述の実施例ＸＮ
に示すようにこの微生物に無機ピロリン酸塩で生育する
能力を与える。このようにピロリン酸塩で生育する能力
は他の微生物に移入することができる。実施例 １ デスルホトマクラム・ニグリフイカンスの細胞を次の培
地で生育させた。 すなわち、基本培地；〔基本培地〕十〔無機ピロリン酸
塩〕：〔基本塔地〕−〔硫酸塩〕十〔無機ピロリン酸塩
〕；〔基本培地〕−〔酢酸塩〕十〔無機ピロリン酸塩〕
；〔基本塔地〕−〔酵母エキス〕十〔無機ピロリン酸塩
〕：〔基本塔地〕−〔酢酸塩および酵母エキス〕十〔無
機ピロリン酸塩〕；および乳酸塩‐硫酸塩塔地を用いた
。基本培地は１夕当り次の各成分を含む：すなわち酢酸
ナトリウム３．総；Ｎａ２Ｓ０４０．４タ：ＭｇＳ０４
・７日２００．２夕；ＭｇＣ１２・母ＬＯＩ‐８タ：Ｋ
２ＨＰ０４０．５夕；ＣａＣ１２・２日２００．２夕；
ディフコ酵母エキス２．０タ：ＦｅＳ０４１０倣：還元
剤（２．５タシスティンＨＣＩ＋２．５タＮａ２Ｓ・餌
２０／２００の‘日２０）２０の上を含んでいる。ＫＯ
Ｈを用いてｐＨを７．２に調節した。無機ピロリン酸塩
（ＰＰｉ）（炉過滅菌したもの）を加える場合には最終
濃度が培地１〆中に０．０５％となるように加えた。乳
酸塩 硫酸塩培地は１〆当り次の各成分を含む：すなわ
ち、乳酸ナトリウム（６０％）１２．５のＺ：ＮＨ４Ｃ
Ｉ２．０タ：Ｍが０４・７日２００．２タ：Ｋ２ＨＰ０
４０．５タ：ＣａＣ１２・２４０．０．２タ：ディフコ
酵母エキス１．０タ：Ｎａ２Ｓ・割日２００．２５夕を
含んでいる。前記第１表は４糊時間後の生育を比較して
示したものである。 実施例 ロ デスルホトマクラム・ルミニスの細胞を、実施例１の基
本塔地に無機ピロリン酸塩（ＰＰｉ）（炉過滅菌したも
の）を最終濃度が１〆当り培地中で０．０１％．０．０
２％．０．０３％．０．０４％．０．０５％．０．０６
％および０．０７％となるように加えて生育させた。 第１図は４斑時間後の比較生育速度を示している。実施
例 ｍデスルホトマクラム・オリェンチスの細胞を実施
例１の〔基本培地〕十〔無機ピロリン酸塩〕および乳酸
塩‐硫酸塩塔地で生生育させた。 前記第２表は酵素活性を比較して示している。実施例
Ｗ 塩水沼地（ａ ｓａｌｔｗａｔｅｒｓｐａｒｔｉ順ｍａ
岱ｈ）から得た士試料を、塩化ナトリウムを１ク当り培
地中２．５％の濃度となるように加えた実施例１の基本
塔地、および塩化ナトリウム２．５％を加えた実施例１
の〔基本培地〕十〔無機ピロリン酸塩〕に接種した。 第２図のような顕微鏡写真は２独特間の嫌気的培養後の
細胞の種類の多用性を示している。実施例 Ｖ 淡水沼地かち得られた士試料を実施例１の基本培地およ
び実施例１の〔基本培地〕十〔無機ピロリン酸塩〕の培
地に接種した。 ２岬時間嫌気的に培養した後、培養物は塩水沼地からの
増菌培養物について観察されたのと同程度の微生物の多
用性を示した。 実施例 の 従来の培地と生育条件を用いて、無機ピロリン酸塩が多
数の多様な微生物の生理学的プロセスと生育を刺激する
ことを立証した。 以下の第３表には無機ピロリン酸塩によって影響を受け
た微生物のリストが示されている。第３表：各種微生物
の生育に及ぼすピｏリン酸塩の効果実施例 皿淡水沼地
から得られた士を、０．０４％無機ピロリン酸塩を含む
および含まないセルロース含有培地（Ｄｉｌｗｏ九ｈ，
Ｇ．，ＷｉｅｇｅＵ．，Ｌｉｕｎｇ船ｈｌ．Ｌ．Ｇ．お
よびＰｅｃｋ，日．Ｄ．，Ｊｒ．，ｉｎＣｅｌｔｕｌｏ
ｓｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｅｎｎｅ．ＣＭＲＳ．Ｎねｒｓｅ
ｊｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ．セルロース（アビセル）５．
０夕／そ：ＮａＨＣ０３４．０夕／で；酵母エキス０．
６夕／ク：カシトン（Ｃａｓｊｔｏ船）２．５夕／そ：
セロピオース０．２夕／そ：ＮａＣＩＯ．９夕／そ；（
Ｎ比）２Ｓ０４０．９タノ〆：ＫＨ２Ｐ０４０．４５夕
／そ：ＭｇＳ〇４０‐０９夕／そ：ＣａＣ１２０‐０９
タ：Ｋ２ＨＰ〇４０．４５夕／そ：システィン０．５夕
／そ）に接種した。 メタン生成速度の刺激を以下の第４表に示す。第４表：
増富豆藍蟹物を用いた無機ビロリン酸塩によるセルｏ−
スからのメタン生成の蔵鰍実施例 風メタノサルシナ・
バーケリィを、０．０４％無機ピロリン酸塩を含むおよ
び含まない酢酸塩（０．２％）含有培地に接種した。 ピロリン酸塩によるメタン生成速度の刺激を以下の第５
表に示す。第５表：メタノサルンナ・バ−ケリイを用い
だ無機ピｏリン酸塩による酌拙礎塩からのメタン生成の
燕轍 メタン生成くｍｍｏｌｅｓ） 実施例 Ｋ グルコースまたは澱粉のような発酵性化合物を含む培地
に発酵性嫌気性細菌例えばサーモアナェロバクタ‐１ェ
タノリカスを接種し、無機ピロリン酸塩を加えおよび加
えずにその細菌の最適生育温度で培養する。 無機ピロリン酸塩が存在すると、より高い濃度の所望の
生成物が得られるように発酵生成物が変化する。実施例
Ｘ 無機ピロリン酸塩を添加しまたは添加せずに、粉砕した
低品位硫化鉄鉱の試料にチオバチルス菌を接種する。 金属イオンの放出を３０００において時間の関数として
追跡する。無機ピロリン酸塩が存在すると金属イオンの
放出が増大し、これはチオバチルス菌の生育が遠くなり
鉱石のリーチング速度が増大していることを示している
。実施例 ＸＩ無機ピロリン酸塩を添加しまたは添加せ
ずに、総砕した硫黄含有量の高い石炭の試料にチオバチ
ルス菌を接種する。 硫酸塩イオンの生成を３０ｑ０において時間の関数とし
て追跡する。無機ピロリン酸塩が存在すると硫酸塩の生
成が増大し、これはチオバチルス菌の生育速度が速くな
り石炭試料の脱硫速度が高くなっていることを示してい
る。実施例 Ｘロ無機ピロリン酸塩を含む標準塔地（Ｗ
ｅｉｎｅｒ，Ｐ．Ｊ．および後ｉｋｕｓ．Ｊ．Ｇ．，Ａ
ｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１９：４６‐５７，１
９７８．ＫＨ２Ｐ０４１．５夕／９８５の上ガラス蒸溜
水；Ｋ２ＨＰ０４・細２０２．９夕／９８５の‘ガラス
蒸溜水：；ＮＡＣＩＩ．０夕／９８５の【ガラス蒸溜水
；ＮａＣ１０．９夕／弊５の‘ガラス蒸溜水；Ｍや１２
・母ＬＯＯ．２夕／９８５の【ガラス蒸溜水：ＣａＣ１
２・幻も００．０５夕／職５の‘ガラス蒸溜水；ＮａＳ
ｅ０３０．０１７の９／９８５の【ガラス蒸留水：ミネ
ラル溶液１０の上／９８５の【ガラス蒸溜水；；ビタミ
ン溶液５の【／弊５の‘ガラス蒸溜水；リアズリン（Ｒ
ｅａｚｍｉｎ）（０．２％）１．０の‘／９８５の【ガ
ラス蒸溜水）にメタノサルシナ・バーケリィを接種する
。 この微生物をビタミンＢ２の商業的生産に用用いること
ができるほど高いビタミンＢ２の収率が得られる。実施
例 Ｘｍ 無機ピロリン酸塩を加えた標準培地 （Ｄｉｌｗｏｎｈ，Ｇ．，Ｗｉｅｇｅｌ，Ｊ．，Ｌ瓜ｎ
ｇ畝ｈｔ，Ｌ．Ｇ．およびＰｅｃｋ，日．Ｄ．，Ｊｒ．
，ｉｎ ＣｅｌｌｕｌｏｓｅＭｉＣｒｏｂｉｅｎｎｅ．
ＣＭＲＳ，Ｍａｒ‐Ｓｅｍｅ，Ｆｒａ比ｅ．セルロース
（アビセル）５．０夕／夕；ＮａＨＣ０３４．０夕／ク
；酵母エキス０．６多／〆；カシトン２．５多／夕；セ
ロビオース０．２夕；ＮａＣＩＯ．９夕／そ；（ＮＡ）
２Ｓ〇４０．９夕／そ；ＫＨ２Ｐ〇４０．４５夕／そ；
ＭｇＳ〇４０‐０９夕 ／そ；ＣａＣ１２０‐０９夕
／Ｚ；Ｋ２ＨＰ０４０．４５夕／そシステイン０．５夕
／夕）にクロストリジウム・サーモセラムを接種する。 クロストリジウム・サーモセラムをセルラーゼの商業的
生産に使用することができる程度に高い収率でセルラー
ゼが得られる。実施例 ＸＷ ェシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ
）は無機ピロリン酸塩で生育することができず、酵母ピ
ロホスフエートアセテートホスホトランスフエラーゼを
もっていない。 ある微生物から他の微生物にデオキシリボ核酸（ＤＮＡ
）を移入する公知の方方法、すなわち米国特許第４２３
７２２４号の方法（コーェンおよびボィャーによる生物
学的機能を有する分子キメラを精造する方法はこの技術
分野において知られている方法である。微生物中で外来
遺伝子を複製し発現させる方法および組成物が提供され
る。プラスミドまたはウイルスのデオキシリボ核酸を開
裂して所望の表現特性をもつ生物学的機能をもつレプリ
コンをつくる。このレプリコンを形質転換によって微生
物細胞中に挿入する。形質転換体を単離すると、改変プ
ラスミド中に存在するデオキシリボ核酸分子を複製し発
現する細胞が得られる。この方法は遺伝能力を微生物中
に導入して、医学的にまたは商業的に有用な酵素のよう
な蛋白質および核酸を製造する便利で効率のよい方法を
提供するものである。この方法はホルモン、抗生物質な
どの医薬の製造、窒素の固定、発酵、特定の材料の利用
などに直接的に有用性をもち利用することができる）を
用いてホスホトランスフェラーゼの生合成情報を有する
デスルホトマクラムからのＤＮＡをエシエリキア・コリ
に移入し、この微生物が生育のためのエネルギー源とし
て無機ピロリン酸塩を利用できるようにする。以上の説
明はこの発明の範囲内における特定の実施態様を説明す
るものであり、この発明の範囲を限定するものと解釈さ
れるべきではない。 この発明を特定の実施態様に関連して説明したが、本発
明はこれに制限されるものではない。本発明の範囲から
逸脱することなく当業者がこれを変形し改変することが
できるということが理解されるべきである。産業上の利
用可能性 この発明は、無機ピロリン酸塩をエネルギー源として使
用し、低品位硫化鉄鉱のリーチング、石炭の脱硫、バイ
オマスからエタノールへの変換およびバイオマスからメ
タンへの変換のような商業的および工業的用途に使用さ
れている微生物の生育速度を刺激する方法である。 第１図 第２図
生育に対する無機ピロリン酸塩濃度の効果を示すもので
ある。 生育条件は以下に示す実施例Ｄと同じであり、基本培地
と種々の濃度の無機ピロリン酸塩を使用している。第２
図は以下の実施例Ｗに示すような塩化ナトリウム２．５
％を加えた基本培地を用いて無機ピロリン酸塩（ＰＰｉ
）を富化した海底の泥の中で生育する微生物の２枚の顕
微鏡写真を示している。発明を実施するための態様 無機ピロリン酸塩．酢酸塩．酵母エキス．硫酸塩および
塩類を含む培地でデスルホトマクラム．ニグリフイカ
ン ス（Ｄｅ測地ｏｍａｃｕｌ側ｎｉｇｒｉｆｉｃａｎ
ｓ）、デスルホトマクラム・ルミニス（Ｄｅｓ山ｆｏｔ
ｏｍａｃｕｌｍｍｍｍｉｎｉｓ）およびデスルホトマク
ラム・オリエンチス（Ｄｅｓのｆｏｔｏｍａｃｕｌｍｍ
ｏｎｅ−ｎｔｉｓ）を生育させた。 硫酸塩還元菌デスルホトマクラム属の微生物の場合には
、生育のプロセスにおいてエネルギー源として無機ピロ
リン酸塩を利用するとただ一種の特定の酵素すなわちピ
ロホスフエートアセテートホスホトランスフエラーゼを
必要とする。汎存酵素アセテートキナーゼも必要とされ
る。アデ／シン三リン酸がこの系においてつくられる。
また海水沼地（ａ ｍａｎｎｅｓｐａｍＭｍａｒｓｈ）
および淡水沼地から得られた粗増菌培養物も同様にエネ
ルギー源として無機ピロリン酸塩を用いて生育させた。
後述の実施例１は無機ピロリン酸塩によるデスルホトマ
クラム・ニグリフィカンスの嫌気性生育条件を説明して
いる。 下記の第１表は種々の培地における生育を比較したもの
である。酢酸塩，酵母エキス，硫酸塩および塩類を含む
基本塔地はこの微生物の生育を持続させない。この基本
培地に無機ピロリン酸塩を加えると、生育は乳酸塩プラ
ス硫酸塩での通常の生育条件におけるよりも良好になっ
た。この基本塔地においては、無機ピロリン酸塩はデス
ルホビブリオ・ブルガリス（Ｄｅｓのｆｏｖｉｂｒｊｏ
ｖ山ｇａｒｉｓ）の生育を刺激しない。 添加した無機ピロリン酸塩と均等物であるオルトリン酸
塩は、デスルホトマクラム・ニグリフイカンス，デスル
ホトマクラム・ルミニスおよびデスルホトマクラム・オ
リェンチスの生育を維持しなし・。無機ピロリン酸塩培
地においてデスルホトマクラム・ニグリフィカンスの生
育を最適にするためには、酢酸塩、酵母エキスおよび硫
酸塩が必要であった。酢酸塩および酵母エキスは固定炭
素源であり、硫酸塩はこれらの微生物にこの基本培地の
固定炭素源の酸化レベルを調節するためのエレクトロン
シンクを与える。硫酸塩の濃度は通常の乳酸塩−硫酸塩
培地に使用されるもののわずかに１／１０であったが、
酢酸塩に対する要求は予想外に高く、濃度が０．２％よ
り低いと殆んど生育しなかった。この酢酸塩に対する高
い要求の生理学的な根拠は、デスルホトマクラム・ニグ
リフィカンス中に酢酸塩が浸透するという生物エネルギ
ー論と関連をもつかもしれない。無機ピロリン酸塩が生
育に及ぼす刺激効果は、酢酸塩の消失対硫化物の生成の
比が３：１４であり予想される比１：１よりかなり大き
いことから、無機ピロリン酸塩による嫌気的酢酸塩酸化
の促進によるものとは思われない。同様の生育応答がデ
スルホトマクラム・ルミニスおよびデスルホトマクラム
・オリェンチスについても見出された。従って、無機ピ
ロリン酸塩はこれらの嫌気性硫酸塩還元微生物の生育の
ためのエネルギー源として働いたものである。第１表
エネルギー源として無機ピロリン酸塩（ＰＰｉ）を利用
するデスルホトマクラム生育の要求性 言宅 ＊５８仇皿で測定：アルゴン中５５ｑ０で４劉時
間培養後の２個のフラスコの平均値。 第１図に示した後述の実施例Ｄのデータは、無機ピロリ
ン酸塩の増加に対するデスルホトマクラム・ルミニスの
生育応答を説明している。 生育応答は０．０４％まで無機ピロリン酸塩濃度に比例
しており、また生育は無機ピロリン酸塩の加水分解を伴
うものであった。生育しない場合には、添加した無機ピ
ロリン酸塩の加水分解は殆んどなかった。０．０５％以
上では無機ピロリン酸塩による生育は阻害された。 これは無機ピロリン酸塩の加水分解によって堵地がアル
カリ性化（ｐＨ８．５）したためであるかも知れない。
同じような結果がデスルホトマクラム・ニグリフイカン
スとデスルホトマクラム・オリェンチスについても得ら
れた。乳酸塩−硫酸塩培地地で生育したデスルホトマク
ラム・オリヱンチスの細胞の酵素総合有量を、基本培地
プラス無機ピロリン酸塩で生育した細胞のそれと比較し
た。生育塔地は後述の実施例ｍｌこ示す。無機ピロリン
酸塩と乳酸塩−硫酸塩で生育したデスルホトマクラム・
オリェンチスの細胞に見出された各種酵素の特異的な活
性を以下の第２表に示す。呼吸的硫酸塩還元のレダクタ
ーゼ類、ＡＰＳレダクターゼ、チオスルフエートレダク
ターゼ、ビスルフアイトレダクターゼおよびアデノシン
トリホスフエートスルフリラーゼはそれぞれの細胞調製
物中でほぼ同じレベルの活性をもっていた。フマレート
レダクターゼは無機リン酸塩で生育した細胞および乳酸
塩−硫酸塩で生育した細胞のいずれにも存在しなかった
。ナイトライトレダクターゼ、ホルメートデヒドロゲナ
ーゼ、無機ピロホスフエートアセテートキナーゼ、ピロ
ホスフアターゼおよびピルベートデヒドロゲナーゼは同
様の比活性濃度で存在していた。無機ピロリン酸塩で生
育した細胞中のヒドロゲナーゼが有意に高い理由は検定
方法の難しさによるものかも知れない。これらの酵素の
特異な存在は、デスルホトマクラム・ニグリフイカンス
とデスルホトマクラム・ルミニスについても確認された
。これは無機ピロリン酸塩で生育した細胞がその代謝パ
ターンに基本的な変化を示さないことを示している。酵
素活性は次の標準的な検定方法により測定した（０ｄｏ
‐ｍ，Ｊ．Ｍ．およびＰｅｃｋ，日．Ｄ．Ｊｒ．，Ｊ．
Ｂａｃｔｅｒｉ‐ｏｌ．１４７：１６１‐ １６９，１
９８１．Ｅｍのｍｅａｓｓａが．）。ペンジルビオロゲ
ン‐またはメチルビオロゲン−結合したナイトライト，
スルフアィト，フマレートおよびチオスルフエートレダ
クターゼ類およびヒドロゲナーゼはすべて検圧法により
検定した。反応混合物は総量１．０の‘中に、リン酸塩
１０仇Ｍ（ＰＨ７．４）、ベンジルビオロゲンまたはメ
チルビオロゲン５．山ｈＭ、および亜硫酸塩、フマル酸
塩またはチオ硫酸塩２０．皿Ｍ、または亜硝酸塩５．仇
Ｍを含んでいた。デスルホビブリオ・ブリガリス由来の
部分的に精製したヒドロゲナーゼ（第ＩＤＥＡＥカラム
通過）（ｖａｎｄｅｒＷｅｓ‐にｎ，日．，Ｓ．Ｇ．Ｎ
損ｙｈｅｗ．およびＣ．Ｖｅｅ舞ｒ，ＦＥＢＳ比ｔｔ．
８６：１２２‐１２０１９７８）をヒドロゲナーゼ検定
を除くすべての検圧法ビオロゲン結合した検定試料中に
加えた。ビルベート‐ＢＶ２十およびホルメート‐ＢＶ
２十レダクターゼ類をべックマンモデル２筋ご光光度計
により５４５ｎｍで分光測定した。ホルメート‐ＢＶ２
十反応用の反応混合物はＢＶ２十５．仇ｈＭ、ジチオス
レイトール１０．仇ｈＭ、ｌｊソ酸カリウム緩衝液（Ｐ
Ｈ７．４）ｌｏ肌Ｍ、およびギ酸ナトリウム２仇ｈＭを
含んでおり、またピルベート‐ＢＶ２十反応用の反応混
合物はＢＶ２十５．仇ｈＭ、還元型補酵素Ａ２．血Ｍ、
リン酸カリウム緩衝液（ＦＨ７．４）１０瓜ｈＭ、およ
びピルビン酸ナトリウム２０．仇ｈＭを含んでいた。い
ずれの検定もツンベルク・コベツト（Ｔｈ血にｒｇｃｏ
ｖｅｔｔｅｓ）中アルゴン雰囲気下で行なった。スクシ
ネート‐フェリシアナィドレダクターゼとＡＰＳレダク
ターゼの検定は、ＡＰＳレダクターゼ反応についてはア
デノシンーリン酸４０．仇Ｍ、亜硫酸塩３０．仇ｈＭ、
フェリシアナィド１．仇ｈＭ、リン酸カリウム１０仇ｈ
Ｍ、ＰＨ７．４を用い（Ｂｒａｍｌｅｔｔ，Ｒ．および
日．Ｄ．Ｐｅｃｋ，Ｊｒ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２５０：２９７９‐２９８６，１９７５）、スクシネー
ト‐フェリシアナイドレダクターゼ反応についてはコハ
ク酸カリウム２０．仇ｈＭ、フェリシアナィド肌ｈＭ、
リン酸カリウム１０位ｈＭ、ｐＨ７．４を用い、空気中
分光光度計により４２血ｍにおいて行なった。Ｃ型チト
クロームの分析は５３８〜５５１ｎｍ（４０）における
示差分光分析法によって行なった。膜画分および全細胞
については、０２‐酸化されたおよびジチオネート‐還
元された膜の示差スペクトルをＡｍｉｍｏＤＷ−２分光
光度計により１側の光路で液体窒素の温度において測定
した。液体窒素温度における見掛上の吸光係数の変化は
、室温における既知量のチトクロームＣ３の示差スペク
トル（Ｍｒ＝１３０００）を測定することによって考慮
した（Ｓｈｉｐｐ．Ｗ．Ｓ．，ふＣｈ．ＢｊｏＣｈｅｍ
．Ｂｉｏｐｈ＄．１５０：４５９‐４７２，１９７２）
。チトクロームｂはそのピリジンヘモクロモゲンの吸収
スペクトルの差によって測定した。フラピンアデニンジ
ヌクレオチドおよびフラビンモ／ヌクレオチドは酸性お
よび中性ｐＨにおける総光によって測定した（Ｓｉｅ滋
１，Ｌ．Ｍ．，Ｍｅ比ｏｄｓＥｎＺｙｍｏｌ．５の：４
１９‐４２９，１９７９）。メナキノンはクローガーの
方法により測定した（Ｋｒｏ鞍ｒ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄ
ｓＥｎｚｙｍｏｌ．５如：５７９‐５９１，１９７９）
。非へム鉄はｏ‐フェナントロリンによる色素生成を測
定することにより検定した（氏ｉｎｅ比．日．，Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０：３２５‐３３４．１９６７
）。蛋白質はビューレツト法によって測定した（Ｇｏｍ
ａｌｌ，Ａ．Ｇ．，○．Ｊ．＆ｒ舷ｗｉｌｌ．およびＭ
．Ｍ．Ｄａｖｉｄ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１７７：
７５１‐ ７６６，１９４９）。Ｌｉｕ，Ｃｈｉ‐Ｌｉ
およびＰｅｃｋ，日．○．Ｊｒ．，Ｊ．斑ｃｔｅｒｉｏ
ｌ．１４５：４６６‐６７３，１職１．Ａｓｓａ＄．）
。アデノシントリホスフエートスルフリラーゼはウイル
ソンとバンドルスキーにより記載されているＭｏｏ葦−
を用いて測定した（Ｗｉｌｓｏｎ．Ｌ．Ｇ．およびＲ．
Ｓ．Ｂａｎｄｍｓｋｉ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３
３：９７５‐９８１，１９５８）。無機ピ。ホスフアタ
ーゼはアカギとキャ＊ンプベルの方法により測定した（
Ａｋａｇｉ，Ｊ．Ｍ．およびＬ．Ｌ．Ｃａｍｐｂｅｌｌ
，Ｊ．Ｂａｃ‐ｔｅｒｉｏｌ．８４：１１９４‐１２０
１．１９６２）。無機ピロホスフアターゼアセテートホ
スホトランスフエラーゼはリーブスとグスリーの条件を
用いることにより検定した（Ｒｅｅｖｅｓ，Ｒ．Ｅ．お
よびＪ．Ｂ．Ｇｕｔｈｒｊｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ
ｐｈ侭．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ側．６６：１３８９‐１３９
５，１９７５）。ただし、酢酸塩とピロリン酸塩から生
成されるアセチルリン酸（Ｌｉｐｍａｎｎ，Ｆ．および
Ｌ．Ｃ．Ｔｕｔｔｌｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１５
９：２１‐２８，１９４５）を測定した。硫化物はシー
ゲルの方法により測定した（Ｓｉｅｇｅｌ．ＬＭ．，Ａ
Ｍ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１：１２６‐３２，１９６５
）。蛋白質はピューレツト法により測定した（Ｌｅｖｉ
ｎ，Ｒ．およびＲ．Ｗ．Ｂｒａ雌ｒ，Ｊ，Ｌａｂ，ＣＩ
ｉｎ，Ｍｅｄ，３８：４７４．４７９，１９５１）。乳
酸塩および酢酸塩は水素炎イオン化デテクターを取付け
たＶａｒｉａｎＡｅｒｏ‐ｇａｐｈ２７００ガスクロマ
トグラフにより測定した。第２表：（正６本培地）＋し
無機ピロリン酸塩〔ＰＰｉ〕）および乳酸塩イ流雌雄塩
塔地で生育したデスルホトマクラム・オリェンチスの抽
出物中の蟹費蓑耐性生育のためのエネルギー源として無
機ピロリン酸塩を利用するものがデスルホトマクラム属
に限定されると信じる演縄的な理由はない。 〔基本培地〕十〔無機ピロリン酸塩〕培地でその他の属
の微生物の生育を微生物の増菌培養物を用いて試験した
。具体的に説明すると、塩水沼地（ａｓａＩＷａｔｅｒ
ｓｐａｒｔｉＭｍａ岱ｈ）かち得られた泥試料から採取
した微生物を使用し、塩化ナトリウムを添加した基本培
地に無機ピロリン酸塩を加えまたは加えずに接種し、後
述の実施例Ｗに示すような嫌気性条件において培養した
。３７０２４時間以内に無機ピロリン酸塩を含む微生物
培地は大量の微生物の生育を示した。 この増菌した微生物の顕微鏡写真を撮った。これらの増
菌培養物の顕微鏡写真は驚くほど多数の予期せぬ数の形
態の微生物類を含んでいた。後述の実施例Ｖに示すよう
に、同じ塔地から塩化ナトリウムを除いた培地を用いて
淡水環境から得られた無機ピロリン酸塩富化生育塔溶物
についても同じような結果が得られた。細胞の種類の多
様性は、無機ピロリン酸塩をエネルギー源として利用す
るものが胞子形成棒状体によって特徴付けられるデスル
ホトマクラム属に制限されないことを示している。これ
らの増菌培養物からのいくつかの初期単離物は硫酸塩還
元微生物ではなく、生育のために酢酸塩または硫酸塩を
必要としなかった。デスルホトマクラム属、メタノバク
テリウム（Ｍｅｔｈａｎｏ‐ｂａｃにｒｉｕｍ）属およ
びメタノサルシナ（Ｍｅ山ａｎｏｓａｒｃｉＭ）属は、
バイオマスおよび有機廃棄物を始めとするセルロースを
メタンおよび二酸化炭素に転換する微生物群に直接に含
まれている。デスルホトマクラム属は乳酸塩、脂肪酸類
およびアルコール類などの発酵生成物を酢酸、二酸化炭
素および水素に変換し、メタノバクテリゥム属は二酸化
炭素及び水素をメタンに変換し、メタノサルシナ属は酢
酸塩をメタンおよび二酸化炭素に変換する。上記の如く
発酵生成物を変換し酢酸塩または水素とＣ０２からメタ
ンを製造することはこの重要な生物学的プロセスにおけ
るステップを制限しており、これらの細菌を特徴づける
生育すなわち生理学的プロセスは後述の実施例Ｗに示す
ように無機ピロリン酸塩によって刺激される。淡水の沼
地から得られた粗セルロース富化物を用いて無機ピロリ
ン酸塩によるメタン生成の刺激が後述の実施例皿に示す
ように立証された。メタノサルシナ・バーケリイ（Ｍｅ
ｔｈａ側ｓａｒｃｉ岬ｂａｒｋｅｒ‐ ｉ）は後述の実
施例肌で示すように無機ピロリン酸塩の存在下に酢酸塩
から遠い速度でメタンを直接に生成することがわかつた
。 好熱性発酵嫌気性菌であるサーモアナェロバクタ−・ェ
タ／リカス（Ｔｈｅ肌ｏａＭｅｒｏ鼠ｃｔｅｒｅ仇ａｎ
ｏｌｉｃ瓜）が無機ピロリン酸塩で生育するということ
は予想されなかったが、このような種類の嫌気性菌が無
機ピロリン酸塩を代謝することができるという事実は無
機ピロリン酸塩を用いて発酵生成物のパターンを変化さ
せる方法を示唆している。 サーモアナエロバクター・エタノリカスはグルコース１
．０モルからエタノール１．８モル、酢酸塩０．１モル
、乳酸塩１．０モル、を生成するので、酢酸塩と乳酸塩
の蓄積によってサーモアナェロバクタ一・ヱタノリカス
を使用してエタノールを連続生産することは制限される
。無機ピロリン酸塩を添加すると酢酸塩と乳酸塩の生成
が排除され少なくなりあるいは完全になくなるので、後
述の実施例Ｋに示すようにサーモアナェロバクタ一・ェ
タノリカスによるエタノールの連続生産が容易になる。
・チオバチルス（Ｔｈｉｏｂａｃｍ船
）属は低品位硫化鉄鉱のリーチングに商業的に用いられ
ている微生物である。 このリーチングは主としてこれらの微生物の生育速度の
ためにゆっくりしたプロセスである。無機ピロリン酸塩
を添加すると後述の実施例Ｘ‘こ示すように、これらの
微生物の初期生育速度が増大し、リーチングプロセスが
促進される。滞留時間が少なくなるためにこのプロセス
に使用されている現存設備の能力が増大する。無機ピロ
リン酸塩を加えたチオバチルス属による微生物リーチン
グの第二の特徴は、これらの微生物の初期生育速度を増
大させることによって脱硫プロセスを加速し、これによ
ってプロセスに必要な菌体量を増加させるということで
ある。 石灰スラリーの滞留時間が少なくなることによりこのプ
ロセスは経済的に実施することができる。多数の酵素、
ファインバイオケミカルズおよび医薬の工業的生産のた
めに微生物学的プロセスが利用されている。製造培地に
無機ピロリン酸塩を添加するとこれらの生成物の収量お
よび微生物が増加する。例えばメタノサルシナ・バーケ
リィによるビタミン耳２の収率は後述の実施例ＸＯに示
すように無機ピロリン酸塩を添加することによって増大
する。またクロストリジウム・サーモセラム（ＣＩｏｓ
ｔｒｉ‐ｄｉｕｍｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）によって
生産されるセルラーゼの量は後述の実施例×ｍに示すよ
うに無機ピロリン酸塩を添加することによって増大する
。無機ピロホスフェートアセテートホスホトランスフヱ
ラーゼは基質からＡＴＰを生産するための最も簡単な生
物学的システムを示している。 ある微生物から他の微生物にデオキシリボ核酸（ＤＮＡ
）を移す従来の方法、すなわち米国特許第４２３７２２
４号（コーェンおよびボィャーによる生物学的機能を有
する分子キメラを製造する方法はこの技術分野において
知られている方法である。 微生物中で外来遺伝子を複製し発現させる方法および組
成物が提供される。プラスミドまたはウイルスのデオキ
シリボ核酸を開裂して所望の表現特性をもつ生物学的機
能をもつレプリコンをつくる。このレプリコンを形質転
換によって微生物細胞中に挿入する。形質転換体を単離
すると、改変プラスミド中に存在するデオキシリボ核酸
分子を複製し発現する細胞が得られる。この方法は遺伝
能力を微生物中に導入して、医学的にまたは商業的に有
用な酵素のような蛋白質および核酸を製造する便利で効
率のよい方法を提供するものである。この方法はホルモ
ン、抗生物質などの医薬の製造、窒素の固定、発酵、特
定の材料の利用などに直接的に有用性をもち利用するこ
とができる）を用いて、酵素の生合成のための遺伝情報
を無機ピロホスフエートアセテートホスホトランスフエ
ラーゼ・をもたない微生物に導入し、後述の実施例ＸＮ
に示すようにこの微生物に無機ピロリン酸塩で生育する
能力を与える。このようにピロリン酸塩で生育する能力
は他の微生物に移入することができる。実施例 １ デスルホトマクラム・ニグリフイカンスの細胞を次の培
地で生育させた。 すなわち、基本培地；〔基本培地〕十〔無機ピロリン酸
塩〕：〔基本塔地〕−〔硫酸塩〕十〔無機ピロリン酸塩
〕；〔基本培地〕−〔酢酸塩〕十〔無機ピロリン酸塩〕
；〔基本塔地〕−〔酵母エキス〕十〔無機ピロリン酸塩
〕：〔基本塔地〕−〔酢酸塩および酵母エキス〕十〔無
機ピロリン酸塩〕；および乳酸塩‐硫酸塩塔地を用いた
。基本培地は１夕当り次の各成分を含む：すなわち酢酸
ナトリウム３．総；Ｎａ２Ｓ０４０．４タ：ＭｇＳ０４
・７日２００．２夕；ＭｇＣ１２・母ＬＯＩ‐８タ：Ｋ
２ＨＰ０４０．５夕；ＣａＣ１２・２日２００．２夕；
ディフコ酵母エキス２．０タ：ＦｅＳ０４１０倣：還元
剤（２．５タシスティンＨＣＩ＋２．５タＮａ２Ｓ・餌
２０／２００の‘日２０）２０の上を含んでいる。ＫＯ
Ｈを用いてｐＨを７．２に調節した。無機ピロリン酸塩
（ＰＰｉ）（炉過滅菌したもの）を加える場合には最終
濃度が培地１〆中に０．０５％となるように加えた。乳
酸塩 硫酸塩培地は１〆当り次の各成分を含む：すなわ
ち、乳酸ナトリウム（６０％）１２．５のＺ：ＮＨ４Ｃ
Ｉ２．０タ：Ｍが０４・７日２００．２タ：Ｋ２ＨＰ０
４０．５タ：ＣａＣ１２・２４０．０．２タ：ディフコ
酵母エキス１．０タ：Ｎａ２Ｓ・割日２００．２５夕を
含んでいる。前記第１表は４糊時間後の生育を比較して
示したものである。 実施例 ロ デスルホトマクラム・ルミニスの細胞を、実施例１の基
本塔地に無機ピロリン酸塩（ＰＰｉ）（炉過滅菌したも
の）を最終濃度が１〆当り培地中で０．０１％．０．０
２％．０．０３％．０．０４％．０．０５％．０．０６
％および０．０７％となるように加えて生育させた。 第１図は４斑時間後の比較生育速度を示している。実施
例 ｍデスルホトマクラム・オリェンチスの細胞を実施
例１の〔基本培地〕十〔無機ピロリン酸塩〕および乳酸
塩‐硫酸塩塔地で生生育させた。 前記第２表は酵素活性を比較して示している。実施例
Ｗ 塩水沼地（ａ ｓａｌｔｗａｔｅｒｓｐａｒｔｉ順ｍａ
岱ｈ）から得た士試料を、塩化ナトリウムを１ク当り培
地中２．５％の濃度となるように加えた実施例１の基本
塔地、および塩化ナトリウム２．５％を加えた実施例１
の〔基本培地〕十〔無機ピロリン酸塩〕に接種した。 第２図のような顕微鏡写真は２独特間の嫌気的培養後の
細胞の種類の多用性を示している。実施例 Ｖ 淡水沼地かち得られた士試料を実施例１の基本培地およ
び実施例１の〔基本培地〕十〔無機ピロリン酸塩〕の培
地に接種した。 ２岬時間嫌気的に培養した後、培養物は塩水沼地からの
増菌培養物について観察されたのと同程度の微生物の多
用性を示した。 実施例 の 従来の培地と生育条件を用いて、無機ピロリン酸塩が多
数の多様な微生物の生理学的プロセスと生育を刺激する
ことを立証した。 以下の第３表には無機ピロリン酸塩によって影響を受け
た微生物のリストが示されている。第３表：各種微生物
の生育に及ぼすピｏリン酸塩の効果実施例 皿淡水沼地
から得られた士を、０．０４％無機ピロリン酸塩を含む
および含まないセルロース含有培地（Ｄｉｌｗｏ九ｈ，
Ｇ．，ＷｉｅｇｅＵ．，Ｌｉｕｎｇ船ｈｌ．Ｌ．Ｇ．お
よびＰｅｃｋ，日．Ｄ．，Ｊｒ．，ｉｎＣｅｌｔｕｌｏ
ｓｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｅｎｎｅ．ＣＭＲＳ．Ｎねｒｓｅ
ｊｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ．セルロース（アビセル）５．
０夕／そ：ＮａＨＣ０３４．０夕／で；酵母エキス０．
６夕／ク：カシトン（Ｃａｓｊｔｏ船）２．５夕／そ：
セロピオース０．２夕／そ：ＮａＣＩＯ．９夕／そ；（
Ｎ比）２Ｓ０４０．９タノ〆：ＫＨ２Ｐ０４０．４５夕
／そ：ＭｇＳ〇４０‐０９夕／そ：ＣａＣ１２０‐０９
タ：Ｋ２ＨＰ〇４０．４５夕／そ：システィン０．５夕
／そ）に接種した。 メタン生成速度の刺激を以下の第４表に示す。第４表：
増富豆藍蟹物を用いた無機ビロリン酸塩によるセルｏ−
スからのメタン生成の蔵鰍実施例 風メタノサルシナ・
バーケリィを、０．０４％無機ピロリン酸塩を含むおよ
び含まない酢酸塩（０．２％）含有培地に接種した。 ピロリン酸塩によるメタン生成速度の刺激を以下の第５
表に示す。第５表：メタノサルンナ・バ−ケリイを用い
だ無機ピｏリン酸塩による酌拙礎塩からのメタン生成の
燕轍 メタン生成くｍｍｏｌｅｓ） 実施例 Ｋ グルコースまたは澱粉のような発酵性化合物を含む培地
に発酵性嫌気性細菌例えばサーモアナェロバクタ‐１ェ
タノリカスを接種し、無機ピロリン酸塩を加えおよび加
えずにその細菌の最適生育温度で培養する。 無機ピロリン酸塩が存在すると、より高い濃度の所望の
生成物が得られるように発酵生成物が変化する。実施例
Ｘ 無機ピロリン酸塩を添加しまたは添加せずに、粉砕した
低品位硫化鉄鉱の試料にチオバチルス菌を接種する。 金属イオンの放出を３０００において時間の関数として
追跡する。無機ピロリン酸塩が存在すると金属イオンの
放出が増大し、これはチオバチルス菌の生育が遠くなり
鉱石のリーチング速度が増大していることを示している
。実施例 ＸＩ無機ピロリン酸塩を添加しまたは添加せ
ずに、総砕した硫黄含有量の高い石炭の試料にチオバチ
ルス菌を接種する。 硫酸塩イオンの生成を３０ｑ０において時間の関数とし
て追跡する。無機ピロリン酸塩が存在すると硫酸塩の生
成が増大し、これはチオバチルス菌の生育速度が速くな
り石炭試料の脱硫速度が高くなっていることを示してい
る。実施例 Ｘロ無機ピロリン酸塩を含む標準塔地（Ｗ
ｅｉｎｅｒ，Ｐ．Ｊ．および後ｉｋｕｓ．Ｊ．Ｇ．，Ａ
ｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１９：４６‐５７，１
９７８．ＫＨ２Ｐ０４１．５夕／９８５の上ガラス蒸溜
水；Ｋ２ＨＰ０４・細２０２．９夕／９８５の‘ガラス
蒸溜水：；ＮＡＣＩＩ．０夕／９８５の【ガラス蒸溜水
；ＮａＣ１０．９夕／弊５の‘ガラス蒸溜水；Ｍや１２
・母ＬＯＯ．２夕／９８５の【ガラス蒸溜水：ＣａＣ１
２・幻も００．０５夕／職５の‘ガラス蒸溜水；ＮａＳ
ｅ０３０．０１７の９／９８５の【ガラス蒸留水：ミネ
ラル溶液１０の上／９８５の【ガラス蒸溜水；；ビタミ
ン溶液５の【／弊５の‘ガラス蒸溜水；リアズリン（Ｒ
ｅａｚｍｉｎ）（０．２％）１．０の‘／９８５の【ガ
ラス蒸溜水）にメタノサルシナ・バーケリィを接種する
。 この微生物をビタミンＢ２の商業的生産に用用いること
ができるほど高いビタミンＢ２の収率が得られる。実施
例 Ｘｍ 無機ピロリン酸塩を加えた標準培地 （Ｄｉｌｗｏｎｈ，Ｇ．，Ｗｉｅｇｅｌ，Ｊ．，Ｌ瓜ｎ
ｇ畝ｈｔ，Ｌ．Ｇ．およびＰｅｃｋ，日．Ｄ．，Ｊｒ．
，ｉｎ ＣｅｌｌｕｌｏｓｅＭｉＣｒｏｂｉｅｎｎｅ．
ＣＭＲＳ，Ｍａｒ‐Ｓｅｍｅ，Ｆｒａ比ｅ．セルロース
（アビセル）５．０夕／夕；ＮａＨＣ０３４．０夕／ク
；酵母エキス０．６多／〆；カシトン２．５多／夕；セ
ロビオース０．２夕；ＮａＣＩＯ．９夕／そ；（ＮＡ）
２Ｓ〇４０．９夕／そ；ＫＨ２Ｐ〇４０．４５夕／そ；
ＭｇＳ〇４０‐０９夕 ／そ；ＣａＣ１２０‐０９夕
／Ｚ；Ｋ２ＨＰ０４０．４５夕／そシステイン０．５夕
／夕）にクロストリジウム・サーモセラムを接種する。 クロストリジウム・サーモセラムをセルラーゼの商業的
生産に使用することができる程度に高い収率でセルラー
ゼが得られる。実施例 ＸＷ ェシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ
）は無機ピロリン酸塩で生育することができず、酵母ピ
ロホスフエートアセテートホスホトランスフエラーゼを
もっていない。 ある微生物から他の微生物にデオキシリボ核酸（ＤＮＡ
）を移入する公知の方方法、すなわち米国特許第４２３
７２２４号の方法（コーェンおよびボィャーによる生物
学的機能を有する分子キメラを精造する方法はこの技術
分野において知られている方法である。微生物中で外来
遺伝子を複製し発現させる方法および組成物が提供され
る。プラスミドまたはウイルスのデオキシリボ核酸を開
裂して所望の表現特性をもつ生物学的機能をもつレプリ
コンをつくる。このレプリコンを形質転換によって微生
物細胞中に挿入する。形質転換体を単離すると、改変プ
ラスミド中に存在するデオキシリボ核酸分子を複製し発
現する細胞が得られる。この方法は遺伝能力を微生物中
に導入して、医学的にまたは商業的に有用な酵素のよう
な蛋白質および核酸を製造する便利で効率のよい方法を
提供するものである。この方法はホルモン、抗生物質な
どの医薬の製造、窒素の固定、発酵、特定の材料の利用
などに直接的に有用性をもち利用することができる）を
用いてホスホトランスフェラーゼの生合成情報を有する
デスルホトマクラムからのＤＮＡをエシエリキア・コリ
に移入し、この微生物が生育のためのエネルギー源とし
て無機ピロリン酸塩を利用できるようにする。以上の説
明はこの発明の範囲内における特定の実施態様を説明す
るものであり、この発明の範囲を限定するものと解釈さ
れるべきではない。 この発明を特定の実施態様に関連して説明したが、本発
明はこれに制限されるものではない。本発明の範囲から
逸脱することなく当業者がこれを変形し改変することが
できるということが理解されるべきである。産業上の利
用可能性 この発明は、無機ピロリン酸塩をエネルギー源として使
用し、低品位硫化鉄鉱のリーチング、石炭の脱硫、バイ
オマスからエタノールへの変換およびバイオマスからメ
タンへの変換のような商業的および工業的用途に使用さ
れている微生物の生育速度を刺激する方法である。 第１図 第２図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ピロホスフエートアセテートホスホトランスフエラ
ーゼ酵素とアセテートキナーゼ酵素とを有する微生物を
用い、固定炭素源を含むが前記微生物は通常生育できな
いような培地上で、アデノシン三リン酸を生成させるた
めのエネルギー源として無機ピロリン酸塩を使用して前
記微生物を生育させることを特徴とする微生物の生育方
法。 ２ 前記微生物が塩水沼地、淡水沼地、下水処理スラツ
ジおよびルーメンからなる群から選ばれた嫌気性生態系
の泥状試料から得られたものである請求の範囲第１項に
記載の方法。 ３ 前記微生物が好気性である請求の範囲第１項に記載
の方法。 ４ 前記微生物が嫌気性である請求の範囲第１項に記載
の方法。 ５ 前記微生物が硫酸還元性ではない請求の範囲第４項
に記載の方法。 ６ 前記微生物が硫酸還元性である請求の範囲第４項に
記載の方法。 ７ 前記微生物がデスルホトマクラム属、メタノバクテ
リウム属、メタノサルシナ属、サーモアナエロバクター
属、チオバチルス属およびクロストリジウム属からなる
群から選ばれる請求の範囲第４項に記載の方法。 ８ 前記微生物がサーモアナエロバクター・エタノリカ
スである請求の範囲第５項に記載の方法。 ９ 前記微生物がデスルホトマクラム・ニグリフイカン
ス、デスルホトマクラム・オリエンチスおよびデスルホ
トマクラム・ルミニスからなる群から選ばれる請求の範
囲第６項項に記載の方法。 １０ 前記固定炭素源が酢酸塩および酵母エキスからな
る請求の範囲第９項に記載の方法。 １１ 前記培地が固定炭素源の酸化レベルを調節するた
めのエレクトロンシンクを含んでいる請求の範囲第１０
項に記載の方法。 １２ エレクトロンシンクが硫酸塩である請求の範囲第
１１項に記載の方法。 １３ 無機ピロリン酸塩の濃度が０．１％（Ｗ／Ｖ）〜
０．０６％（Ｗ／Ｖ）である請求の範第１０項に記載の
方法。 １４ 無機ピロリン酸塩の濃度が０．０５％（Ｗ／Ｖ）
である請求の範囲第１０項に記載の方法。 １５ 前記微生物がメタノサルシナ・バーケリイである
請求の範囲第６項に記載の方法。 １６ ピロホスフエートアセテートポスホトランスフエ
ラーゼ酵素およびアセテートキナーゼ酵素とを有する微
生物を用い、固定炭素源を含み前記微生物が生育しうる
培地上で、アデノシン三リン酸を生成させるためのエネ
ルギー源として無機ピロリン酸塩を使用して前記微生物
を生育させることを特徴とする微生物の生育速度を刺激
する方法。 １７ 前記微生物がセルロースをメタンと二酸化炭素に
変換する請求の範囲第１６項に記載の方法。 １８ 前記微生物がバイオマスをメタンと二酸化炭素に
変換する請求の範囲第１６項に記載の方法。 １９ 前記微生物がセルロースをエタノールとその他の
生成物に変換する請求の範囲第１６項に記載の方法。 ２０ 前記微生物がバイオマスをエタノールとその他の
生成物に変換する請求の範囲第１６項に記載の方法。 ２１ 前記微生物が低品位硫化鉄鉱をリーチグする請求
の範囲第１６項に記載の方法。 ２２ 前記微生物が石炭を脱硫する請求の範囲第１６項
に記載の方法。 ２３ 前記微生物が酵素を生産するのに使用される請求
の範囲第１６項に記載の方法。 ２４ 酵素微生物がクロストリジウム・サーモセラムで
あり、前記酵素がセルラーゼである請求の範囲第２３項
に記載の方法。 ２５ 前記微生物がフアインバイオケミカルおよび医薬
からなる群から選ばれる化合物を生産するのに使用され
る請求の範囲第１６項に記載の方法。 ２６ 前記微生物がメタノサルシナ・バーケリイであり
、前記フアインバイオケミカルがビタミンＢ＿１＿２で
ある請求の範囲第２５項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US35274282A | 1982-02-26 | 1982-02-26 | |
| US352742 | 1982-02-26 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59500253A JPS59500253A (ja) | 1984-02-23 |
| JPS6027511B2 true JPS6027511B2 (ja) | 1985-06-29 |
Family
ID=23386302
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58501076A Expired JPS6027511B2 (ja) | 1982-02-26 | 1983-02-22 | 無機ピロリン酸塩による細菌生育刺激 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0101721A4 (ja) |
| JP (1) | JPS6027511B2 (ja) |
| WO (1) | WO1983002952A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62152203A (ja) * | 1985-12-26 | 1987-07-07 | Yuken Kogyo Kk | 比例電磁弁駆動用パワ−増幅器 |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4727031A (en) * | 1984-11-08 | 1988-02-23 | International Technology Corporation | Nutrient for stimulating aerobic bacteria |
| US5362639A (en) * | 1991-01-10 | 1994-11-08 | Monsanto Company | Method to increase anaerobic fermentation rates |
| EP2222863B1 (en) * | 2007-11-19 | 2012-04-04 | Novozymes A/S | Processes of producing fermentation products |
| US9528061B2 (en) * | 2010-09-10 | 2016-12-27 | Synthetic Genomics Inc. | Solubilization of coal or lignocellulose biomass |
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Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3105014A (en) * | 1961-12-07 | 1963-09-24 | Tidewater Oil Company | Bacterial treatment of media containing hydrocarbons and sulfides |
| US4237224A (en) * | 1974-11-04 | 1980-12-02 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University | Process for producing biologically functional molecular chimeras |
-
1983
- 1983-02-22 JP JP58501076A patent/JPS6027511B2/ja not_active Expired
- 1983-02-22 WO PCT/US1983/000227 patent/WO1983002952A1/en not_active Application Discontinuation
- 1983-02-22 EP EP19830901047 patent/EP0101721A4/en active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62152203A (ja) * | 1985-12-26 | 1987-07-07 | Yuken Kogyo Kk | 比例電磁弁駆動用パワ−増幅器 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1983002952A1 (en) | 1983-09-01 |
| EP0101721A1 (en) | 1984-03-07 |
| EP0101721A4 (en) | 1986-04-15 |
| JPS59500253A (ja) | 1984-02-23 |
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